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バイオ医薬品の特性解析バイオ医薬品の特性解析ACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®
SYNAPTSYNAPTTMTM G2 HDMSG2 HDMSTMTM
日本ウォーターズ株式会社日本ウォーターズ株式会社
ソリューションセンターソリューションセンター
©2010 Nihon Waters K.K.
日本薬学会第130年会併催 薬科機器展示会新技術・新製品セミナー
2010/3/29 13:00-13:20
バイオ医薬品に適したバイオ医薬品に適したLC/MSLC/MS
より複雑な分子の機器分析に求められるのは
Monoclonal Antibody
より高い解像度
+多様性+
データ解析能力
©2010 Nihon Waters K.K. 2
MW 6,000
Insulin
MW 34,000
EPO
MW 147,000
Aspirin
MW 180
サイズ=複雑さ
2
バイオ医薬品に適したバイオ医薬品に適したLC/MSLC/MSACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®/SYNAPT/SYNAPTTMTM G2 HDMSG2 HDMSTMTM
©2010 Nihon Waters K.K. 3
ACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®とカラムテクノロジーとカラムテクノロジー
PITTCON 2004
©2010 Nihon Waters K.K. 4
3
HPLC
Speed
耐圧 : 15,000 psiシステム容量 : 120 µL
ACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®
より質の高いより質の高いLC/MSLC/MSデータデータ
HPLC
HPLC
UPLC®
Resolution
Sensitivity
=UPLC®
©2010 Nihon Waters K.K. 5
UPLC®
Sensitivity
Better MS DataBetter MS Data耐圧20,000 psiのカラム充てん剤
Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788
U.S. Patent No. 6,686,035 B2
バイオ医薬品バイオ医薬品UPLCUPLC®®カラムカラム
1. UPLC® Amino Acid Analysis Solution
標準物質による2. Peptide Separation Technology
3. Oligonucleotide Separation Technology
標準物質による厳しいQCチェック
©2010 Nihon Waters K.K. 6
4. Protein Separation Technology
5. Glycan Separation Technology
4
SYNAPTSYNAPTTMTM HDMSHDMSTMTM
©2010 Nihon Waters K.K. 7
PITTCON 2007
SYNAPTSYNAPTTMTM G2 G2 HDMSHDMSTMTM システムシステム
最先端のQ-TOFに3つの独自機能を付加・イオンモビリティ・デュアルディソシエーションMSE取込みモ ド
世界初のQ-TOFから10数年高レベルに改善された基本性能
・MSE取込みモード
©2010 Nihon Waters K.K. 8
ESI ⇔ MALDI簡易な切り替え
5
SYNAPTSYNAPTTMTM G2G2QQ--TOFTOF性能性能、、IMSIMS性能性能
高分解能 > 40,000 FWHM
ダイナミックレンジ > 105
高分解能、高質量精度MS/MS、定量性向上、高速データ取得率を提供する革新的なハイブリッド四重極-飛行時間型MS
高質量精度 1 ppm RMS
UPLC®対応データ取得率
20 spectra/sec
クラスリーディングの感度
©2010 Nihon Waters K.K. 9
高分解能、高質量精度、高効率IMSを組み合わせた四重極-IMS-飛行時間型MS
従来の4倍以上のモビリティ分解能
IMS精密質量測定
ソフトウェアによって衝突断面積情報取得
構造解析に最適なTAPフラグメンテーション
多様なアプリケーションをサポートする多様なアプリケーションをサポートする解析ソフトウェア解析ソフトウェア
©2010 Nihon Waters K.K. 10
Prepare Analyse Interpret Decide
6
SYNAPTSYNAPTTMTM HDMSHDMSTMTMによるによる抗体製剤分析ソリューション抗体製剤分析ソリューション
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インタクト 還元 ペプチドアミノ酸
糖鎖・修飾構造
抗体製剤の特性解析抗体製剤の特性解析ワークフローワークフロー
- 分子量測定- 不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認
- LC,HC分析- 糖鎖プロファイリング
- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸
- 修飾の確認/同定酸化・脱アミド etc
- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造
Goal
©2010 Nihon Waters K.K. 12
7
- 分子量測定- 不純物分析
インタクト 還元 ペプチドアミノ酸
糖鎖・修飾構造
- LC,HC分析- 糖鎖プロファイリング
- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス
- 修飾の確認/同定- 酸化・脱アミド etc
ⅠⅠ..分子量測定、不純物分析、糖鎖プロファイリング分子量測定、不純物分析、糖鎖プロファイリング
不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認
糖鎖プロファイリング ペプチドシ クエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸
酸化 脱アミド etc- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造
Goal
Watersのソリューション
インタクトタンパク専用LC/MSカラムM PREPTM Mi D lti C l
©2010 Nihon Waters K.K. 13
— MassPREPTM Micro Desalting Column— Protein Separation Technology Column
ロット間解析、デコンボリューションソフト
— BiopharmaLynxTM
— MaxEnt1
インタクトインタクトIgGIgG分析ワークフロー分析ワークフロー
IgG製剤
軽鎖および重鎖
LC/MS(脱塩カラム)
DTT還元
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BiopharmaLynxTM解析分子量測定ロット間比較不純物分析
糖鎖プロファイリング
8
MassPREPTM Desalting Column :ハイスループット検体 3
モノクローナル抗体の高速オンライン脱塩モノクローナル抗体の高速オンライン脱塩LC/MSLC/MS
+ 51Charge state
Pre-runBlank
TIC (0.0 – 3.0 min)
G0F/G1F
G1F/G1F
1検体 = 3 min
MaxEnt1 :高精度デコンボリューションソフトイオン強度の定量的解析
-S-S
-
-S-S
-
-S-S-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S-
-S-S--S-S
--S-S-
S SS S
SS
SS
( )
( )
( )
( )
-S-S
-
-S-S
-
-S-S-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S
-
-S-S-
-S-S--S-S
--S-S-
S SS SS SS S
SS
SS
SS
SS
( )
( )
( )
( )
©2010 Nihon Waters K.K. 15
0.5 µg IgG1
Post-runBlank
GOF/G0F
G0F/G2F
G1F/G2F
G0/GOF
G2F/G2F
Gal
Fuc
Man
Fuc
Gal
Fuc
Gal
Fuc
Man
Fuc
Man
Fuc
BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTMによるインタクトタンパク解析によるインタクトタンパク解析
BiopharmaLynxTM :ロット間比較不純物検出
糖鎖プロファイリングの確認
©2010 Nihon Waters K.K. 16
9
- 分子量測定- 不純物分析
インタクト 還元 ペプチドアミノ酸
糖鎖・修飾構造
- LC,HC分析- 糖鎖プロファイリング
- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス
- 修飾の確認/同定- 酸化・脱アミド etc
ⅡⅡ..アミノ酸、ペプチド、修飾アミノ酸、ペプチド、修飾 etcetc
不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認
糖鎖プロファイリング ペプチドシ クエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸
酸化 脱アミド etc- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造
Goal
Watersのソリューション
UPLC® AAA solutionP tid M i l ti
©2010 Nihon Waters K.K. 17
Peptide Mapping solution— RapiGestTM SF— Peptide separation technology column— MSE取り込みモード
— BiopharmaLynxTM 1.2
IgG製剤
ペプチドマッピングワークフローペプチドマッピングワークフロー
ペプチド
LC/MS(PSTカラム)
トリプシン消化
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BiopharmaLynxTM解析ペプチドカバレージマップ
ロット間比較修飾ペプチド検索修飾サイトの特定
10
6 0e 2
7.0e-2
90 min
HPLC 2.1 x 250 mm, 3.5 µ
Peptide Separation TechnologyPeptide Separation Technology
8 0e 2
9.0e-2
1.0e-1
Time30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00
AU
1.0e-2
2.0e-2
3.0e-2
4.0e-2
5.0e-2
6.0e-2
55 minUPLC® 2.1 x 150 mm, 1.7 µImproved resolution
Reduced run time
PST Column :高速、高分離ペプチドマッピング
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Time20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 52.00 54.00 56.00
AU
2.0e-2
3.0e-2
4.0e-2
5.0e-2
6.0e-2
7.0e-2
8.0e-2
TFA or Formic acid
pH 1-12, High Temp
Columns QC tested with a peptide map
%
G2 (M+H)+3
m/z 976.026
3
6
3
PST Column :
High Resolution Separation of High Resolution Separation of Glycopeptides by UPLCGlycopeptides by UPLC®®
%
47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00
%
1
47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.002
G1 (M+H)+3
m/z 922.00
G0 (M+H)+3
m/z 867.99
6
3
6
3
6
3
6
3
6
3
6
3
66
PST Column :糖ペプチドの分離にも有効
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Time47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00
%
1
m/z 867.9933
Mouse IgG glycoforms were detected using extracted mass chromatograms of the triply charged glycopeptides. The positional isomers of G1 have been separated by UPLC®.
11
BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTMによるペプチドマッピング解析によるペプチドマッピング解析
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BiopharmaLynxTM :ロット間比較カバレージマップ差クロマトグラム修飾ペプチド解析
LC/MSLC/MSEE Data AcquisitionData Acquisition
1 sec
MSPrecursor
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Precursor
MSE
Fragments
Retention Time
MSE取込みモード :情報のロスがない
LowEnergy ⇒ 質量情報HighEnergy ⇒ 配列情報
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BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTM 1.2 : 1.2 : フラグメントイオンによるペプチドアサイン機能フラグメントイオンによるペプチドアサイン機能
©2010 Nihon Waters K.K. 23
BiopharmaLynxTM ver.1.2 :MSEデータ対応
フラグメントイオン(b/yイオン)によるより高確度な帰属
1.1. Fragmentation patterns can be compared between analysesFragmentation patterns can be compared between analyses2.2. Potential alternative peptide assignments tested and selectedPotential alternative peptide assignments tested and selected3.3. Modifications can be assigned to specific residuesModifications can be assigned to specific residues
BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTM 1.2 : 1.2 : アサインの確認アサインの確認
©2010 Nihon Waters K.K. 24
BiopharmaLynxTM ver.1.2 :帰属根拠の確認には
1クリックでスペクトル画面へ
13
- 分子量測定- 不純物分析
インタクト 還元 ペプチドアミノ酸
糖鎖・修飾構造
- LC,HC分析- 糖鎖プロファイリング
- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス
- 修飾の確認/同定- 酸化・脱アミド etc
ⅢⅢ..糖鎖糖鎖
不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認
糖鎖プロファイリング ペプチドシ クエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸
酸化 脱アミド etc- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造
Goal
Watersのソリューション
LC/ESI/MSによるインタクトIgG測定IgGから糖鎖を切り出して測定
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— MassPREPTM Glycoanalysis Kit— Glycan separation technology column— MALDI/MS
糖ペプチドのサイト特定と定量的測定
— BiopharmaLynxTM
糖鎖解析ワークフロー糖鎖解析ワークフロー
IgG製剤
糖ペプチド& ペプチド N-結合型糖鎖
2 ベル化
IgG(糖鎖なし)
PNGaseFトリプシン
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2-ABラベル化
LC/FLR/MS
(GSTカラム)
LC/MS
(脱塩カラム)MALDI/MS
LC/MS
(PSTカラム)
14
GST column :ヒトIgGでメジャーな13糖鎖の分離でQCチェックしたカラム
GlycanGlycan Separation TechnologySeparation Technology
MassPREPTM Glycoanalysis kit :PNGaseFによる糖鎖切り出しHILIC SPEでのクリーンアップ
MALDIマトリックス
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5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G
22500.000
25000.000
27500.000
30000.000
090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 (1) ACQUITY FLR ChA Ex330,Em420 nmRange: 3066224.58
18.57
31.87
G0F G1F
G2F FLR
GSTGSTカラムによるカラムによる22--ABABラベル化糖鎖のラベル化糖鎖のLC/FLR/MSLC/FLR/MS
10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00
EU x
10e
4
0.000
2500.000
5000.000
7500.000
10000.000
12500.000
15000.000
17500.000
20000.000
15.47
20.0721.22
25.60
26.6326.98
28.50
37.43
33.1734.28
41.03
090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 1: TOF MS ES+ BPI
77.824.56
G0G1
Man6Man5
G2FS1
G0FGN G1FGN
5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G
100090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 1047 (18.564) Cm (1038:1056) 1: TOF MS ES+
702792.3
G2G1FS1
Loss -15 Da of labeled glycans
GST column :高い糖鎖分離能高感度蛍光検出
GST column :ESI/MSによる構造情報
©2010 Nihon Waters K.K. 28
Time10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00
%
7
18.55
9.86
20.0721.18
23.95
31.85
25.57
26.63
30.22
40.48
37.4733.01
43.3345.13
BPI
m/z800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
%
0
758.2
792.8
1583.7
793.3
1380.6
793.81177.5
820.3 1015.5840.31218.5
1219.5
1381.6
1382.6
1383.6
1584.7
1585.7
1586.6
(M+H)+
(M+2H)2+
Loss of GN
Loss -15 Da of labeled glycansESI/MSによる構造情報
IMS機能によりMS3も可能
15
GOF
G1FA)
フリー糖鎖のMALDI/TOF
切出したフリー糖鎖の切出したフリー糖鎖のMALDI/MSMALDI/MS
m/z1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800
G2F
GlcNAcGlcNAcY1
B5Y2Y3
Y4
B2
Y5
B1Y4/Y5
B)
質量情報:高感度でシンプルなスペクトルマイナー糖鎖も検出可能
©2010 Nihon Waters K.K. 29
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Man
Fuc
Man
FucB4
3
B3
B2B1Y4
B2
Y5
B1
(M+Na)+B5Y5B4
B5/Y5
Y4
B5/Y5/Y5
B3/Y5
Y3
B2
B3/Y5/Y5
Y5/Y5Y4/Y4
B5/Y5/Y4Y2B1
B5Y3
G0FのMALDI/Q-TOF構造情報:
Q-TOFモードでフラグメンテーションの確認
インタクト 還元 ペプチドアミノ酸
糖鎖・修飾構造
抗体製剤の特性解析抗体製剤の特性解析ワークフローワークフロー
- 分子量測定- 不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認
- LC,HC分析- 糖鎖プロファイリング
- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸
- 修飾の確認/同定酸化・脱アミド etc
- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造
Goal
©2010 Nihon Waters K.K. 30
あらゆる特性解析に対応可能
16
分析項目 UPLC®分離 MS 検出器
Software Solution system
ICHガイドライン Q6B 物理的化学的特性解析の分類
インタクトマスMassPREPTM micro desalting column PrST column
SYNAPTTM BiopharmaLynxTM
MaxEntTM 16.1.2 a) 分子量・分子サイズ
6.1.1 c) 末端アミノ酸配列
抗体分析のソリューション抗体分析のソリューションまとめまとめ
抗体
製剤評価
ペプチドマッピング PST columnSYNAPTTM HDMSTM
TUV
BiopharmaLynxTM
MaxEntTM 3 BioLynxTM
DriftScopeTM
6.1.1 c) 末端アミノ酸配列6.1.1 d) ペプチドマップ6.1.1 e) スルフヒドリル基及びジスルフィド結合6.1.1 f ) 糖組成・糖鎖構造6.1.2 e) 液体クロマトグラフィパターン6.2.2 a) 切断体6.2.2 b) 切断体以外の分子変化体
アミノ酸組成AccQ・TagTM Ultra BEH C18 column SYNAPTTM EmpowerTM
MassLynxTM 6.1.1 b) アミノ酸組成
糖鎖解析GST column
SYNAPTTM HDMSTM
FLR SimGlycan* DriftScopeTM
6.1.1 f) 糖組成・糖鎖構造- MALDI/SYNAPTTM
糖組成 Amide column SYNAPTTM
FLR BioLynxTM
©2010 Nihon Waters K.K. 31
アグリゲーション、重合体 SEC, IEX TUV EmpowerTM, MassLynxTM 6.2.2 c) 凝集物
HCP同定nanoACQUITY 2D RP-RP TRIZAICTM
SYNAPTTM PLGS6.2.1 a) 細胞基材に由来する不純物6.2.1 b) 細胞培養液に由来する不純物6.2.1 c) 細胞培養以降の工程に由来する不純物
HCP定量 nanoACQUITY TRIZAICTM TQ VerifyE
TargetLynxTM
コンフォメーション、サブユニット- SYNAPTTM HDMSTM DriftScopeTM
6.1.2 f) 分光学的性質nanoACQUITY HDX* SYNAPTTM -
薬物動態
同定 PST column SYNAPTTM PLGS
定量 PST column TQ VerifyE
TargetLynxTM
SYNAPTSYNAPTTMTM HDMSHDMSTMTMによる核酸医薬分析による核酸医薬分析
©2010 Nihon Waters K.K. 32
17
~60merまでのピーク分離にてQCチェックしたカラム
①①核酸医薬の核酸医薬のLC/MSLC/MS分析分析UPLCUPLC®®によるオリゴヌクレオチドの分離によるオリゴヌクレオチドの分離
ACQUITY® BEH OST C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 µm column30-60 mer oligothymidine ladder, 0.2 mL/min
©2010 Nihon Waters K.K. 33
40T
0 minutes 8
50T60T
UV 260 nm
移動相:A: 15 mM TEA, 400 mM HFIP aq.B: 50% Solvent A, 50% MeOH
①核酸医薬の①核酸医薬のLC/MSLC/MS分析分析不純物分離不純物分離
合成核酸よりも短いshort-mer不純物の高いピーク分離能
核酸LC/MSのスタンダードメソッド
©2010 Nihon Waters K.K. 34
TIC MS
18
①①核酸医薬核酸医薬ののLC MSLC MS分析分析ProMass for MassLynxProMass for MassLynxTMTM ワークフローワークフロー
Deconvolution
-3-4 自動デコンボリューション
Deconvolution-5
charged envelope parent MW
1) MassLynxTM と ProMass間での簡易なデータのやり取り
2) バックグラウンド除去とピーク検出の全自動化
©2010 Nihon Waters K.K. 35
3) 設定されたシーケンスに基づくマススペクトルのピークアサイン
4) 1塩基脱離の適切なアサイン
5) 結果のレポートフォーマット化
自動ピーク検出
①核酸医薬の①核酸医薬のLC MSLC MS分析分析ProMassProMass for MassLynxfor MassLynxTMTM 結果表示結果表示
検出されたピーク情報をテーブルに表示
保持時間、質量数、イオン強度、シーケンス
©2010 Nihon Waters K.K. 36
バッチ間の差を色分けして表示
19
分析項目 UPLC®分離 MS 検出器
Software Solution system
分子量 修飾確認
OST columnHFIP/TEA(1本鎖) SYNAPTTM MaxEntTM1
ProMass
核酸分析のソリューション核酸分析のソリューションまとめまとめ
核酸
製剤評価
分子量、修飾確認OST columnAmmonium bicarbonate(2本鎖) SYNAPTTM MaxEntTM1
ProMass
配列確認
OST column SYNAPTTM MaxEntTM3 Spreadsheet*
- MALDI/SYNAPTTM
不純物解析 OST column SYNAPTTM
TUV ProMass
PEG化核酸 (MassPREPTM desalting column) SYNAPTTM HDMSTM MaxEntTM1 BiopharmLynxTM
©2010 Nihon Waters K.K. 37
PEG化核酸 (MassPREP desalting column) (charge stripping) BiopharmLynxDriftScopeTM
コンフォメーション、衝突断面積 - SYNAPTTM HDMSTM DriftScopeTM
薬物動態
同定 OST column SYNAPTTM ProMass
定量OST column BEH C18 1.0mm column nanoACQUITY UPLC® (TRIZAICTM)
SYNAPTTM QuanLynxTM
総括総括バイオ医薬分析のためのトータルソリューションバイオ医薬分析のためのトータルソリューション
ACQUITY UPLC®
カラムテクノロジー
©2010 Nihon Waters K.K. 38
SYNAPTTM G2 HDMSTM
アプリケーションマネージャXevoTM QTof MS
20
一般ポスター発表一般ポスター発表QQ--TofTofを用いたバイオ医薬品の特性解析を用いたバイオ医薬品の特性解析
1. UPLC®/MSを用いた遺伝子組換えIgGの糖鎖の定量
2 Nano UPLC®/MSを用いたIgGのペプチドマッピング2. Nano UPLC®/MSを用いたIgGのペプチドマッピング
3. イオンモビリティを用いたリガンド結合タンパクの構造変化の解析
4. UPLC®/イオンモビリティTofを用いた糖ペプチドの定性および定量的解析
5. UPLC®/MSおよびUPLC®/MSEを用いた核酸製剤の迅速な特性および配列
©2010 Nihon Waters K.K. 39
ポスター発表資料をご希望の方は、
展示ブースにお越しください
ブース番号45