Embed Size (px)
Citation preview
國立屏東教育大學化學生物學系研究所
Graduate Institute of Chemical Biology
National Pingtung University of Education
碩士論文
For the Degree of Master
酵母菌拓樸異構酶 II的 C末端區功能探究
Functional analysis of the C-terminal domain of
yeast topoisomerase II
指導老師:樊琳博士(Lynn Farh, Ph.D)
研究生:詹宗憲(Tsung Hsien Chan)
中華民國一零二年一月 (Submitted January , 2013)
致謝
感謝我的指導教授樊琳老師，感謝老師這兩年半間不管老師再忙都願
意騰出時間與我討論實驗方向和數據，讓我在碩士期間能學到許多事
情，真的很謝謝老師。感謝高雄大學生物科技研究所的楊文仁教授對
論文仔細的審閱與指導，並擔任口試委員。此外，感謝本校黃鐘慶老
師在我研究期間內以輕鬆的態度與我討論實驗遇到的疑惑。
另外，也感謝台灣大學醫學院詹迺立教授讓我短暫停留在台北的期間
內能學到許多該有的能力與態度。
感謝實驗室眾多成員，彭正學長、紀淳學姊、柔芳學姊、西甫、思涵
由他們的教導讓我在儀器的使用上能得心應手。也感謝台大王英任學
長在我待在實驗室期間內的細心教導。還有曾在實驗室一起奮鬥到半
夜的昀展、亦茹、彥錡及其他彥鈞、禮臣、婷芸、家銘、范詩函、林
珮詩、鄭羽含等許多學弟妹總為實驗室帶來許多歡笑。
感謝我最摯愛的父母，有你們的支持我才能在這碩士期間專心於我的
學業，謝謝你們總是在我想家的時候千里迢迢的順道帶著哈奇到屏東
來給我適時的關心與鼓勵。當然怎能忘記親愛的姐姐除了供給我在台
北的吃住也協助我在研究所期間內的瑣事。誠摯真心的感謝你們。
詹宗憲 2013.01.22
中文摘要
DNA在轉錄及複製完成後，需要將 DNA分離到兩個子細胞中卻完全
一樣的相同基因組的複製，此關鍵步驟需要 DNA 拓樸異構酶扮演關
鍵角色。拓樸異構酶主要分成第一型拓樸異構酶 I (Type I)與第二型
拓樸異構酶 II(TypeII)。然而在酵母菌的DNA拓樸異構酶 II (topos II)
主要是作用在染色體分離時。但其C末端區(胺基酸位置在1202-1429)
的結構至今尚未有任何文獻報導。先前已有文獻指出，在 C末端區
具有核定位訊號，SUMO化等結合位。
本研究將具有 yCTD的載體送入 Rosetta(DE3)LysS大腸桿菌菌株與
BY4741酵母菌菌株以進行活體外及活體內的研究分析。在活體外分
析方面，利用 Rosetta(DE3)LysS去大量表現帶有 his-tag的 yCTD，
利用膠體電泳位移分析 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
來檢視 yCTD與 ssDNA與 dsDNA結合能力。結果顯示 yCTD並不
會對 ssDNA具有結合能力，只對 dsDNA具有結合的功能。此外也試
著了解 dsDNA與 yCTD結合時鎂離子(Mg2+
)是否會影響與 yCTD的
結合。結果顯示鎂離子(Mg2+
)並不參與 yCTD與 dsDNA結合的過程。
在分析 condensin與 topoisomerase共同結合在染色體的片段發現具
有GC-rich的現象，因此設計一 40mer GC-rich的DNA片段與 yCTD
結合，觀察 yCTD是否是藉由 GC-rich而結合在 DNA上，結果 yCTD
並非藉由 GC-rich 的因素與 DNA結合。
在活體內分析方面，利用 BY4741去大量表現帶有 GST融合蛋白的
yCTD。利用免疫螢光觀察 yCTD在有絲分裂(mitosis)期間的停留位
置。結果顯示在加入 nocodazole藥物時，使酵母菌生長期可以形成
有絲分裂(mitosis)，並停滯在中期(metaphase)但無法進入到後期
(anaphase)，藉由免疫螢光染色可發現在 yCTD會在中期前由核膜進
到核內。
關鍵字：拓樸異構酶 II、C末端區、膠體電泳位移分析、免疫螢光
英文摘要
DNA topoisomerase plays an important role in cell growth.
They are divided into two classes: type I topoisomerase
and type II topoisomerase. In yeast , the topoisomerase II
major role is on the chromosome separate . NLS、SUMO-
ylation binding site of the C-terminal domain had been
identified in recent years. Howerer , there is no research
about the C-terminal domain (the amino acid at 1202-1429) struc-
ture until now . In this study , yCTD was cloned to E.coli
Rosetta (DE3) LysS strain and yeast BY4741 strain for in
vitro and in vivo assay. We used an in vitro yCTD ,
which was overexpressed in Rosetta (DE3) LysS , assay re-
combinant His-tagged. Then we tested the yCTD combination
with the dsDNA and ssDNA by the Electrophoretic
mobility shift assay (EMSA) . The result shows that the
yCTD can only bind with dsDNA , but not with the
ssDNA . On the other hand , we want to find out whether
Mg2+ has effect on the binding of dsDNA and yCTD or
not. The result shows that the Mg2+ was not involved in
the process of yCTD and DNA combination . During the
analysis the condensing and topoisomerase combination on
chromosome sequence , we find out that the sequence has
GC-rich. To exam whether yCTD recognizes the DNA by
the GC-rich , we then design an GC-rich sequence in our
assay. Unfortunately , the answer is no. In the in vivo
assay , yCTD was tagged with GST fusion protein , over-
expressed in By4741 . Then we observed the location of
yCTD in mitosis by immunofluorescence. The result shows
that the yeast with nocodazole can arrest in metaphase ,
but not entry into the anaphase. Furthermore , the asses-
sment of yeast by immunofluorescence shows yCTD can
enter the nucleus from the nuclear membrane before the
metaphase.
Key words: Topisomerase II ; C-terminal domain ; Electrophoretic
mobiolity shift assay ; Immunofluorescence
I
目錄
目錄 ----------------------------------- I
圖表目錄 ------------------------------- IV
縮字表 --------------------------------- VI
第一章 緒論 --------------------------- 1
1-1 DNA 拓樸異構酶的功能及種類 ------------- 1
1-2 第二型拓樸異構酶的結構 ------------------ 2
1-3 原核生物有關 C 末端區的文獻探討 ---------- 3
1-4 真核生物有關 C 末端區的文獻探討 ---------- 4
1-5 研究動機、目的及實驗大綱 ---------------- 5
實驗流程圖 ----------------------------- 6
實驗流程圖 ----------------------------- 7
第二章 實驗方法 ------------------------- 9
2-1 大腸桿菌融合蛋白質的表現及萃取 --------- 9
2-2-1 管柱層析純化(histrap) ------------------ 11
2-2-2 管柱層析純化(Superdex 75) --------------- 12
II
2-3 濃縮 ------------------------------------ 13
2-4 正十二烷硫酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳(Sodium dodecyl
sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
-------------------------------------- 14
2-5 膠體電泳位移分析 electrophoretic mobility shift assay
(EMSA) ------------------------------ 15
2-6 西方墨點法 (Western blotting) -------------- 16
2-7 酵母菌融合蛋白質的表現 ------------------ 18
2-8 酵母菌免疫螢光染色 ---------------------- 19
2-9 酵母菌融合蛋白質的萃取 ------------------ 21
第三章 實驗結果 ------------------------- 22
3-1 yCTD 的蛋白質表現及純化 ---------------- 22
3-2 yCTD 與 DNA 在 EMSA 中的膠體移動 ------ 23
3-3 yCTD 在酵母菌中大量表現的免疫螢光分布 -- 25
III
第四章 討論及未來展望 ---------------- 26
4-1 yCTD 與 DNA 結合能力 ------------------- 26
4-2 yCTD 的免疫螢光分布與其可能性推論 ------- 27
4-3 總結 ------------------------------------ 28
第五章 參考文獻 ------------------------- 29
圖表 -------------------------------------- 32
附錄 -------------------------------------- 50
IV
圖表目錄
表一、加入 nocodazole 觀察大量表現 yCTD
析計算細胞型態之統計 --------------------32
圖一、Type IIA 拓樸異構酶的催化反應 ----- 33
圖二、Type IA 拓樸異構酶的催化反應 ------ 34
圖三、Type IB 拓樸異構酶的催化反應 ------ 35
圖四、Type II DNA topoisomerase 作用機制 - 36
圖五、真核 Topoisomerase II 結構與示意圖 - 37
圖六、Type II topoisomerase 之序列在不同
物種間 C 末端區的差異性 ----------- 38
圖七、利用 GE histrap 1ml 純化 pET28a-yCTD
的層析記錄與 SDS-PAGE 圖 ----------- 39
圖八、利用 Superdex 75 分離 Histrap 純化後目
標蛋白的層析紀錄與 SDS-PAGE 圖 ------40
圖九、利用 Superdex 75 分離 Histrap 純化後濃
縮目標蛋白 SDS-PAGE 圖 ----------- 41
圖十、pET28a-yCTD 在 EMSA 中的 Western
blotting 與 commassie blue 染色 -----------42
V
圖十一、Scatchard analysis of EMSA -----------43
圖十二、pET28a-yCTD 在 EMSA 中 觀察鎂離
子的影響 -----------------------------------44
圖十三、pET28a-yCTD 在 EMSA 中 觀察
dsDNA 或與 ssDNA 的結合能力 ------45
圖十四、pET28a-yCTD 在 EMSA 中 觀察與
GC-rich 的結合能力 ---------------------46
圖十五、pEG(KT)-yCTD 在 BY4741 中大量表
現的免疫螢光分析圖 ------------- 47
圖十六、pEG(KT)-yCTD 在 BY4741 中大量
表現的 Western blotting -----------------48
圖十七、pEG(KT)-yCTD 在 BY4741 中大量
表現加藥後的免疫螢光分析圖 ---------49
VI
縮字表
Amp Ampicilin
β-Me β-mercaptoethanol
CAM Chloramphenicol
CV column volume
DMSO Dimethyl sulfoxide
DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole
Dropout
powder
Yeast synthetic Drop-out Medium supplement
EDTA 2-[2-(Bis(carboxymethyl)amino)ethyl-
(carboxymethyl)amino]acetic acid
EtBr Ethidium bromide
IPTG Isopropyl-β-Dthiogalatopyranoside
Kan kanamycin
PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
SUMO small ubiquitin-like modifier
TEMED N,N,N,N-tetramethyl-ethylenediamine
YNB-AA/AS Yeast Nitrogen Base without amino acid
1
第一章 緒論
1-1 DNA 拓樸異構酶的功能及種類
DNA 拓樸異構酶(topoisomerase)在細胞分裂中，扮演極重要的角色，
藉由拓樸異構酶的 Tyrosine 殘基與 DNA的磷酸根相互作用，再由共
價聯結的形式，使得當 DNA 複製後所形成超螺旋(supercoil)、連鎖
(catenation)、扭結(knotting)時，可得以舒緩，進而形成穩定的結構(圖
一)【Pommier et al, 2010】。
拓樸異構酶可分為兩類，分別是 Type I 與 Type II，Type I 又可再細分
出 IA 型與 IB 型。與 TypeII 不同的是，TypeI 在整個反應過程中，並
不需要 ATP 的參與。IA 的作用機轉為斷裂其雙股 DNA 其中一股的
磷酸雙酯鍵，使其產生一缺口，使 IA 能繞過另一股 DNA，再使斷裂
的一股 DNA 重新黏合(圖二)。IB 其作用機轉為拓樸異構酶與 DNA
結合後，使 DNA 其中一股斷裂，由拓樸異構酶 Tyrosine 的殘基與 3’
端的磷酸根共價連接，形成一個缺口，使拓樸異構酶能以旋轉的方式
改變 DNA 的環繞數(linking number)，再將斷裂的 DNA 重新連接起
來，過程並無消耗 ATP(圖三)。而 Type II 則含有拓樸異構酶 II
(topoisomerase II)與拓樸異構酶 IV (topoisomerase IV)，在真核的 type
II 拓樸異構酶為二聚體，可以短暫的使兩條雙股 DNA 其中一條雙股
2
DNA 會分離約 4 bp 長度的距離，形成一個小缺口。而另一雙股 DNA
稱為'transported'或'T-segment'，可以通過斷裂 DNA 所形成的'gate'或為
'G-segment'。經由 footprinting 的實驗與結構提出兩股 DNA 與
topoisomerase 如何形成相互結合的介面，在真核的 type II
topoisomerase 二聚體上具有半圓形凹槽的構型，被認定為可與 DNA
結合的區域，而其中一雙股 DNA 被切斷是在 A’ subdomains 上半圓
形凹槽中的 tyrosine 殘基與 G-segment 在 CAP domain 形成 helix turn
helix(HTH)的結構，使 tyrosin 的殘基會對未斷裂的 G-segment 上 5’
端的磷酸根藉由共價連結而斷裂形成缺口。而 T-segment 通過缺口
後，DNA 斷裂的一股會再重新接合起來(圖四)，使 DNA 能夠解決如:
超螺旋、連鎖等結構【James , 2001】。
1-2第二型拓樸異構酶的結構
第二型拓樸異構酶在原核的結構上為異四聚體(heterotetramer)，而在
真核的拓樸異構酶則為二聚體(homodimeric) 【James , 2001】。在真
核的第二型拓樸異構酶結構上主要分為 ATP 分解區、Toprim、DNA
斷裂-結合區、羧基端支撐區與 C 末端區(C-terminal domain) (圖五)
3
【Hsieh et al , 2006】。然而在第二型拓樸異構酶 C末端區的結構目
前尚未被解開。
1-3 原核生物有關 C 末端區的文獻探討
若比較酵母菌的 topoisomerase II 與人類的 topo IIα與 topoIIβ 及 E.coli
的 gyrase、topo IV 一級結構上的 N 端序列相似性很高，但在 C 末端
區的序列則保留性較低。(圖六)【 James , 2001 】。在次單元體上
yCTD 正好與 gyrase 的 gyrA 及 topo IV 的 ParC 相對應。目前這兩
個蛋白質的結構都已被解出來了，可得知原核 CTD 位於 DNA
cleavage-religation region 的左右兩側，故推測 yCTD 亦有可能也在相
同區域上。而在原核生物的 DNA gyrase C 末端區的功能研究有文
獻指出在未與 DNA 結合時，gyrase C 末端區是位在 GyrA 的兩側，
在與DNA結合後，會致使C末端區的擺動與位移， 也因而促使gyrase
capture T-segment 與後續穿越的動作。【Lanz and Klostermeier ,
2011】。 然而 gyrase CTD 與 topoIV CTD 的結構皆被解出來,但其解
開 supercoil 的能力卻不一樣，故對 yeast topo II 的 C 末端區的功能可
能仍扮演著其他功能的角色。
4
1-4 真核生物有關 C末端區的文獻探討
Type II DNA 拓樸異構酶(Topo II)在 DNA 複製與轉錄或是染色體的
分離過程中是必須的酶，其中在人類的 topo II 又可以分為兩種，α
與β，但在細胞中所扮演的腳色則被認為具有不同的功能【Corbett et
al , 2004】。目前的研究認為 topoII α 主要的功能在 DNA 的分離，而
topoII β 則與 DNA 的轉錄有關。比較其兩者序列則可以看到在人類的
α與 β 在 N端具有較高的保留性序列，但在 C末端區則保留性較低(圖
六) 【 James , 2001 】。儘管 C 末端區的序列保留性較低，但是有研
究指出在人類的 Topo α 與 β 具有 nuclear localization signals
(NLS)，使 topo IIα 與 β 可進入到核內【Susan , 1999；Austin , 1998】。
此外，在真核 C 末端區亦有 phosphorylation，SUMOylation 等的位置
點，但其確切的功能仍不清楚【Dang , et al，1994；Bachant , 2002】。
目前已知酵母菌 topoII的修飾位(K1220, K1246/K1247, K1277/K1278)
【Bachant , 2002】，皆位於 CTD 上。且酵母菌 topoII 的 SUMO 修飾
已經證實與染色體穩定有關【Takahashi and Vladimir , 2006】。
5
1-5 研究動機、目的及實驗大綱
Yeast topoisomerase II C-terminal domain 已知能與 DNA 結合，但是否
具有特定專一性的結合，目前仍未知，故此實驗藉由測試不同的 DNA
或金屬離子觀察這些變因是否具有影響 CTD 與 DNA 的結合能力，
來探討 yCTD可能與 DNA的結合方式。 此外，先前的研究指出 yCTD
會在核外聚集，以 GST 抗體去觀察可以發現會將核圍繞成一個環形
的狀態，因此藉由 nocodazole 觀察 yCTD 在有絲分裂期間是否在
metaphase 及進入到核內亦或是仍在核外膜上仍形成一環形狀態。
6
Get cloning pET28a-yCTD and pEG(KT)-yCTD
Protein overexpression in rosetta(DE3)LysS and
BY4741
實驗流程圖:
Transform plasmid to rosetta(DE3)LysS and BY 4741
Using LysS for
in vitro assay
Using BY4741
for in vivo assay
7
8
Overexpression yCTD in BY4741
Experimental Method-in vivo
Immunofluorescence
Add nocodazole 100μ g/ml Western blotting
9
第二章、實驗方法
2-1 大腸桿菌融合蛋白質的表現及萃取
配置1×LB (tryptone 10g, NaCl 10g, Yeast 5g)加水至925ml，並用NaOH
滴定溶液直到 pH7.5 後滅菌。再加入已滅過菌的 10% Glucose 75ml，
總體積為 1000ml。(整個流程皆用此配方養 E. coli)。將具有蛋白質表
現質體 pET28a-yCTD 轉型送到 Rosrtta(DE3)LysS 勝任細胞中，將菌
液培養在含有抗生素 Kanamycin 50 μg/ml 與含有抗生素
Chloramphenicol 34 μg/ml 的 1×LB 40ml，隔夜震盪培養在 37℃，
230 rpm。取欲培養體積 1/50 的菌液，加到培養基中，等到 OD 0.6
後，加入 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)使其最終濃度為
1mM，再放置到培養箱持續培養 6 小時。將菌液以 10000×g, 4℃下，
離心半小時。將上清液去除掉後，以 1/4 culture volume 的 20 mM
Tris-HCl, pH 7.5 混合均勻兩次後，再利用上述方式離心。之後以
extraction buffer 回溶(1 g 菌以 1 ml 回溶)。菌液冰凍解凍兩次，並加
入 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 0.5 M (10 ml 菌液加入 50μl
PMSF) ，最後將退冰後的菌液，利用超音波破菌機破菌(power level
between 7-8) ，待菌液不再黏稠後，放入超高速離心機以 15000 rpm,
10
4℃,離心 1 小時，再將離心後之上清液取出，重複以 15000 rpm 再次
離心。離心後取上清液以 0.22μm 之過濾膜來去除雜質。
11
2-2-1 管柱層析純化(histrap)
在冷房下，將 1 ml 的 GE histrap 管柱接在 P-1 pump 上，設定流速
為 1 ml/min,先用 ddH2O 清洗管柱 15 CV(column volume) ，再洗 10
CV Equilibration buffer (50 mM Tris-HCl , 100 mM NaCl, 5 mM
Imidazole, 10% glycerol, 2 mM PMSF, 2 mM β-Me, 0.2% Triton-X100)
。接著將粗蛋白以流速 1 ml/min 的方式流入管柱中。約一小時後，將
管柱接在 AKTA prime(GE Healthcare)上，並設定流速 0.5 ml/min 。
先用 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7.5 流洗 15 CV。再用 200 mM
NaCl, 20 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole , pH 7.5 流洗 15 CV。再用 200
mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 75 mM imidazole , pH 7.5, 流洗 15 CV。
再用 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole , pH 7.5, 流洗
15 CV。目標蛋白在流洗約 55 CV 後開始出現。當目標蛋白流洗差不
多後將梯度拉到 500 mM imidazole 做清洗，最後再拉至無 imidazole
流洗約 15 CV。
12
2-2-2 管柱層析純化(Superdex 75)
膠體過濾類產品可依據膠球孔徑大小區分為兩種用途，一種是孔徑較
大的膠體，適合進行傳統膠體過濾實驗使用。在膠體過濾實驗中，樣
品液中的生物分子會依照分子大小在不同時間點而流出管柱，其中小
分子由於會滯留於膠球中較久，因此會使較大的分子更快流出管柱，
利用此原理即可將一成份複雜的樣品液依照分子大小的不同而進行
純化與分離。因此將保存在 20 % 酒精中的 Superdex 75 接在 FPLC
(GE Healthcare) 上，先用 ddH2O 清洗 1.5 CV，再以 buffer (20 mM
Tris-HCl, 200 mM NaCl , 1 mM EDTA , 5 mM β-Me , pH7.5) 換洗 1.5
CV，將 Histrap 純化下的 protein 濃縮體積至 1ml 後，注入管柱中，
以流速 0.3 ml/min 之流速分離蛋白質。
13
2-3 濃縮
離心過濾系統是利用膜上的孔徑大小將特定大小的 protein 與溶液分
離的方法，而在此實驗是利用 Centrifugal Filter Units (MILLPORE) 10
k 濃縮，先以 ddH2O 清洗 membrane 兩次，每次 5000 ×g， 5min。再
以 buffer 置換 ddH2O，以 5000 ×g， 5min 離心一次。將 sample 放入
離心管中，每次以 4000 ×g 離心 10 min，約 2-4 次後，致使 protein 體
積濃縮約至 1 ml 為止。再以 BSA 為標準品，以 1X 稀釋、2 X 稀釋、
4 X 稀釋、8 X 稀釋、16 X 稀釋的 BSA，利用 OD 595吸收值做檢量線。
再以內差法將OD 595所測得之 protein 吸收值算出其 protein相對應之
濃度。
14
2-4 正十二烷硫酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳(Sodium dodecyl
sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
先配置 Separating gel solution (4.97 ml dH2O, 3.39 ml 40%
acrylamide solution, 2.72 ml Separating Gel buffer, 35.8 μl 10% APS,
11.4 μl TEMED) ，倒入玻璃間槽內，加入 95%酒精以隔絕空氣，約
40 分鐘後，將酒精倒棄，並配置 Stacking gel solution (3.55 ml dH2O,
0.63 ml 40% acrylamide solution, 1.4 ml Separating Gel buffer,31.6μl
10% APS, 8.15μl TEMED) ，倒入玻璃間槽 separating gel 之上，插入
孔梳，待 40 分鐘膠體凝固。將凝固的膠體置於電泳槽中，於上下電
泳槽各加入電泳緩衝溶液 1×SDS running buffer(Tris base 3 g, glycine
14.39 g,10% SDS 10ml,加水至 1L),並將蛋白質樣品加入適量的 6X
loading dye 【12% SDS, 0.06% servablue G, 60%glycerol, 300 mM
Tris(pH 6.8), 15% β-Me, 加水到 100 ml 】，以 95℃乾浴槽煮沸 5 分
鐘，使蛋白質變性，之後再注入到 stacking gel 的凹槽中，於室溫以
25 mA 電泳跑約 1.5 小時，直到 dye 移動到膠體底部為止。將跑完電
泳的膠體浸泡在 Coomassie blue 染液(coomassie blue R250 0.4g ,
methanol 100 ml, acetic acid 24 ml, 加水到 200 ml)染 15 分鐘後，將染
色後的膠體取出，浸泡在退染劑 destaining solution (methanol 400 ml,
15
acetic acid 70 ml 加水至 1L)中，直到膠體背景完全退去為止
【Laemmli，1970】。
2-5 膠體電泳位移分析 Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
先配置 6 % native polyacrylamide gel solution (6.665 ml dH2O, 1.695 ml
40% acrylamide solution , 2.72 ml 2X TBE pH10 , 71.6μl 10% APS ,
22.8μl TEMED)混合均勻後，倒入預做的玻璃間隔中,插入孔梳,約 40
分鐘後待 gel 凝固。凝固後的 gel 放置於電泳槽中，於上下電泳槽中
加入電泳緩衝液 (0.5X TBE , pH10)。將蛋白質與約 40 mer dsDNA
或 ssDNA 混合，並在 16℃下作用 1hr，再注入 well 內，於 4℃下以
90 V 的電壓下約 75 min。再以 5μg/ml EtBr 與 coomassie blue 染色
觀察之【Hendrickson , 1985】。
16
2-6 西方墨點法 (Western blotting)
將 SDS-page 電泳膠體取下後，浸置於 transfer buffer(25 mM Tris-HCl,
192 mM glycine, 10% methanol)中 15 min。剪裁與膠體相同大小之
Immobilon-P Transfer membrane (帶手套剪裁，以避免手上的蛋白質汙
染 Immobilon-P Transfer membrane) 及四張相同大小的濾紙(Whatman
3M)，並將 Immobilon-P Transfer membrane 浸置於 100% methanol
(15-30s)，浸潤後再置換至 diH2O 中漂洗 2-4 min，再將 Immobilon-P
Transfer membrane 及濾紙同時浸置於 transfer buffer 中 15 min。以
support grid(負極面)為最下面，依序放上海綿、兩張濾紙、SDS-page、
Immobilon-P Transfer membrane、兩張濾紙、海綿，再將另一 support
grid 合起，以 cassette 夾好，需注意各層間皆不可有氣泡。將此 cassette
放入電泳轉印槽中(靠近膠體端之電極為負，靠近 Immobilon-P
Transfer membrane 端為正極，於 4℃冷房中以 250 mA 通電 96 分鐘，
使 SDS-page 上的蛋白質轉印至 Immobilon-P Transfer membrane 上。
轉印完成後，將 Immobilon-P Transfer membrane 浸於 5 % non-fat dry
milk 的 1× PBST(1×PBS contain 0.05% TWEEN 20)溶液中，輕輕搖晃
60 min，再以適量的 1× PBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘。再將
Immobilon-P Transfer membrane 浸泡於含有 primary antibody 的 PBS
17
的溶液中在室溫下搖晃 2 小時，再以 100 ml 1×PBST 將膜清洗 3 次，
每次 10 分鐘。再加入 secondary antibody 於 PBST 溶液中均勻搖晃一
小時，再以 100 ml 1×PBST 將膜清洗乾淨，每次 10 分鐘。再以 30 ml
PBS 清洗膜 2 次，每次 5 分鐘【Burnette , 1981】。最後加入呈色劑呈
色。混合後顏色逐漸出現，待適當深度後，再加入去離子水終止反應
繼續進行。取出 Immobilon-P Transfer membrane 以 UVP EpiChemi3
Darkroom 之照膠硬體拍照。
18
2-7 酵母菌融合蛋白質的表現
將具有融合蛋白的菌落培養在 5 ml selection media (SC-ura,-his/2%
ethanol/2% glycerol) 30℃下 250 rpm 震盪隔夜培養。取 60μl 隔夜菌液
至 30 ml selection media (SC-ura,-his/2% ethanol/2% glycerol)，至使其
OD600 為 0.2-0.3 之間。當菌液生長至 OD600 為 0.4-0.5 時，把培養基
置換成 selection media (SC-ura,-his/4% galactose)，並在 30℃下 250 rpm
震盪隔夜培養 18 小時誘導表現，再以 4000 ×g 離心 3 分鐘收集菌體。
去除上清液後，再用 TE buffer(20 mM Tris-HCl, pH8, 1 mM EDTA)清
洗兩次，儲存菌體至-80℃。
19
2-8 酵母菌免疫螢光染色
收集約 0.4g 的菌體至 1.5 ml 的微量離心管中，離心 4000 ×g ,5 min。
用 PBS (137 mM NaCl,4.3 mM Na2HPO4 , 2.7 mM KCl , 1.47 mM
KH2PO4 ,pH 7.3)清洗菌體兩次。離心 4000 ×g , 5 min 去除 PBS，加入
4% formaldehyde in 1×PBS，並在室溫下搖晃 1 小時去固定細胞。接
著用 PBS 在室溫下清洗兩次，每次 5 分鐘。以 4000 ×g , 5 min 去除
PBS，再加入 800μl sorbitor buffer (1.2 M sorbitor , 10 mM CaCl2 ,0.1 M
Tris-HCl ,pH7.5 , 20μl β-Mercaptoethanol , 50μl 0.5 M DTT)和 200 U
lyticase(Sigma)去懸浮菌體，並在 37℃下以 50 rpm 清微搖晃作用 40
分鐘。40 分鐘後以 1500 rpm 離心 4 分鐘去收集 spheroplast ，去除
上清液。加入 1 ml cold methanol 懸浮菌體並以 50 rpm 輕微搖晃。作
用完成後，以 1500 rpm 離心 4 min 去收集 spheroplast，去除上清液
後，再加入 cold acetone 懸浮菌體作用 30 s。作用完後，以 1500 rpm 離
心 4 min 去收集 spheroplast，去除上清液後。再以 1X PBS 在室溫下
清洗兩次，以 1500rpm 離心 4 min 去除上清液。再利用 5 % non-fat dry
milk in 1X PBSTB (1X PBS with 0.1% Triton X-100 and 0.2% BSA)在
室溫下作用 30 min。用 1X PBSTB 在室溫下清洗 2 次，每次 5 分鐘，
20
再以 1500 rpm 離心去除上清液。接著加入 GST˙TagTM
Monoclonal
Antibody (Merck) diluted 1:10000 in PBSTB，在 37℃下作用 1 小時。
用 1X PBSTB 在室溫下清洗 2 次，每次 5 min，再以 1500 rpm 離心 4
分鐘去除上清液。接著加入 secondary antibody goat anti-mouse IgG
fluoresein conjugate (Calbiochem) diluted 1:50 in PBSTB 在 37℃下作
用 30 分鐘。用 1X PBSTB 在室溫下清洗兩次，每次 5 分鐘，再以 1500
rpm 離心 4 分鐘去除上清液。用 15μg/ml DAPI 在室溫下染細胞核 15
分鐘，離心去除上清液。用 1X PBS 在室溫下清洗五次，每次 5 分鐘，
再以 1500 rpm 離心 4 分鐘去除上清液。用約 50-100μl 的 PBS 懸浮
spheroplast。最後取 4.5μl spheroplast 液體到載玻片上，並蓋上蓋玻
片。操作螢光顯微鏡(OLYMPUS BX61)利用 100x 油鏡做觀察
【Matsuyama et al , 1999】。
21
2-9 酵母菌融合蛋白質的萃取
誘導表現完後，菌體以 4000 × g 離心 5 分鐘收集。再以 buffer A(20mM
Tris-HCl, pH 8.0,150 mM NaCl)清洗兩次。去除上清液後，再以 buffer
A 包含 1 mM EDTA, protein inhibitors cocktail for use with fungal and
yeast extracts (Sigma)，以 1:1 回溶菌液後再加入等體積的 glass
beads，利用 Vortex 震盪 10 秒後，靜置於含鹽的冰上 20 秒，震盪約
莫 1 小時。接著在 4℃下離心 4000 × g，5 min 以去除未打破之細胞。
取上清液以 15000 × g ，10 min，兩次。之後再離心 407500 × g，60min
並置於冰上以 buffer A 回溶 30min。之後再離心 407500 × g，60min。
將上清液保存跑 SDS-PAGE，此外以 buffer A 含 0.5 % Triton X-100
回溶 pellet 後亦以 SDS-PAGE 分析之【Rappsilber , 1998】。
22
第三章 實驗結果
3-1 yCTD 的蛋白質表現及純化
本實驗是由pET28a-yCTD送入Rosetta(DE3)LysS的E. coli，利用 IPTG
進行蛋白質表現，萃取粗蛋白後，進行 his-tag 的管柱純化及過
Superdex 75 等兩種不同的蛋白質純化，使研究的蛋白質能減少其他
非主要蛋白質的干擾而影響實驗數據。由於先前研究已將此菌種表現
蛋白，利用 his-tag 純化並利用抗體去偵測目標蛋白的位置，發現在
imidazole 濃度達 200 mM 時目標蛋白分子量 43kDa 的位置找到明顯
的條帶(圖七)，且將目標蛋白的條帶切下，送至中央研究院做
MALDI-TOF Mass 分析，證明位於 43kDa 的目標蛋白為 yCTD。再將
目標蛋白流出之主要管數濃縮成 1 ml 再利用 Superdex 75 以分子篩之
方法分流出目標蛋白(圖八)，將兩種純化下來的目標蛋白比較(圖九)
可以得知過 Superdex 75 濃縮後之蛋白較少其他非主要蛋白質，因此
以此菌種所表現之蛋白純化並實驗。
23
3-2 yCTD 與 DNA 在 EMSA 中的膠體移動
EMSA 的原理主要是因為若兩個物質能互相結合而使得分子量變
大，在相同的膠體孔徑及電流下，分子越大的物質其泳動率會下降。
故利用 EMSA 來觀察 yCTD 是否能與 DNA 結合。由實驗結果(圖十)
可得知隨著當 yCTD 的濃度越高，則與 15μM DNA 的螢光條帶約從
蛋白質濃度達 15μM 的時候 DNA 的螢光條就開始有向上移動的現
象。為了確定 gel shift 的現象是由 yCTD 與 DNA 結合後的結果，故
將 native gel 利用 Western blotting 藉由抗體的辨認去確認是否為
yCTD，在與 coomassie blue 與 DNA 螢光染色條帶做比較可以觀察
到 gel shift 是由 yCTD 所造成的結果。此外，也藉由此方法去觀察
yCTD 與 dsDNA 及 ssDNA 結合是否有所差別，藉由 gel shift 的 DNA
螢光條帶觀察比較可發現在相同濃度下 dsDNA能與 yCTD有 gel shift
的現象，但在 ssDNA 上面則無 gel shift 的情形發生，表示 yCTD 能
與 dsDNA 結合但卻不具有與 ssDNA 的結合能力。至於 yCTD 是否因
鎂離子促使與 DNA 結合的實驗也是藉由 EMSA 的 gel shift 去觀察其
結果，但藉由 EMSA 的研究結果顯示，當鎂離子的濃度增加，並不
會影響 yCTD與DNA的結合能力(圖十二)。先前有文獻指出 condensin
能促使 Topo II 解連鎖(catenation)【D'Ambrosio , et al；2008】，因而分
24
析 topo II、condensin與 chromosome IIX 620000到 680000位置上DNA
是否有特定或是隨機分布的 DNA，分析所得到的結果為 GC-rich 約
莫 70%，因此再設計一段含 GC-rich 70% 的 DNA 序列，去觀察
GC-rich 是否具有影響 yCTD 與 DNA 的結合能力(圖十四)。因此與隨
機分布的 DNA 比較下，並沒有特別增加 yCTD 與 DNA 結合的能力，
這表示說 yCTD 並非由 GC-rich 的影響而結合在染色體 chromosome
IIX 620000 到 680000 這段位置的方式。
25
3-3 yCTD 在酵母菌中大量表現的免疫螢光分布
藉由 pEG(KT)-yCTD 以及 pMA210 讓 yCTD 在 BY4741 的酵母菌株
可大量表現，由於 pEG(KT)-yCTD 具有 GST 融合蛋白，因此可以利
用免疫螢光去偵測 yCTD 在 in vivo 大量表現的情形。利用螢光顯微
鏡(OLYMPUS BX61)觀察在加入 nocodazole 使 yeast 生長期在形成有
絲分裂(mitosis)期間，停滯在中期(metaphase)但無法進入到後期
(anaphase)計算細胞數目可以看到大部分的細胞數都停留在
metaphase(表一)。由於 yCTD 具有 NLS，因此可觀察在這期間內 yCTD
是否進入到核內或是仍在細胞質中。由圖十七，觀察螢光圖與染細胞
核的 DAPI 圖片中可以觀察到 yCTD 在中期就已經進入到核中。為了
證實在酵母菌具有表現的 yCTD，便利用 glass beads 打破細胞，並利
用 Western blotting 去作偵測 GST 蛋白。由圖十六可知，yCTD-GST
的分子量約為 70kDa，而 GST 大小約 26kDa。
26
第四章 討論及未來展望
4-1 yCTD 與 DNA 結合能力
藉由 EMSA 膠體位移分析可得知，yCTD 具有與 DNA 結合的能力。
然而 yCTD 如何促使與 DNA 結合，本實驗中利用添加鎂離子與分析
DNA 序列觀察是否能了解到 yCTD 與 DNA 的結合，但這兩種方法並
無明顯的觀察出其 yCTD與 DNA結合的關係。但可以確定的是 yCTD
僅會與 dsDNA 結合，而不是 ssDNA(圖十三)。觀察 DNA 與 yCTD 的
結合能力。以圖十 yCTD 與 dsDNA 利用軟體分析結合的程度，若以
[Bound DNA]與[yCTD]的比例作圖(圖十一)，所得的曲線類似於
specific binding 曲線。表示 yCTD 與 DNA 有結合的正相關。若是以
[Bound DNA]/[Free DNA]與[Bound DNA]的比例作圖，利用此圖的趨
勢線 y = 0.1579x – 0.0915 可得知 yCTD 與 DNA 的 Kd 值為 6.33312
×10-6
M。而在生化反應中對於緊密結合的 Kd 值會落在 10-9
~10-11
M，
這表示 yCTD對於DNA結合能力是處於比較弱的結合力,但是還是具
有與 DNA 結合的能力。
27
4-2 yCTD 的免疫螢光分布與其可能性推論
利用 GST 抗體去偵測大量表現 yCTD 的酵母菌其 yCTD 在細胞中的
分布情形。先前研究顯示，大量表現在酵母菌中的 yCTD 會在核外聚
集並將核給圍起來形成一個綠色螢光環(圖十五)。由於 yCTD 具有
NLS 的序列，原本就預期其可能可進入到核內，因此藉由藥物
nocodazole 促使 yeast 生長期在形成有絲分裂(mitosis)期間，停滯在中
期(metaphase)但無法進入到後期(anaphase)。再藉由 GST 抗體去觀察
yCTD 在細胞中分布的情形，可以發現加入 nocodazole 的酵母菌大量
表現的 yCTD 顯示在核內，表示 yCTD 在中期及進入到核內(圖十七)
。先前 topoisomerase II 在 Xenopus egg 的文獻研究指出【Azuma, et al，
2003】， SOMO-2/3 調節 TopoII 在 mitosis 期間，由於 yCTD 的序
列上亦具有 SUMOylation 的 binding site，因此 yCTD 是否也是在此生
長期間內亦是藉由 SUMOylation 的調節進而進入到細胞核中，未來
則可利用點突變 yCTD 的 SUMOylation binding site 來觀察 yCTD 的
SUMOylation 與進入到核中之間的關聯性是否有關。
28
4-3 總結
目前可確定 yCTD 能與 dsDNA 結合，並非與 ssDNA 結合，然而如何
促使與 dsDNA 結合並無法知道，也許是藉由其它因素所造成 yCTD
與 dsDNA 結合，須待由其他方式證明。但藉由 GST 的免疫螢光染色
觀察 yCTD，可得知 yCTD 在中期(metaphase)即進入到核中，故可再
藉由點突變如 SUMOylation binding site 或 phosphorylation binding
site 來觀察是否因此而使 yCTD 進入到核中的因素。
29
第五章 參考文獻
Austin, C . A. (1998) Nuclear distribution of human DNA
topoisomerase IIb: A nuclear targeting signal resides
in the 116-residue C-terminal tail. Experimental Cell
Research . 243: 232–240
Azuma, Y., Arnaoutov, A. and Dasso, M. (2003) SUMO-2/3
regulates topoisomerase II in mitosis. Cell Biology.
163:477–487
Burnette, W. N. (1981) Western blotting: electrophoretic transfer
of protein from sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose
and radiographic detection with antibody and
radiodinated protein A. Anal Biochem. 112:195-203
Bachant, J. (2002) The SUMO-1 isopeptidase Smt4 is linked
to centromeric cohesion through SUMO-1 modification
of DNA topoisomerase II. Molecular Cell. 9:1169–1182
Corbett, K. D., Shultzaberger , R. K. and Berger, J.M. (2004)
The C-terminal domain of DNA gyrase A adopts
a DNA-bending β-pinwheel fold. P.N.A.S . 101:
7293–7298
30
Corbett, K. D. and Berger, J. M., (2004) Structure, molecular
mechanisms , and evolutionary in DNA topoisomerases .
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. :33:95–118
Dang ,Q. , Alghisi, G. C. and Gasser, S. M. (1994)
Phosphorylation of the C-terminal domain of yeast
topoisomerase II by casein kinase II affects
DNA-Protein interaction. J. Mol. Biol. 24: 10-24
D'Ambrosio , C., Uhlmann, F., (2008) Condensin-dependent rDNA
decatenation introduces a temporal pattern to
chromosome segregation. Current Biology. 18: 1084–1089
Hsieh, T. J., Farh, L., Huang, W. M. and Chan, N. L., (2006)
Structure of the Topoisomerase IV C-terminal
Domain. The Journal of Biological Chemistry. 279:
55587–55593
Hsieh, T. J., Chan, N. L. and Farh, L. (2010) On the
recognition and regulation of DNA topology by
prokaryotic type IIA topoisomerase. The Chinese Chem.
Soc., Taipei . 64: 179-190
Hendrickson, W. (1985) Protein-DNA interactions studied by
the gel electrophoresis-DNA binding assay.
BioTechniques. 3:198-207.
James J. (2001) DNA Topoisomerases: structure, function, and
mechanism. Annu. Rev. Biochem. 70:369–413.
Lanz , M. A. and Klostermeier, D. (2011) Guiding strand
31
passage: DNA-induced movement of the gyrase
C-terminal domains defines an early step in the
supercoiling cycle. Nucleic Acids Research. 39:9681–9694
Matsuyama, S., Nouraini, S. and Reed, J. (1999) Yeast as a
tool for apoptosis research. Curr. Opin.Microbiol.
2:618-623.
Nitiss, J. L. (2009) DNA topoisomerase II and its growing
repertoire of biological functions. NATURE REVIEWS ,
Cancer. 9:327
Pommier, Y., Leo, E., Zhang, H. L. and Marchand, C. (2010)
DNA topoisomerases and their poisoning by
anticancer and antibacterial drugs. Chemistry & Biology.
17: 423-433
Rappsilber, J., (1998) A novel complex of membrane
proteins required for formation of a spherical
nucleus. EMBO Journal . 17 :6449–6464
Susan , P. C. ,(1999) Sequence determinants of nuclear
localization in the α and β isoforms of human
topoisomerase II . Experimental Cell Research.
251:329–339
Takahashi,Y., Vladimir, Y.G., (2006) SIZ1/SIZ2 control of
chromosome transmission fidelity is mediated by
the sumoylation of topoisomerase II. Genetics Society of
America. 172: 783–794
32
圖表
表一、加入 nocodazole 觀察大量表現 yCTD 的免疫螢光分析計
算細胞型態之統計
(A)pEG(KT)大量表現的細胞數。(B) pEG(KT)-yCTD 大量表現的細胞型
態。由表可發現細胞型態主要落在單一細胞及 anaphase 的型態。
33
圖一、Type IIA 拓樸異構酶的催化反應
在 type IIA topoisomerases 除了可以導入或解開 Catenation
、knotting，也可以解開 supercoil 在原核的 gyrase 亦可導
入負向 supercoil【Pommier et al, 2010】。
34
圖二、Type IA 拓樸異構酶的催化反應。
http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Deoxy_Ribose_Nucleic_Acid4-Super_Coiling.htm
35
圖三、Type IB 拓樸異構酶的催化反應
a、b . Type IB 與 DNA 結合。c、d. Type IB 與 DNA 切斷其中一股 DNA 。
e.DNA 旋轉使結構穩定【James , 2001】。
36
圖四、Type II DNA topoisomerase 其作用機制
【James , 2001】
37
真核Topoisomerase II 結構與示意圖
(A)
(B)
ATP分解區
Toprim
C末端區
羧基端支撐區
DNA 斷裂-結合區
圖五、真核 Topoisomerase II 結構與示意圖
(A)Type II A 型 DNA 一級結構及所對應之功能區示意圖。(B) IIA 型 DNA
拓樸異構酶可能的四級結構【Hsieh et al，2006】。
38
圖六、Type II topoisomerase 之序列在不同物種間 C 末端區的差異性
將 Topoisomerase II 的序列比較，發現 N 端保留性序列高，但在 C 末端區
(C-terminal domain)的序列則保留性較低【 James , 2001 】。
39
2
A B
C
D
A buffer : 20 mM Tris-Cl pH 7.5
200mM NaCl
B buffer : 20 mM Tris-Cl pH 7.5
200 mM NaCl
500 mM Imidazole
M 粗 12 13 14 15 16 17 23 24 M 25 26 27 28 29 30 31
170130
9572
55
43
34
26
17
A B
UV吸收值
流經管柱體積
圖七、利用 GE histrap 1ml 純化 pET28a-yCTD 的層析記錄圖
此為 1 ml his-tag column(GE histrap)純化圖，流速為 0.5 ml/min。buffer A 為 20 mM Tris-HCl,
pH 7.5 , 200mM NaCl ; buffer B 為 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200mM NaCl, 500mM imidazole。
(A)為20 mM Tris-HCl, pH 7.5 , 200mM NaCl, 50mM imidazole,共流洗15 CV 。(B)再以20 mM
Tris-HCl, pH 7.5 , 200mM NaCl, 75mM imidazole, 共流洗 10 CV。(C) 接著以再以 20 mM
Tris-HCl, pH 7.5 , 200mM NaCl, 300mM imidazole,共流洗 10 CV。(D)最後以 buffer B 流洗 10
CV 清洗 column。縱軸為 UV 吸收值，代表蛋白質的多寡，以藍線表示。橫軸為流過管柱的
體積，紅色數字代表收集盤上的管數。綠線則為沖洗管柱時 buffer B 所佔的百分比。目標蛋
白以箭頭表示之。
40
A buffer : 20 mM Tris-Acetate pH 8.0
200 mM NaCl
1 mM EDTA
5 mM β -Me
1 mM PMSF
Histag 4 M 5
170130
9572
55
43
34
26
UV吸收值
流經管柱體積
A B
圖八、利用 Superdex 75 分離 Histrap 純化後目標蛋白的層析紀錄與
SDS-page 圖
(A)將 histrap 第 24-26 管蛋白質濃縮成 1 ml 後，inject 到 FPLC 1ml 的 loop 中，再以
0.3 ml/min 流洗 1.5 CV(1 CV 為 120ml)。目標蛋白在第 4 管(40ml)開始流出。紅色數
字為目標蛋白流洗收集管數。縱軸為 UV 吸收值，代表蛋白質的多寡，以藍線表示。
橫軸為流過管柱的體積，紅色數字代表收集盤上的管數。
(B)將第四管濃縮成 1 ml 後再以 12% SDS-PAGE 進行電泳分析。
41
圖九、利用 Superdex 75 分離 Histrap 純化後濃縮目標蛋白
SDS-PAGE 圖
Lane 1 為 Marker。Lane 2 為 histrap 純化濃縮後的目標蛋白。
Lane 3 為過 histrap 濃縮後再過 Superdex 75 後濃縮的目標蛋
白。在分子量約 43 kDa 可得目標蛋白，以箭頭表示位置。之後
in vitro 的蛋白皆以此蛋白實驗。
42
圖十、pET28a-yCTD 在 EMSA 中的 Western blotting 與 coomassie blue
染色
將 40mer 的 15μM DNA，以 (D)所示分別加入不同濃度的 yCTD 作用，作用條件為:先將
reaction buffer 置換成 10mM Hepes pH7.5, 50mM KCl,10% glycerol，再將 yCTD 與 15μM DNA
以 16℃的條件下作用 1 小時。所有樣本體積以總反應體積為 40 μl 注入到 6% acrylamide
gel 。並以 100 V、4 ℃下跑 40min 。(A)經過 5 μg/ml EtBr 染色 1min 退染 10min 後在 UV 照
光下的螢光電泳圖。(B)經過 coomassie blue 染色。 (C) Western blotting，transfer buffer 為 0.5
x TBE pH10，而以 250mA 下通電 96min 。一級抗體為 anti his-tag ，二級抗體為 anti-mouse ，
並以 HRP 呈色。以 EtBr 、commassie blue 及 Western blotting 觀察 gel shift 為 yCTD 所造成
的結果。
(40merDNA:5’GTCCAGACCCTGACACGCGCCATACGCGCCTGCAGCCAGC-3’)
43
圖十一、Scatchard analysis of EMSA
將 EMSA 三重複定量分析，觀察 DNA 與 yCTD 的結合能力。(A)圖是以[Bound DNA]
與[yCTD]的比例作圖，所得的曲線類似於 specific binding 曲線。(B)圖則是以[Bound
DNA]/[Free DNA]與[Bound DNA]的比例作圖，利用此圖的趨勢線 y = 0.1579x – 0.0915
可得知 yCTD 與 DNA 的 Kd 值為 6.33312×10-6
M。
44
1 2 3 4 5 6 7 8
1: 15 μ M dsDNA 6. 40 μ M protein + 15 μ M dsDNA2.10 μ M protein + 15 μ M dsDNA 7.40 μ M protein + 15 μ M dsDNA +5 mM MgC l23.10 μ M protein + 15 μ M dsDNA +5mM MgC l2 8.20 μ M protein4. 20 μ M protein+ 15 μ M dsDNA5. 20 μ M protein + 15 μ M dsDNA +5mM MgC l2
A B
Bo
un
d D
NA
(%)
[yC TD]
圖十二、pET28a-yCTD 在 EMSA 中 觀察鎂離子的影響
分別以各數字其不同濃度的 yCTD 與 DNA 濃度，將 40 mer 的 15 μM DNA，加入不同濃度的
yCTD 作用，作用條件為:先將 reaction buffer 置換成 10mM Hepes pH7.5, 50mM KCl, 10%
glycerol，再將 yCTD 與 15μM DNA 以 16℃的條件下作用 1 小時。所有樣本體積以總反應體積
為 40 μl 注入到 6% acrylamide gel 。並以 100 V、4 ℃下跑 40 min。圖 A 為 EtBr 染色圖。另
外若比較圖 B 在加入 MgCl2與不加 MgCl2的情況下皆無明顯的發現 DNA 與 yCTD 結合量有提
高。
(40merDNA:5’GTCCAGACCCTGACACGCGCCATACGCGCCTGCAGCCAGC-3’)
45
1 2 3 4 5 6 7 8 9
(1) 30 μ M ssDNA (5) 15μ M dsDNA(2) 10μ M protein + 30 μ M ssDNA (6) 10μ M protein + 15 μ M dsDNA(3) 20μ M protein + 30 μ M ssDNA (7) 20μ M protein + 15 μ M dsDNA(4) 30μ M protein+ 30μ M ssDNA (8) 30μ M protein + 15 μ M dsDNA(9) 20μ M protein
A B
Bo
un
d D
NA
(%)
[yC TD]
圖十三、pET28a-yCTD 在 EMSA 中 觀察 dsDNA 或與 ssDNA 的結合能力
分別以各數字其不同濃度的 yCTD 與 DNA 濃度，將 40 mer 的 15 μM DNA，加入不同濃度的
yCTD 作用，作用條件為:先將 reaction buffer 置換成 10mM Hepes pH7.5, 50mM KCl, 10%
glycerol，再將 yCTD 與 15 μM DNA 以 16℃的條件下作用 1 小時。所有樣本體積以總反應體
積為 40 μl 注入到 6% acrylamide gel 。並以 100 V、4 ℃下跑 40min。可以觀察到同樣的 yCTD
濃度下，比較 dsDNA 與 ssDNA 結合之間的差異性可以很明顯的看到 yCTD 並不與 ssDNA 結
合。
(40merDNA:5’GTCCAGACCCTGACACGCGCCATACGCGCCTGCAGCCAGC-3’)
46
Bo
un
d D
NA
(%)
1 2 3 4 5 6
(1) 15 μ M GC -richDNA (4) 15μ M random DNA(2) 10μ M protein + 15 μ M GC -richDNA (5) 10μ M protein + 15 μ M random DNA (3) 30μ M protein + 15 μ M GC -richDNA (6) 30μ M protein + 15μ M random DNA
[yC TD]
圖十四、pET28a-yCTD 在 EMSA 中 觀察與 GC-rich 的結合能力
分別以各數字其不同濃度的 yCTD 與 DNA 濃度，將 40 mer 的 15 μM DNA，加入不同濃度
的 yCTD 作用，作用條件為:先將 reaction buffer 置換成 10 mM Hepes pH 7.5, 50mM KCl, 10%
glycerol，再將 yCTD 與 15μM DNA 以 16℃的條件下作用 1 小時。所有樣本體積以總反應
體積為 40 μl 注入到 6% acrylamide gel 。並以 100 V、4 ℃下跑 40min。可以觀察到同樣的
yCTD濃度下，比較GC-rich與 random DNA結合之間的差異性並無因為GC-rich或為 random
DNA 則增加與 yCTD 的結合。
(40mer GC-rich DNA: 5’-GTCCAGACCCTGACACGCGCCATACGCGCCTGCAGCCAGC-3’)
(40mer random DNA:5’- TCACTAGTTCGACAGTTAATAGTTTGCTCAATGTTGTTGC-3’)
47
圖十五、pEG(KT)-yCTD 在 BY4741
中大量表現的免疫螢光分析圖
(A)為免疫螢光實驗的控制組 pEG(KT)，此
載體在 BY4741 中大量表現，加入
nocodazole 後，再利用 anti-GST 抗體去偵
測 GST 蛋白。由圖可知單獨表現 GST 蛋
白在 BY4741 中是呈現均勻分布。
(B)-(K)為 BY4741 中大量表現 yCTD 的螢
光圖，由圖可知yCTD會圍繞著細胞核， 而
在圖上以綠色螢光環的型態出現。圖形排
列依序為 Bright field (BF)、DAPI staining 、
FITC immunofluorescence 。
【Farh and Peng , 2010】
48
72
55
43
34
26
130
72
55
95
43
34
26
130
AB
1 M M 2 3M 1 2 3
9572
55
43
34
26
95
圖十六、pEG(KT)-yCTD 在 BY4741 中大量表現的 Western blotting
(A)圖為大量表現 pEG(KT)-yCTD。(B)圖為大量表現 pEG(KT)。
(A)(B)圖的一級抗體皆為 anti-GST，二級抗體為 anti-mouse 並以 HRP 呈色。
M: Marker，Lane 1:以 15000 ×g 離心下的粗萃取物，Lane 2:70800 ×g 離心後的
上清液。Lane 3 : 70800 ×g 離心後以 0.5% Triton X-100 回溶後的 pellet。由(A)
圖可得知 yCTD 主要為在內膜而不是在細胞質中。yCTD 分子量約為 72kDa，
GST 分子量大小則約為 26 kDa。
49
圖十七、pEG(KT)-yCTD 在
BY4741 中大量表現加藥後的免
疫螢光分析圖
(A)為免疫螢光實驗的控制組
pEG(KT)，此載體在 BY4741 中大量表
現，加入 nocodazole 後，再利用
anti-GST 抗體去偵測 GST 蛋白。由圖
可看到單獨表現 GST 蛋白是均勻呈現
在 yeast 中。
(B)-(J)為 BY4741中大量表現 yCTD的
螢光圖，亦是加入 nocodazole 後再利
用 anti-GST 去觀察 yCTD 的位置點。
由圖觀察到在加入 nocodazole 後
yCTD 的位置點皆與細胞核重疊，表示
yCTD在mitosis期間的metaphase已經
進入到細胞核中。圖形排列依序為
Bright field (BF)、DAPI staining 、
FITC immunofluorescence 。
50
附錄:
培養基配方:
Synthetic Dropout (SD) Medium -Ura/His
Dropout powder 0.13 g
YNB - AA/AS 0.67 g
Agar 2 g
Leucine 0.006 g
Tryptophan 0.004 g
ddH2O to 100 ml 滅菌 15 min
add
Glycerol/alcohol 2%
溶液配方
1. 1X PBS
NaCl 137 mM
Na2HPO4 4.3 mM
KCl 2.7 mM
KH2PO4 1.47 mM
Use NaOH to PH 7.3
2. 1X PBSTB
1X PBS
0.1% Triton X-100
0.2% BSA
51
3. 1XSDS running buffer
Tris base 3g
Glycine 14.39g
10%SDS 10ml
ddH2O to 1L
4. 4X Loading dye
Tris-HCl 250mM , pH6.8
SDS 8%
DTT 300mM
Glycerol 40%
Bromophenol blue 0.02%
使用前外加 β-Me 10%
5. Coomassie blue 染液
Coomassie blue R 250 0.4g
Methanol 100ml
Acetic acid 24ml
ddH2O to 0.2L
6. Destaining solution
Methanol 400ml
Acetic acid 70ml
ddH2O to 1L
52
7. 2XTBE pH10
Tris base 21.6g
Boric acid 11g
0.5M EDTA 8ml
ddH2O to 1L
8. Buffer A
Tris-HCl 20mM, pH8.0
NaCl 150mM
