Fosforilación Oxidativa

Carlos I. González, Ph.D. Catedrático Asociado

Departamento de Biología Universidad de Puerto Rico – Río Piedras

CHAPTER 19

Oxidative Phosphorylation and

Photophosphorylation

– Electron-transport chain in mitochondria

– Capture of light energy in photosynthesis

– Building up the proton-motive force

– Synthesis of ATP in mitochondria and chloroplasts

Key topics:

Fosforilación Oxidativa

Convergencia de rutas catabólicas - glucólisis, Ciclo de Krebs, β-oxidación, degradación de amino ácidos.

Energía liberada de oxidación de estas moléculas→ síntesis ATP.

En células eucarióticas ocurre en mitocondrio, envuelve reducción de O2 a H2O con electrones donados por NADH y FADH2.

Se conoce también como cadena respiratoria - transporte de e- por moléculas en la membrana del mitocondrio. Electrones vienen de dehidrogenasas en rutas metabólicas. Dehidrogenasas remueven e- de intermediarios. Donan e- a aceptadores (NAD y FAD)

Fosforilación Oxidativa

Energy Flow in Cellular Respiration

Oxidative Phosphorylation

• Electrons from the reduced cofactors NADH and FADH2

are passed to proteins in the respiratory chain

• In eukaryotes, oxygen is the ultimate electron acceptor

for these electrons

• Energy of oxidation is used to phosphorylate ADP

Oxidative Phosphorylation

Photophosphorylation

• In photosynthetic organisms light causes charge

separation between a pair chlorophyll molecules

• Energy of the oxidized and reduced chlorophyll

molecules is used to drive synthesis of ATP

• Water is the source of electrons that are passed via a

chain of protein transporters to the ultimate electron

acceptor, NADP+

• Oxygen is the byproduct of water oxidation

Photophosphorylation

Chemiosmotic Theory

Peter Mitchell 1961 1978 Nobel Prize

Origen endosimbiótico (mit.DNA, ribosomas, tRNAs)

Mitocondrio

Mitochondria – site of oxidative phosphorylation

Structure of a Mitochondrion

1,100 proteins (300 still unknown function)

Tipos de Transferencia de Electrones:

1) como electrones Fe3+ a Fe2+

2) átomo de hidrógeno (H+ y e-)

3) hydride ion (2 e- y 1 H+)

Aceptadores de electrones: Dehidrogenasas asociadas a NAD - electrones transferidos como “hydride ion” a NAD+ y otro H+ es liberado al medio. Sust. red. + NAD+ Sust. ox. + NADH + H+ NAD+ también obtiene e- de NADPH: NADPH + NAD+ NADP+ + NADH NADH (catabolismo) y NADPH (anabolismo) - solubles, asociación a enzimas (reversible) Ninguno cruza membrana interna.

Flavoproteínas - asociado, a veces covalente, nucleótido de flavina (FAD, FMN) FAD o FMN acepta 1 o 2 e- participan en rxns. de transferencia de 1 o 2 e-. Transferencia - Flavoproteína tiene más afinidad por e- que compuesto oxidado. Afinidad por e- de flavina depende de proteína asociada. FAD es parte de sitio activo de la enzima.

Ubiquinona (Coenzima Q) – hidrofóbica, acepta 1 o 2 e- Citocromos - contienen grupo prostético heme. Proteínas ferrosulfuradas - átomo de hierro NO en grupo heme

Ubiquinona (coenzima Q)

Como flavoproteínas, funciona en transferencias de donante de 2 e- y aceptador de 1 e-. Pequeña, hidrofóbica, difusible en membrana, transporta e- de otros transportadores menos móviles. Transporta e- y H+, imp. en acoplamiento.

Citocromos

a y b asociado a su proteína, no covalente, integrales

c – covalente, cisteínas, soluble

Afinidad átomo de hierro por e- depende de su asociación a diferentes proteínas.

Iron-containing heme prosthetic groups

Cytochromes

• One electron carriers

• Iron coordinating porphoryin ring derivatives

• a, b or c differ by ring additions

Proteínas Ferro – sulfuradas

Hierro NO está presente en grupo heme, asociado a azufre inorgánico, azufre en residuos de cisteína de la proteína. Estructura puede ser compleja (1 Fe a 4 Cys, 4 Fe). Envueltos en transferencias de 1 e-. Un Fe es oxidado o reducido.

Big Picture:

Energía liberada en transporte de e- (exergónica) es asociada a transporte de protones a través de la membrana impermeable del mitocondrio.

Electrones se mueven de NADH, succinato u otros donantes a O2 a través de transportadores como flavoproteínas, ubiquinonas, citocromos y proteínas ferro-sulfuradas.

Esta energía se conserva como potencial electroquímico transmembranal. El transporte de protones a favor de gradiente (hacia dentro) a través de canales de transporte se utiliza para sintetizar ATP. ATP sintetasa acopla transporte de protones a fosforilación de ADP.

Chemiosmotic Theory

Peter Mitchell 1961 1978 Nobel Prize

Determinación de secuencia de la cadena respiratoria

a) Determinación experimental de potencial de reducción (afinidad por e-) de cada uno de los transportadores. Electrones tienden a moverse espontáneamente de portadores con –E’o a portadores con +E’o.

Free Energy of Electron Transport

Reduction Potential (E)

∆Eo′ = Eo′(e- acceptor) – Eo′(e- donor)

∆Go′ = –nF∆Eo′ For negative G need positive E

E(acceptor) > E(donor)

Electrons are transferred from lower (more negative)

to higher (more positive) reduction potential.

Free Energy released is used to pump proton, storing

this energy as the electrochemical gradient

Jim Jones Adolf Hitler Rasputin

Qué tienen en común estos individuos?

b) Inhibidores de la cadena de transporte

En presencia de O2 y donante inicial de e-, los portadores que funcionan antes del paso inhibido se reducen, los que funcionan después de la inhibición permanecen oxidados.

Separación de Complejos Multienzimáticos de la Cadena Respiratoria

Flow of Electrons from Biological Fuels

into the Electron-Transport Chain

NADH:ubiquinone oxidoreductase,

a.k.a. Complex I

• One of the largest macro-molecular assemblies in the

mammalian cell

• Over 40 different polypeptide chains, encoded by both

nuclear and mitochondrial genes

• NADH binding site in the matrix side

• Noncovalently bound flavin mononucleotide (FMN)

accepts two electrons from NADH

• Several iron-sulfur centers pass one electron at a time

toward the ubiquinone binding site

Complex I

IDENTIFIQUE EL ERROR DEL LIBRO!

NADH:Ubiquinone oxidoreducase is a

proton pump

• Transfer of two electrons from NADH to ubiquinone is

accompanied by a transfer of protons from the matrix (N) to

the intermembrane space (P)

• Experiments suggest that about four protons are transported

per one NADH

NADH + Q + 5H+N = NAD+ + QH2 + 4 H+

P

• Reduced coenzyme Q picks up two protons

• Protons are transported by proton wires – A series of amino acids that undergo protonation and deprotonation to

get a net transfer of a proton from one side of a membrane to another

Complejo I: Transferencia de e- de NADH a Ubiquinona

Cataliza 2 procesos simultáneos: 1) Transferencia de 2e- (hydride ion) – exergónica 2) Transferencia de 4H+ al exterior.

Negativo

Positivo

Complejo I: Transferencia de e- de NADH a Ubiquinona

Negativo

Positivo

Proton Pump - utiliza energía de transporte de e- para mover H+. Ubiquinona reducida (Ubiquinol) se mueve de Complejo I a III

Complejo I:

42 polipéptidos, incluyendo 1 flavoproteína que contiene FMN y 6 Fe-S

Amital (barbitúrico), rotenona (insecticida) y piericidin A (antibiótico) - inhiben Complejo I

Inhiben transporte de e- de Fe-S a ubiquinona.

Complejo II: Transferencia de e- de Succinato a Ubiquinona

Dehidrogenasa de succinato – única enzima del Ciclo de Krebs integrada en la membrana. 2 grupos prostéticos y 4 proteínas diferentes e- pasan de succinato a FAD, a centros Fe-S, a ubiquinona

Complejo II - Succinato a Ubiquinona Otras formas de reducir CoQ pero no por Complejos I y II: β-oxidación - dehidrogenasa de acyl CoA glicerol - dehidrogenasa de glicerol 3P

Complejo III: Ubiquinona a citocromo c (complejo citocromo bc1)

La CoQ transfiere e- a citocromos (hierro en grupo heme). Citocromos aceptan e- en forma Fe3+ y se transforman a Fe2+.

Citocromo c ha variado muy poco en evolución.

Complejo III: Transferencia de e- de Ubiquinona a Citocromo c

CoQ reducida transfiere e- a Cytocromo c.Transporte de H+ acoplado a transferencia de e-. CoQ dona 2e-, citocromos aceptan sólo 1e-. Resultado: CoQ se oxida, 2 citocromos c se reducen. Citocromo c es soluble y se mueve al Complejo IV para donar e-.

Transferencia de electrones en el Complejo III

2 moléculas de QH2 se oxidan, 4 H+ salen al exterior, cada QH2 dona 1e- via Fe-S a citocromo c1 y otro e- (via cit.b) a Q, reduciendo a QH2. Esta reducción utiliza 2 H+ de la matriz.

Complejo IV: Citocromo c a O2 (citocromo oxidasa), reduce O2 a H2O. Complejo de 13 subunidades, acopla transferencia de e- a transporte de H+

La reducción de O2 envuelve pasos intermedios que generan radicales de O2. Se mantienen unidos al complejo para evitar que reaccionen con componentes celulares. Citocromo a3 diferente - contiene Cu2+.

Complejo IV: Transferencia de e- de Citocromo c a O2

Por cada 4e-, el complejo consume 4H+ de la matriz para convertir O2 en 2H2O. Por cada e- se transporta 1 H+ al exterior. Subunidad I – 2 heme, a y a3, CuB Subunidad II – 2 Cu2+ en complejo con SH de cisteína (CuA)

Potencial de Reducción (E’o) - mide afinidad por electrones.

Fuerza electromotriz (energía liberada) al moverse de estado oxidado a reducido.

Negativo tiene menos afinidad por electrones.

Positivo tiene más afinidad por electrones.

Rxns. con ∆E’o positivo - exergónicas. Transportadores de electrones funcionan en orden de incremento en potencial de reducción. Electrones tienden a moverse espontáneamente de portadores con -E’o a portadores con +E’o.

Transporte de electrones - libera energía

∆G’o = -nF∆E’o

Transferencia de 2e- de NADH a O2:

NADH + H+ + ½ O2 → NAD+ + H2O

Reaccion exergónica. Si calculamos ∆G’o vemos que:

n= 2e- F=constante ∆E’o = cambio en afinidad de e- de par Redox

Para NAD+/NADH = -.32 Para O2/H20 = 0.816 ∆E’o = E aceptador - E donante = .816-(-.32) = 1.14 Calculamos ∆G’o = -220 kJ/mol NADH En cels. [NAD] y [NADH] no 1M, rxn. es más negativa (exergónica).

Esta energía liberada se acopla a la salida de H+ al exterior (endergónica).

Por cada 2e- transferidos a O2, 4H+ salen por medio de Complejo I, 4H+ por medio de Complejo III y 2 H+ por Complejo IV.

La energía electroquímica en esta diferencia de [H+] y separación de cargas representa una conservación de la mayoría de la energía liberada en la transferencia de electrones.

La energía almacenada en este gradiente - proton motive force (fuerza protón-motriz)

PMF - 2 componentes

1) H+ afuera alto/ adentro es bajo ya que membrana es impermeable

2) cargas positivas afuera/negativas adentro

Por cada H+ que sale afuera ∆G = 20kJ/mol

Si por cada 2e- transportados de NADH a O2, salen 10 protones:

∆G total = 200kJ/mol

Si el transporte de 2e- tiene ∆G = -220 kJ/mol,

es termodinámicamente posible el transporte de 10 protones.

Cuando los protones fluyen espontáneamente a favor del gradiente (de afuera hacia adentro) para nivelar las conc., la energía liberada se utiliza para sintetizar ATP.

Modelo Quemiosmótico de Mitchell

Energía liberada por el transporte de e- se acopla al transporte de H+

al espacio intermembranal formando un gradiente. La diferencia en cargas y pH se transforma en energía (PMF) que produce ATP cuando los H+ entran nuevamente a la matriz de forma pasiva y espontánea.

Expts. que confirman Modelo Quemiosmotico

1) Requiere membrana intacta – sintesis de ATP

2) Memb. Impermeable a iones (H+, OH-, K+, Cl-)

3) Mitocondrios activos aumentan [H+] exterior

4) Inhibidores de transporte de e- (cianuro, CO) inhiben síntesis de ATP

5) Inhibidores de síntesis de ATP inhiben transporte de e-.

6) Ionóforos – evitan fosforilación oxidativa, transportan iones a través de la membrana y no permiten diferencia en cargas eléctricas en la membrana (Valinomicina)

7) Desacopladores – aumentan permeabilidad de membrana, liberan H+ y eliminan diferencia en H+ (DNP).

ATP Sintetasa o F1ATPasa (Complejo V) Complejo multienzimático – formacion de ATP, acoplado a transporte de H+ a través de membrana 2 componentes: F1 – periferal, esencial para fosforilación Fo – integral, sensitivo a oligomicina, poro de [H+] hacia el interior F1 o Fo – no síntesis de ATP, necesita ambos complejos, ambos acoplan transferencia de e- y H+ a síntesis de ATP. F1 – hidrólisis de ATP

Mitochondrial ATP Synthase Complex

ADP + Pi ATP+H2O→ Rx. Reversible en superficie de enzima (no convencional). ATP se une más fuerte que los reactantes. ATP se estabiliza y Rx. Procede aunque es un proceso endergónico. La estabilización de ATP libera energía para nivelar costo de síntesis de ATP. La energía almacenada en PMF libera ATP de la superficie de la enzima.

Binding-change Model for ATP Synthase

Modelo de Mitchell: Por 2e- desde NADH, 10H+ son expulsados Por 2e- de succinato, 6H+ son expulsados 4H+ son requeridos/ 1ATP (1 de éstos es usado en transporte de Pi, ADP y ATP) Entonces: Desde NADH →P/2e- ratio 10/4 = 2.5 ATP Desde succinato→ P/2e- ratio 6/4 = 1.5 ATP

Cuántos ATP por O2 reducido? P/O o P/2e- ratio Expt. – Mitocondrios en presencia de NADH y O2 o succinato y O2 → se oxida el NADH, se sintetiza ATP y se reduce O2. P/O ratio -> 2-3 ATP – NADH P/O ratio -> 1-2 ATP – succinato

Lo superamos!

Proteínas Transportadoras – Membrana Interna Mitocondrio

1) Translocasa de nucleótido de Adenina – ADP al matrix y ATP hacia afuera

2) Translocasa de fosfato –

“symport” de Pi y H+

hacia adentro. Consume energía ya que

consume H+ que pudo haberse utilizado para síntesis de ATP

Malato - Aspartato

NADH transfiere e- a Oxaloacetato→Malato, entra y transfiere e- a NAD+ y NADH entonces entra a cadena de transporte. Oxaloacetato en citoplasma se regenera por transaminación: Aspartato + ketoglutarato oxaloacetato + glutamato

Regulación Fosforilación Oxidativa

Produce mayoría de ATP en células aeróbicas

Regulación coordinada en otros procesos:

[ATP] bajas – aumenta actividad de glucólisis, oxidación de piruvato, ciclo de Krebs, cadena de transporte.

[ADP] bajas – disminuye glucólisis (ATP inhibe PFK1), oxidación de piruvato, ciclo de Krebs, cadena de transporte.

Citrato – activo ciclo de Krebs, inhibe PFK1 cuando sale al citoplasma

Regulación Coordinada