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Fraia MelchiondaFraia Melchionda
Terapia Cellulare Non TrapiantologicaTerapia Cellulare Non Trapiantologica
In Ematologia ed OncologiaIn Ematologia ed Oncologia
Terapia Cellulare:
Trattamento che prevede la ricostituzione, l’aumento di numero o di efficacia di una funzione biologica ottenuto mediante l’impiego di popolazioni cellulari.
Possibile Definizione
Terapia Cellulare
Trapianto di Celulle Staminali Ematopoietiche Allogeniche
• Donor Lymphocites Infusion
• ,, ,, Allo-EBV-CTL nel trattamento delle Post Tramplant Lymphoprolipherative Disorders (PTLD) in pz sottoposti a BMT; AutoEBV-CTL nelle PTLD post SOT
• Utilizzo di CTLp anti-leucemia (LAM)
Terapia Cellulare anti-infettiva CTL anti CMV, BK e Aspergillo
APC artificiali (CD3+/CD28+ beads) nel contesto di Auto-TMO (NHL, CML, MM)
Terapia Cellulare Correlata a Procedura Trapiantologica
Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF- -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Terapia Cellulare non Trapiantologica
La storia dell’immunoterapia
M. Burnet e L. Thomas nel 1957 proposero il concetto di “Cancer Immunesurveilance”
Le prime prove di tale ipotesi furono testate mediante l’utilizzo di ceppi murini per K.O. per alcuni geni dimostratisi essenziali per lo sviluppo di alcuni componenti fondamentali del sistema immunitario:
Es.: RAG2-/- pertanto incapaci di formare T Ly, B ly, NKT; perforina-/-; IFN gamma-/- ecc.
Questi animali sviluppano, con diverse caratteristiche, tumori spontanei o elevata percentuale dopo stimolazione con sostanze chimiche
Tumor Immunology: Cancer ImmunoeditingDunn & Schreiber Nature Immunology 2002 (3)11; 991-998
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Immunosorveglianza
Immunosorveglianza
Possibili Meccanismi di Tumor-Escape
Fattori del compartimento linfocitario:•Scarso numero T cell help•Insufficiente numero CTL anti-tumorali• ,, avidita’ dei CTL per il tumore•Tolleranza immunologica•Down-regulation di TCR signaling•Apoptosi CTL•Inadeguata funzione T cell (citochine, lisi)•Aumento di T cellule a carattere soppressivo (T reg, CD4+CD25+)•Produzione di citochine immunosoppressive (IL-10)
Fattori Tumorali•Insufficiente/assente espressione dell’antigene•Perdita di espressione MHC•Assenza di molecole co-stimolatorie•Produzione di citochine immunosoppressive (VEGF, IL-10,TGFb)
CellulaTumorale
Ag TCRSIGNAL # 1
SIGNAL # 2
T- Cell
ATTIVAZIONE/ATTIVAZIONE/INSUFFICIENTE INSUFFICIENTE ESPANSIONESPANSIONEESpeiser D.E. et Al.J.Exp.Med. 1997; 186, 645-653
APC
Cross priming
Ag
Ag Ag
TOLLERANZATOLLERANZA -- delezione clonale - anergia clonaleJenkins MK. JExpMed 1987;165 302Pardoll D. Nature, 2001; 411, 1010
IMPLICAZIONI IMPLICAZIONI TERAPEUTICHETERAPEUTICHE
Terapie immunologicheOttimizzare presentazione dell’Ag (DCs, vaccini) Amplificazione della risposta T cellulo mediataTerapia anti-soppressiva
Ripopolazione con T cell Adottiva
Ottimizzare presentazione dell’AgStrategia DC based, peptide based, APC artificiali, ecc.
NEGLETTANEGLETTAOchsenbein A.F et Al Nature, 2001, 411: 1058
Possibili Effetti Indotti dalla Crescita Tumorale sul Compartimento T Cellulare
STIMOLAZIONESTIMOLAZIONE
Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF- -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Terapia Cellulare non Trapiantologica
• CTL: T Linfociti che esercitano la loro attività citotossica mediante riconoscimento di cellule target (antigenicamente differenti) nel contesto del MHC classe I e II.
• TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes): popolazione eterogenea di linfociti (prevalentemente CD8+CD4+NK) localizzati nel contesto tumorale (es. melanoma, ca.ovarico) o linfonodi drenanti il tumore, aventi azione citotossica per lo più LAK-type, spesso non MHC-mediata).
• LAK (Lymphokine-Activated Killer): cellule con un’azione citotossica su target cellulari NK-resistenti (es. Daudi cell) questa è implementata da IL-2.
• Cellule NK: hanno una spontanea attività citotossica nei confronti di cellule target (es. cellula tumorale) con una modalità non-MHC ristretta.
Cellule Effettrici ad Azione Citotossica
Impianto K7M2 Amputazione Monitoraggio Recidiva
Monitoraggio volume Tum.
Volume: 0.8-1 cm3
MRD
Immunosorveglianza: Modello Murino
Osteosarcoma nell’Ospite SCID:
Invariata la crescita tumorale primaria significativo incremento di recidive/metastasi
0 25 50 75 100 125 1500
20
40
60
80
100
p=0.008
Days after tumor implant
Balb/c
SCID
Primary Tumor Growth
0 10 20 30 40 50 60 700.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Days After Implant
Balb/c
SCID
Amputation size
Death from Recurrent Disease
K7M2 Impianto
K7M2 Osteosarcoma MRD
SCIDMonitoraggia volume
Amputazione MonitoraggioDi Recidiva
LN lateImmuno-ricostituzioneCD4+ e CD8+ 25x 106 cells = 10 % T cell repertoire
MRD
LN early Immuno-ricostituzioneCD4+ e CD8+ 25x 106 cells = 10 % T cell repertoire
Tumor Burden
Ruolo dell’Immuno-ricostituzione nella Prevenzione di Metastasi
Primary Tumor Growth
0 10 20 30 40 50 60 70
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00scid
LN e
Days After Implant
arly
Death From Recurrent Disease
0 50 100 150 2000
20
40
60
80
100 scid
LN early
LN late
Days After Implant
p= 0.002 vs. SCID
p= 0.005 vs. SCID
Esposizione di cellule T alla Crescita Tumorale Primaria Esposizione di cellule T alla Crescita Tumorale Primaria Non Enficia la Capacita’ di Controllo di RecidivaNon Enficia la Capacita’ di Controllo di Recidiva
T Cell Immuno-Ricostituzione Puo’ Prevenire Recidiva Tumorale
Produzione di IFNdopo stimolazione in vitro con
cellule K7M2
Naive T. Bearing0
20
40
60
80
100
120
140
160 p= 0.0092
Evidenza di Priming Immunologico in Animali con Progressiva Crescita di Osteosarcoma
Tum. Bear.+ DCs
Tum. Bear.+Lisato tum.- DC
Naive+Tum. Lysate DC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
p= 0.03
Produzione di IFNdopo stimolazione in vitro con
DC pulsate Lisato Tumorale
Terapia Cellulare non Trapiantologica
PNAS 2004
Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF- -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Ottimizzazione di Strategie Vaccinali Mediante l’Utilizzo di DC
Copyright 2000-2003Cell Systems Initiative, University of Washington
Cellule Dendritiche (DC): biologia
Le Sentinelle del Sistema Immunitario
M. Jefford et al. Lancet 2003
Cellule Dendritiche: biologia …
endocitosi
MHC-II
Endosoma/lisosomi
TAP
MHC-I
Golgi
Proteosoma
peptidicitosol
PatogenoCross-presentation
MHC-IIpeptide
CD4
MHC-Ipeptide
CD8
La Processazione dell’Antigene
DC
Uptake antigene Endocitosi
Migrazione vs linf. Presentazione del Ag
Stimolazione cell T Sviluppo cellule CD4+ CD8 T antigene specifiche (CTL)
Processazione antigene via MHC class I/II
Immature vs Mature DCsImportanza della maturazione, effetti sulla risposta immunitaria
Costimolazionehigh CD40, CD54, Class II
Bacterial productsCytokines
T cells
DC Immature DC Mature
Danger signals
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Possibili Fonti di Antigeni Tumorali nella strategia Vaccinale DC-based
Peptidi sinteticiPeptidi sintetici(modificati)
PeptidiPeptidi
cRNAcRNA
cDNAcDNA
Estratti proteiciEstratti proteici
Corpi Corpi apoptoticiapoptotici
DCs
DCs
DCs
DCs
Tumor cells
rProteinerProteine mRNAmRNA
Cellule di Cellule di fusionefusione
•Tumore specifici
•bcr/abl protein (CML, ALL)
•Idiotipo immunoglobuline (NHL, MM)
•Pml/Rar alfa protein (APL)
•Shared Tumor-specific Ag (cancer testis Ag, o Melanoma associate)
•MAGE
•BAGE
•GAGE
•Antigeni di differenziazione (espressi anche dai normali tessuti)
•Melan A
•Mart-1
•Proteinase-3
•WT-1
•Oncogene/tumor suppression Ag
•P53
•Ras mutated protein
•Virus Associated Ag
•EBV
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Classificazione degli Antigeni Tumorali
L’attivita’ di Antigen discovery nei tumori dell’adulto implicazioni nei tumori pediatrici
NBL GAGE-1 (80%) MAGE-1 (50-80%)EWS GAGE-1 XAGE-1,2RMS XAGE-1,2Sarcomas GAGE-2 (25%)
NY-ESO-1(80%)MAGE
Glioblastoma GAGE-3,6 (70%) MAGE-1
Her-2gp100
Medulloblastoma GAGE-3,6 (45%)Head & Neck PRAMEALL t(8;21) PRAME
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Quando? MRD/low tumor burdenImmmuno RiconstituzionePost alte dosi CT
Utilizzo di adiuvanti?
Selezione?
Quanto?
Terapia Cellulare: Strategia Vaccinale
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Fonti alternative di APC• CD40 Activated B cell (CD40-B cell): Linfociti B attivati ex-vivo
mediante stimolazione con CD40. Tale trattamento media la up-regolazione di molecole co-stimolatorie ed incremento della presentazione dell’Ag. Conferendo alla cellula caratteristiche che assomigliano a quelle tipiche della DC. ( espressione Rec. Chemochine, produzione di citochine, ecc.) Possono essere facilmente ottenute ed espanse in vitro, pertanto rappresentano una potenziale alternativa fonte di APC autologhe.
• APC artificiali: CD3/CD28 stimolazione mediante anticorpi coniugati con microbiglie. Mediano l’attivazione e l’espansione policlonale di popolazioni T cellulari (NHL, CML)
Von Bergwelt et al. Cancer Res 2004; Lapointe R. Cancer Res 2004
• Expression of MHC class I, MHC class II and cancer germline antigens in neuroblastoma (Wolfl et al Cancer Immunol Immunother 2004)
• Neuroblastona and DC function (Redlinger RE et al Semin Pedatr Surg 2004)• Results of phase 1 study utilizing monocyte-derived Dendritic cells pulsed with
tumor RNA in children and young adults with brain tumor (DA Caruso et al. Neuro-Oncol 2004)
• Restored immune response to an MHC-II restricted antigen in tumor bearing hosts after elimination of regulatory T cell. (Nicholl et al. J ped. Surg 2004)
• Characterization of CD34+progenitor-derived DC pulsed with tumor cell lysate for a vaccination strategy in children with malignant solid tumor and a poor prognosis (Ackermann et al Klin Pediatr 2004)
• Functional and molecular characterization of interleukin-2 transgenic Ewing tumor cell for in vivo immunotherapy (Burdach et al Ped Blood Cancer 2004)
• Pilot trial of tumor specific peptide vaccination and continous infusion of IL2 in patients with recurrent Ewing sarcoma and Alveolar Rhabdomiosarcoma (Dagher R Med. Ped. Oncol. 2002)
Terapia cellulare non Trapiantologica
Studi in ambito pediatrico
Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF- -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Terapia Cellulare non Trapiantologica
IL-15IL-15TherapyTherapy
Proliferation of activated T cellDifferentiation of CTL
Synergize for production of other cytokines (e.g. IFN, TNF)
Expand NK cells (low dose)
IL-2IL-2TherapyTherapy
Substitute IL15 in NK cell differentiation(via IL2/15Rc)
Innate ImmunityInnate Immunity
NKNKNK NK
NK
Activate NK cell (high dose)
NK
Lysis
NK effector function
Tumor
Innate ImmunityInnate Immunity
Activation-Induced Cell Death
(AICD)
NKpre NK cell
Innate ImmunityInnate Immunity
CD56- CD56+
Type 1 CytokinesType 1 Cytokines
Effetti IL-2 mediati Potenzialmente UtiliNel contesto di Immunoterapia
T Cell trophic factorT Cell trophic factor
IL-7 IL-7 TherapyTherapy
Induce Other Cytokines(e.g. IL-2, IFN)
Expand High affinity CD8+ clonesExpand High Affinity CD4+ clones
Recruit Low Affinity clones
TGF production
Induce Lak cells
GM-CSF + IL7Generate Monocytes
derived DCs
Partially substituteIL-15 in the generation of memory CD8+ pool
?
Tumor cell
TGF production
Tumor Induced Suppression
Expansion of existing or vaccine-induced Immune response
Broaden Immune response
Memory T cell
DCsmono
Ag Presenatation
Induce Type 1 cytokines
Lytic Activity (CTLs, NK)
Up-regulation bcl-2family molecules
Programmed Cell death
Effetti IL-7 mediati Potenzialmente UtiliNel contesto di Immunoterapia
IL-15IL-15TherapyTherapy
ExpandHigh AffinityCD8+ clones
Recruit Low Affinity CD8+ clones
Critical in the generation andMaintenance
of Memory CD8+ pool
No effect on naïve CD4+ T cell(low expression IL2/15R)
Expansion of existing or vaccine-induced Immune response
BroadenImmune response
Increase Memory CD8+ T cell
MaintenanceExpansion
of NK cells IL-15IL-15TherapyTherapy
Innate Immunity
NKNKNK NK
NK
NK cellDifferentiation
NKpre NK cell
Innate Immunity
CD56- CD56+
Synergize for production of other cytokikens (e.g. IFN, TNF)
Type 1 Cytokines
Effetti IL-15 mediati Potenzialmente UtiliNel contesto di Immunoterapia
Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)
Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per
incrementare la loro avidità
Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione
(es:. -TGF- -IL-10, T Reg /CD4+25+)
Terapia Genica
Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata
Terapia Cellulare non Trapiantologica
Terapia Genica:
Trattamento che si propone di correggere il/i difetti molecolari causa di una determinata patologia mediante introduzione nelle cellule somatiche del gene mancante o difettivo.
Possibile Definizione
Terapia Genica e Vaccinoterapia
Inserzione di geni in grado di ottimizzare la risposta immunitaria nel contesto di vaccini antitumoralies:
Gene hIL-2 in TIL (vettori retrovirali)
TCR antigene specifico (es. Anti-gp100)
Gene per hIL-12 in DC
Gene per GM-CSF in cellule tumorali
Molecole co-stimolatorie (es. CD80) in cellule tumorali
Vaccinoterapia
Antigene specifici
GM-CSF
APCartificiali
Proteine
AdoptiveT cell
Terapia genica
Citochine
DCs