FRAZIONAMENTOeCENTRIFUGAZIONE

FrazionamentocellulareetissutaleLecellulepossonoessereseparateerotteinvariomodo:Enzimaticamente(collagenasi,ialuronidasi,papaina,elastasi,cellulasi,lisozima)OmogenizzazionemeccanicaUltrasuonishockosmoticousodidetergenti(digitonina,igepal,sodiodesossicolato,sds)Questiprocedimentiromponomoltemembranemalascianointattigliorganulichepossonoessereseparatisullabasedellelorodimensioniedensità.

macinatoremortaio

Potter FrenchPress Sonicatori

sonicazionehttps://youtu.be/ykvS2gldQnw

Omogenizzazionehttps://youtu.be/olwyI7_EFNE

Lacentrifugazione

E’ una delle principali metodologie separative utilizzate dell’indaginebiochimica insieme alla dialisi, alla filtrazione, alla cromatografia o allaelettroforesi

Permettelaseparazionemeccanicainunmezzoliquidodimaterialisolididalliquidoedimaterialisoliditralorosottoponendoliadunaforzacentrifuga.ècelluleèorganulisubcellularièmacromolecole

Applicareuncampogravitazionaleartificialeattraversolarotazioneadaltavelocità(Campocentrifugo)

SCOPO

leparticellepossonoessereseparatepoichésedimentanoconvelocitàdiversaasecondadellediversecaratteristichedimassadensità,dimensioneeforma

PERCHE’??

CAMPOCENTRIFUGOAbbiamo detto che il campo centrifugo (G) è dato da:

Ma è possibile esprimerla giri·min-1 o (RPM) dove una rivoluzione del rotore è equivalente a 2π radianti:

…e il campo centrifugo viene quindi definito come:

rRPMG ⋅⋅

=3600

)(4 22π

G =ω 2r

602 RPM⋅

=πω

……….inoltre

velocitàangolareωèespressainradsec-1

E’possibileesprimereinterminidiω=velocitàangolare ingiri·min-1o(RPM) dove una rivoluzione completa del rotore è equivalente a 2πradianti:

Oppure

ω =2π60

RPM

come forza centrifuga relativo (RCF) come multiplo della costantegravitazionale(g=980cm·s-2):

Chediventa:

RCF = FcFg

=mω 2rmg

=4π 2 ⋅ (RPM )2

3600×980⋅R

RCF =1.11×10−5 ⋅ (RPM )2 ⋅R

Comepossoesprimerel’intensitàdell’azionedellacentrifuga?

600rpmoppure9000rpm

Mainquestocasolerotazioniperminutodipendonodalladistanzadall’assedirotazionecioèdaR

600xgo9000xg

Nomogramma

Per descrivere le modalità di centrifugazione in maniera completa bisogna indicare:

o la R.C.F (come multiplo dellaforza di gravità, cioè di g)

o la velocità di rotazione (rpm) + il raggio del sistema (r=dipende dal rotore usato)

M.N. Gadaleta

N.B. rpm = revolution per minute=giri al min.

Il nomogramma serve per convertire i g in rpm quando è noto il rotore che si deve adoperare e quindi si conosce r

Perdescriverelemodalitadicentrifugazioneinmanieracompletabisognaindicare:1)  olaR.C.F(comemultiplodellaforza

digravità,cioedig):13000xg2)  olavelocitàdirotazione(rpm)+il

raggiodelsistema(r=dipendedalrotoreusato):6000rpm;rotoreA6.24

Ilnomogrammaserveperconvertireircfinrpmeviceversa

nomogramma

FG=forzacentrifuga=mpω2R ω2R=accelerazioneangolare m=ρV ρ=m(kg)/V(m3) V=4/3πrp3FG=4/3πrp3ρpω2Rdoveρpèladensitàdellaparticella(kg.m-3)

FB=forzadovutaalprincipiodiArchimede(spintaidrostatica)FB=mmω2r=4/3πrp3ρmω2R

Nelcorsodellasedimentazionelaparticellaèsottopostaadunaforzanettaversol’esternoFG-FB=4/3πrp3ρpω2R-4/3πrp3ρmω2R=4/3πrp3(ρp–ρm)ω2R

Seancheilliquidoopponeresistenza

Edinoltreleparticellementremigranogeneranoattrito,cheassumendosempreunaparticellasfericaechesimuovaconvel.Nota,alloralaforzachesiopponealmotodellaparticellaè:FD=forzadiattrito=6πrpηv leggediStokesη=coeff.diviscosità

v=veldisedimentazione

Unaparticellainunmezzoadensitàcostante,saràacceleratainuncampocentrifugofinoaquando:4/3πrp3(ρp–ρm)ω2R=6πrpηv Poisedimenteràavelocitàcostante

Velocitàdisedimentazione

ra mp 22 )(

92

ωη

ρρν ⋅

−⋅⋅=

DensitàdellaparticellaDensitàdelmezzo

ViscositàdelmezzoCostanteperunasfera

Campogravitazionale

RaggiodellaparticellaVelocitàdisedimentazionedellaparticella

Possoutilizzarelasedimentazionechesiottienedopouncertotempo

ω2R

Campo centrifugo applicato

r2

1.Permolecoleconugualedimensioneeforma,quellaconmassamaggioreavràsmaggiore:sedimenteràperprima

2.Laformainfluiscesullasedimentazione.Ilcoeff.diattrito(f)èminorequantopiùsfericaèlaparticella.Particelledimassauguale,maformadiversa,sedimenterannoinmododiverso

3.Maggioreèladensitàdellaparticella,minoreèilrapportoconladensitàdelmezzo,piùgrandesaràilvaloredis,piùvelocesaràlasedimentazione

4.Ladensitàdelmezzoinfluenzalavelocitàdisedimentazione:Seρm=ρpallorav=0Seρm>ρpalloralaparticellagalleggeràsulmezzoSeρm<ρpalloralaparticellaprecipiteràsulfondo

v=-------------m(1-ρm/ρp) ω2R

f

S

seesprimoilvolumeV=m/ρm/ρp(ρp–ρm)ω2R=6πrpηv sepongo6πrpη=fm(1-ρm/ρp)ω2R=fvricavo

Tempo di sedimentazione

Il tempo di sedimentazione si ottiene attraverso l’integrazione della legge di Stokes tra due raggi:

– rt= raggio di rotazione alla superficie e– rb = raggio di rotazione al fondo

t

b

mp rr

at ln

)(29

22 ⋅−⋅⋅

⋅=ρρω

ηrb

rt

Posso utilizzare il tempo necessario per la loro completa sedimentazione

Lavelocita’disedimentazionepuo’ancheessereespressainterminidivelocita’disedimentazioneperunita’dicampocentrifugoapplicato,comunementedetta“coefficientedisedimentazione”(s).Seilmezzohaunacomposizionedefinita,lavelocita’disedimentazionee’proporzionaleaω2r,quindil’equazionesisemplificain:

ν=sω2r

s=ν/ω2r (coeff.disedimentazione)

CENTRIFUGAZIONE NELLA SEPARAZIONE DI PROTEINE

enzimi,ormonipeptidici,proteinesolubili 2-25sAcidinucleici 3-100sRibosomiepolisomi 20-200sVirus 40-4,0x103sLisosomi,perossisomi 4,0x103sMembrane 100-1,0x105sMitocondri 2,0x104s-7,0x104sNuclei 4,0x106s-4,0x107sIlcoefficientedisedimentazionedipendedallatemperatura,dalladensitaedallaviscositadellasoluzione,glistudipossonoessereeffettuatiindiversisistemisoluto-solvente,ilvaloreottenutovienespessocorrettonelvalorechesiotterrebbeinunmezzolacuiviscosita’edensita’fosseropariaquelledell’acquaa20oCcoefficientedisedimentazionestandardoS20,w.S=Svedberg=10-13sec.

Letecnichecentrifugativesipossonosuddividereingeneralein:

preparativeeanaliticheLacentrifugazionepreparativaseparazionedicomponenticellulariemacromolecoleabassaealtavelocità(dabancoodaterra)Lacentrifugazioneanaliticaaltavelocitàevolumiinferioridimaterialedaanalizzare;metodoperlacaratterizzazionedisoluzionidimacromolecoleedèunostrumentoindispensabileperl'analisiquantitativadelleinterazionimacromolecolari;necessitàdistrumentispecificiconsistemiotticiincorporati

Puòessereseparatasecondoduecriteri:-  PerVELOCITAdiSEDIMENTAZIONEdettaanchecentrifugazionezonale

Vantaggi:

bassavelocitàetempibreviLimitazioni:

separazioneincompleta

-  PerEQUILIBRIOdiSEDIMENTAZIONEdettaanchecentrifugazioneisopicnicaoadensità

Vantaggi:

buonaseparazionedellafrazionediinteresseLimitazioni:

altavelocità,necessariastrumentazionespecificaecostosa

-Lostudiodellamorfologia,composizioneeattivitadeicomponenti-Laseparazionedisostanzeconcaratteristicalocalizzazionesubcellulare(DNA,Enzimi,CoEnzimiecc)-L’integrazionedelleattivitadicomponentisubcellulariisolati

Perchéseparare….

-Lasceltadelmaterialedipartenza(estessuto,celluleetc)-L’omogenizzazione(sesipartedatessuti)-L’usodiopportunitamponi,peres.isotoniciconl’ambientecellulareincuilastrutturasubcellularesitrova(es.unasoluzionesalina;unasoluzione0,25Mdisaccarosioperl’integritadeimitocondri)

moltoimportante…

TipidicentrifugazionePreparativa: -Differenziale -Sugradientedidensita:zonale isopicnica

Centrifugazionedifferenziale(Pelleting)

Ilmaterialedafrazionarevieneseparatoinuncertonumerodifrazionimediantecentrifugazionisuccessiveincui

aumentadivoltainvoltalaforzacentrifugaapplicata

Sedimentoofondello(opelletoP) Sovranatante(SN)

Lavelocitàsedimentazionedipendedalledimensioniedalladensitàdellaparticella

L’efficienzadisedimentazionedipendedallaforzadigravitàapplicata(RCF)edaltempodicentrifugazione

Ottengo2frazioni

CentrifugazioneDifferenzialeCentrifugazionediunasospensioneomogenea:siseparanounsedimento(P)eunsovranatante(SN)

Tempo di centrifugazione

Cam

po c

entr

ifugo

Solvente

Particelle piccole

Particelle medie

Particelle grandi

Centrifugazione differenziale

Fr

da Kleinsmith Fig 4-29M.N. Gadaleta

Centrifugazioneingradientedidensità:Richiedelapresenzadiunacolonnadiliquidolacuidensitàsiacrescentemanmanochesiraggiungeilfondodellaprovettadacentrifuga

Caratteristicheidealideimaterialipergradienti:•Ampiointervallodidensita•Bassapressioneosmotica•Bassaviscosita•Nessunatossicita•CompatibilitaconmaterialibiologiciIncapacitadipenetrarelemembranebiologiche

p.parenti

CentrifugazioneZONALE

ρp>ρmTecnicadivelocitàDipendentedaltempoDipendentedaS(dimensione,formaedensita)

Cam

po c

entr

ifugo

Gra

dien

te

di d

ensi

tà

Campione

Particelle piccole

Particelle medie

Particelle grandi

A Z

Sfruttaledifferenzedidimensioneeformadelleparticelle

CentrifugazioneISOPICNICA

ρp=ρmTecnicadiequilibrioIndipendentedaltempoDipendentesolodalladensita

Sfruttaladensitadelleparticelle

AvolteilgradientenonèpreformatomasiformapereffettodellaF.C.sullemolecoledelsoluto.Gradienticontinuiediscontinui.

Chapter 4 • Centrifugation Techniques in Biochemistry 109

Centrifugation time

Forc

e fie

ld

Forc

e fie

ld

Forc

e fie

ld

Sample zone

Densitygradient

1. Centrifuge tube filled with density gradient solution

1. Uniform mixture of sample and gradient

2. Under centrifugal force, gradient redistributes and sample particles band at their isopycnic positions

2. Sample applied to top of gradient

3. Under centrifugal force, particles move at different rates depending upon their mass

C

B

A

1 2 3 4

FIGURE 4.12 Acomparison ofdifferential anddensity gradientmeasurements.A Differentialcentrifugation in a medium ofunchanging density.B Zonalcentrifugation in a prepared densitygradient.C Isopycniccentrifugation; thedensity gradientforms duringcentrifugation.

>> (Eq. 4.11)

This equation provides an accurate calculation of molecular weight and is applica-ble to macromolecules such as proteins and nucleic acids. However, its usefulness

MW = RTsD(1 - vr)

D e n s I t à

Organelli

100,000 g

4 ore (all’equili

brio)

Lisosomi (1.13) Mitocondri (1.18)

Perossisomi (1.23)

(g/cm3

)

1.09 1.11 1.15 1.19 1.22 1.25

Densitàdialcunimaterialibiologici

Materiale

Densità(g/cm3)

Cellulemicrobiche 1.05-1.15Celluledimammifero 1.04-1.10Organuli 1.10-1.60Proteine 1.30DNA 1.70RNA 2.00

Troveretediverseindicazionididensitàasecondadelmaterialeutilizzatoperilgradiente

Comeèpossibilevalutareilgradodipurezzadelprecipitatodopocentrifugazionedifferenziale?

Utilizzandodei“marker”subcellulari

Valutazionetramitel’attivitaspecificaAttivitaspecifica(inU/mgproteine)=attivitaenzimatica(inU/ml)/concentrazionetotalediproteine(inmg/ml)Selacentrifugazioneèstataefficacel’attivitaspecificanellafrazionepurificataèmaggioredell’attivitaspecificadipartenza

Marcatori di frazioni subcellulari

Kleinsmith &Kish, tab 4-2M.N. Gadaleta

….attivitàspecifica

p.parenti

Concetto di attività specifica

Valutazionetramitel’attivitaspecificaAttivitaspecifica(inU/mgproteine)=attivitaenzimatica(inU/ml)/concentrazionetotalediproteine(inmg/ml)Selacentrifugazioneèstataefficacel’attivitaspecificanellafrazionepurificataèmaggioredell’attivitaspecificadipartenza

Marcatori di frazioni subcellulari

Kleinsmith &Kish, fig 4-30M.N. Gadaleta

Acknowledgements

We would like to thank Mathieu Poirier for providing the isolated, perfused rat hearts. This studywas supported by funds from the Canadian Institutes of Health Research (MOP-77526) and theNatural Sciences and Engineering Research Council of Canada to R.S., and a Faculty of Medicine andDentistry Graduate Student Recruitment Studentship award to S.B. MethodsX thanks the reviewers ofthis article for taking the time to provide valuable feedback.

References

[1] P. Holden, W.A. Horton, Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines, BMC Res. Notes 2 (2009) 243–253.[2] S. Sikorskaite, M.L. Rajamaki, D. Baniulis, V. Stanys, J.P.T. Valkonen, Protocol: optimised methodology for isolation of nuclei

from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families, Plant Methods 9 (2013) 31–40.[3] I. Schulz, Permeabilizing cells: some methods and applications for the study of intracellular processes, Methods Enzymol.

192 (1990) 280–300.[4] A.V. Le, D. Huang, T. Blick, E.W. Thompson, A. Dobrovic, An optimised direct lysis method for gene expression studies on

low cell numbers, Sci. Rep. 5 (2015) 12859.[5] X. Osteikoetxea, B. Sodar, A. Nemeth, K. Szabo-Taylor, K. Paloczi, K.V. Vukman, V. Tamasi, A. Balogh, A. Kittel, E. Pallinger, E.I.

Buzas, Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations, Organ. Biomol. Chem. 13 (2015) 9775–9782.[6] M. Skrzypiec-Spring, B. Grotthus, A. Szelag, R. Schulz, Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the

new millennium, J. Pharmacol. Toxicol. Methods 55 (2007) 113–126.[7] C. Tristan, N. Shahani, T.W. Sedlak, A. Sawa, The diverse functions of GAPDH: views from different subcellular

compartments, Cell. Signal. 23 (2011) 317–323.[8] A. Raturi, T. Simmen, Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: the mitochondria-associated

membrane (MAM), Biochim. Biophys. Acta 1833 (2013) 213–224.

[(Fig._2)TD$FIG]

Fig. 2. The purity of subcellular fractions from fresh heart tissue isolated from Sprague-Dawley rats (A) or HT1080 humanfibrosarcoma cells (B) were assessed by western blotting against specific markers. The cytosolic, membrane bound organellesand nuclear fractions are denoted by C, M and N, respectively. Cytosolic marker: GAPDH; membrane bound organelles markers:SERCA2, VDAC; nuclear marker: Lamin A/C.

S. Baghirova et al. / MethodsX 2 (2015) 440–445 445

SERCA2:sarco/endoplasmicreticulumCa2+-ATPaseLAMININA/C:nuclearmarkerGAPDH:cytosolicmarkerVDAC:voltage-dependentanionchannel,mitochondrialmarker

TipidiultracentrifugheCentrifugheabassa,media,altaeultravelocitàUltracentrifugazionepreparativa:perseparareparticellepiccole:microsomi,ribosomi,batteri,virus,ac.nucleicieproteine.Ultracentrifugazioneanalitica:utilizzaunsistemaotticochepermettedivisualizzareilprocessodisedimentazionemanmanochesiverifica.E’possibilecaratterizzare:coef.sedimentazione,coef.diffusione,pesomolecolare,densita,misuraconcentrazioneeomogeneitadiunasoluzione.

Krappresental’efficienzadisedimentazionerelativa:

Dipendeda:massimavelocitàangolareω(rad/sec)delrotoreRaggiominimoemassimodelrotorek = ln(rmax / rmin )

ω 21013

3600

k = 2,53⋅105 × ln(rmax / rmin )

(RPM /1000)2 …selavelocitàvieneespressainrpm..

kadj = kmaxvelrotore

velocitàattualerotore⎛

⎝⎜

⎞

⎠⎟2

…senonsiusalamassimavelocitàdelrotore

T=K/STèiltempo(ore)necessariopersedimentareuncampionedicuiènotoilcoefficientedisedimentazione(s)S=coefficientedisedimentazionein(S)

Chapter 4 • Centrifugation Techniques in Biochemistry 101

TABLE 4.1 Types of Centrifuges and Applications

Characteristic

Type of Centrifuge

Low SpeedMicrofuge

(Medium Speed) High Speed Ultracentrifuge

Range of speed (rpm) 1–6000 1000–15,000 1000–25,000 20–150,000

Maximum RCF (g) 6000 12,000 50,000 1,500,000

Refrigeration Some Some Yes Yes

Applications

Pelleting of cells Yes Yes Yes Yes

Pelleting of nuclei Yes Yes Yes Yes

Pelleting of organelles No No Yes Yes

Pelleting of ribosomes No No No Yes

Pelleting of macromolecules No No No Yes

Analytical techniques No No No Yes

FIGURE 4.4 A labtechnician loadssamples into aSorvall RC-6 PlusSuperspeedcentrifuge, a typicalhigh-speedcentrifuge. Imageprovided byThermo FisherScientific Inc., allrights reserved.www.thermofisher.com.

called pelleting.) The upper liquid portion, the supernatant, is then separatedby decantation.

High-Speed Centrifuges

For more sophisticated biochemical applications, higher speeds and temperaturecontrol of the rotor chamber are essential. A typical high-speed centrifuge isshown in Figure 4.4. The operator of this instrument can carefully control speedand temperature, which is especially important for carrying out reproducible

102 Chapter 4 • Centrifugation Techniques in Biochemistry

FIGURE 4.5Rotors for a high-speed centrifuge. A Fixed-angle;B Swinging-bucket;C Vertical.Courtesy ofBeckman Coulter.

Centrifugal force

A

B

C D

FIGURE 4.6Operation of afixed-angle rotor. A Loading ofsample. B Sampleat start ofcentrifugation.C Bands form asmolecules sediment.D Rotor at restshowing separationof two components.

centrifugations of temperature-sensitive biological samples. Rotor chambers inmost instruments are maintained at or near

Three types of rotors are available for high-speed centrifugation: the fixed-angle, the swinging-bucket, and the vertical rotor (Figure 4.5A–C). Fixed-anglerotors are especially useful for differential pelleting of particles (Figure 4.6A). Inswinging-bucket rotors (Figure 4.5B), the sample tubes move to a position per-pendicular to the axis of rotation during centrifugation, as shown in Figure 4.7.These are used most often for density gradient centrifugation (see below). In thevertical rotor (Figure 4.5C), the sample tubes remain in an upright position(Figure 4.8). These rotors are used often for gradient centrifugation. Prior to the

4°C.

Chapter 4 • Centrifugation Techniques in Biochemistry 103

B

A

C D

Centrifugal force

FIGURE 4.7Operation of aswinging-bucketrotor. A Loading ofsample. B Sampleat start ofcentrifugation.C Sample duringcentrifugationseparates into twocomponents. DRotor at rest.

Centrifugal force

A

B

C D E F

FIGURE 4.8Operation of avertical rotor. A Loading ofsample.B Beginning ofcentrifugation.C, D Duringcentrifugation.EDecelerationof sample. F Rotorat rest.

102 Chapter 4 • Centrifugation Techniques in Biochemistry

FIGURE 4.5Rotors for a high-speed centrifuge. A Fixed-angle;B Swinging-bucket;C Vertical.Courtesy ofBeckman Coulter.

Centrifugal force

A

B

C D

FIGURE 4.6Operation of afixed-angle rotor. A Loading ofsample. B Sampleat start ofcentrifugation.C Bands form asmolecules sediment.D Rotor at restshowing separationof two components.

centrifugations of temperature-sensitive biological samples. Rotor chambers inmost instruments are maintained at or near

Three types of rotors are available for high-speed centrifugation: the fixed-angle, the swinging-bucket, and the vertical rotor (Figure 4.5A–C). Fixed-anglerotors are especially useful for differential pelleting of particles (Figure 4.6A). Inswinging-bucket rotors (Figure 4.5B), the sample tubes move to a position per-pendicular to the axis of rotation during centrifugation, as shown in Figure 4.7.These are used most often for density gradient centrifugation (see below). In thevertical rotor (Figure 4.5C), the sample tubes remain in an upright position(Figure 4.8). These rotors are used often for gradient centrifugation. Prior to the

4°C.

Chapter 4 • Centrifugation Techniques in Biochemistry 103

B

A

C D

Centrifugal force

FIGURE 4.7Operation of aswinging-bucketrotor. A Loading ofsample. B Sampleat start ofcentrifugation.C Sample duringcentrifugationseparates into twocomponents. DRotor at rest.

Centrifugal force

A

B

C D E F

FIGURE 4.8Operation of avertical rotor. A Loading ofsample.B Beginning ofcentrifugation.C, D Duringcentrifugation.EDecelerationof sample. F Rotorat rest.

§  I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra rmax e rmin

§  Il tempo richiesto per la sedimentazione è minore per rotori ad angolo fisso

§  I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare

§  I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle

§  Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso

§  I rotori a bracci mobili sono da preferire per la centrifugazione su gradiente.

p.parenti

Aspetti pratici

• uso di provette adeguate• bilanciamento delle provette• uso di tappi

Se devo caricare 2 o più campioni?

RIEMPIMENTO DEI ROTORI

Comedevocaricareseho2opiùcampioni??

Se devo caricare 2 o più campioni?

RIEMPIMENTO DEI ROTORI

p.parenti

Strumentazione:tubioprovette