FTH-211 จลชววทยาอาหาร

วธการทดสอบทางอมมโนวทยา(Immunological Methods)

อาจารย ดร. จราพร เจรญพลสาขาวชาเทคนคการแพทย ส านกวชาสหเวชศาสตร

มหาวทยาลยวลยลกษณ1

วตถประสงค

❖นกศกษามความเขาใจเกยวกบปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด

❖นกศกษามความเขาใจในหลกการการทดสอบทางอมมน

❖สามารถน าวธการทดสอบทางอมมนไปประยกตใชในการตรวจวเคราะหทางจลชววทยาอาหารได

2

เนอหา

ความรพนฐานเกยวกบแอนตเจนและแอนตบอด

✓ แอนตเจนและแอนตบอด

หลกการทดสอบทางอมมนแบบตางๆ✓ หลกการทดสอบทอาศยปฏกรยาระหวาง

แอนตเจนแอนตบอด

การประยกตใชการทดสอบทางอมมนในจลชววทยาอาหาร

✓ ปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด

3

❖ จลชพและสารพษจากจลชพ

❖ แบคทเรย เชอรา ไวรส ปรสต

❖ สารเคม

❖ สารกมมนตรงส

สงเปนพษทปนเปอนในอาหาร

5

Staphylococcus aureus

Clostridium perfringens

Clostridium botulinum

Vibrio parahaemolyticus

Bacillus cereus

Shigella

Escherichia coli Salmonella

Vibrio cholerae

จลชพและสารพษจากจลชพ

5

วธการทดสอบทางหองปฏบตการเพอตรวจหาเชอจลชพ

มอะไรบาง ?

❖ การแยกเชอและการเพาะเชอ❖ การตรวจโดยตรงดวยกลองจลทรรศน เชน การยอมส

❖ การตรวจหาเชอดวยวธการทดสอบทางอมมน

❖ การตรวจหากรดนวคลอกของเชอจลชพ

6

วธการทดสอบทางหองปฏบตการเพอตรวจหาเชอจลชพ

7

การตรวจหาเชอดวยวธการทดสอบทางอมมน

เปนการทดสอบทอาศยปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด

สารอนทรยทงหลายรวมทงจลชพและผลผลตของจลชพ เชน สารพษ (toxin) สารเคม หรอยาบางชนดสามารถเปนแอนตเจนได

แอนตเจนคอสารทสามารถชกน าใหรางกายสรางแอนตบอดและลมโฟซยตทจ าเพาะ และท าปฏกรยาไดอยางจ าเพาะกบแอนตบอดและลมโฟซยตนนๆ

8

สารชนดตางๆ ทมคณสมบตเปนแอนตเจน

9

แอนตบอด

โปรตนในพลาสมาทรางกายสรางขนจากพลาสมาเซลล เมอถกกระตนดวยแอนตเจนหรอสงแปลกปลอม

แอนตบอดมความสามารถในการท าปฏกรยาไดอยางจ าเพาะกบแอนตเจนทหลากหลาย ท าหนาทในการก าจดสงแปลกปลอมออกจากรางกาย โดยท างานรวมกบโมเลกลและเซลลตางๆ ในระบบภมคมกน

10

แอนตบอด

11

แอนตบอด

12

ปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอดแอนตเจนสามารถจบไดกบแอนตบอดทจ าเพาะ เรยกปฏกรยานวาปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด (Antigen-Antibody Interaction)

น าไปประยกตใชในการทดลองทเกยวของกบการศกษาเชงปรมาณและคณภาพของแอนตเจนและแอนตบอด เชน วนจฉยโรคตดเชอจลชพ แบคทเรย ไวรส ปรสต เชอรา สารพษจากจลชพ ยา

13

ปฏกรยาระหวาง แอนตเจนและแอนตบอดตองอาศยโครงสรางทเหมาะสมกนในลกษณะ แมกญแจและลกกญแจ (Lock and Key)

Figure from http://www.historyofnimr.org.uk/

ปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด

14

❖ ปฏกรยาระหวาง Ag และ Ab ตองอาศยแรงยดระวางโมเลกลคอ พนธะไฮโดรเจน แรงจากประจไฟฟา แรงวลเดอรวาลส และแรงขบน า

❖ ปจจยทมผลตอการเกดปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด

✓ อณหภม (temperature)✓ ความเปนกรดดาง (pH)✓ ความเขมขนของไอออน (ionic strength)

ปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด

15

16

วธการทดสอบทางอมมนเปนการประยกตใชความรดานวทยาศาสตรในหลายแขนง ทงทางดานเคม ชววทยา ความรทางดานชววทยาระดบโมเลกล พนธวศวกรรม

วธการทดสอบทางอมมนสามารถตรวจหาไดทงแอนตบอดและ แอนตเจนทเปนจลชพและไมใชจลชพ

เปนการตรวจวดในเชงคณภาพ (qualitative assay) หรอเชงปรมาณ (quantitative assay) ขนกบการตรวจวดแตละวธ

วธการทดสอบทางอมมน

16

➢ ปฏกรยาการจบกลม (agglutination)

➢ ปฏกรยาเอนไซมอมมโนแอสเสย (Enzyme immunoassay)

➢ ปฏกรยาเรดโออมมโนแอสเสย (radioimmunoassay)

➢ ปฏกรยาอมมโนโครมาโตกราฟฟ(immunochromatography)

➢ วธการทดสอบแบบรวดเรว (rapid test)

➢ ปฏกรยาอมมนเรองแสง (immunofluorescence assay)

➢ Immunoblot (western blot)

วธการทดสอบทางอมมน

17

❖ เปนปฏกรยาระหวาง แอนตบอดและแอนตเจนทเปนอนภาค เชน เซลลของจลชพ เมดเลอดแดง แอนตบอด จะเปนตวเชอมโยงอนภาคท าใหเกดการเกาะกลม

❖ สามารถอานผลการเกดปฏกรยาไดดวยตาเปลา

❖ มหลกการ 2 แบบคอ❖ การจบกลมโดยตรง (direct agglutination) และ❖ การจบกลมโดยออม (indirect agglutination)

ปฏกรยาการจบกลม (Agglutination)

❖ การอานผลของการตรวจวดเปนแบบเชงคณภาพหรอกงปรมาณ (semi-quantitative)

18

Direct Agglutination

แอนตเจนทเปนอนภาคโดยตรงเชน แบคทเรย เชอรา เมดเลอดแดง

เมดเลอดแดง แบคทเรย

19

Indirect (passive) Agglutination

❖ แอนตเจนทเปนสารละลาย สามารถน ามาใชในปฏกรยาจบกลมได โดยการน ามาเคลอบบนผวของอนภาคเฉอย (inert particle)

❖ อนภาคเฉอย อาจเปนเมดเลอดแดง, polystyrene latex particles, bentonite ซงไมท าปฏกรยากบแอนตเจนแอนตบอด

20

RBC

Ab

Agglutination

Soluble antigen

Latex

Antigen coated latex

Indirect (passive) Agglutination

21

Reverse Passive Agglutination

Bacteria in food Latex particle Agglutination

22

19.2.56www.essum.se/gbs.htm

การทดสอบหาชนดเชอแบคทเรยโดยปฏกรยาการจบกลม

www.medicine.uiowa.edu

23

ขอดท าไดงาย สะดวก

ราคาไมแพง

มความไว (sensitivity) สง

ไมตองใชเครองมอหรออปกรณทางหองปฏบตการ

การทดสอบหาชนดเชอแบคทเรยโดยปฏกรยาการจบกลม

24

การประยกตใชทางจลชววทยาอาหาร

❖ latex agglutination for detection of heat-labile- and shiga-like toxin-producing Escherichia coli in meat

❖A latex agglutination test for the presence of Campylobacter spp in food, environmental and water testing laboratories

Microgen Campylobacter Latex ®

การทดสอบหาชนดเชอแบคทเรยโดยปฏกรยาการจบกลม

25

ปฏกรยาเอนไซมอมมโนแอสเสย(Enzyme immunoassay)

แอนตเจนหรอแอนตบอดสามารถน ามาตดฉลากดวยเอนไซมโดยไมท าใหคณสมบตของสารทงสองเสยไป

ตรวจสอบปฏกรยาโดยการใส substrate ของเอนไซมนน เมอมการยอย substrate จะท าใหมการเปลยนส สามารถมองเหนไดดวยตาเปลา หรอวดความเขมสไดดวยเครอง spectrophotometer

เปนวธทมความไวสงสามารถหาปรมาณสารไดถงระดบนาโนกรม มความจ าเพาะสง ราคาไมแพง เกบไดนาน ปลอดภย

26

Enzyme immunoassay ทนยมมากทสดคอ Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Enzyme และ substrate ทนยมใชไดแก

Enzyme Substrate

Alkaline phosphatase

Horseradish peroxidase

p-nitrophenylphosphate (PNPP )

-o-phenylenediamine in Hydrogen peroxide (H2O2)

3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine(TMB) and hydrogen peroxide

ปฏกรยาเอนไซมอมมโนแอสเสย

27

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)ใหแอนตเจนหรอแอนตบอดเคลอบอยบน solid phase เชน บนผวของหลอดทดลอง, microtiter plate, bead, ซงเปนพลาสตกพวก Polypropylene, polystyrene, polyvinyl, nylon, cellulose, polyacrylamide

เตมสงสงตรวจทตองการตรวจหา (Ag หรอ Ab) ลงไปท าปฏกรยา และลางสวนเกนทไมไดท าปฏกรยาออกไป

เตมแอนตบอดทตดฉลากดวยเอนไซม (conjugate ) ลงไป เมอเตม substrate เอนไซมจะยอย substrate เปลยนเปนสโดยความเขมสขนกบปรมาณแอนตเจนและแอนตบอดทท าปฏกรยากน

28

หลกการของการทดสอบ

1. Indirect method 2. double antibody sandwich method3. competitive binding method4. IgM captured ELISA5. Indirect ELISA (Avidin-biotin system)

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

29

Indirect ELISA

หลกการ

ใหแอนตบอดทตองการตรวจท าปฏกรยากบแอนตเจนททราบชนดแลวซงเคลอบอยบนพนผวของ solid phase แลวใช Anti-human immunoglobulin ทตดฉลากดวยเอนไซมท าปฏกรยาอกขนหนง ปรมาณความเขมสขนกบปรมาณ แอนตบอดทตองการตรวจหา

30

E

E E E

E

E E E

E

E

E E E

Wash Wash

Wash

EAg Ab Enzyme-labeled Ab substrate

Indirect ELISA

31

Double Antibody Sandwich ELISA

หลกการ

เคลอบแอนตบอดบนพนผวของ solid phase แลวท าปฏกรยากบแอนตเจนทตองการตรวจ หลงจากลางแลวใช แอนตบอด ทตดฉลากดวยเอนไซม (แอนตบอดนจ าเพาะกบแอนตเจนทตองการตรวจเชนกน) ลางและเตมsubstrate แลววดปรมาณความเขมสทเกดขน

32

E

EEE

E

E

EEE

E

E

EEE

E

Wash Wash

Wash

Double Antibody Sandwich ELISA

33

Competitive Binding ELISA

หลกการ

ถาตองการหาแอนตเจนเคลอบแอนตบอดบนพนผวของ solid phase แลวท าปฏกรยากบแอนตเจนทตองการตรวจและแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซม ลางและเตม substrate แลววดปรมาณความเขมสทเกดขน

*** (ถาตองการหาแอนตบอดกเคลอบ solid phase ดวยแอนตเจน)

34

เคลอบ Ab บนเพลท

Enzyme labeled Ag + Ag ทตองการตรวจ Enzyme-labeled Ag

เตม substrate

ลาง

ลาง

Competitive Binding ELISA

35

• การตรวจหาปรมาณยาทปนเปอน

การประยกตใช ELISA

• การตรวจหาแอนตเจนของเชอจลชพ

การตรวจหาปรมาณยาคลอแรมฟนคอล

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

36

ปฏกรยาอมมโนโครมาโตกราฟฟ(Immunochromatography)

การท าปฏกรยาระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดทจ าเพาะตดฉลากดวยสารส (dye) หรอ แอนตบอดกบแอนตเจนทจ าเพาะ ทตดฉลากดวยสารส

Ag-Ab complex จะถกพาไปในตวกลาง เชน แผนเซลลโลส แลวถกจบอกครงดวยแอนตบอดตวท 2 ทยดตดอยกบแผนเซลลโลส เกดเปนแถบสขน โดยมแถบควบคมซงจะตรงดวยแอนตบอดตวท 3 ตอแอนตบอดตวแรกเพอใชเปนตวควบคมการทดสอบ

37

ttp://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d3/Lateral_Flow_Assay.jpg38

ปฏกรยาอมมโนโครมาโตกราฟฟ

การอานผล : อานผลดวยตาเปลา

ถาเกดสชมพ2 แถบ

ถาเกดสชมพ1 แถบ

ไมเกดสชมพทง2 แถบ

ปฏกรยาอมมโนโครมาโตกราฟฟ

39

❖ เปนวธการตรวจวเคราะหแบบรวดเรว (rapid test)

❖ ท าไดงาย สะดวก ราคาไมแพง

❖ ไมตองใชอปกรณทมราคาแพง

ปฏกรยาอมมโนโครมาโตกราฟฟ

40

Immunoblot (Western Blot)

การตรวจหาโปรตนจ าเพาะในสวนประกอบของจลชพ

ขนตอน1. การแยกสวนประกอบของโปรตนดวยกระแสไฟฟาบนวน (gel)

แยกโปรตน2. การถายซบ (Blot) โปรตนจากวนไปยงแผนเมมเบรน

เชน nitrocellulose membrane 3. เตมแอนตบอดทจ าเพาะกบแอนตเจนทอยบนเมมเบรน

4. เตม anti-immunoglobulin ทตดฉลากดวยเอนไซม

5. เตม substrate แลวดปฏกรยาการเกดสบนแผนเมมเบรน

41

Immunoblot (Western Blot)

42

Immunoblot (Western Blot)

43

Immunoblot (Western Blot)

44

❖ การตรวจหาแอนตบอดตอเชอจลชพ

การประยกตใช❖ การตรวจหาแอนตเจนของเชอจลชพ, โปรตนจากเซลล

Immunoblot (Western Blot)

45

การตรวจหาเชอจลชพและสารพษจากจลชพในอาหาร เชน แบคทเรยกอโรคทางเดนอาหารจาก เนอ นม อาหารกระปอง อาหารแชแขง

การตรวจหายาปฏชวนะปนเปอนในอาหาร เชน น าผง นม กง ปลา ไข เนอ

46

http://www.ams.cmu.ac.th/depts/clinimm/311-chapter7.pdf

http://pirun.ku.ac.th/~fsciwcc/immune8.pdf

อานเพมเตม

สทธพนธ สาระสมบต (บรรณาธการ), อมมโนวทยา. พมครงท 4หนท 3, กรงเทพฯ : พพเอสไซเนซเทคนคอล จ ากด . 2542

อรวด หาญววฒนวงศ (บรรณาธการ) วทยาภมคมกนพนฐานและคลนก กรงเทพฯ : ส านกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย., 2551

47