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FUNDAMENTOS DE LA MANIPULACION GENETICA
Benjamín Paz Aliaga M.D.; MSci. DMS
Profesor Emérito de la UNSA
Profesor Principal de la UCSM
2009
DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL ADN
REPLICACION DEL ADN BACTERIANO
DNA RNA
PROTEINA
EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
FUNCIONAMIENTO DE LOS GENES
EXPRESION GENICA
RIBOSOMA
SUBUNIDAD MENOR
SUBUNIDAD MAYOR
PARTICIPACION DEL RIBOSOMA EN LA SINTESIS PROTEICA
REGULACION DE LA EXPRESION GENICA ( OPERON LAC)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y LOS LUGARES DE CORTE DEL DNA
ENZIMAS DE RESTRICCION
ACCION DE LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ECO R1 SOBRE UN PLASMIDO
ACCION DE LA DNA LIGASA
ACCION DE LA ENZIMA DE RESTRICCION Eco R 1
ELECTROFORESIS DE UN FRAGMENTO DE DNA CORTADO Y SIN CORTAR CON UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN
SEPARACION ELECTROFO-RETICA DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION
PLASMIDO
MICROGRAFIA ELECTRONICA DE UN PLASMIDO BACTERIANO
PLASMIDO pBR322
FORMACION DE LA MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
VECTORES DE DNA
VEHICULOS DE CLONAJE
• TIPOS:
1. Plásmidos
2. Fagos
3. Cósmidos
4. Cromosoma artificial de bacteria (BAC)
5. Cromosoma artificial de levadura (YAC)
VEHICULOS DE CLONAJE
• TIPOS:
– Plásmidos, que son moléculas extracromo-
somales de DNA circular que se replican autónomamente en el interior de la célula bacteriana. Tamaño del inserto a clonar: de 100 a 10,000 bp ( 0.1kb -10kb)
VEHICULOS DE CLONAJE
• TIPOS:
- Fagos, que son derivados del bacteriófago λ. Moléculas de DNA lineal que tienen un sector que no es útil para la replicación y que puede ser reemplazado por el DNA extraño.
Util para clonar fragmentos de 8 a 20 kb
VEHICULOS DE CLONAJE
• Cósmidos,son moléculas de DNA circular extracromosomal que combinan las carácterísticas de los plásmidos y de los fagos.
El tamaño del fragmento a clonar en estos vectores oscila entre 35 a 40 kb
TAMAÑO DEL INSERTO EN DIFERENTES VEHICULOS
CLONADORES
YAC (Cromosoma artificial de levadura)100- 1000 kb
• BAC (Cromosoma artificial bacteriano)
75- 300 kb
• Cosmido 35 - 50 kb• Fago λ 8 - 20 kb• Plásmido 0.1- 10 kb
MARCADORES DE PESO MOLECULAR
DNA RECOMBINANTE
Construcción de una molécula de ADN recombinante
FORMACION DE LA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE
PLASMIDO CON INSERTO CRECIENDO Y MULTIPLICANDOSE EN UN CULTIVO BACTERIANO
CONSTRUCCION DE MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTE
CLONAJE DE FRAGMENTODE ADN EN UN PLASMIDO
CLONAJE DE FRAGMENTOS DE ADN USANDO EL FAGO COMO VRECTOR
DETECCION DE GENES RELACIONADOS CON LA EXPOSICIÓN DE NUTRIENTES
INGENIERIA GENETICA
CONSTRUCCION DE UNA BIBLIOTECA GENOMICA
IDENTIFICACION DE LAS CLONAS QUE CONTIENEN LOS PLASMIDOS CON LOS FRAGMENTOS BUSCADOS
TECNICA DEL SOUTHERN BLOTT
IDENTIFICACION DE LOS FRAGMENTOS BUSCADOS MEDIANTE AUTORRADIOGRAFIA
CLONAJE DE GENES DE DROSOPHILA
COSMIDO RECOMBINANTE
BIBLIOTECA GENOMICA
OBTENCION DE UNA CLONA GENOMICA Y UNA CLONA cDNA
FORMACION DE LA MOLECULA DE cDNA
AISLAMIENTO DEL mRNA
METODO PARA CONVERTIR EL mRNA en cDNA DE DOBLE HEBRA
CONSTRUCCION DE UNA BIBLIOTECA GENOMICA Y UNA BIBLIOTECA cDNA
CLONAJE DE UN cDNA DE DOBLE HEBRA EN UN FAGO VECTOR
SELECCIÓN DE UNA LIBRERÍA CON UNA SONDA DE ACIDO NUCLEICO PARA DETECTAR UN GEN
EXPRESION DE UN GEN INSERTO EN UN PLASMIDO
EXPRESION DE UN GEN NORMAL Y MUTADO
EXPRESION DE LAS BIBLIOTECAS
BIOLOGIA MOLECULAR: HACE POSIBLE EL DESPLAZAMIENTO DE LA PROTEÍNA AL GEN Y VICEVERSA PARA UN MEJOR ESTUDIO
USO DE LA HIBRIDIZACION IN SITU PARA LA LOCALIZACION DE LOS GENES EN LOS CROMOSOMAS
(Cromosoma humano 5)
MARCACION DE LAS CELULAS QUE EXPRESAN UN TIPO PARTICULAR DE RNA MENSAJERO
( Mensajero de la proteína ciclina)
PCR
PCR
USO DE PCR PARA LA DETECCION DEL HIV EN EL SUERO DE UN PACIENTE
USO DE LA PCR EN MEDICINA FORENSE
KNOCKOUT DE UN GEN
PRODUCCION DE UN ANIMAL TRANSGENICO
SECUENCIACION DEL ADN POR EL METODO DE SANGER