GGénmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikákénmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

A P elem technikák: deléció A P elem technikák: deléció izolálása P elem izolálása P elem remobilizációvalremobilizációval

P elem: mozgó genetikai elem- ugrásához P elem: mozgó genetikai elem- ugrásához transzpozáz szükégestranszpozáz szükéges

Vad típusú P elem Laborban használt P elemVad típusú P elem Laborban használt P elem P elem mobilizációhoz szükséges:P elem mobilizációhoz szükséges:

mutátor elemmutátor elem

transzpozáz elemtranszpozáz elem Inszerció Inszerció - nem mindig génbe inszertálódik- nem mindig génbe inszertálódik

- lehet a vizsgált gén közelében- lehet a vizsgált gén közelében Remobilizáció lehet - precízRemobilizáció lehet - precíz

- nem precíz: inszerció, deléció- nem precíz: inszerció, deléció Deléciós mutánsok izolálása Deléciós mutánsok izolálása

Bevezetés:Bevezetés:

Deléció előállítása P elem remobilizációvalDeléció előállítása P elem remobilizációval

vizsgált gén

P elemP elem

transtranszpozázpozázz

szomszéd gén

Deléciós mutánsok azonosításaDeléciós mutánsok azonosítása

Fenotípus alapjánFenotípus alapján: létfontosságú génben történt : létfontosságú génben történt deléció letalitást okozdeléció letalitást okoz

PCR-al: PCR-al: megfelelő primerekkel a kapott deléció megfelelő primerekkel a kapott deléció mérete meghatározhatómérete meghatározható

P elem

deléció

PCR primer

PCR primer

vizsgált gén

1. Jumpstarter hímek előállítása:1. Jumpstarter hímek előállítása:

w, P(w+)/Y; +/ TM3, Sb P(Δ2-3) ♂

Jumpstarter hímekJumpstarter hímek:: piros szem, rövid szőr

A legyek szeme piros a w+ miatt Sb: rövid szőr fenotípus

Deléció létrehozása egy X kromoszómás Deléció létrehozása egy X kromoszómás génbengénben

w, P(w+) / w, P(w+) ♀ ♀ X +/Y; Df(3L)C4/TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ ♂

UtódokUtódok::

Jumpstarterek ivarsejtjeiben játszódik le a P elem mobilizációja.

2. P elem-hiányos kromoszómák azonosítása2. P elem-hiányos kromoszómák azonosítása

ΔP

w, P(w+)/Y; +/ TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ Df(1)6C, w/FM6, w; +/+ ♀ ♀

jumpstarter hím balanszer kr-t hordozó nőstény

X

FM6: első kromoszómás balanszer , Bar domináns mutációt hordozza

G1 utódok: w, Δw, ΔP/P/FM6, w; +/+ ♀FM6, w; +/+ ♀fehér és Bar szemű, valamint hosszú szőrű

ΔP jelöli a P elem hiányt

A w, Δw, ΔP/P/FM6FM6 genotípusú G1 utódok egy-egy olyan kromoszómát hordoznak, amelyből a P elem kiugrott. Ezt úgy is mondhatjuk, hogy a G1 utódok egy-egy „mutagenizált” kromoszómát reprezentálnak.

A P elem kiugrása lehet pontos, vagy pontatlan.

3.lépés: törzsalapítás3.lépés: törzsalapítás

FMFM66, , ww/Y ♂ ♂/Y ♂ ♂w, Δw, ΔP/P/FM6, w ♀FM6, w ♀ X

w, w, ΔΔP/Y P/Y ♂♂ w, w, ΔΔP/FM6, w P/FM6, w ♀♀ FM6, w/Y FM6, w/Y ♂♂

törzsfenntartástörzsfenntartás

A törzsalapító keresztezéseket a nem balanszeres A törzsalapító keresztezéseket a nem balanszeres w, Δw, ΔP/ P/ YY hímek hímek megjelenésére, vagy hiányára teszteljük.megjelenésére, vagy hiányára teszteljük. A A w, Δw, ΔP/ P/ YY hímekhímek hiánya azt mutatja hogy a hiánya azt mutatja hogy a w, Δw, ΔPP kromoszómán letális mutáció képződött.kromoszómán letális mutáció képződött. A keresztezésből származó fertilis utódok átrázásával A keresztezésből származó fertilis utódok átrázásával fenntartható az új mutációt hordozó törzs.fenntartható az új mutációt hordozó törzs.

X FM6, w/FM6, w FM6, w/FM6, w ♀♀

A deléció kimutatása és méretének A deléció kimutatása és méretének meghatározásameghatározása

A kapott mutáns törzsekből genomikus DNS-t kell izolálni, majd A kapott mutáns törzsekből genomikus DNS-t kell izolálni, majd megfelelő primerek segítségével a deléció mérete meghatározható.megfelelő primerek segítségével a deléció mérete meghatározható.

Vad típusú PCR termékVad típusú PCR termék

mutáns PCR termékmutáns PCR termék

P elem

Vizsgált gén

Deléció képződése esetén:

A deléciók mérete néhány bázispártól citológiailag látható A deléciók mérete néhány bázispártól citológiailag látható nagyságig terjedhet.nagyságig terjedhet.

mu

tán

s

va

d

típ

us

GGénmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikákénmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

A P elem technikák: deléció A P elem technikák: deléció izolálása hímrekombinációvalizolálása hímrekombinációval

Bevezetés:Bevezetés:

• A P elem mobilizációja crossing overt okoz Drosophila A P elem mobilizációja crossing overt okoz Drosophila ivar- és szomatikus sejtekben is, ahol rekombináció ivar- és szomatikus sejtekben is, ahol rekombináció normálisan nem történik.normálisan nem történik.

• A P elem indukált rekombinációt tanulmányozták A P elem indukált rekombinációt tanulmányozták osztódó ivarsejtekben a rekombináns kromoszómák osztódó ivarsejtekben a rekombináns kromoszómák struktúrájának vizsgálatával. struktúrájának vizsgálatával.

• Korábbi tanulmányok szerint a legtöbb P elem Korábbi tanulmányok szerint a legtöbb P elem indukált hímrekombinációs esemény az inszercióval indukált hímrekombinációs esemény az inszercióval szomszédos szekvenciák delécóját vagy duplikációját szomszédos szekvenciák delécóját vagy duplikációját váltja ki.váltja ki.

Három modell a P elem indukálta Három modell a P elem indukálta rekombinációs folyamatok magyarázatárarekombinációs folyamatok magyarázatára

1.1. A P elem transzpozáz random vág a genomban, A P elem transzpozáz random vág a genomban, ahol a transzpozáz expresszálódik. Ezek ahol a transzpozáz expresszálódik. Ezek rekombináns helyeket produkálnak.rekombináns helyeket produkálnak.

2.2. A hímrekobináció egy mellékterméke azoknak a A hímrekobináció egy mellékterméke azoknak a kettősszálú töréseket javító mechanizmusoknak, kettősszálú töréseket javító mechanizmusoknak, amelyek a P elem kivágódása után következnek be.amelyek a P elem kivágódása után következnek be.

3.3. A P elem egy másik DNS duplexen elhelyezkedő P A P elem egy másik DNS duplexen elhelyezkedő P elemmel transzpozáz bekötődésével „hibrid elemmel transzpozáz bekötődésével „hibrid elemet” alkot a sister kromatidákon.elemet” alkot a sister kromatidákon.

Első lépésben a P elem jobb végéhez és Első lépésben a P elem jobb végéhez és a sister kromatidán lévő P elem bal a sister kromatidán lévő P elem bal végéhez transzpozáz kapcsolódik végéhez transzpozáz kapcsolódik „hibrid elemet” formálva.„hibrid elemet” formálva.

Midkét végen duplaszálú törés Midkét végen duplaszálú törés következik be. A P elemek szabad következik be. A P elemek szabad végei target helyhez tapadnak, végei target helyhez tapadnak, amivel rekombinációs mechanizmust amivel rekombinációs mechanizmust indukálnakindukálnak

A P elemet hordozó kromatidák A P elemet hordozó kromatidák rekombinánsok.rekombinánsok.

A duplaszálú törések kijavításával a A duplaszálú törések kijavításával a kromoszóma funkcionális lesz, de kromoszóma funkcionális lesz, de valószínűleg nem rekombináns.valószínűleg nem rekombináns.

P elemA B

A B

A B

A B

A B

A B

A B

A B

A B

A B

A B

A B

C

C D

D

C D

C D

C D

C D

C D

C D

C D

C D

C D

C D

P elemA B C D

A B C D

DA B

A B C C D

A B B C D

A C D

függetlenfüggetlen rekombinánsokrekombinánsok

számaszáma

Hímrekombináció során a P elem mindkét Hímrekombináció során a P elem mindkét oldalán képződik deléció, vagy duplikációoldalán képződik deléció, vagy duplikáció

A hímrekombináció egy hőmérsékletfüggő A hímrekombináció egy hőmérsékletfüggő folyamatfolyamat

Rekombinánsok vizsgálata:Rekombinánsok vizsgálata:

PCR-elPCR-elDNS szekvenálássalDNS szekvenálássalKomplementációs teszttelKomplementációs teszttelA kromoszómák citólógiai A kromoszómák citólógiai vizsgálatávalvizsgálatával

A B C D Ms

5 kb

3 kb

1 kb

0,5 kb

Mutáns jelöltek

P-elem

P-elem

3 kb

Az ábrán egy hímrekombinációval indukált deléció látható, amelynek mérete az 50C20-23 régiótól az 50D4-7 régióig terjed.

A deléciók mérete néhány bázispártól néhány száz kb.-ig terjedhet. A deléciók mérete néhány bázispártól néhány száz kb.-ig terjedhet.

A nagyobb deléciókat nem lehet PCR amplifikációval kimutatni.A nagyobb deléciókat nem lehet PCR amplifikációval kimutatni.

A nagyobb deléciók méretét komplementációs teszttel, és A nagyobb deléciók méretét komplementációs teszttel, és nyálmirígy óriáskromoszóma preparátumok citológiai analízisével nyálmirígy óriáskromoszóma preparátumok citológiai analízisével határozzák meg.határozzák meg.

A deléciók A deléciók méretemérete

Mikor alkalmazzunk Mikor alkalmazzunk hímrekombinációt?hímrekombinációt?

A vizsgálni kívánt gén közelében van P elem inszerció.A vizsgálni kívánt gén közelében van P elem inszerció.

Túl nagy génsűrűség esetén, amikor a P elem Túl nagy génsűrűség esetén, amikor a P elem remobilizációval indukált deléció érintheti a szomszédos remobilizációval indukált deléció érintheti a szomszédos géneket.géneket.

Vizsgált génVizsgált gén

P elem

Szomszéd génSzomszéd gén

DELÉCIÓ

Kísérlet deléciós mutánsok izolálásáraKísérlet deléciós mutánsok izolálásárahímrekombinációvalhímrekombinációval

P(wP(w++))

P(wP(w++))

YY

ww--

ww--

mutátor törzsmutátor törzs

CyO,P(CyO,P(ΔΔ2-3)2-3)

transzpozáz forrástranszpozáz forrás

ww--

ww--

m

mmarker mutációt hordozó törzsmarker mutációt hordozó törzs

ww--

m

m

P(wP(w++))

markermarker

++

P(wP(w++))

markermarker

A rekombináns kromoszómákat a P elem és egy A rekombináns kromoszómákat a P elem és egy marker mutáció szegregációjának változása alapján marker mutáció szegregációjának változása alapján lehet azonosítanilehet azonosítani

géngén

géngén

géngén

P(wP(w++))

P(wP(w++))

ww--

ww--

CyO,P(CyO,P(ΔΔ2-3)2-3)

ww-- m

YY m

mutátor törzsmutátor törzs

X

P(wP(w++))

ww--

mYY CyO,P(Δ2-3)CyO,P(Δ2-3)

„jumpstarter” hím

Xww-- m

mww--

ww-- m

mww--

P(wP(w++))

ww-- m

m

P(wP(w++))

YY

ww-- m

mww--

P(wP(w++))

ww-- m

m

P(wP(w++))

YY

ww--

ww--X

Tm3, Sb, Ser

Tm6,Tb, Hu

P(wP(w++))

P(wP(w++))ww--

ww-- m

m

ww-- mP(wP(w++))

YY Tm6,Tb, Hu

Homozigóta életképes

Homozigóta letális

X

ww-- mP(wP(w++))

YY Tm6,Tb, Hu/

TörzsalapításTörzsalapítás

A rekombináns kromoszómák fenntarthatók

a balanszerrel szemben.

/

/

GGénmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikákénmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

A P elem technikák: A P elem technikák: transzgénikus állatok transzgénikus állatok

előállításaelőállítása

Transzgénikus legyek előállítása P Transzgénikus legyek előállítása P elem mikrionjektálássalelem mikrionjektálással

A kívánt DNS szakasz vagy szakaszok P elem végek közé vannak helyezve egy A kívánt DNS szakasz vagy szakaszok P elem végek közé vannak helyezve egy plazmidban amit transzpozáz jelenlétében injektálnak M citotípusú pre-plazmidban amit transzpozáz jelenlétében injektálnak M citotípusú pre-blasztoderma állapotban lévő embriókba.blasztoderma állapotban lévő embriókba.

Transzpozáz forrás biztosítása: Transzpozáz forrás biztosítása:

- tisztított transzpozáz fehérje a plazmidhoz kötve- tisztított transzpozáz fehérje a plazmidhoz kötve- „helper” plazmiddal történő együttes injektálás- „helper” plazmiddal történő együttes injektálás- endogén transzpozáz forrást tartalmazó legyekbe történő injektálás- endogén transzpozáz forrást tartalmazó legyekbe történő injektálás

5’-vég5’-vég 3’-vég3’-vég

whitewhite

bakteriális szekvenciabakteriális szekvencia

Hsp70Hsp70

EcoRI, KpnI, BamHI, XbaI, HpaI, XhoI, PstI

klónozó helyklónozó hely

Az embrionális fejlődés korai állapotai

Megtermékenyített pete 30 percelmegtermékenyítés után.

A magi osztódások 10 percenként követikegymást egy sokmagvú sejtet a sinciciálisblasztodermát létrehozva.

Kb 9 osztódás után (512 mag) a sejtmagokkivándorolnak a felszínre

A felszínen további négy osztódás történik.A sejteknek egy kis csoportja, a polsejtek kb.2.5 óra múlva formalódnak a posterior végen.Ezekből lesznek a felnőtt állat ivarsejtjei.

Három órával a megtermékenyítés után a sejtmagokat memrán zárja körül és a sejtekegy réteget képeznek az embrió felszínén, ez a sejtes blasztoderma állapot.

Az injektálás főbb technikai Az injektálás főbb technikai problémáiproblémái

1.1. a pete belső nyomásaa pete belső nyomása

2. 2. az injektálás során keletkező „lyuk” befedéseaz injektálás során keletkező „lyuk” befedése

Megoldások:Megoldások:

1.1. Az embrió kontrollált körülmények között végzett szárítása az injektálás előttAz embrió kontrollált körülmények között végzett szárítása az injektálás előtt

2.2. -1971. Zalokar: a lyuk befedése heptánban oldott gum demarral-1971. Zalokar: a lyuk befedése heptánban oldott gum demarral-1972. Ilmensee: kezelés 1.2 % sulfoszalicilsav oldattal-1972. Ilmensee: kezelés 1.2 % sulfoszalicilsav oldattal-Geyer-Duszynska: a beavatkozás halokarbon olaj alatt történik-Geyer-Duszynska: a beavatkozás halokarbon olaj alatt történik

Szükséges eszközökSzükséges eszközök

1. Mikroszkóp, vibráció mentes asztal

2. Mikromanipulátor

Egyszerű mikromanipulátor elégséges.

3. Tű – tűhúzó - kapilláris

A tű hegyének élesnek kell lennie, 1-10 m átmérővel.

3. Injektáló rendszerLehetővé teszi a tű tartalmának folyását amikor az az embrióban vanés nem engedi azt amikor a tű az olajban van. - vizzel töltött- olajjal töltött- levegős rendszer

Az injektálás meneteAz injektálás menete

0. A kívánt konstrukt előállítása

1. Az emriók preparálása

- petéztetés-dekorionálás-sorbarakás Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó-szárítás (a térfogat 1-5 %-a)

2. Injektálás

1-100 pl oldat

3. Gondviselés

injektálás injektálás ww-- embriókba embriókba

ww-- szemű G szemű GOO állatok állatok

keresztezés nem transzformált,keresztezés nem transzformált,ww-- szemű állatokkal szemű állatokkal

ivarsejt prekurzorivarsejt prekurzor

donor DNS-t hordozódonor DNS-t hordozósejtmagoksejtmagok

sejtmagoksejtmagok

donor plazmiddonor plazmidnem autonómnem autonómP elemP elem

transzpozáz gén marker w+ allél

hibás5’-vég

transzgén

3’-P5’-P

donor DNS-t hordozódonor DNS-t hordozóés és ww++ szemű szemű

transzgénikus utódoktranszgénikus utódok

ww-- szemű nem szemű nem transzgénikus utódoktranszgénikus utódok

ÖsszefoglalásÖsszefoglalás