Upload
others
View
6
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
GAMBARAN POLIMORFISME GEN CYP A * A
RS (T>C) SEBAGAI FAKTOR RISIKO
KANKER KOLOREKTAL PADA MAHASISWA
KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER
ANGKATAN - UIN SYARIF
HIDAYATULLAH JAKARTA
Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
OLEH:
Nurul Fathimah
NIM:
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI
SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
H/ M
ii
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KAYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa:
. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan
untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Strata di
Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya
cantumkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau
merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia
menerima sanksi yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Ciputat, Agustus
Nurul Fathimah
ii
iii
LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING
GAMBARAN POLIMORFISME GEN CYP A * A RS (T>C)
SEBAGAI FAKTOR RISIKO KANKER KOLOREKTAL PADA MAHASISWA
KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER ANGKATAN - UIN
SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Laporan Penelitian
Diajukan kepada Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked)
Oleh
Nurul Fathimah
NIM:
Menyetujui,
Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
H/ M
Dosen Pembimbing I
Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD
NIP.
Dosen Pembimbing II
dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, PhD, FINASIM
NIP.
iii
iv
LEMBAR PENGESAHAN
Laporan Penelitian berjudul GAMBARAN POLIMORFISME GEN
CYP A * A RS (T>C) SEBAGAI FAKTOR RISIKO KANKER
KOLOREKTAL PADA MAHASISWA KEDOKTERAN DAN PROFESI
DOKTER ANGKATAN - UIN SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA yang diajukan oleh Nurul Fathimah (NIM ), telah
diujikan dalam sidang di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan pada tanggal
Agustus . Laporan penelitian ini telah diperbaiki sesuai dengan masukan
dan saran penguji, serta telah diterima sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran (S. Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter.
Ciputat, Agustus
DEWAN PENGUJI KETUA SIDANG
Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD
NIP.
Pembimbing I Pembimbing II
Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD dr. Hari Hendarto, Sp.PD-KEMD, Ph.D, FINASIM
NIP. NIP.
Penguji I Penguji II
dr. Achmad Lutfi SpB-KBD Dr. Zeti Harriyati, S. Si, M. Biomed
NIP.
Pimpinan Fakultas
Dekan FKIK UIN Kaprodi PSKPD FKIK UIN
Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS
NIP. NIP.
Pembimbing I
Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD
NIP.
Pembimbing II
dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, PhD, FINASIM
NIP.
DEWAN PENGUJI
Ketua Sidang
Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD
NIP.
Dekan FKIK UIN Jakarta
Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes
NIP.
Kaprodi PSKPD UIN Jakarta
dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS
NIP.
Penguji I
dr. Achmad Lutfi, SpB-KBD
NIP.
Penguji II
Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M. Biomed
iv
v
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan terima kasih kepada:
. Puji syukur kepada Allah SWT atas rahmat dan hidayahNya, saya telah
diberikan kesabaran, kekuatan dan kemudahan sampai saya dapat
menyelesaikan riset ini dengan lancar. Sekaligus Nabi besar Muhammad
SAW yang telah membimbing umat islam hingga akhir hayatnya.
. Orang tua penulis, Muhajir dan Nikmatul Fauriyah yang selalu memberi
doa, bantuan moril dan materiil dari hati yang tulus hingga penulis dapat
menyelesaikan riset ini dengan lancar. Terima kasih juga kepada saudara
penulis dek Dina, dek Iqbal, dek Fiqi yang menyemangati penulis dan
pengingat sampai saat ini.
. Tim peneliti kanker kolorektal FKIK UIN Syarif Hidayatullah dan RSUP
Fatmawati atas kerjasama penelitian pemetaan kanker kolorektal dan
kesempatan serta ilmu yang sudah diberikan kepada penulis.
. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta
. dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS selaku Ketua Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
. Pembimbing dan penguji skripsi yaitu Chris Adhiyanto S.Si, M.Biomed,
PhD, dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, PhD, FINASIM, dr. Achmad Lutfi,
SpB-KBD, Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M. Biomed yang telah membimbing
dengan penuh kesabaran dan keikhlasan serta ketulusan dan atas seluruh
pengalaman yang diberikan sehingga saya dapat menyelesaikan riset ini.
. Tim Fantastic Four sebagai kelompok riset di PSKPD
. Seluruh Civitas Akademik PSKPD UIN Jakarta, seluruh dokter, dosen, dan
staff.
. Laboran yang telah membantu riset penulis mbak Suryani S.Si, mbak Ayu
Latifa A.Md, yang setia menemani dan membantu serta mengingatkan
penulis
v
vi
. Kak Amatilah Raifah, Kak Hipni Solehudin, Kak Adamilzary Fikri sebagai
kakak kelas yang telah membantu penulis dalam penelitian, tahap penulisan
dan ilmu lain yang telah diajarkan kepada penulis
. Carotis selaku sejawat yang menjadi penyemangat dan mendukung
penulis.
. Sahabat penulis yaitu Dhia Fairus yang telah membantu memperoleh jurnal
yang berguna dalam penulisan skripsi ini.
. Sahabat penulis yaitu Taqiyya Maryam, Masruroh, Kak Zaima Dzatul Ilma,
Kak Mahdiah Maemunah, Kak Aliefa Syifa, Kak Yofara M Muslihah yang
tetap memberi dukungan serta penyemangat penulis selama di PSKPD UIN
Jakarta.
. Keluarga pohon PSKPD UIN Jakarta Juragan’s Family yang turut
membantu menyemangati, memberi kritik dan saran kepada penulis
sehingga dapat menjadi lebih baik.
. MERCY , , yang telah memberi dukungan dan kesempatan
untuk aktif organisasi disertai menyelesaikan riset.
. BPH MERCY periode - , Ciwi-Ciwi Mercy yang telah memberi
saya pelajaran berorganisasi, mendukung dalam partisipasi dalam
pembuatan karya ilmiah dalam lomba nasional, disertai mengatur prioritas
untuk menyelesaikan riset.
Penulis sadar atas ketidaksempurnaan riset ini dan berharap semua kekurangan
bisa dimaklumi karena kesalahan adalah proses dari pembelajaran. Penulis juga
memohon kritik-kritik membangun yang dapat membantu dalam kesuksesan riset
ini. Terima kasih.
Ciputat, Agustus
Peneliti
vi
vii
ABSTRAK
Nurul Fathimah. Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter. Gambaran
Polimorfisme Gen CYP A * A rs (T>C) Sebagai Faktor Risiko Kanker
Kolorektal Pada Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter
Angkatan - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Latar Belakang: Kanker kolorektal merupakan penyebab kematian ketiga dari
seluruh kasus kanker di Indonesia. Dari penelitian sebelumnya telah diketahui
bahwa terdapat hubungan antara polimorfisme genetik sitokrom P (CYP)
dengan kejadian kanker kolorektal. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan
antara FKIK UIN dengan RSUP Fatmawati dalam menentukan alel SNP
CYP A * A rs (T>C), maka dilakukan identifikasi alel SNP
CYP A * A rs (T>C) pada mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta. Metode: Pengambilan darah diambil dari mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang sehat.
Pemeriksaan genotip dilakukan dengan metode PCR-RFLP. Hasil dan
Kesimpulan: Dengan demikian didapatkan hasil penapisan SNP CYP A * A
rs (T>C), sebagian besar merupakan heterozigot varian dan sebagian
kecil merupakan homozigot murni dan homozigot varian. Sehingga sebagian
besar mahasiswa memiliki polimorfisme SNP CYP A * A rs (T>C)
Kata Kunci : Kanker Kolorektal, CYP A * A, single nucleotide polymorphism
Nurul Fathimah. Medical Study Program and Doctor Profession. The Distribution
of CYP A * A rs (T>C) Polymorphism as Colorectal Cancer Risk
Factor among Students in Medical Study Programs and Doctor Profession -
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Background: Colorectal cancer is the third leading cause of death from all cancer
cases in Indonesia. From previous research it is known that there is a relationship
between genetic polymorphism of cytochrome P (CYP) with the incidence of
colorectal cancer. Therefore, research team of FKIK UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta and Fatmawati General Hospital work together to evaluate the frequency
of SNP CYP A * A rs (T> C) allele in Medical Study Program and
Doctor Profession of FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Methods: Blood
sampling was taken from healthy student of Medical Study Program and Doctor
Profession of FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Genotype examination was
performed by PCR-RFLP method. Results and Conclusions: Based on screening
results, most of genotype is a variant heterozygot, while pure homozygote and
homozygote variant are minority. So most of the students has polymorphism SNP
CYP A * A rs (T> C)
Keywords: Colorectal Cancer, CYP A * A rs , single nucleotide
polymorphism
vii
viii
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL .......................................................................................... i
LEMBAR PERNYATAAN ........................................................................... ii
LEMBAR PERSETUJUAN ......................................................................... iii
LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... iv
KATA PENGANTAR .....................................................................................v
ABSTRAK .................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................x
DAFTAR TABEL ......................................................................................... xi
DAFTAR SINGKATAN .............................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiii
BAB PENDAHULUAN ...............................................................................
Latar Belakang ............................................................................................
Rumusan Masalah .......................................................................................
Hipotesis ......................................................................................................
Tujuan .........................................................................................................
Manfaat Penelitian ......................................................................................
BAB TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................
Landasan Teori ............................................................................................
Genomik ............................................................................................
Area Intergenik .....................................................................
Single Nucleotide Polymophysm ..........................................
Ekspresi Gen .....................................................................................
Kanker ...............................................................................................
Kanker Kolorektal ...........................................................................
Anatomi Kolorektal ............................................................
Pengertian Kanker Kolorektal ............................................
Faktor Resiko Kanker Kolorektal .......................................
Patogenesis Kanker Kolorektal ..........................................
Deteksi Dini Kanker Kolorektal .........................................
Diagnosis Kanker Kolorektal .............................................
Tatalaksana Kanker Kolorektal ..........................................
Komplikasi Kanker Kolorektal ...........................................
CYP A * A T>C(rs ) ..............................................
Isolasi Genom .................................................................................
Persiapan untuk Human Genomic DNA .............................
Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA ......................
Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................
Komponen dalam PCR .......................................................
Tahapan PCR ......................................................................
. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .....................
. Restriksi Endonuklease ......................................................
Prinsip deteksi RFLP ..........................................................
Analisis hasil RFLP ............................................................
Elektroforesis ..................................................................................
viii
ix
Gel Agarose ........................................................................
Kerangka Teori..........................................................................................
Kerangka Konsep ......................................................................................
Definisi Operasional..................................................................................
BAB METODE PENELITIAN .................................................................
Desain Penelitian .......................................................................................
. Lokasi dan Waktu Penelitian ....................................................................
Populasi Penelitian dan Sampel ................................................................
Populasi Target ...............................................................................
Populasi Terjangkau ........................................................................
Kriteria Pemilihan ...........................................................................
Perkiraan Besar Sampel ..................................................................
Teknik Pemilihan Sampel ...............................................................
Alat dan Bahan Uji ....................................................................................
Cara Kerja Penelitian ................................................................................
Pengumpulan Sampel ......................................................................
Isolasi DNA ....................................................................................
Optimalisasi Primer.........................................................................
Isolasi DNA ....................................................................................
Tata Kerja PCR ..............................................................................
Tata Kerja RFLP .............................................................................
Analisis Data ...................................................................................
Etika Penelitian ...............................................................................
Alur Penelitian ................................................................................
BAB HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................
Hasil .........................................................................................................
Data Karakteristik responden ..........................................................
Hasil Isolasi DNA Genom dan PCR dari Sel Darah .......................
Hasil analisis Genotyping PCR RFLP ............................................
Hasil PCR ...........................................................................
Hasil RFLP .........................................................................
Hasil Skrining gen CYP A * A rs (T>C) .......
. Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Homozigot murni,
Heterozigot varian, Homozigot varian) ..........................................
Pembahasan ...............................................................................................
Kelebihan Penelitian .................................................................................
Keterbatasan Penelitian .............................................................................
BAB SIMPULAN DAN SARAN ...............................................................
Simpulan ...................................................................................................
Saran ..........................................................................................................
BAB ACKNOWLEDGMENT ..................................................................
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
LAMPIRAN ...................................................................................................
ix
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar Struktur umum gen manusia ........................................................
Gambar Mutasi pada area splicing ............................................................
Gambar Struktur DNA eukariot dan proses splicing. Area intergenik
berada diantara gen, area exon lebih pendek daripada intron .....
Gambar Proses transkripsi dan translasi ....................................................
Gambar Tahapan perubahan sel normal menjadi sel kanker ...................
Gambar Anatomi sistem pencernaan manusia ........................................
Gambar Letak gen CYP A * A di kromosom q -qter ..................
Gambar Gambar tahapan PCR ................................................................
Gambar Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A
pada sekuens GAATTC ............................................................
Gambar Genotipe marker alel pada hasil RFLP di sebuah keluarga ......
Gambar Perbandingan hasil isolasi DNA dengan pita DNA yang baik
(a); dan pita DNA yang kabur/ smear (b) .................................
Gambar Hasil PCR ..................................................................................
Gambar Hasil RFLP ................................................................................
Gambar Hasil Skrining rs DNA Genom ..................................
Gambar Hasil Distribusi Alel ..................................................................
x
xi
DAFTAR TABEL
Tabel Konsentrasi Larutan Buffer yang Dapat Dibuat ...................................
Tabel Definisi operasional ..............................................................................
Tabel Alat dan bahan penelitian .....................................................................
Tabel Tahapan isolasi genom DNA ...............................................................
Tabel Prosedur PCR ......................................................................................
Tabel Prosedur Restriksi Enzim .....................................................................
Tabel Karakteristik jenis kelamin responden .................................................
Tabel Karakteristik usia responden ................................................................
Tabel Kategori Kemurnian DNA ...................................................................
Tabel Kategori Konsentrasi DNA Genom .....................................................
Tabel Analisis Genotyping PCR RFLP ..........................................................
Tabel Distribusi Frekuensi kategori genotyping menurut jenis kelamin .......
xi
xii
DAFTAR SINGKATAN
PCR Polymerase Chain Reaction
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SNP Single Nucleotide Polymorphysm
WHO World Health Organization
xii
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran . Lembar Persetujuan Responden ........................................................
Lampiran . Lembar Tanda Terima Komisi Etik Penelitian ..................................
Lampiran . Fragmen Primer .................................................................................
Lampiran . Alat dan Bahan Penelitian .................................................................
Lampiran . Optimalisasi Primer ...........................................................................
Lampiran . Gel Documentation Hasil Elektroforesis Agarose.............................
Lampiran . Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel ..............................
Lampiran . Hasil RFLP ........................................................................................
Lampiran . Hasil Analisis Statistik ......................................................................
Lampiran . Curiculum Vitae Peneliti .................................................................
xiii
BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan penyakit yang menyebabkan morbiditas dan mortalitas
di dunia, dengan perkiraan juta kasus di tahun . WHO menyatakan terjadi
juta kematian pada tahun . Jumlah kasus baru diperkirakan akan terus
meningkat sekitar selama dekade mendatang. Berdasarkan Riset
Kesehatan Dasar (Riskesdas) , prevalensi kanker di Indonesia penduduk
semua umur di Indonesia tahun sebesar atau diperkirakan sekitar
.
Kanker kolorektal (KKR) adalah keganasan ketiga yang paling sering
didiagnosa dan penyebab utama kematian keempat akibat kanker di dunia,
terdapat sekitar juta kasus baru dan hampir kematian di tahun .
Sementara itu secara jens kelamin, karsinoma kolorektal merupakan keganasan
ketiga terbanyak laki-laki ( kasus, dari total) dan kedua terbanyak
perempuan ( kasus, dari total) di dunia.
Insiden kanker kolorektal di Indonesia adalah per penduduk
usia dewasa ( per tahun, ) dan merupakan penyebab kematian nomor
dengan mortalitas , % ( pertahun) dari seluruh kasus kanker.
Kanker
kolorektal menempati urutan nomor , setelah kanker payudara dan kanker paru
di Indonesia.
Peningkatan ini diakibatkan oleh perubahan pada diet masyarakat
Indonesia, baik sebagai konsekuensi peningkatan kemakmuran serta pergeseran
ke arah pola makan orang Barat (westernisasi) yang lebih tinggi lemak serta
rendah serat.
Meskipun perkembangan pengobatan berkembang secara cepat dan sangat
maju, akan tetapi hanya sedikit saja meningkatkan harapan hidup pasien
karsinoma kolorektal bila sudah ditemukan dalam stadium lanjut. Kunci utama
keberhasilan penanganan karsinoma kolorektal adalah ditemukannya karsinoma
dalam stadium dini, sehingga terapi dapat dilaksanakan secara bedah kuratif.
Pada tindakan kuratif seperti kemoterapi, angka keberhasilannya bergantung pada
stadium kanker. Selain itu, operasi yang juga merupakan tindakan kuratif,
membutuhkan biaya pengobatan yang cukup tinggi. Oleh karena itu usaha
preventif penting dilakukan untuk mengurangi resiko terjadinya pembentukan sel
kanker, salah satunya adalah dengan melakukan skrining genetik. Hal ini penting
dilakukan mengingat perkembangan kanker kolon yang cukup cepat. Dengan
tekhnologi yang semakin modern, metode pencegahan pada tingkat genetik ini
sudah banyak digunakan para peneliti di barat maupun di Indonesia.
Sitokrom P (CYP) berperan dalam metabolisme xenobiotik, dimana
terdapat enzim metebolit fase I dan II yang berperan dalam proses detoksifikasi
dan apabila regulasinya terganggu dapat memicu karsinogenesis. -
CYP A * A
adalah variasi alel yang cukup banyak dimiliki oleh penduduk di wilayah Asia
(Jepang) daripada Kaukasia, dengan frekuensi variasi alel adalah pada
Kaukasia, pada Asia, and pada Afrika. ,
Penelitian di Jepang
ditemukan bahwa alel heterozigot dan homozigot varian untuk CYP A * A
memiliki resiko untuk terjadi kanker koloretal.
Oleh sebab itu pada penelitian ini
ingin melihat presentasi dan frekuensi gen CYP A * A rs (T>C) yang
memiliki hubungan dengan faktor resiko terjadinya kanker kolorektal.
Berdasarkan hal tersebut, peneliti ingin melakukan penelitian yang berjudul
“Gambaran Polimorfisme Gen CYP A * A rs (T>C) sebagai Faktor
Resiko Kanker Kolorektal Pada Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan
Profesi Dokter Angkatan - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta” yang
diharapkan mampu menurunkan kejadian kanker kolon di masa yang akan datang.
Dengan melakukan penapisan gen ini, diharapkan mahasiswa dapat mengetahui
dan memperkirakan apakah berpotensi menderita kanker atau tidak dimasa akan
datang, sehingga pola makan dan kebiasaan buruk dapat diubah secara dini.
Rumusuan Masalah
Berdasarkan uraian diatas maka dapat dirumuskan masalah
- Apakah Single Nucleotide Polymorphysm (SNP) CYP A * A
rs (T>C) terdapat pada mahasiswa Program Studi Kedokteran
dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta angkatan -
Hipotesis
Didapatkan alel gen CYP A * A rs (T>C) pada mahasiswa
Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas Islam
Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan - .
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum
Untuk melakukan screening polimorfisme gen CYP A * A rs
(T>C) menggunakan teknik PCR RFLP pada mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN)
Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan - .
Tujuan Khusus
Mengidentifikasi dan mengetahui jumlah variasi gen CYP A * A
rs (T>C) sebagai salah satu faktor resiko untuk terjadinya kanker
kolorektal pada mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter
(PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
angkatan - menggunakan teknik PCR RFLP
Manfaat Penulisan
Manfaat untuk peneliti:
- Memiliki ketrampilan dalam molekuler untuk mengetahui adanya
mutasi gen dengan teknik PCR RFLP
- Meningkatkan dan mengembangkan kemampuan berpikir dalam
menganalisis masalah-masalah pada kanker kolorektal.
- Menambah pengetahuan mengenai mutasi genotyping pada Gen
CYP A * A rs (T>C)
- Menambah wawasan mengenai pentingnya pencegahan dini
terutama pencegahan dini terhadap munculnya kanker melalui
skrining.
- Dapat memberikan edukasi tenaga kesehatan dalam menanggapi
masalah kanker kolorektal yang disebabkan mutasi gen
CYP A * A rs (T>C).
Manfaat untuk Civitas Akademika
- Sebagai sumber pengetahuan dan bahan referensi bagi peneliti
selanjutnya yang akan melakukan penelitian yang berkaitan dengan
penelitian ini.
- Bagi masyarakat, sebagai sumber informasi dalam mengatur pola
makan yang sehat dan bergizi cukup.
- Bagi mahasiswa, menambah wawasan mengenai persentase
mahasiswa yang memilki polimorfisme gen CYP A * A
rs atau tidak di masa akan datang.
- Meningkatkan kewaspadaan yang memilki faktor resiko kanker
kolorektal sehingga dapat dilakukan tindakan pencegahan berupa
melakukan pola hidup sehat pada mahasiswa.
- Memberikan informasi tentang hubungan gen dengan kemungkinan
munculnya kanker kolorektal.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Landasan Teori
Genomik
Menurut National Human Genome Research Institute, genomik merupakan
istilah yang banyak digunakan untuk menggambarkan studi tentang seluruh gen
manusia (genom), termasuk interaksi antar gen dan dengan lingkungannya.
Genomik mempelajari studi ilmiah mengenai berbagai macam penyakit yang
kmpleks, seperti penyakit jantung, asma, diabetes, dan kanker.
Menurut WHO,
genomik didefinisikan sebagai studi tentang gen dan fungsi mereka, dan teknik
terkait.
Sementara itu kedokteran genomik adalah salah satu disiplin ilmu
kedokteran yang menyediakan informasi genomik tentang individu sebagai bagian
dari perawatan medis (misalnya, untuk menentukan diagnostik atau terapeutik
yang akan dipilih) dan hasil keluarannya dan kebijakan yang diambil berguna
dalam klinis. Pengobatan genomik memiliki dampak di bidang onkologi,
farmakologi, penyakit yang langka dan tidak terdiagnosis serta penyakit
menular.
Gambar Struktur umum gen manusia
Pada sel eukariot, gen terdiri dari:
. Domain regulasi inisiasi transkripsi,
Inisiasi transkripsi adalah area yang mengatur awal mula dari transkripsi
yang terdiri antara lain dari deret GCCACACCC, ATGCAAAT, kotak GC,
kotak CCAAT dan kotak TATA.
. Intron (intragenic)
Pada genom manusia terdapat banyak gen yang mengkode berbagai macam
protein dan juga area non-koding. Area non-koding tersebut disebut dengan
intron. Intron awalnya ditrasnkripsi menjadi iRNA di dalam inti tetapi tidak
hadir dalam mRNA matang di sitoplasma.
Intron merupakan mRNA yang
akan tetap berada di dalam nukleus karena kemungkinan mRNA tersebut
akan membentuk protein yang tidak fungsional (tidak berguna) jika
ditranslasikan. Intron kemudian akan terurai kembali untuk membentuk rantai
mRNA baru. Dengan demikian, informasi dari urutan intron tidak terwakili
dalam produk protein akhir.
. Ekson
Ekson merupakan area koding yang mengkode produk akhir protein.
Ekson merupakan mRNA yang akan dikirim keluar nukleus untuk
ditranslasikan. Mutasi pada area ekson maupun intron dapat mempengaruhi
hasil akhir dari mutasi tersebut, karena area ekson dan intron berpengaruh
secara langsung terhadap pembentukan protein.
Contoh pada kelainan
tersebut adalah β-talasemia.
Gambar Mutasi pada area splicing
. Domain regulasi akhir transkripsi
Area Intergenik
Area intergenik adalah urutan DNA yang berada di antara gen.
Daerah
intergenik adalah area noncoding DNA. Terkadang beberapa DNA intergenik
berfungsi untuk mengontrol gen di dekatnya, namun sebagian besar fungsinya
belum yang diketahui, sehingga kadang-kadang disebut sebagai DNA sampah
(junk DNA). fragmen DNA di daerah intergenik juga disebut sebagai "dark
matter" atau "dark matter transcripts".
Pada area ini mengandung bagian yang
penting seperti promoters dan enhancers. Regio intergenik mengandung gen yang
belum bisa diidentifikasi seperti noncoding RNA. ,
Pada manusia area
intergenik terdiri dari sekitar genom, sedangkan pada bakteri hanya sekitar
dan pada ragi sekitar . Mutasi pada daerah intergenik embC-embA
berkontribusi terhadap resistensi Mycobacterium tuberculosis terhadap
ethambutol.
Gambar Struktur DNA eukariot dan proses splicing. Area intergenik berada
diantara gen, area exon lebih pendek daripada intron
Single Nucleotide Polymophysm
Polimorfisme nukleotida tunggal atau Single Nucleotide Polymophysm,
sering disebut SNP (diucapkan “snips”) adalah sebuah perubahan komposisi
nukelotida di sekuens DNA pada satu posisi tertentu, dimana ini adalah jenis yang
paling umum dari variasi genetik pada seorang individu. Setiap SNP merupakan
perbedaan dalam sebuah blok bangunan DNA tunggal, yang disebut nukleotida.
Misalnya, SNP dapat menggantikan sitosin nukleotida (C) dengan timin
nukleotida (T) di hamparan tertentu DNA. SNP terjadi secara normal di seluruh
DNA seseorang.
SNP terjadi sekali dalam setiap nukleotida, yang berarti ada sekitar
juta SNP dalam genom manusia. Paling umum, variasi ini ditemukan dalam DNA
antar gen. Mereka dapat bertindak sebagai penanda biologis, membantu para
ilmuan menemukan gen yang berhubungan dengan penyakit. Ketika SNP terjadi
dalam gen atau intragenic region, mereka dapat memainkan peran lebih langsung
dalam penyakit dengan mempengaruhi fungsi gen.
Kebanyakan SNP tidak berpengaruh pada kesehatan atau perkembangan.
Namun polimorfisme genetik ini, telah terbukti sangat penting dalam studi
kesehatan manusia. Para peneliti telah menemukan SNP yang dapat membantu
memprediksi respon seseorang terhadap obat tertentu, kerentanan terhadap faktor
lingkungan seperti racun dan resiko perkembangan penyakit tertentu. SNP juga
dapat digunakan untuk melacak pola pewarisan gen penyakit dalam keluarga.
Pada penelitian selanjutnya merupakan identifikasi SNP yang berkaitan dengan
penyakit kompleks seperti penyakit jantung, diabetes, dan kanker.
Ekspresi Gen
Informasi genetik akan mengkode pembentukan protein sehingga terbentuk
polipeptida melalui beberapa tahapan. Awal mula transkripsi sebuah gen
dipengaruhi promoter dan regulator lainnya. Faktor transkripsi yang merupakan
protein spesifik, akan berinteraksi dengan urutan area spesifik di dalam wilayah
tersebut dan menentukan pola ekspresi gen.
Transkripsi gen dimulai pada area awal transkripsi pada DNA kromosom
yang disebut transcribed but untranslated region ( UTR). Kemudian
terbentuklah beberapa pasang basa termasuk melalui intron dan ekson, serta
berujung pada akhir rangkaian pengkodean. Setelah ujung RNA primer 'dan
'dimodifikasi , bagian intron dikeluarkan dan bagian ekson disambung menjadi
satu. Setelah penyambungan RNA, maka terbentuklah mRNA (mengandung
segmen inti yang saling terkait dengan pengkodean gen) lalu dipindahkan dari
nukleus ke sitoplasma, di mana mRNA akhirnya diterjemahkan ke dalam urutan
asam amino sehingga membentuk polipeptida. Setiap langkah dalam jalur
kompleks tersebut dapat terganggu. Hal tersebut dapat berupa mutasi yang bisa
berakibat pada beberapa kelainan genetik yang diwariskan.
Gambar Proses transkripsi dan translasi
Kanker
Kanker adalah salah satu penyakit genetik yang disebabkan oleh
perubahan/ mutasi genetik yang mengontrol fungsi sel, terutama pertumbuhan dan
pembelahan. Mutasi tersebut akan mengakibatkan perubahan sifat dasar sel yang
disertai dengan kerusakan gen regulator sel normal dalam tubuh.
Kerusakan/
mutasi genetik non lethal pada sel normal ini dapat diakibatkan oleh pengaruh
lingkungan, seperti: zat kimia, radiasi, virus atau sel germinal yang kemudian
diwariskan.
Gen regulator sel normal adalah gen yang menjadi sasaran
kerusakan sehingga menimbulkan perubahan sifat dasar sel, diantaranya:
. Gen Proto-oncogen yakni gen yang berfungsi dalam mendorong
pertumbuhan.
. Gen supresi tumor yakni gen yang menghambat pertumbuhan
(anti-onkogen).
. Gen Apoptosis yakni gen yang mengatur kematian sel secara
terencana (programmed cell death).
. Repairing Gene yakni gen yang mengatur perbaikan DNA yang
rusak, biasanya berkaitan dengan karsinogenesis.
Kerusakan gen tersebut menyebabkan aktivasi onkogen pendorong
pertumbuhan, perubahan gen yang mengendalikan pertumbuhan, dan
penonaktifan gen supressor kanker. Sehingga mengakibatkan ekspresi gen yang
mengalami perubahan dan hilangnya produk gen regulatorik yang berujung pada
peningkatan mutasi sehingga terbentuk sel baru yang abnormal.
Tidak semua sel baru tersebut membentuk kanker. Namun jaringan
abnormal yang terbentuk dapat berubah menjadi hiperplasia dan displasia.
Hiperplasia adalah sel normal yang mengalami pertumbuhan yang cepat.
Sementara displasia adalah tingkat lanjut dari hiperplasia, dimana sel dalam
jaringan tersebut mengalami perubahan yang abnormal. Pada kondisi lebih lanjut
sel ini berpotensi berkembang menjadi kanker.
Gambar . Tahapan perubahan sel normal menjadi sel kanker
Kanker ganas ini berbeda dengan sel normal pada umumnya karena
memiliki sifat:
. Self-sufficiency (menghasilkan sendiri sinyal pertumbuhan),
. Tidak sensitf terhadap sinyal penghambat pertumbuhan
. Menghindari apoptosis
. Potensi replikasi tanpa batas (proliferasi tanpa batas yang berkaitan
dengan dipertahankannya panjang dan fungsi telomer)
. Angiogenesis berkepanjangan (pertumbuhan pembuluh darah yang
diinduksi oleh berbagai faktor seperti VEGF, faktor pertumbuhan
endotel vaskuler)
. Kemampuan menginvasi dan metastasis meningkat.
Selama ini untuk penatalaksanaan dari kanker adalah dengan memberikan
suatu zat yang dapat menginduksi kematian dari sel kanker sendiri. Tetapi tak
dapat dipungkiri, dengan memberikan zat pemicu kematian sel kanker ini bukan
hanya sel kanker saja yang mengalami kematian tetapi sel-sel normal ditubuh juga
ikut mendapatkan dampaknya, hal ini dikarenakan zat yang digunakan tidak
memiliki sifat selektif dalam membunuh sel kanker.
Kanker Kolorektal
Anatomi Kolorektal
Usus besar adalah bagian dari sistem pencernaan. Sebagaimana kita ketahui
sistem pencernaan dimulai dari mulut lalu esofagus, gaster, usus halus yang terdiri
dari duodenum, yeyunum, ileum, dilanjutkan dengan usus besar yang terdiri dari
sekum, apendiks, rektum dan dubur. Sekum membentuk kantong buntu dibawah
pertemuan antara usus halus dan usus besar di katup iliosekum. Tonjolan kecil
seperti jari di dasar sekum adalah apendiks, suatu jaringan limfoid yang
mengandung limfosit. Kolon membentuk sebagian besar usus besar. Kolon terdiri
dari kolon asenden, kolon transversum, kolon desenden. Bagian terakhir kolon
desenden berbentuk huruf S dan membentuk kolon sigmoid dan kemudian
melurus untuk membentuk rektum.
Gambar Anatomi sistem pencernaan manusia
Pengertian Kanker Kolorektal
Kanker kolon dan rektum (KKR) adalah keganasan yang berasal dari
jaringan usus besar, terdiri dari kolon (bagian terpanjang dari usus besar) dan/atau
rektum (bagian kecil terakhir dari usus besar sebelum anus). Tumor berupa massa
polipoid, besar, tumbuh ke dalam lumen, dan dengan cepat meluas ke sekitar usus
sebagai striktura anular (mirip cincin). Lesi anular lebih sering terjadi pada bagian
rektosigmoid, sedangkan lesi polipoid yang datar sering terjadi pada sekum dan
kolon ascendeen. Secara histologis, hampir semua kanker usus besar adalah
adenokarsinoma (terdiri atas epitel kelenjar) dan dapat menyekresi mukus yang
jumlahnya berbeda-beda.
Faktor Resiko Kanker Kolorektal
Kanker kolorektal timbul melalui interaksi yang kompleks antara faktor
genetik dan faktor lingkungan. Faktor lingkungan multipel beraksi terhadap
predisposisi genetik atau defek yang didapat dan berkembang menjadi KKR.
Faktor tidak dapat dimodifikasi:
. genetik
. riwayat kanker kolorektal atau polip adenoma individual dan keluarga.
. riwayat individual penyakit kronis inflamatori pada usus (kolitis
ulserative.
Faktor risiko yang dapat dimodifikasi, yang berhubungan dengan peningkatan
insiden kanker kolorektal:
. inaktivitas
. obesitas
. diet tinggi lemak, protein, kalori, dan daging merah, rendah serat
. merokok
. konsumsi alkohol moderat-sering.
Selain itu terdapat pula faktor protektif yang dapat mengurangi resiko terjadinya
kanker kolorektal
. aktivitas fisik
. diet tinggi serat
. asupan vitamin D, E dan asam folat.
. kalsium
. NSAID (piroksikam, sulindak dan aspirin dapat mencegah
terbentuknya adenoma atau menyebabkan regresi polip adenoma pada
FAP sehingga dapat menekan kekambuhan)
. ERT (estrogen replacement therapy) menurunkan risiko KKR dan
fraktur pelvis, akan tetapi manfaat ini diikuti efek yang tidak baik
yaitu meningkatnya penyakit jantung koroner, stroke, emboli paru dan
kanker payudara invasif
. kolonoskopi (pengangkatan polip adenomatosa dapat mengurangi
risiko kejadian kanker kolorektal)
Patogenesis Kanker Kolorektal
Interaksi faktor genetik dan lingkungan yang cukup kompleks akan dapat
memicu terjadinya kanker kolorektal. Berkurangnya kandungan serat
menyebabkan berkurangnya massa tinja, meningkatnya waktu transit di usus, dan
berubahnya fora bakteri usus. Oleh karena itu, konsentrasi produk-produk
sampingan penguraian oksidatif karbohidrat oleh bakteri berpotensi toksik
meningkat di tinja dan berkontak lebih lama dengan mukosa kolon. Selain itu,
asupan kolesterol yang tinggi dalam daging merah meningkatkan sintesis asam
empedu oleh hati, yang pada gilirannya mungkin diubah menjadi karsinogen oleh
bakteri usus.
Terdapat kelompok KKR berdasarkan perkembangannya yaitu:
. kelompok yang diturunkan (inherited) yang mencakup kurang dari dari
kasus KKR;
. kelompok sporadik, yang mencakup sekitar ;
. kelompok familial, mencakup .
Kelompok diturunkan adalah mereka yang dilahirkan sudah dengan mutasi
germline (germline mutation) pada salah satu alel dan terjadi mutasi somatik pada
alel yang lain. Contohnya adalah FAP (Familial Adenomatous Polyposis) dan
HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer). HNPCC terdapat pada
sekitar dari kanker kolorektal. Kelompok sporadik membutuhkan dua mutasi
somatik, satu pada masing masing alelnya. Kelompok familial tidak sesuai
kedalam salah satu dari dominantly inherited syndromes diatas (FAP & HNPCC)
dan lebih dari terjadi pada umur muda. Meskipun kelompok familial dari
KKR dapat terjadi karena kebetulan saja, akan tetapi faktor lingkungan, penetrant
mutations yang lemah atau currently germline mutations dapat berperan.
Terdapat model perjalanan perkembangan KKR (karsinogenesis) yaitu
LOH (Loss of Heterozygocity) dan RER (Replication Error). Model LOH
mencakup mutasi tumor gen supresor meliputi gen APC, DCC dan p- serta
aktifasi onkogen yaitu K-ras. Model ini contohnya adalah perkembangan polip
adenoma menjadi karsinoma. Sementara model RER karena adanya mutasi gen
hMSH , hMLH , hPMS , hPMS . Model terakhir ini contohnya adalah
perkembangan HNPCC. Pada bentuk sporadik, berkembang lewat model
LOH dan berkembang lewat model RER.
Mutasi Pada Gen K-RAS
Perubahan genetik dan epigenetika sangat berperan penting dalam
perubahan sel epitel normal hingga terjadinya metastasis. Perubahan genetika ini
biasanya terjadi melalui dua jalur: Chromosomal instability (CIN), dan
Microsatellite instability (MIN), sedangkan perubahan epigenetika terlihat degan
ditemukannya CIMP (CpG Island Methylator Phenotype). Chromosomal
instability yang salah satunya disebabkan oleh mutasi pada gen-gen tertentu
seperti APC, K-RAS, dan p berperan dalam kasus kanker kolorektal yang
bersifat sporadis. Salah satu mutasi yang sering ditemui pada jaringan kanker
kolorektal adalah mutasi pada gen K-RAS terutama pada kodon dan .
Gen RAS terdiri dari famili yaitu H-RAS, K-RAS, dan N-RAS. Yang
menghasilkan macam protein serupa yang memiliki ukuran berkisar Kd. Gen
RAS ini pada dasarnya berperan dalam menghasilkan protein yang mengikat dan
menghidrolisis GTP. Protein-protein yang dihasilkan ini bekerja debagai mediator
dalam transduksi signal ekstraseluler seperti growth factor, sitokin, dan hormon
menuju sitoplasma dan nukleus. Dalam hal ini, protein tersebut berperan penting
dalam proses pertumbuhan, diferensiasi, dan apoptosis sel. Mutasi yang spesisfik
pada gen RAS akan menyebabkan perubahan formasi dari protein yang dihasilkan
sehingga membuat protein RAS (GTPase) selalu aktif. Hal ini menyebabkan
trasnduksi signal ekastraseluler terganggu sehingga akan mengganggu proliferasi
sel yang terjadi.
Pada kanker kolon, lebih dari mutasi yang terjadi pada gen RAS adalah
gen K-RAS. Mutasi K-RAS umumnya dijumpai pada kodon , dan .
Namun mutasi pada kodon lebih jarang ditemui. Mutasi gen K-RAS terjadi
pada - kasus kanker kolorektal.
Mutasi gen KRAS kodon pada
adenocarcinoma colorectal di Rumah Sakit Dr. Soetomo Surabaya sebanyak
.
Konsekuensi mutasi pada gen K-RAS adalah penyandian protein K-RAS
yang akan selalu aktif, terlepas ada tidaknya hambatan pada EGFR. Dengan kata
lain, sel kanker yang memiliki mutasi pada K-RAS akan tetap mampu
berproliferasi dan akan resisten dengan terapi antibodi monoklonal anti-EGFR.
Mutasi pada gen K-RAS dapat dideteksi menggunakan PCR yang diikuti oleh
sekuensing DNA, atau dengan menggunakan Alelle Spesific Real Time PCR
maupun Restriction Fragment Lengh Polymorphisme (RFLP) PCR.
Deteksi Dini Kanker Kolorektal
Tujuan skrining kanker kolorektal adalah deteksi dini, membuang lesi pre-
kanker dan mendeteksi penyakit pada stadium dini sehingga dapat dilakukan
terapi kuratif. Indikasi pemeriksaan dini atau skrining kanker kolorektal adalah
individu dengan risiko sedang dan risiko tinggi. Yang termasuk risiko sedang
adalah:
. Individu berusia tahun atau lebih;
. Individu yang tidak mempunyai riwayat kanker kolorektal atau
inflammatory bowel disease
. Individu tanpa riwayat keluarga kanker kolorektal;
. Individu yang terdiagnosis adenoma atau kanker kolorektal setelah berusia
tahun.
Yang termasuk risiko meningkat atau risiko tinggi adalah:
. Individu dengan riwayat polip adenomatosa;
. Individu dengan riwayat reseksi kuratif kanker kolorektal;
. Individu dengan riwayat keluarga tingkat pertama kanker kolorektal atau
adenoma kolorektal (rekomendasi berbeda berdasarkan umur keluarga saat
diagnosis);
. Individu dengan riwayat inflammatory bowel disease yang lama;
. Individu dengan diagnosis atau kecurigaan sindrom hereditary
nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) atau sindrom Lynch atau
familial adenomatous polyposis (FAP).
Selain itu dapat pula dilakukan pemeriksaan dini pada populasi. Pilihan
pemeriksaan skrining ditentukan berdasarkan risiko individual, pilihan individual
dan akses. Pada orang dewasa dengan risiko sedang, skrining harus dimulai pada
individu berusia tahun dengan pilihan berikut:
. Colok dubur
. FOBT atau FIT setiap tahun
. Sigmoidoskopi fleksibel setiap tahun
. Kolonoskopi setiap tahun
. Barium enema dengan kontras ganda setiap tahun
. CT kolonografi setiap tahun
Deteksi dini pada individual dengan risiko meningkat dan risiko tinggi
Rekomendasi skrining pada individual dengan risiko meningkat dibagi
menjadi :
. Pasien dengan riwayat polip pada kolonoskopi sebelumnya,
. Pasien dengan kanker kolorektal,
. Pasien dengan riwayat keluarga.
. Diagnosis Kanker Kolorektal
Berikut ini adalah gejala dan tanda yang menunjukkan nilai prediksi tinggi
akan adanya KKR. Keluhan utama dan pemeriksaan klinis:
- Perdarahan per-anum disertai peningkatan frekuensi defekasi dan/atau
diare selama minimal minggu (semua umur)
- Perdarahan per-anum tanpa gejala anal (di atas tahun)
- Peningkatan frekuensi defekasi atau diare selama minimal minggu (di
atas tahun)
- Massa teraba pada fossa iliaka dekstra (semua umur)
- Massa intra-luminal di dalam rectum
- Tanda-tanda obstruksi mekanik usus.
- Setiap pasien dengan anemia defisiensi Fe (Hb < g% untuk laki-laki atau
< g% untuk perempuan pascamenopause)
Pemeriksaan colok dubur
Pemeriksaan colok dubur dilakukan pada setiap pasien dengan gejala ano-
rektal. Pemeriksaan ini bertujuan untuk menetapkan keutuhan sfingter ani dan
menetapkan ukuran dan derajat fiksasi tumor pada rektum tengah dan distal.
Pada pemeriksaan colok dubur ini yang harus dinilai adalah:
- Keadaan tumor: Ekstensi lesi pada dinding rektum serta letak bagian
terendah terhadap cincin anorektal, cervix uteri, bagian atas kelenjar
prostat atau ujung os coccygis.
- Mobilitas tumor: untuk mengetahui prospek terapi pembedahan.
- Ekstensi dan ukuran tumor dengan menilai batas atas, bawah, dan sirkuler.
Pemeriksaan penunjang
. Endoskopi
Endoskopi merupakan prosedur diagnostik utama dan dapat dilakukan
dengan sigmoidoskopi (> tumor terletak di rektosigmoid) atau dengan
kolonoskopi total.
. Enema barium dengan kontras ganda
. CT colonography (Pneumocolon CT)
Modalitas CT yang dapat melakukan CT kolonografi dengan baik
adalah modalitas CT scan yang memiliki kemampuan rekonstruksi
multiplanar dan D volume rendering. Kolonoskopi virtual juga
memerlukan software khusus.
Tatalaksana Kanker Kolorektal
Penatalaksanaan kanker kolorektal bersifat multidisiplin. Pilihan dan
rekomendasi terapi tergantung pada beberapa faktor Terapi bedah merupakan
modalitas utama untuk kanker stadium dini dengan tujuan kuratif. Kemoterapi
adalah pilihan pertama pada kanker stadium lanjut dengan tujuan paliatif.
Radioterapi merupakan salah satu modalitas utama terapi kanker rektum. Saat ini,
terapi biologis (targeted therapy) dengan antibodi monoklonal telah berkembang
pesat dan dapat diberikan dalam berbagai situasi klinis, baik sebagai obat tunggal
maupun kombinasi dengan modalitas terapi lainnya.
. Komplikasi dan Prognosis Kanker Kolorektal
Tumor dapat menyebar ( ) melalui inflitrasi langsung ke struktur
berdekatan, seperti ke dalam kandung kemih, ( ) melalui pembuluh limfe ke
kelenjar limfe perikolon dan mesokolon; dan ( ) melalui aliran darah, biasanya ke
hati karena kolon mengalirkan darah ke sistem portal.
Kanker kolon memiliki sifat seperti kanker yang lain yakni: dapat tumbuh
dengan relatif cepat, dapat menginfiltrasi ke jaringan di sekitarnya kemudian
merusaknya, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kematian bila tidak
ditangani dengan baik. Namun prognosis relatif baik bila lesi terbatas pada
mukosa dan submukosa pada saat reseksi, dan jauh lebih buruk bila telah terjadi
metastasis ke kelenjar limfe.
CYP A * A T>C(rs )
Sitokrom P (CYP) merupakan keluarga besar enzim berjenis
hemeprotein yang berfungsi sebagai katalis oksidator pada lintasan metabolisme
steroid, asam lemak, xenobiotik, termasuk obat, racun dan karsinogen.
CYP
adalah enzim metabolit fase I dimana substrat teroksidasi.
Enzim metabolit fase
II sering menggunakan oksigen dalam metabolismenya, sehingga produk dapat
dibuang, dengan demikian terjadilah proses detoksifikasi, misal: Glutathinone S-
transferase dan N-acetyltransferase.
Oleh karena itu, dalam situasi ini,
regulasi gen CYP mungkin sangat protektif terhadap karsinogenesis.
Polimorfisme genetik yang cukup tinggi pada sitokrom P dapat
mempengaruhi kemampuan metabolik sehingga dapat menyebabkan perbedaan
kerentanan terhadap kanker kolorektal.
Salah satu polimorfisme CYP adalah CYP A yang terletak pada lengan
panjang kromosom q -qter.
CYP A diaktivasi dengan cara mengoksidasi
polutan seperti PAH menjadi karsinogen.
CYP A adalah salah satu gen yang
paling banyak diteliti karena perannya yang sangat penting dalam bioaktivasi
berbagai jenis zat eksogen terhadap turunan karsinogeniknya.
Selain itu
CYP A banyak terdapat di usus besar.
Gambar . Letak gen CYP A * A (rs ) di kromosom q -qter
Polimorfisme CYP A * A telah dikaitkan dengan peningkatan aktivitas
katalitik. Sehingga dengan demikian, individu yang memiliki variasi alel
CYP A * A diduga menunjukkan tingkat aktivasi karsinogen yang tinggi.
CYP A * A adalah variasi alel yang cukup banyak dimiliki oleh penduduk di
wilayah Asia (Jepang) daripada Kaukasia.
Variasi genetik CYP A * A sekitar
kali lebih sering di Jepang daripada di Kaukasia.
Frekuensi variasi alel
adalah pada Kaukasia, pada Asia, and pada Afrika.
Penelitian pada populasi Saudi Arabia menunjukkan bahwa varisi alel
CYP A * A secara signifikan dikaitkan dengan dengan kejadian kanker
kolorektal. Penelitian ini menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen CYP A
empat kali lebih tinggi pada kanker kolorektal dibandingkan dengan jaringan
normal yang menjadi kontrol yang diukur dengan qPCR. Hal tersebut
menunjukkan bahwa tingkat mRNA yang tinggi pada CYP A di jaringan tumor
dibandingkan dengan jaringan normal. Temuan tersebut dikonfirmasi oleh studi
imunohistokimia dengan menggunakan antibodi anti-sitokrom P A
sehingga dapat dilihat bahwa jaringan kanker usus besar mengekspresikan protein
CYP A lebih banyak.
Pada penelitian di Turki dapat diketahi bahwa CYP A * A T/C
(rs ) secara signifikan diikuti dengan faktor resiko kanker kolorektal
dimana pasien yang memiliki alel C memiliki resiko yang lebih tinggi untuk
terkena penyakit kanker kolorektal dibandingkan alel T.
Pada penelitian di
Jepang, seseorang yang tidak merokok maka genotip CYP A * A T/C
dibandingkan dengan T/T maka memiliki peningkatan resiko sebesar x untuk
terjadinya kanker kolorektal, sementara untuk C/C tidak ada peningkatan yang
cukup signifikan. Pada penelitian ini juga ditemukan bahwa alel heterozigot untuk
CYP A * A memiliki resiko yang paling besar untuk terjadi kanker koloretal.
CYP A * A T/C dan NAT memiliki efek yang signifikan untuk terjadinya
kanker kolorektal pada seseorang yang tidak merokok dibandingkan polimorfisme
gen yang lainnya (CYP A * C, CYP A * C, CYP A * F, GTSM ).
Sehingga CYP A * A T/C dan NAT berpotensi sebagai biomarker genetik.
Penelitian di Turki dan Jepang menunjukkan tidak ada perbedaan yang
signifikan antara seseorang yang menderita kanker kolorektal dan seseorang yang
sehat jika dilihat dari usia dan jenis kelamin.
Empat penelitian yang dilakukan
di populasi Asia diketahui bahwa pembawa alel C dari CYP A * A memiliki
kali peningkatan risiko kanker kolorektal dibandingkan dengan pembawa
alel T.
Pada studi variasi genetik, genetik yang berhubungan dengan
polimorfisme CYP A * A dan CYP A * C memberikan kali lipat
peningkatan aktivitas katalitiknya.
Namun, tidak semua penelitian menunjukkan bahwa terdapat hubungan
yang signifikan antara polimorfisme CYP A * A dengan kejadian kanker
kolorektal. CYP A * A tidak terkait dengan perkembangan kanker kolorektal di
Inggris, Kaukasia, Lebanon, Skotlandia dan kulit putih non-Hispanik lainnya. -
Polimorfisme genetik individu dalam metabolisme karsinogen mungkin tidak
secara signifikan terkait dengan kanker kolorektal. Namun, mereka mungkin
memiliki peran penting pada individu yang terpapar dengan karsinogen, seperti
. polutan pada lingkungan
. hormon steroid.
. geografis.
. pola makan.
Isolasi Genom
. Persiapan untuk Human Genomic DNA
Secara umum, sekitar % DNA terdapat di dalam nukleus (kromosom).
Pada studi genetika, isolasi DNA lebih banyak berasal dari sel darah tepi. Namun
karena prosedurnya yang invasif, sulit untuk memperoleh sampel dari teknik
tersebut. Sumber DNA lain dapat berasal dari sel mukosa pipi yang diperoleh
dengan pencucian mulut menggunakan salin (teknik yang non invasif dan tidak
menyebabkan perdarahan). Isolasi DNA dari sel bucal lebih murah dan
membutuhkan jumlah yang sedikit, dan dapat disimpan dalam waktu yang lama.
Teknik lain menggunakan folikel rambut dan biasa digunakan sebagai teknik
investigasi pada kasus kriminal. Sampel yang berasal dari urin bermanfaat dalam
mendeteksi kasus doping dan drug screening test. Tujuan dari isolasi DNA adalah
mengisolasi dan mempurifikasi berat DNA dalam jumlah yang banyak. Berikut
ini beberapa tahapan dalam purifikasi DNA.
a. Cell breakage (pemecahan sel)
Pemecahan sel merupakan langkah awal dalam purifikasi DNA.
Teknik ini dapat membuka sel dan memperoleh DNA yang intak
menggunakan bahan kimia berupa detergen dan / prosedur enzmatis.
Detergen dapat melarutkan asam lemak membran sel dan mengakibatkan sel
lisis. Detergen juga memiliki efek inhibitor terhadap seluruh DNAse enzim
selular dan dapat mendenaturasi peotein, dengan demikian membantu dalam
membersihkan protein dari larutan tersebut.
b. Removal of protein ( Membuang protein)
Langkah kedua dalam purifikasi adalah membuang kontaminan
berupa protein dari sel lisis. Prosedur ini disebut dengan deproteinisasi.
Prinsip kerja prosedur ini bergantung pada perbedaan bentuk fisik antara
asam nukleat dan protein. Perbedaan ini terletak pada kelarutan, volume
spesifik parsial, sensitivitas terhadap enzim pencernaan.
Deproteinisasi menggunakan pelrut orgenik merupakan cara yang
umum digunakan. Asam nukleat merupakan molekul hidrofilik yang sangat
mudah larut di dalam air. Sedangkan protein, mengandung banyak residu
hidrofobik yang menyebabkan protein secara parsial larut di dalam pelarut
organik. Pelarut organik biasanya mengandung fenol dan kloroform.
Metode yang menggunakan fenol sebagai agen deproteinisasi dikenalkan
oleh Kirby ( ), sehingga dikenal sebagai Metode Kirby. Penggunaan
campuran kloroform isoamil alkohol dikenalkan oleh Marmur, sehingga
dikenal Metode Marmur. Metode ini mendasari banyak modifikasi dan
pengembangan dari waktu ke waktu.
Penggunaan fenol pada metode Kirby memiliki beberapa prinsip.
Fenol pada suhu ruang akan membentuk suspensi yang mengandung
butiran-butiran fenol tersebar di dalam molekul air. Molekul protein secara
umum mengandung banyak residu hidrofobik, yang mana terkonsentrasi di
bagian tengah molekul. Ketika protein bercampur dengan fenol dalam
volume yang sama, beberapa molekul fenol akan terlarut dalam fase cair
(kurang lebih air dan fenol). Sehingga fenol dapat menembus
masuk ke dalam protein, menyebabkan protein membengkak dan rusak.
Protein yang telah terdenaturasi akan larut di dalam fenol. Sehingga tersisa
asam nukleat. Asam nukleat tidak memiliki molekul yang bersifat
hidrofobik sehingga tidak larut di dalam fenol.
Kekurangan metode Kirby adalah produk oksidasi dari fenol dapat
bereaksi secara kimia dengan molekul DNA (dan RNA). Fenol juga sangat
toksik dan membutuhkan prosedur pembuangan. Untuk mengurangi efek
tersebut, beberapa modifikasi yang dapat dilakukan sebagai berikut:
- Menggunakan detergen ionik
- Menggunakan reaksi enzimatis untuk membuang protein sebelum
ekstraksi fenol. Hal tersebut menurunkan kebutuhan fenol yang akan
digunakan. Sehingga kemungkinan hilangnya molekul DNA dapat
diturunkan.
- Menambahkan -hydroxyquinoline ( HQ) ke dalam fenol. HQ
meningkatkan kelarutan fenol di dalam air. Dengan adanya senyawa
ini, fenol dapat diencerkan pada suhu ruang dengan air. HQ juga
mudah teroksidasi sehingga memegang peranan penting dalam anti-
oksidan, menjaga fenol mengalami oksidasi. Bentuk dari HQ
berwana kuning dan saat teroksidasi menjadi tidak berwarna, hal ini
merupakan indikator yang baik yang dapat terlihat.
Penggunaan dari metode Marmur berdasarkan pada karakteristik dari
pelarut organik. Kloroform tidak larut dalam air dan meskipun banyak
ekstraksi tidak mengakibatkan hilangnya DNA ke dalam fase organik.
c. Removal of RNA (Membuang RNA)
Prinsip pembersihan RNA dari DNA menggunakan rekasi enzimatik.
Konsekuensi dari prosedur ini tidak dapat membuang semua RNA secara
bersih. Prosedur ini menggunakan dua ribonuklease, yaitu ribonuklease A
dan ribonuklease TI.
Ribonuklease A (RNase A) merupakan endoribonuklease yang dapat
memotong RNA setelah residu C dan U. Reaksi tersebut menghasilkan
oligonukleotida yang diakhiri dengan ’-phosphorylated pyrimidine
nucleotide. Ribonuklease TI (RNase TI) memotong dsRNA dan ssRNA
setelah residu G, menghasilkan oligonukleotida yang diakhiri dengan ’-
phosphorilated guanosine nucleotide. Karena kedua enzim tersebut spesifik
terhadap RNA, penggunaan kedua enzim tersebut dalam RNA removal pada
sampel DNA sangat direkomendasikan. Penggunaan hanya salah satu enzim
akan menghasilkan DNA yan terkontaminasi dengan oligonukleotida dalam
jumlah yang banyak. Sehingga dapat mengganggu pembacaan
spektrofotometri.
d. Concentrating the DNA (pemekatan DNA)
DNA didapatkan dengan cara pengendapan menggunakan alkohol.
Dalam prosedur ini digunakan dua macam alkohol yakni ethanol dan
isopropanol. Pengendapan menggunakan alcohol berdasarkan pada
fenomena penurunan kelarutan asam nukleat di dalam air. Kutub positif air
berinteraksi secara kuat dengan kutub negatif kelompok fosfodiester DNA.
Interaksi ini menyebabkan DNA larut dalam air. Sedangkan ethanol tidak
dapat berinterkasi dengan kutub negatif DNA seperti air. Sehingga asam
nukleat tidak larut dalam ethanol.
Penggantian molekul air di dalam DNA dapat menyebabkan
DNA mengendap. Untuk mengendapkan DNA dengan konsentrasi ethanol
yang rendah, aktivitas dari molekul air harus diturunkan. Hal ini dapat
dilakukan dengan cara menambahkan garam di dalam larutan DNA.
e. Determination of the Purity and quantity of DNA (Pengukuran kemurnian dan
jumlah konsentrasi DNA)
Untuk mengukur kemurnia DNA hasil isolasi, dapat dilakukan
pembacaan dengan alat spektofotometer menggunakan cahaya ultraviolet
(UV). Keberadaan kontaminan berupa protein dapat diketahui dari rasio nilai
optical density (OD) hasil isolasi pada panjang gelombang nm dan
nm. Hasil isolasi dinyatakan murni bila nilai rasio A : A adalah .
Jika rasio kurang dari , maka konsentrasi DNA dapat dihiung dengan
menggunakan rumus sebagai berikut.
N(μg ml-
) = A – A
A dan A merupakan daya serap DNA pada panjang gelombang
nm dan nm. Indikator yang lebih baik untuk kemurnian sampel DNA
adalah rasio A : A . DNA memiliki daya serap minimum pada nm
dan daya serap protein tinggi pada nm. Rasio A : A merupakan
indikator yang sangat sensitif untuk menentukan kontaminasi protein. Rasio
antara - menunjukkan asam nukleat yang murni. A dan A
merupakan daya serap sampel DNA pada panjang gelombang nm dan
nm. Dengan menggunakan kedua panjang gelombang tersebut, konsentrasi
DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
N(μg ml-
) = A – A
Identifikasi kontaminasi memiliki makna tertentu. Jika rasion
rendah, maka terdapat kontaminan yang diserap pada gelombang . Hal
tersebut bisa disebabkan oleh fenol atau reagen lain pada protokol dan
konsentrasi asam nukleat yang sangat rendah sekali (< ng/uL). Meskipun
kualitas DNA merupakan hal penting, namun bergantung kembali pada teknik
apa yang digunakan.
. Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA
Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain
dengan cara diekstraksi atau dilisiskan, biasanya dilakukan dengan homogenisasi
dengan penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak.
Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang
murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform dan isoamil alkohol. Proses
selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan
yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk
debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.
Kontaminan yang umum ditemukan diantaranya adalah polisakarida yang
dapat mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjadi hambatan aktivitas
Taq polimerase, atau kontaminan lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk
teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal
ini, maka jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses
ekstraksi.
Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi
DNA dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua
bahan yang lain akan larut dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan
sentrifugasi, maka DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau
bahan lain. Pada sampel darah, presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu
supernatan dipisahkan dari protein atau debris sel dengan pemberian larutan
garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh supernatan DNA yang
kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi, siapkan tabung
yang berisi etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet μL,
dan pindahkan ke tabung yang berisi etanol.
Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning
atau sekuensing, maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan
(mempunyai kemurnian tinggi) dan memiliki berat molekul yang tinggi. Selama
proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat terjadi antara lain:
- DNA patah-patah selama proses isolasi
- DNA terdegradase oleh enzim nuklease
- Terjadi kontaminasi oleh polisakarida
- Metabolit sekunder ikut terisolasi.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Teknologi PCR (Polymerase chain reaction) merupakan suatu proses
sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi fragmen DNA secara in vitro. ,
Teknik PCR dapat meningkatkan jumlah fragmen DNA hingga mencapai -
kali dalam waktu singkat. Pada setiap n siklus PCR, akan diperoleh sebanyak
n kali DNA target. Keberhasilan PCR sangat tergantung pada kemampuannya
untuk hanya memperbanyak (amplifikasi) DNA target dan tidak memperbanyak
DNA non target.
Salah satu keuntungan PCR adalah teknik ini lebih baik dari
teknik kloning biasa, karena tidak perlu pemurnian bahan. Teknik PCR ideal
untuk menganalisis campuran DNA kompleks dari jaringan atau cairan biologi.
. Komponen dalam PCR
. Deoksiribonuklease trifosfat (dNTP)
dNTP digunakan sebagai sumber nukleotida pada proses PCR. Sintesis
DNA menggunakan dNTP yang mengandung deoksiguanosin trifosfat (dGTP),
dan deoksitimin trifosfat (dTTP). dNTP dihubungkan dengan primer melalui
ikatan kovalen dimana gugus hidroksil bebas (OH) dari primer berikatan dengan
gugus fosfat dari nukleotida. Konsentrasi dNTP yang digunakan berkisar -
mM untuk setiap rekasi, dan masing-masing dNTP harus memiliki konsentrasi
yang ekuivalen.
Pola hasil amplifikasi ditentukan oleh DNA cetakan dan kespesifikan
primer yang digunakan. DNA yang digunakan sebagai cetakan pada PCR tidak
harus memiliki BM yang tinggi, karena jumlah DNA yang dibutuhkan sangat
sedikit, yaitu sekitar μM. Akan tetapi, bila konsentrasi DNA telah diketahui,
maka jumlah yang biasa digunakan pada setiap perbanyakan DNA adalah -
ng untuk setiap reaksi. Bila DNA terlalu banyak digunakan, maka pada proses
PCR selain menyebabkan pita DNA pada gel agarosa menjadi kabur, juga
menyebabkan rantai DNA akan bergabung kembali membentuk ikatan ganda
terpilin (double helix).
. Primer
Primer adalah rantai DNA pendek dari ssDNA yang terdiri atas beberapa
nukleotida. Polymerase dimulai dengan mensintesis DNA baru dari ujung primer.
Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari A, T, G, dan
C, yang pada merupakan membentuk DNA baru. Primer yang umum digunakan
terdiri atas atau lebih nukleotida (oligonukleotida). Primer berfungsi sebagai
pemula pada proses sintesis DNA dengan PCR. Contoh primer oligonukleotida
yang digunakan misalnya TGAGCGGACA.
Konsentrasi primer PCR berkisar - μM. Konsentrasi primer yang
tinggi (≥ μM) dapat meningkatkan kesalahan penempelan primer pada DNA
cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak spesifik dan akan
mengganggu analisis. Namun, penggunaan konsentrasi yang terlalu rendah akan
memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas. Primer yang biasa digunakan
adalah primer spesifik dan primer acak (tersusun atas nukleotida sembarang yang
belum diketahui dengan jelas susunan nukleotidanya).
. Enzim Taq DNA polimerase
Enzim ini pertama kali diisolasi oleh Kary Mullis ( ) dari bakteri
Thermus aquaticus YT yang hidup di sumber air panas Yellowstone Nasional
Park California. Enzim ini dikenal sebagai Taq DNA polimerase yang sekarang
telah beredar secara komersial. Enzim ini mampu mempertahankan aktivisnya
pada suhu tinggi (sampai ˚C) walaupun dilakukan pemanasan beberapa kali
Enzim pertama dan paling umum digunakan enzim ini adalah Taq DNA
polymerase (dari Thermis aquaticus), sedangkan Pfu DNA polimerase (dari
Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena keakuratan yang lebih tinggi
saat menyalin untaian DNA. Meskipun kedua enzim ini berbeda, namun tetap
memiliki kemampuan yang baik untuk digunakan PCR, yakni: dapat
menghasilkan untaian baru DNA menggunakan template DNA dan primer, tahan
panas.
Konsentrasi Taq DNA polimerase berkisar - unit untuk setiap
reaksi. Konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menyebabkan hasil yang diperoleh
menjadi tidak spesifik, dan pita DNA pada gel agarosa menjadi menyebar,
sedangkan konsentrasi yang terlalu rendah akan menghasilka pita yang terlalu
tipis sehingga sulit diidentifikasi.
. Ion Mg +
dan Bufer
Faktor lain yang penting dalam PCR adalah bufer dan ion Mg +
.
Konsentrasi ion Mg +
sangat berpengaruh pada proses PCR, karena menentukan
aktivitas enzim Taq DNA polimerase. Ion ini berfungsi sebagai kofaktor bagi
enzim Taq DNA polimerase dengan konsentrasi maksimum sebesar mM.
Konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat menghambat dan menyebabkan
penempelan primer terganggu, dan menghasilkan pita-pita yang kompleks.
Komposisi bufer PCR terdiri dari Tris-HCl dan Triton X- yang kondisi
optimumnya tergantung pada enzim yang digunakan. Biasanya pH bufer yang
digunakan berkisar - .
. . Tahapan PCR
. Denaturasi
Denaturasi awal dilakukan sebelum enzim Taq polimerase ditambahkan di
dalam tabung reaksi. Proses ini berlangsung sekitar menit untuk memastikan
bahwa molekul DNA target yang akan dilipatgandakan telah terdenaturasi
menjadi DNA untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan
hanya detik pada suhu ˚C atau detik pada suhu ˚C Apabila DNA
target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi dapat juga dinaikkan.
Denaturasi yang tidak sempurna mengakibatkan DNA mengalami renaturasi
(membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat. Dan akan mengakibatkan
gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat
mengurangi aktivitas enzim Taq polymerase. Aktivitas enzim tersebut mempunyai
waktu paruh lebih dari jam, menit, menit masing-masing pada suhu ;
; dan ˚C
Gambar . Gambar tahapan PCR
. Penempelan Primer (Annealing)
Kriteria yang umum digunakan untuk merangcang primer yang baik
adalah bahwa primer sebaiknya berukuran - basa, mengandung -
G+C dan Tm (˚C) terhitung untuk kedua primer sebaiknya sama Selain itu
sekuens DNA kedua primer tidak saling berkomplemen karena akan
memungkinkan terjadinya penempelan antar primer yang kemudian membentuk
primer-dimer. Sekuens DNA di dalam masing-masing primer itu sendiri juga
sebaliknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan
terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi
PCR.
Temperatur penempelan yang digunakan biasanya ˚C dibawah Tm
dimana formula untuk menghitung Tm= (G+C) + (A+T). Semakin panjang
ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan
yang digunakan antara ˚C sampai dengan ˚C; namun suhu yang biasa
digunakan antara - ˚C
. Pemanjangan Primer (Extension)
Selama tahap ini, Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang
DNA primer dari ujung ’ Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut
pada suhu ˚C diperkirakan antara - nukleotida per detik, bergantung
pada bufer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian,
untuk produk PCR sepanjang pasang basa, waktu menit sudah lebih dari
cukup untuk tahap pemanjangan primer ini. Biasanya, di akhir siklus PCR, waktu
yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai menit, sehingga seluruh
produk PCR diharapkan berbentuk DNA untai ganda.
. Amplifikasi (Amplification)
Campuran yang dipanaskan lagi pada suhu - ˚C untuk denaturasi
molekul dan memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru kemudian
bertindak sebagai template untuk siklus sintesis berikutnya. Jadi amplifikasi hasil
pada eksponensial (logaritmik) tingkat, yaitu jumlah DNA yang dihasilkan ganda
pada tiap siklus. Produk diperkuat pada akhir PCR yang disebut amplikon.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) adalah salah satu
teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat
sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk
membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan
dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Enzim
restriksi ini diperoleh dari spesies bakteri yakni: EcoRI adalah enzim RE yang
dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain RI, BamHIII diperoleh dari
bakteri Bacillus americanus strain HIII.
Pada RFLP, sampel DNA akan dipotong oleh enzim restriksi, dimana
enzim restriksi ini mengenali lokasi spesifik yang disebut “lokasi restriksi”
Dengan adanya berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisme, hal ini mampu
mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-
fragmen dengan panjang yang berbeda ketika dilakukan pemotongan oleh enzim
restriksi. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan
elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa
digunakan untuk pengujian sebuah pola dan memiliki aplikasi forensik, uji
paternitas RFLP juga dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi dan menentukan
status penyakit individu. ,
. . Restriksi Endonuklease
Kloning gen didasarkan atas peran enzim-enzim modifikasi tersebut dalam
memotong vektor, DNA target, memasukkan DNA target maupun
menggandakannya. Salah satu enzim restriksi endonuklease yang berperan
penting dalam kloning gen adalah ER tipe II (RE). Ciri utama ER ini adalah setiap
enzim mengenal urutan spesifik pada molekul DNA yang akan dipotong. RE
tertentu akan memotong pada urutan pengenal dan tidak memotong daerah urutan
lainnya.
Gambar . Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A pada
sekuens GAATTC
Beberapa enzim mengenali urutan heksanukleotida BanHI yaitu
GGATCC-, tetranukleotida Alul yaitu AGTC-, atau pentanukleotida dengan basa
pengenalan umum misalnya Hinfl yaitu GANTC-.Hasil pemotongan enzim RE ini
menghasilkan ujung tumpul (blunt end) maupun ujung lengket (sticky end). Hal
yang perlu diketahui adalah aktivitas enzim akan maksimal pada komposisi buer
yang spesifik, terkadang bagi enzim yang aktivitasnya rendah bisa dimaksimalkan
dengan menambahkan bovine serum albumin (BSA) sebagai aktivator. Akan
tetap, untuk RE yang mempunyai aktivitas tinggi seperti EcoRI, penambahan
BSA akan menurunkan aktivias enzim ini secara tajam. Enzim EcoRI memotong
DNA pada bagian dari sebuah palindrom dengan kata lain segmen pendek DNA
di mana keduanya, untai dan untai yang berlawanan memiliki urutan yang sama
(masing-masing dibaca dari arah `- `) .
. . Prinsip deteksi RFLP
Pada restriksi dilakukan dengan mencampurkan DNA hasil PCR dengan
enzim restriksi. Kemudian diinkubasi pada suhu tertentu minimal jam. Setelah
restriksi selesai, dilakukan elektroforsis menggunakan gel polyacrylamid.
Keuntungan dari penggunaan PCR RFLP:
. Murah
. Mudah dalam mendesign
. Dapat digunakan untuk menganalisa nukleotida polimorfisme maupun
microindels
. Tidak membutuhkan alat yang mahal
. Tidak menggunakan pelatihan ekstensif bagi staf laboratorium
. Miniaturisable (mudah dipetakan dalam peta genetik)
. Besifat stabil (tidak mudah berubah hasilnya bila diulang)
Kerugian dari penggunaan metode RFLP adalah:
. Membutuhkan variasi yang dapat menghasilkan atau menghapuskan
lokasi pengenalan enzim restriksi
. Beberapa enzim restriksi harganya cukup mahal
. genotip tertentu tidak dapat dikenali ketika terdapat lebih dari variasi
nukleotida dalam pengenalan lokasi enzim restriksi
. Membutuhkan waktu yang lebih banyak dalam pengerjaannya
. Membutuhkan waktu yang lebih lama dari awal dilakukannya PCR
hingga selesai analisis
. Tidak cocok untuk high-throughput analysis
. Membutuhkan DNA dalam jumlah besar.
. . Analisis Hasil RFLP
Satu dari alel RFLP tidak dapat dikenali oleh enzim restriksi sehingga
terjadi hanya satu fragmen (bulat hitam penuh pada pohon kelurga). Di alel yang
lain, enzim restriksi mampu mengenali posisi dan menghasilkan fragmen (kotak
putih pada phon keluarga). Dan pada yang lainnya terdapat fragmen dimana
enzim restriksi hanya mampu mengenali lokasi pada salah satu alel sehingga
hanya satu alel menjadi fragmen dan alel lainnya tetap utuh.
Gambar Hasil Pemotongan DNA dengan enzim restriksi akan menghasilkan
homozigot murni, hetereozigot varian, homozigot varian.
Elektroforesis
DNA dapat bermigrasi di dalam gel dalam bentuk padat yang diletakkan
dalam larutan penyanggah yang dialiri arus listrik. Sedikitnya, ada jenis gel
yang seirng digunakan untuk proses elektroforesis yakni gel agarose dan gel
polyacrilamida.
. Gel Agarose
Secara fisik tampak seperti bubuk putih yang sangat halus. Agarose yang
dijual secara komerisial terkontaminasi dengan polisakarida, garam, dan protein.
Banyak sedikitnya kontaminasi di dalam gel dapat mempengaruhi migrasi DNA
di dalam gel dan kemampuan mengambil DNA dari dalam gel untuk digunakan
sebagai substrat dalam reaksi enzimatis. Gel agarose dapat dicetak dengan
memanaskan agarose yang dilarutkan dalam larutan buffer sampai didapatkan
larutan jernih. Larutan yang masih cair (dengan temperatur sekitar ˚C)
dituangkan ke dalam pencetak gel. Segera setelah itu, sisir ditempatkan di dekat
tepian gel dan gel dibiarkan mengeras. Kepadatan gel bergantung dari presentase
agarose di dalam larutan tersebut. Apabila gel telah mengeras, sisir dicabut
sehingga akan terbentuk sumur-sumur yang digunakan untuk menempatkan
larutan DNA. Jika gel ditempatkan ke dalam tangki elektroforesis yang
mengandung larutan buffer dan tangki tersebut dialiri listrik, molekul DNA yang
bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak (migrasi) ke arah positif
(anode).
Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor diantaranya;
) Ukuran molekul DNA
Ukuran dan stuktur molekul DNA/RNA mempengaruhi mobilitas saat
dielektroforesis. Secara berurutan mobilitas molekul berbeda dalam hal
kecepatan: sirkular > linear, fragmen DNA > genom utuh. Migrasi molekul
DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran
kecil.
) Konsentrasi agarose
Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi rendah lebih cepat
daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi.
Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarose dalam membuat gel harus
memperhatikan ukuran molekul DNA yang dianalisis. Molekul besar seperti
genom utuh dielektroforesis dengan agarose berkonsentrasi , sedangkan
hasil amplifikasi DNA, dielektroforesis dengan konsentrasi yang lebih tinggi
yaitu - %.
) Konformasi DNA
Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan
bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda. Pada beberapa kondisi tertentu
(konsentrasi agarose, aliran listrik, ion di dalam larutan buffer), molekul
DNA yang membelit-belit bermigrasi lebih cepat daripada molekul DNA
linier, tetapi pada kondisi lainnya kecepatannya menjadi terbalik.
) Voltase yang digunakan
Pada voltase rendah, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan
tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi, apabila penggunaan voltase
dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat secara lebih tajam. Hal ini
dapat mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun dengan
meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk
mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar Kb adalah tidak
lebih dari Volt per cm.
DNA/RNA merupakan molekul bermuatan negatif. Voltase V biasa
digunakan untuk analisis rutin, sedangkan bila diperlukan pemisahan yang
sempurna maka digunakan voltase V. Pada voltase V ini, walaupun lebih
lambat tetapi hasil pemisahannya lebih maksimal.
) Adanya ethidium bromide di dalam gel
Pewarna etidium bromida (EtBr) digunakan untuk alat identifikasi dan
mengukur semikualitatif fragmen DNA yang terpisah dalam gel. Etbr ini akan
terikat diantara dua untai ganda DNA, sehingga pita DNA dalam gel agarosa
akan berpendar karena pewarna ini mengandung zat fluoresen. Ikatan DNA-
EtBr ini akan terkspos pada sinar UV level medium, sekitar panjang
gelombang λ nm. Etidium bromida dapat diberikan pada setiap sampel
yang akan dimasukkan ke sumur gel atau dicampurkan ke gel agarosa
sebelum gel dicetak ke dalam cetakan gel. Intesitas fluoresen dapat diukur
dengan menggunakan DNA penanda standar, sehingga kuantitas DNA dapat
diperkirakan, misalnya antara - μg/mL.
Pewarna etidium bromida (EtBr) mengakibatkan pengurangan tingkat
kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar . Larutan ini sangat
berbahaya dan bersifat carcinogenic.
) Komposisi larutan buffer.
Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik
akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan
buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik
menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA
dapat mengalami denaturasi. Beberapa larutan buffer yang digunakan terdapat
pada tabel dibawah ini.
Tabel . Konsentrasi Larutan Buffer yang Dapat Dibuat
Buffer Konsentrasi yang
digunakan
Konsentrasi yang biasa dibuat
(per liter)
Tris-acetate
(TAE)
X : Tris-acetate
M EDTA
X : g Tris base ml
glacial acetic acid ml M
EDTA (pH. )
Tris-borate
(TBE)
X : M Tris-
borate M EDTA
X : g Tris base g boric
acid mL M EDTA (pH. )
) Suhu
Molekul DNA akan cepat terurai pada suhu tinggi dan akan kembali
menyatu bila suhu ruangan mendingin.
Kerangka Teori
Makanan
(daging merah)
Genetik Zat karsinogenik
(Merokok, polusi)
Geografi
Polimorfisme CYP A * A
rs (T>C)
Peningkatan aktivitas
katalitik kali lipat
Tingkat aktivasi karsinogen
tinggi
Hiperplasia sel
Displasia sel
Kanker kolorektal
Manifestasi Klinis : Perdarahan saluran cerna bawah, peningkatan
frekuensi defekasi, terdapat massa pada usus, tanda obstruksi
mekanik usus
Kerangka Konsep
Polimorfisme gen CYP A * A
(rs ) (T>C)
Identifikasi polimorfisme gen
dengan teknik PCR-RFLP
Didapatkan SNP CYP A * A
(rs ) (T>C) pada
individu
Heterovarian Homo murni Homo varian
Penyebab kanker
(salah satunya kanker
kolorektal)
Modifikasi
lingkungan
Perubahan
gaya hidup
Perubahan
pola makan
Definisi Operasional
Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah-istilah yang didefinisikan
sebagai berikut.
Tabel . Definisi operasional
No Variabel Definisi Alat
Ukur
Skala Skor
SNP rs
(T > C)
Variasi
sekuensing
DNA pada
gen
CYP A* A
. Homozigot murni
. Heterozigot varian
. Homozigot varian
BAB III
METODE PENELITIAN
Desain penelitian
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah deskriptif yaitu dengan
melakukan skrining untuk melihat polimorfisme gen CYP A * A (rs )
(T>C) yang menjadi salah satu faktor resiko kanker kolorektal terhadap
mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah angkatan - . Penelitian ini
dilakukan dengan menggunakan metode PCR RFLP.
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Juli hingga Juli di Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan
melakukan studi deskriptif untuk melihat pola variasi genetik pada mahasiswa
Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan hingga .
Populasi Penelitian dan Sampel
Populasi Target
Populasi target adalah responden pria dan wanita mahasiswa FKIK UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta
Populasi Terjangkau
Populasi terjangkau penelitian ini adalah responden pria dan wanita
mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan hingga
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Kriteria Pemilihan
Kriteria pemilihan sampel dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi
dan eksklusi. Kriteria inklusi mahasiswa aktif Program Studi Kedokteran dan
Porfesi Dokter angkatan hingga yang telah mengisi lembar informed
consent (lampiran ). Pada penelitian ini kriteria eksklusi tidak ditentukan karena
peneliti ingin melihat hasil skrining seluruh sampel dan melihat hubungan antara
hasil skrining. Kriteria drop out dalam penelitian ini adalah mahasiswa yang
menolak sebagai responden
Perkiraan Besar Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel DNA yang
diambil sebanyak sampel dari total mahasiswa Program Studi Kedokteran
dan Porfesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah angkatan - . Dalam
penentuan jumlah sampel, peneliti menggunakan perhitungan deskriptif kategorik.
Deskriptif kategorik yaitu penelitian yang bertujuan untuk menggambarkan
proporsiatau rerata suatu variabel dan hasil pengukurannya dikelompokkan
dengan klasifikasi tertentu.
Rumus perhitungan adalah:
Keterangan:
N : Besar sampel
Zα : nilai distribusi normal baku pada tabel Z
P : Proporsi dari penelitian sebelumnya
Q : -P
D : Presisi (ditentukan oleh peneliti)
Zα yang dipilih yaitu % karena penelitian kedokteran menggunakan
dan dan arah karena menyatakan ada perbedaan proporsi tanpa menyebutkan
secara spesifik yaitu sebesar . Proporsi penelitian sebelumnya di Indonesia
dari data IARC ( ) prevalensi kanker kolorektal di Indonesia yaitu sebesar
. Presisi yang digunakan oleh peneliti yaitu karena presisi merupakan
kesalahan penelitian yang masih bisa diterimauntuk memprediksi yang akan
diperoleh dengan selisih kurang lebih masih dapat diterima.
Teknik Pemilihan Sampel
Sampel yang dipilih berdasarkan Simple Random Sampling dimana sampel
diambil secara acak dari jumlah yang telah ditentukan. Subjek yang terlibat
terlebih dahulu menyatakan kesediaannya untuk menjadi subjek penelitian dengan
menandatangani lembar inform consent. Selanjutnya subjek yang bersedia
mengisi dan menandatangani inform consent secara sukarela memberikan - mL
darahnya untuk dilakukan screening genetik. Sampel darah dimasukkan ke tabung
EDTA dan diberi nomor, selanjutnya disimpan dalam cold room untuk dilakukan
isolasi DNA, kemudian dilakukan PCR-RFLP dan terakhir dianalisa
menggunakan elektroforesis. Pengambilan sampel ini telah mendapat persetujuan
etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan, Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta (lampiran )
Alat dan Bahan Uji
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dijelaskan dalam tabel
sebagai berikut
Tabel . Alat dan bahan penelitian
Alat Bahan Keterangan
Pengambilan sampel (darah)
- Spuit cc
- Torniquet
- Tabung berisi EDTA
- Handscoon
- Alcohol Swab
Isolasi Genom DNA dari darah & deteksi gen spesifik
- Penangas air (Water bath) AS ONE
TRW - TP high temperature
Whole Blood μL
version
- Water destilation apparatus
ADVANTEC RFD NA
- Incubator EYELA NDO-
- Biomedical Freezer SANYO
- PCR Applied Biosystem Veritil
Well thermal
- GD column
- ml collection tube
- Tabung mikro untuk PCR
- Microcentrifuge Eppendarf R
- Micropipet BIOHIT ukuran -
μL
- Micropipet Nichipet EX Nichiryo
ukuran - μL dan - μL
- Micropipet BIORAD ukuran -
μL
- Mikrotip biologix ukuran μL,
μL dan μL
- Aluminium foil
RBC Lysis Buffer
GB Buffer
Ethanol Absolut
W Buffer
Wash Buffer
Elution Buffer
μL dan
μL
μL
μL
μL
μL
μL
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi DNA
- DeNovix DS- Spectrophotometer Genom DNA μL
- Aquadest
- Micropipet BIOHIT ukuran -
μL
- Mikrotip biologix ukuran μL
Elektroforesis genom DNA
- Elektroforesis ATTO My Power II
AE-
Agarose
Ethidium bromide
Loading dye
- Microwave SHARP lowwattage
- Timbangan analitik AdventureTM
- Gel doc system
- Printgraph ATTO AE- CF
CCD camera controller
- Penggaris sumur
- Gelas kimia/ botol pereaksi
- Gelas ukur sibata
Plastic Wrap
Buffer Tris Asetat
EDTA (TAE) x
Gambar alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada
lampiran
Cara Kerja Penelitian
. Pengumpulan Sampel
Sampel yang digunakan adalah whole blood mahasiswa PSKPD UIN
Jakarta angkatan - melalui punksi vena sebanyak - cc satu kali.
Sampel darah diambil dari orang. Subjek sebelumnya telah dimintai
persetujuan (informed consent).
Sampel darah dimasukkan ke tabung EDTA dan diberi nomor, selanjutnya
disimpan dalam cold room untuk dilakukan isolasi DNA, kemudian template
DNA diamplifikasi dengan teknik PCR.
Isolasi DNA
Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan
genom DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)
Geneaid GB dengan langkah kerja seperti dalam tabel .
Tabel . Tahapan isolasi genom DNA
Persiapan
Sampel
Fresh Blood
. Darah sebanyak μL kedalam ml tabung
mikrosnetrifugasi dimasukkan
. μL RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan
dikocok.
. Tabung diinkubasi menit dalam suhu ruangan
. Tabung disentrifugasi selama menit pada kecepatan
rpm selama menit, supernatan dibuang.
. μL RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk
mensuspensi endapan leukosit, kocok, kemudian
diproses dengan cell lysis
Langkah
Cell Lysis
. μL GB Buffer ditambahkan ke dalam tabung tadi
. Tabung diinkubasi pada suhu ᵒ C selama menit
untuk memastikan sampel terlisiskan
. Pada saat yang sama tabung lain berisi μL Elution
Buffer untuk tiap satu sampel disiapkan, kemudaian
diinkubasi pada suhu ᵒ C.
. Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung
didinginkan di suhu ruangan.
Langkah
DNA binding
. μL ethanol absolute ditambahkan kedalam tabung
tadi, kemudian secara cepat dikocok selama detik.
. Menyiapkan GD Column pada mL Collection Tube.
. Mencampuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD
Column.
. Tabung disentrifugasi pada – x g
selama menit
. Membuang cairan pada ml Collection Tube
. GD Column ditempatkan kembali pada ml Collection
Tube
Langkah
Wash
. Menambahkan μL W Buffer kedalam GD Column
kemudian disentrifugasi pada – x g
selama menit
. Membuang cairan pada ml Collection Tube
. GD Column ditempatkan kembali pada ml Collection
Tube
. Menambahkan μL Wash Buffer ke dalam GD
Column
. Tabung disentrifugasi pada – x g
selama menit
. Cairan pada ml Collection Tube dibuang
. GD Column ditempatkan kembali pada ml Collection
Tube
. Tabung disentrifugasi kembali selama menit untuk
mengeringkan matriks kolum
Langkah
DNA Elution
Standar volume elution buffer untuk sampel adalah μL.
Jika sampel yang digunakan dalam volume yangs edikit,
volume elusi sekitar - μL dapat meningkatkan konsentrasi
DNA
. GD Column yang sudah kering dipindahkan ke dalam
tabung mikrosentrifugasi yang steril
. μL Elution Buffer yang sudah diinkubasi
ditambahkan ke dalam matriks kolom, dibiarkan selama
menit
. Tabug disentrifugasi pada – x g selama
menit untuk mendapatkan hasil
Genom DNA yang telah diisolasi dinilai apakah sudah terisolasi atau tidak dengan
cara elektroforesis dan dibaca menggunakan Gel documentation.
Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya dengan
menggunakan alat DeNovix DS- Spectrophotometer. Memilih dsDNA pada
piliha menu. Meletakkan aquadest sebanyak μL, lalu diletakkan di lensa nano,
ditutup dan di-analized untuk me-reset. Kemudian bersihkan dengan
menggunakan kertas tissue, sebelum mengecek sampel lainnya. Sampel diambil
sebanyak μL, lalu diletakkan di lensa nano, ditutup dan di-analyzed. Hasil
kemurnian dan konsentrasi akan langsung terbaca dilayar dan tersimpan.
Optimalisasi Primer
Pada PCR menggunakan fragmen primer forward ( ’-
TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT- ’) dan fragmen primer reverse ( ’-
CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT- ’
Optimalisasi primer dilakukan untuk
mencari konsentrasi primer yang optimal sehingga didapatkan pita DNA yang
tebal dan dimer yang tidak terlihat (lampiran ).
Konsentrasi primer PCR berkisar - μM. Konsentrasi primer yang
tinggi (≥ μM) dapat meningkatkan kesalahan penempelan primer pada DNA
cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak spesifik dan akan
mengganggu analisis. Namun, penggunaan konsentrasi yang terlalu rendah akan
memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas.
Dan pada penelitian ini
dilakukan optimalisasi primer yakni dengan mengencerken primer hingga
konsentrasi mencapai μM (lampiran ).
Tata Kerja PCR
Pada proses ini diawali dengan langkah sebagai berikut:
. Membuat primer mix
) Membuat pengenceran primer dan primer dengan konsentrasi
akhir μM
) Menggabungkan primer induk yang telah diencerkan dengan
menambahkan dH O hingga mencapai konsentrasi μM (Primer
Mix)
. Pencampuran bahan
Mencampurkan dH O, PCR mix, primer (mix), primer (mix)
dan template DNA dengan jumlah yang terdapat pada tabel
Tabel . Prosedur PCR
Bahan-Bahan μl
dH O
PCR mix
Primer (mix)
Primer (mix)
Template DNA
. Proses PCR
Pada proses PCR dilakukan dengan inkubasi awal pada suhu ° C
selama menit, detik, diikuti oleh siklus serangkaian proses yang
terdiri dari denaturasi pada suhu C selama detik, annealing pada
C selama detik dan pemanjangan (elongation) pada ° C selama
detik. Proses PCR diakhiri dengan tahap pemanjangan akhir pada suhu
C selama menit. Produk PCR dianalisa menggunakan gel
elektroforesis dengan konsentrasi agarose sehingga didapatkan ukuran
produk PCR pada bp.
Tata Kerja RFLP
Produk PCR berupa gen CYP A * A rs (T>C) dipotong dengan
enzim restriksi MspI (batasan = C ^ CGG) pada suhu C selama jam. Setelah
itu produk RFLP dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose dan
diamati dengan GelDoc.
Tabel . Prosedur Restriksi Enzim
Bahan-Bahan μl
dH O
Buffer
Msp
Template DNA
. Analisis Data
Pengolahan data hasil pemeriksaan genotyping CYP A * A rs
(T>C) dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi .
. . Etika Penelitian
Penelitian ini memerlukan ethical clearance (lampiran ) dari panitia Etik
Penelitian PSKPD (Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter) UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta. Semua data yang didapat dari hasil penelitian yang
dipergunakan akan dijaga kerahasiaannya.
. . Alur Penelitian
Penilaian Genotyping (homozigot
murni, heterozigot varian dan
homozigot varian)
Mahasiswa PSPD UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan
-
Bersedia menjadi responden dan
mengisi lembar informed consent
Punksi Vena
Isolasi Genom DNA
Tes Kemurnian dan Konsentrasi
genom DNA
Penapisan gen CYP A * A
rs menggunakan teknik
PCR-RFLP
BAB IV
HASIL dan PEMBAHASAN
Hasil
Data Karakteristik Responden
Responden dalam penelitian ini adalah mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Porfesi Dokter angkatan - UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta. Responden terdiri dari laki-laki dan perempuan dengan rentang
usia - tahun (saat dilakukan pengambilan darah)
Tabel . Karakteristik jenis kelamin responden
Frekuensi Presentase (%)
Jenis Kelamin Laki-laki
Perempuan
Total
Berdasarkan tabel diketahui bahwa presentase laki-laki adalah dan
perempuan
Tabel . Karakteristik usia responden
Usia Responden (tahun) Frekuensi Presentase (%)
Total
Berdasarkan tabel diketahui bahwa presentase usia terbanyak dari
responden adalah tahun. Rerata usia responden adalah
Hasil Isolasi DNA Genom dan PCR dari Sel Darah (whole blood)
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah responden
mahasiswa PSPD UIN Jakarta - . Sampel yang dipakai adalah darah
yang selanjutnya diisolasi untuk mendapatkan DNA. Isolasi dan purifikasi DNA
genom dari sampel darah dilakukan berdasarkan protokol Geneaid GB . Hasil
isolasi ini dianalisis secara kualitataif dengan teknik elektroforesis gel agarosa
menggunakan gel doc system untuk memastikan keberadaan dari DNA target.
Hasilnya dapat dilihat pada gambar (lampiran ).
Setelah itu dilakukan pemeriksaan kemurnian dan konsentrasi dari
sampel DNA genom yang dapat dilihat pada tabel (lampiran ). Dari sampel,
memiliki kategori kemurnian rasion A /A ( - ) baik,
tinggi dan rendah. Rasio A digunakan untuk identifikasi
kontaminasi di dalam DNA sampel. Rasio A yang rendah dapat
disebabkan oleh kontaminasi polisakarida, etanol absolut atau reagen lain pada
saat isolasi, namun dapat pula disebabkan oleh konsentrasi yang sangat rendah
(< ng/uL) dari asam nukleat.
Sampel yang memiliki konsentrasi rendah
sebanyak . Meskipun rasio kemurnian menentukan kualitas dari sampel,
indikator kualitas DNA bergantung dari aplikasi jumlah DNA yang digunakan.
Dari hasil pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA dapat disajikan
dalam bentuk tabel dibawah ini:
Tabel . . Kategori Kemurnian DNA
A /A (borderline: - ng/μL)
Kategori Kemurnian Frekuensi (N) Presentase (%)
Baik
Tinggi
Rendah
Total
Tabel . Kategori Konsentrasi DNA Genom
Kategori Konsentrasi Frekuensi (N) Presentase (%)
Baik
< ng/ μL
Total
. Hasil Analisis Genotyping PCR RFLP (Homozigot murni, Heterozigot
varian dan Homozigot varian)
Hasil PCR
Setelah melalui proses isolasi DNA maka dilakukan PCR, sehingga
didapatkan hasil seperti pada gambar .
Gambar . Hasil PCR akan memberikan gambaran pita pada bp
Hasil RFLP
Setelah melalui proses PCR, produk PCR dipotong dengan enzim
restriksi MspI, sehingga didapatkan hasil seperti pada gambar .
Gambar . Hasil RFLP akan memberikan gambaran pita pada bp untuk
homozigot murni, bp dan bp untuk homozigot varian serta gambaran
pita pada bp, bp, bp pada heterozigot varian.
Sampel yang telah dilakukan pemeriksaan mutasi gen dengan metode
PCR-RFLP akan memberikan data genotyping dari sampel seperti dalam tabel
. Berdasarkan tabel diketahui bahwa dari sampel presentase homozigot
murni ( orang), genotip heterozigot varian ( orang), genotip
homozigot varian ( orang).
bp
Tabel . Analisis Genotyping PCR RFLP
Genotyping Frekuensi Persentase (%)
Homozigot murni (TT)
Homozigot varian (CC)
Heterozigot varian (TC)
Total
. . Hasil Skrining gen CYP A * A rs (T>C)
Gambar Hasil Skrining gen CYP A * A rs (T>C) pada Mahasiswa
PSPD UIN Syarif H. Angkatan -
Berdasarkan gambar . menunjukkan bahwa dari sampel didapatkan
presentase genotip homozigot murni TT % ( orang), genotip heterozigot
varian TC ( ), genotip homozigot varian CC ( orang).
Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Homozigot Murni,
Heterozigot Varian, Homozigot Varian)
Tabel . Distribusi frekuensi kategori genotyping menurut jenis kelamin
Jenis
Kelamin
Kategori Genotyping
Homozigot
murni
Heterozigot
varian
Homozigot
varian Total
N % N % N % N %
Laki-laki
Perempuan
Hasil data yang diperoleh dari responden didapatkan presentase laki-
laki yang memiliki genotyping homozigot murni sebesar , heterozigot
varian , dan homozigot varian . Sedangkan presentase perempuan
yang memiliki genotyping homozigot murni sebesar , heterozigot varian
, dan homozigot varian .
Hasil data yang diperoleh dari responden kemudian dicari hubungan
antara kategori jenis kelamin dan genotyping (homozigot murni, heterozigot
varian dan homozigot varian). Tabel x (lampiran ) layak untuk diuji dengan
Chi Square karena sel yang nilai expected-nya kurang dari sebesar . Oleh
karena itu, digunakan uji alternatifnya yakni uji Mann-Whitney dengan p value =
. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang signifikan
antara jenis kelamin dengan genotyping (homozigot murni, heterozigot varian,
homozigot varian).
Pembahasan
Hasil screening genotyping Gen CYP A * A rs menggunakan
teknik PCR RFLP pada mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter
(PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan
- didapatkan bahwa dari sampel, presentase homozigot murni
( orang), genotip heterozigot varian ( orang), genotip homozigot
varian % ( orang), sehningga frekuensi genotip heterozigot varian paling
dominan. Hal ini diperkuat dengan penelitian sebelumnya bahwa CYP A * A
adalah variasi alel yang cukup banyak dimiliki oleh penduduk di wilayah Asia
(Jepang) daripada Kaukasia.Frekuensi persebaran alel adalah pada
Kaukasia, pada Asia, and pada Afrika.
Pada hasil penelitian ini secara statistik tidak ditemukan adanya hubungan
yang signifikan antara jenis kelamin dan genotyping(homozigot murni, heterozigot
varian, homozigot varian (p value = ). Secara teori, terdapat penelitian di
Turki dan Jepang menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara
seseorang yang menderita kanker koloretal dan seseorang yang sehat jika dilihat
dari usia dan jenis kelamin.
Empat penelitian yang dilakukan di populasi Asia diketahui bahwa
pembawa alel C dari CYP A * A memiliki kali peningkatan risiko kanker
kolorektal dibandingkan dengan pembawa alel T.
Pada studi variasi
genetik, genetik yang berhubungan dengan polimorfisme CYP A * A dan
CYP A * C memberikan kali lipat peningkatan aktivitas katalitiknya.
Ditambah lagi pada penelitian di Jepang juga ditemukan bahwa alel heterozigot
untuk CYP A * A memiliki resiko yang paling besar untuk terjadi kanker
koloretal.
Mengingat adanya hubungan antara gen CYP A * A rs
dengan faktor resiko kanker kolorektal maka perlu dilakukan edukasi pada
mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas
Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
Kelebihan Penelitian
Penelitian skrining CYP A * A rs (T>C) untuk mengetahui
kemungkinan responden memiliki faktor resiko kanker kolorektal dapat dikatakan
penelitian yang baru di Indonesia. Dalam pelaksanaan penelitian ini, cara kerja
penelitian yang dilakukan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi karena
membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak. Dalam mendeteksi mutasi dari
SNP tersebut, teknik PCR RFLP yang digunakan merupakan salah satu teknik
yang murah.
Keterbatasan penelitian
Selama penelitian berlangsung terdapat beberapa hambatan yang dialami oleh
peneliti, diantaranya:
. Tidak dilakukannya kriteria diagnosis lain seperti pemeriksaan FOB (Fecal
Occult Blood).
. Tidak mencari data mengenai kebiasaan merokok, konsumsi daging
merah, riwayat keluarga yang merupakan beberapa faktor resiko terjadinya
kanker kolon.
. Besar sampel diduga mempengaruhi hasil statistik analitik.
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pada penelitian ini didapatkan SNP CYP A * A rs (T>C) pada
mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan - , dengan
sebagian besar heterozigot varian dan sebagian kecil homozigot murni dan
homozigot varian. Sehingga sebagian besar mahasiswa mengalami polimorfisme
SNP CYP A * A rs (T>C)
Saran
. Untuk penelitian berikutnya diperlukan jumlah sampel yang lebih besar
supaya hasilnya bermakna.
. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk mendiagnosis kanker
kolorektal seperti pemeriksaan FOB, kolonoskopi, dan pemeriksaan
lainnya.
. Diperlukan kuesioner untuk mengetahui faktor lain yang dapat
meningkatkan faktor resiko terjadinya kanker kolorektal seperti kebiasaan
merokok, konsumsi daging merah, riwayat keluarga yang terkena kanker
kolorektal, pola makan.
BAB VI
ACKNOWLEDGMENT
Penulis mengucapkan terimakasih kepada RSUP Fatmawati dan tim
peneliti kanker kolorektal FKIK UIN Syarif Hidayatullah; DIKTIS DEPAG RI;
DitJen Anggaran Kemenkeu, Chris Adhiyanto, S.Si,M.Biomed,PhD, dr. H. Hari
Hendarto, Sp. PD-KEMD, PhD, FINASIM, dr. Ahmad Lutfi SpB-KBD, Dr. Zeti
Harriyati, S.Si, M. Biomed, FKIK UIN-Laboratorium Biomolekuler, dan yang
telah memberikan bantuan dalam ide, pendanaan dan sampel DNA. Penelitian ini
merupakan bagian dari penelitianpemetaan genotip kanker kolorektal di Indonesia
yang diketuai oleh Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed,PhD dari FKIK UIN Syarif
Hidayatullah bekerjasama dengan RSUP Fatmawati
DAFTAR PUSTAKA
. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, editor. Cancer Incidence and Mortality
Worldwide . France: International Agency for Research on Cancer,
. World Health Organization. Fact sheets of cancer. US: World Health
Organization,
. Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan RI. Situasi Penyakit
Kanker . Indonesia: Kementerian Kesehatan RI, . p
. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, editor. Cancer Incidence and Mortality
Worldwide . France: International Agency for Research on Cancer,
.
. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, editor. Colorectal Cancer Estimated
Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in . France:
International Agency for Research on Cancer, .
. International Agency for Research on Cancer. Fact sheets by population,
incidence, mortality and -year prevalence: both sexes INDONESIA.
Indonesia: World Health Organization, .
. Sharkas GF, Arqoub KH, Khader YS, et al. Colorectal Cancer in Jordan:
Survival Rate and Its Related Factors. J Oncol. Mar; : - .
. Sudoyo AW, Setiohadi B, Alwi I, dkk. Buku ajar ilmu penyakit dalam jilid .
Ed. . Jakarta: Internal Publishing, . h. - .
. Nebert DW, Nelson DR, Coon MJ, et al. The P superfamily: update on
new sequences, gene mapping, and recommended nomenclature. DNA and
Cell Biology. Jan; ( ): - .
. Nebert DW. Role of genetics and drug metabolism in human cancer risk.
Mutat Res. Apr; ( ): – .
. Slattery ML, Samowtiz W, Ma K. et al.CYP A , cigarette smoking, and
colon and rectal cancer. Am. J. Epidemiol. Nov; ( ): – .
. Kury S, Buecher B, Robiou-du-Pont S, et al. Combinations of cytochrome
P gene polymorphisms enhancing the risk for sporadic colorectal cancer
related to red meat consumption. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
Jul; ( ): – .
. O¨ zhan G, Mutur M, Ercan G, et al. Genetic variations inthe xenobiotic-
metabolizing enzymes CYP A , CYP A ,CYP C , CYP C and
susceptibility to colorectal canceramong Turkish people. Genet Test Mol
Biomarkers. Apr; ( ): – .
. Garte S, Gaspari L, Alexandrie AK, et al. Metabolicgene polymorphism
frequencies in control populations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
Dec; ( ): -
. Yoshida K, Osawa K, Kasahara M, et al.Association of CYP A , CYP A ,
GSTM and NAT gene polymorphismswith colorectal cancer and smoking.
Asian Pac J Cancer Prev. Jul-Sep; ( ): - .
. National Human Genome Research Institute. What are Genetic and
Genomics. USA: National Human Genome Research Institute,
. World Health Organization. Genomics and World Health, report of the
Advisory Committee on Health Research. Geneva: World Health
Organization, .
. National Human Genome Research Institute. What is Genomic Medicine?
USA: National Human Genome Research Institute, .
. Anthony JFG, Jeffrey HM, David TS, et al. An Introduction to Genetic
Analysis. th ed.New York: W. H. Freeman; , h. - .
. Nussbaum, Robert L. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. th ed.
Philadelphia: Elsevier; . h. - .
. National Cancer Institute. Understanding Cancer Genomics. USA: National
Cancer Institute, .
. Tropp, Burton E. Molecular Biology: Genes to Proteins. th ed. USA: Jones
& Bartlett Learning; . h. - .
. van Bakel H, Nislow C, Blencowe BJ, Hughes TR. Most "dark matter"
transcripts are associated with known genes. PLoS Biol. May ; ( ):
e .
. Birney E, Stamatoyannopoulos JA, Dutta A, et al. Identification and analysis
of functional elements in of the human genome by the ENCODE pilot
project. Nature. June ; ( ): – .
. Dunham I, Kundaje A, Aldred SF, et al. An integrated encyclopedia of DNA
elements in the human genome. Nature. Sept ; ( ): – .
. Cui Z, Li Y, Cheng S, et al. Mutations in the embC-embA intergenic region
contribute to Mycobacterium tuberculosis resistance to ethambutol.
Antimicrob Agents Chemother. Nov; ( ): - .
. Liu G, Luan Y. Identification of Protein Coding Regions in the Eukaryotic
DNA Sequences Based on Marple Algorithm and Wavelet Packets
Transform. Hindawi Publishing Corporation Abstract and Applied Analysis.
Jul; : - .
. Department of Health & Human Services National Institutes of Health. What
are single nucleotide polymorphism (SNPs)? USA: U.S. National Library
of Medicine; . p.
. Kumar, Vinay. Robins & Cotran Dasar Patologis Penyakit. Ed . Jakarta:
EGC; . h. -
. Winslow T. What Is Cancer? USA: U.S, Department of Health and Human
Services; .
. Sherwood L. Fisiologi Sel: dari Sel ke Sistem ed . Jakarta: EGC; .
h.
. Center for Disease Control and Prevention. What Is Colorectal Cancer? USA:
U.S., Department of Health & Human Services;
. Price SA. Patofisiologi: Konsep Klinis Prose-Proses Penyakit Ed. . Jakarta:
EGC, . h. -
. Nagara FS, Utomo AR, Sandra F. Efek mutasi K-RAS pada Kanker
Kolorektal terhadap terapi Antibodi Monoklonal anti EGFR. Indonesian
Journal of Cancer. ; : -
. Arrington AK, Heinrich EL, Lee W, et al. Prognostic and Predictive Roles of
KRAS Mutation in Colorectal Cancer. Int J Mol Sci. Sep
; ( ): - .
. Mastutik G, et al. The mutation status of KRAS gene codon and in
colorectal adenocarcinoma. Indonesian Journal of Clinical Pathology and
Medical laboratory. Nov; ( ): -
. Basir I, Rudiman R, Lusikoy R, dkk. Pedoman Nasional Pelayanan
Kedokteran Kanker Kolorektal. Indonesia: Kementerian Kesehatan RI,
Komite Penanggulangan Kanker Nasional; . h. - .
. Lu Y, Cederbaum AI. CYP E and Oxidative Liver Injury by Alcohol. Free
Radic Biol Med. Mar ; ( ): - .
. Corchero J, Primprale S, Kimura S, et al. Organization of the CYP A cluster
on human chromosome : implications for gene regulation.
Pharmacogenetics. Feb; ( ): - .
. Bartsch H, Nair U, Risch A, et al. Genetic polymorphismsof CYP genes,
alone or in Combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev. Jan; ( ): - .
. Go RE, Hwang KA, Choi KC. Cytochrome P family and cancers. J
Steroid Biochem Mol Biol. Mar; : -
. McKay JA, Murray GI, Weaver RJ, et al. Xenobiotic metabolising enzyme
expression in colonic neoplasia. Gut. Sep; ( ): - .
. Mercurio MG, Shiff SJ, Galbraith RA, et al. Expression of cytochrome P
mRNAs in the colon and the rectum in normal human subjects. Biochem
Biophys Res Commun. May ; ( ): - .
. Genome Reference Consortium. Chromosome (human). USA: NCBI's
Genome Decoration Based on Ensembl's, . GRCh .p
. Landi MT, Bertazzi PA, Shields PG, et al. Association between CYP A
genotype, mRNA expression and enzymatic activity in humans.
Pharmacogenetics. Oct; ( ): - .
. Kawajiri K, Nakachi K, Imai K, et al. The CYP A gene and cancer
susceptibility. Crit Rev Oncol Hematol. Feb; ( ): - .
. Saeed HM, Alanazi MS, Nounou HA, et al. Cytochrome P A , E and
GSTM genepolymorphisms and susceptibility to colorectal cancer in
theSaudi population. Asian Pac J Cancer Prev. ; ( ): - .
. Garte S. The role of ethnicity in cancer susceptibility gene polymorphisms:
The example of CYP A . Carcinogenesis. Aug; ( ): - .
. Sachse C, Smith G, Wilkie MJ, et al. A pharmacogenetic study to investigate
the role of dietary carcinogens in the etiology of colorectal cancer.
Carcinogenesis. Nov; ( ): - .
. Ye Z, Parry JM. Genetic polymorphisms in the cytochrome P A ,
glutathione S-transferase M and T , and susceptibility to colon cancer.
Teratog Carcinog Mutagen. ; ( ): - .
. Slattery ML, Samowtiz W, Ma K, et al. CYP A , cigarette smoking, and
colon and rectal cancer. Am J Epidemiol. Nov ; ( ): - .
. Little J, Sharp L, Masson LF, et al. Colorectal cancer andgenetic
polymorphisms of CYP A , GSTM and GSTT : a case-control study in the
Grampian region of Scotland. Int J Cancer. Nov ; ( ): - .
. Darazy M, Balbaa M, Mugharbil A, et al. CYP A , CYP E , and GSTM
gene polymorphisms and susceptibility to colorectal and gastric cancer
among Lebanese. Genet Test Mol Biomarkers. Jun; ( ): - .
. Firozi PF, Bondy ML, Sahin AA, et al. Aromatic DNA adducts and
polymorphisms of CYP A , NAT and GSTM in breast cancer.
Carcinogenesis. Feb; ( ): - .
. Inoue H, Kiyohara C, Marugame T, et al. Cigarette smoking, CYP A MspI
and GSTM genotypes, and colorectal adenomas. Cancer Res. Jul
; ( ): - .
. Surzycki S. Laboratory manual: human molecular biology. Ed. . Berlin:
Blacwell Publishing; . h. -
. Matlock B. Assessment of nucleic acid purity. USA: MA, Wilmington,
Thermo Fisher Scientific;
. Fatchiyah, dkk. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Ed. .Jakarta: PT
Penerbit Erlangga; , h. -
. Radji M. Rekayasa Genetika: Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Jakarta:
CV Sagung Seto; . h. -
. Maria B. Biokimia: Teknik Penelitian. Ed. . Jakarta: Erlangga; . h. -
. Muladno. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed. . Bogor: IPB Press; .
h. -
. National Center for Biotechnology Information. Poymerase Chain Reaction
(PCR). USA: U.S. National Library of Medicine; .
. Rasmussen HB. Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of
PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis–Valuable
Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. Denmark: Institute of
Biological Psychiatry; .
. Wijanarko E. Teknologi DNA Rekombinan. Indonesia; . h.
. Dahlan S. Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan. Ed. . Jakarta: Salemba
Medika; . h.
Lampiran . Lembar Persetujuan Responden
Lembar Persetujuan Mengikuti Penelitian
Bersama ini saya yang bertandatangan di bawah ini :
Nama :
Umur :
Alamat :
Telepon :
Setelah mendapat keterangan secukupnya dan mengerti manfaat penelitian
tersebut di bawah ini dengan judul :
Gambaran Polimorfisme Gen CYP A * A rs (T>C) sebagai Faktor
Resiko Kanker Kolorektal Pada Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan
Profesi Dokter Angkatan - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Saya mengerti tujuan penelitian ini dan mengapa diminta untuk berpartisipasi.
Semua pertanyaan yang saya ajukan telah dijawab peneliti.
Saya mengerti bahwa keiikutsertaan dalam penelitian ini bersifat sukarela dan
setiap saat dapat mengundurkan diri dari penelitian.
Ciputat,…… Juli
Yang memberi penjelasan Yang menyetujui
(Nurul Fathimah) ( )
Peneliti Mahasiswa
Lampiran . Lembar tanda terima komisi etik penelitian
Lampiran Fragmen primer
Fragmen primer forward
’-AAGAGGTGTAGCCGCTGCACT-
Fragmen primer reverse
’-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT- ’
Gambar Letak fragmen primer foward dan reverse
Sumber: http://scialert.net/fulltext/?doi=jms. &org= f
Proses PCR RFLP
Pada proses PCR dilakukan dengan inkubasi awal pada suhu C selama
menit, detik, diikuti oleh siklus serangkaian proses yang terdiri dari
denaturasi pada suhu C selama detik, annealing pada C selama
detik dan pemanjangan (elongation) pada C selama detik. Proses PCR
diakhiri dengan tahap pemanjangan akhir pada suhu C selama menit. Produk
PCR dianalisa menggunakan gel elektroforesis dengan konsentrasi agarose
sehingga didapatkan ukuran produk PCR pada bp. (Gambar ).
Gambar Proses PCR
Produk PCR dipotong dengan U enzim restriksi MspI (batasan = C ^ CGG)
pada suhu ° C selama jam. Kemudian hasil restriksi dianalisis dengan
elektroforesis pada gel agarose yang ditambahkan dengan DNA loading dye
dan kemudian diamati dengan GelDoc.
Lampiran . Alat dan bahan penelitian
Gambar . . Darah dari tabung EDTA, Bahan RFLP, Ethanol
Gambar . . PCR mix, Primer PCR
Gambar . . DNA loading dye, Bahan PCR
Gambar . . Sampel Genom DNA, Centrifuge eppendorf
Gambar . . Gel doc system, microcentrifuge
Gambar . . DeNovix DS- Spectrophotometer, GD Collum
Gambar . . Freezer, tabung mikro PCR
Gambar . . Bilogix ukuran μL, μL dan μL
Gambar . . ml collection tube
Gambar . . Tempat sampah medis, Waterbath, Micropipet
Gambar . . Timbangan analitik, TAE x, Gelas ukur
Gambar . . Botol pereaksi, agarose, ethidium bromide
Gambar . . Water destilation, pemanas
Gambar . . Penggaris sumur dan pencetak agar, seperangkat alat elektroforesis
Lampiran . Optimalisasi Primer
Gambar . . Optimalisasi primer
Konsentrasi
Konsentrasi ,
Lampiran . Gel documentation hasil elektroforesis agarose
Gambar . . Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom
DNA sampel
(Lanjutan)
Gambar . . Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari PCR DNA
sampel
Lampiran . Hasil kemurnian dan konsentrasi DNA sampel
Tabel . Kemurnian dan Konsentrasi DNA sampel
No No
Sampel
Konsentrasi
,
Lampiran . Hasil RFLP
Gambar . Hasil Elektroforesis RFLP terdapat hasil homozigot murni,
homozigot varian dan heterozigot varian
(Lanjutan)
Tabel. . Hasil Analisis Penggolongan SNP CYP A * A rs (T>C)
berdasarkan hasil RFLP
No No Sampel Jenis Kelamin Usia Hasi RFLP
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homomurni
Perempuan Homovarian
Perempuan Homomurni
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homomurni
Laki-Laki Heterovarian
Perempuan Homomurni
Perempuan Homomurni
Perempuan Homomurni
Laki-Laki Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Heterovarian
Laki-Laki Homovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Laki-Laki Heterovarian
Perempuan Homovarian
Laki-Laki Heterovarian
Laki-Laki Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Perempuan Homovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Laki-Laki Heterovarian
Laki-Laki Heterovarian
Laki-Laki Homomurni
Laki-Laki Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homomurni
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Laki-Laki Heterovarian
Laki-Laki Homovarian
Perempuan Homomurni
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homovarian
Perempuan Homomurni
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homomurni
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homomurni
Laki-Laki Heterovarian
Laki-Laki Homomurni
Laki-Laki Homomurni
Perempuan Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Laki-Laki Homomurni
Perempuan Homomurni
Laki-Laki Homomurni
Laki-Laki Heterovarian
Perempuan Heterovarian
Perempuan Homovarian
Perempuan Heterovarian
Laki-Laki Homovarian
Laki-Laki Heterovarian
Lampiran . Hasil analisa statistik
Jenis Kelamin
Jenis Kelamin
Frequency Percent
Valid
Percent
Cumulative
Percent
Valid Laki-Laki
Perempuan
Total
Usia Responden
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid
Total
Kategori Konsentrasi
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid rendah
baik
Total
Kategori Kemurnian ( )
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid rendah
baik
tinggi
Total
Hasil RFLP
Frequency Percent
Valid
Percent
Cumulative
Percent
Valid Homomurni
Homovarian
Heterovarian
Total
Jenis Kelamin * Hasil RFLP Crosstabulation
Ketegori Genotyping
Total
Homo
murni
Homo
varian
Hetero
varian
Jenis
Kelamin
Laki-Laki Count
% within Jenis
Kelamin
Perempuan Count
% within Jenis
Kelamin
Total Count
% within Jenis
Kelamin
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig. ( -
sided)
Pearson Chi-Square a ,
Likelihood Ratio ,
Linear-by-Linear Association ,
N of Valid Cases
a. cells ( ) have expected count less than . The minimum expected count
is .
Dari hasil uji Pearson Chi square didapat nilau signifikan (p-value) =
sehingga keputusan yang kita ambil adalah menerima Ho yang berarti bahwa
tidak ada perbedaan yang signifikan proporsi laki-laki dan perempuan
Lampiran . Curiculum vitae
Curiculum Vitae
Nama : Nurul Fathimah
Nama Panggilan : Fathimah
Jenis Kelamin : Perempuan
Tempat dan Tanggal Lahir : Bekasi, Juli
Usia : tahun
Golongan darah : AB
Mobile :
Agama : Islam
E-mail : nurulfathimah @gmail.com
Alamat : Jl. Kenanga RT Gedang, Porong Sidoarjo,
Jawa Timur
Pendidikan
a. Elementary School : SDN Gedang II Porong Sidoarjo
b. Junior High School : SMPN Candi Sidoarjo
c. Senior High School : SMAN Sidoarjo
d. University : Universitas Islam NegeriSyarif Hidayatullah
Pengalaman Organisasi
Ketua MERCY (MedicalReaserch Community)UIN Syarif H. -
Staff Pengembangan Wilayah PTBMMKI (PerhimpunanTim Bantuan
MedisMakasiswa KedokteranIndonesia) -
Staff Logistik USMR (UIN SyahidMedical Rescue) -
Penghargaan
Juara Literatur Review Scientific Work Competition ISMKI wilayah
Juara Esai Ilmiah JIMU FKUI
Karya Tulis
Kombinasi IMT, Usia Ibu, Doppler dan Biomarker Serum NGAL sebagai Deteksi
Dini Preeklampsia
Kombinasi Biomarker Serum (Inhibin A, Activin A, PIGF) dengan Doppler Arteri
Uterina sebagai Deteksi Preeklamsia dalam Upaya Membentuk Generasi
Muslim Tangguh melalui Kesehatan Reproduksi
Potensi Asam Askorbat dan Asam Asetat dalam LawaBuah Gandaria (Bouea
macrophylla) sebagai Kemopreventif pada Kanker Kolorektal dan Kanker
Gaster
Potensi Asam Askorbat dalam Asinan Buah Gandaria (Bouea macrophylla)
sebagai Kemopreventif pada Kanker Kolorektal
Mahasiswa Indonesia Pertama Konser Tunggal di Abu Dhabi
Man Jadda wa Jada, ManShabara Zhafira