Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(2): 91-98 (2019)http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.2.91 ISSN 1225-7117 / eISSN 2288-8268

한국 여성의 질에서 분리된 유산균의 Gardnerella vaginalis와 Candida

albicans 저해효과 및 프로바이오틱스 특성

김용경, 한설화, 김진성, 정율아, 백남수, 강창호*

Probiotic Properties and Inhibitory Activity of Lactic Acid Bacteria

Isolated from Vaginal Microbiota of Korean Women against Gardnerella

vaginalis and Candida albicans

YongGyeong Kim, SeulHwa Han, Jin-Seong Kim, Yulah Jeong, Nam-Soo Paek, and Chang-Ho Kang*

Received: 28 February 2019 / Revised: 5 April 2019 / Accepted: 8 April 2019

© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: Vaginitis is one of the most common problems in

fertility, premenopausal and pregnant women. Normal vagi-

nal microflora including lactic acid bacteria plays an import-

ant role in maintaining vaginal health by preventing over

growth of pathogenic and opportunistic organisms. How-

ever, in abnormal conditions like vaginitis, the pH in the

vagina increases and the normal vaginal flora is disturbed.

Therefore, in order to prevent the reoccurrence of vaginitis

even after treatment, the restoration of the vaginal micro-

flora is crucial. A total of 30 lactic acid bacteria isolated from

vagina of healthy Korean women were studied on their

inhibitory activity against pathogens associated with vagini-

tis such as Gardnerella vaginalis and Candida albicans.

Among them, two strains were selected and identified by 16S

rRNA analysis as Lactobacillus paracasei MG4272 and L.

rhamnosus MG4288. Probiotic properties were tested on the

basis of guidelines for probiotic selection protocols such as

tolerance for simulated gastric and intestinal fluid, autoag-

gregation activity, antibiotic resistance, and pathogen inhibi-

tory activity. Results show that resistance to simulated

gastric/intestinal fluid and their autoaggregation rates were

as high as 55%. Further studies are underway to demonstrate

those the two strains can be applied as pharmaceutical agents

for recovering a healthy vaginal ecosystem.

Keywords: Gardnerella vaginalis, Candida albicans, probiot-

ics, Lactobacillus paracasei MG4272, Lactobacillus rhamno-

sus MG4288

1. INTRODUCTION

건강한 여성의 질은 다양한 미생물이 군집을 이루고 있으며

이중 젖산을 생성하는 유산균 (lactic acid bacteria)은 수적으

로 가장 우세한 미생물로 질의 병원균 감염의 장벽 역할을

한다 [1]. 유산균은 질 상피세포에 부착하여 병원균의 질 정

착을 막고, 젖산을 생산하여 질 내 산도를 4.5 이하로 유지하

며, 과산화수소, 박테리오신 등의 항균물질을 생산해 병원균

의 성장을 억제하여 건강한 질 환경을 유지하게 한다 [2-4].

질 세정제, 항생제 오남용, 임신 등의 원인으로 질 내 세균

총이 파괴되면, 질 내 pH가 변화하면서 질염이 발생되게 된

다 [5]. 질염 (vaginitis)은 질 점막의 감염으로 염증이 발생하

는 질병으로, 외음부 질의 가려움증, 작열감, 악취 및 비정상

적인 분비물이 생성되는 증상이 나타난다 [6]. 질염은 원인균

에 따라 크게 세균성 질증 (bacterial vaginosis), 칸디다성 질염

(vulvovaginal candidosis), 트리코모나스 질염 (trichomonas

vaginitis)으로 구분되며 이중 가장 흔하게 발생되는 질병은

세균성 질증과 칸디다성 질염이다. 위 두 질병은 원인균이

(주)메디오젠MEDIOGEN, Co., Ltd, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27159, Korea Tel: +82-43-644-4216, Fax: +82-43-644-4215e-mail: changho-kang@naver.com

Research Paper

92 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(2): 91-98 (2019)

질 내 항상 존재하는 기회성 감염이기 때문에 건강한 여성에

게도 흔히 발생할 수 있다는 공통점이 있으며, 질 내 세균총

이 회복되지 않으면 약물치료 후에도 질염이 재발한다는 문

제가 있다 [7].

이러한 질염의 발생 및 재발 위험을 막고 여성의 질 내 환

경개선을 위하여 항생제의 대안으로 프로바이오틱스가 연

구되고 있다. 프로바이오틱스 (Probiotics)란 적정량 복용 시

숙주에게 이로운 영향을 주는 살아있는 미생물 [8]로, 미생

물이 프로바이오틱스로 활용되기 위해서는 섭취에 대한 안

전성, 소화기관 내에서의 안정성, 세포정착능 및 항균활성

등에 대한 기능적 측면의 검증이 필요하다 [9,10]. 일반적으

로 유산균은 위의 낮은 pH 및 담즙액에 대한 내성을 지니며

안정성이 확보된 GRAS (Generally Regarded As Safe) 등급

미생물로 분류되어 프로바이오틱스로의 활용 가치가 높다

알려져 있다. Reid의 연구 [11]에 의하면 구강을 통해 섭취한

유산균이 위와 장을 거쳐 배출되고 회음부를 통해 질 입구

까지 자연스럽게 이동하여 질 내 균총을 바꿀 수 있다고 보

고되었다.

이에 본 연구는 여성의 질 내 환경개선 효능을 가지는 유

산균 소재자원 확보를 위하여 한국 여성의 질에서 분리한

유산균 중 Gardnerella vaginalis와 Candida albicans에 항균

력을 지니는 다양한 종의 유산균주를 선별하고 특성을 확인

하여 향후 프로바이오틱스로의 활용 가능성을 확인하고자

한다.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Gardnerella vaginalis에 대한 항균효과

본 연구에서는 1차적으로 한국 여성의 질에서 분리된 유산

균 30균주 [12]중 세균성 질증의 주요 원인균인 Gardnerella

vaginalis KCTC5096 (G. vaginalis)에 대한 항균 효과를 지니

는 유산균을 액체배지 희석법을 이용하여 선별하였다. G.

vaginalis의 배양은 10% 말 혈청 (Horse serum, Life techno-

logies corp., NY, USA)을 함유한 BHI 배지 (Difco, MI, USA)

를 사용하였으며 (이하 mBHI), Anaerocult® A (Merck,

Germany)로 혐기상태를 유지하며 37oC에서 24시간 배양하

였다. 유산균주는 MRS 평판배지 (Difco, MI, USA)에 자란

단일 집락을 MRS 액체배지에 접종하여 37oC, 24시간 정치

배양한 뒤 배양액의 흡광도를 OD600 1.0 (108‒109 CFU/mL)으

로 조정하여 새로운 MRS 액체배지에 1% 접종하였다. 37oC,

18시간 정치배양한 배양액은 0.20 μm 필터를 이용하여 여과

하였으며 여과된 상등액 (cell free supernatant, CFS)을 본 실

험에 사용하였다.

G. vaginalis에 대한 항균효과는 유산균주의 CFS 0.5 mL을

4.5 mL mBHI 배지에 첨가한 뒤 G. vaginalis의 배양액을

OD600 0.5로 조정하여 1% 접종하였다. 이후 24시간 혐기배양

하여 G. vaginalis의 생균수를 측정하여 유산균주의 항균효과

를 확인하였다.

2.2. Candida albicans에 대한 항진균효과

G. vaginalis에 대한 항균효과를 바탕으로 선별된 유산균주는

칸디다성 질염의 주요 원인균인 Candida albicans SC5314

(C. albicans)에 대한 항진균 효과를 확인하였다. 선별된 유산

균주는 MRS 액체배지, C. albicans는 YM (0.3% malt extract,

0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 1% glucose) 액체배지로

37oC, 18시간 배양한 뒤, 두 균주를 MRS 액체배지와 YM 액

체배지를 1:1로 섞은 혼합배지 10 mL에 최종 105 CFU/mL 농

도가 되도록 접종하여 37oC에서 20시간 정치 배양하였다. 배

양 후 erythromycin (0.3 μL/mL)을 도포한 YM 평판배지를 이

용하여 C. albicans의 생균수를 측정하였다.

2.3. 유산균주 동정 및 형태학적, 생화학적 특성 분석

선별된 유산균주는 universal rRNA gene primer (27F, 1492R)

를 이용한 16S rRNA gene sequencing을 진행하여 동정하였

으며, 각 과정은 Sol-gent (Daejeon, Korea)를 통하여 수행하

였다. 분석된 sequence는 National center for biotechnology

institute (NCBI)의 Basic local alignment search tool (blast)을

이용하여 genebank database와 비교하여 동정하고, MEGA

7.0 software의 neighborjoining method를 이용하여 계통수를

작성하였다.

선별된 유산균주의 형태적 특성 확인을 위하여 1%

glutaraldehyde (Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA) 용액에

4oC, 24시간 고정화 시킨 뒤, 에탄올로 탈수시켜 주사전자현

미경 (Field emission scanning electron microscope, S4300,

Hitach, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였으며, 생화학적

특성은 API 50 CHL kit (BioMérieux, France)를 이용하여

API test를 진행하였다.

2.4. 인공위액 및 인공담즙액에 대한 내성 확인

유산균의 장내 생존 가능성을 확인하기 위하여 Maragkoudakis

의 방법 [13]을 참고하여 인공위액, 인공담즙액에 대한 생존

율 확인 실험을 진행하였다. 선별된 유산균주를 MRS 평판

배지에 획선도말하여 37oC에 24시간 배양한 뒤, 생성된 집

락을 MRS 액체배지에 접종하여 배양 (37oC, 24시간)하였

다. 이후 새로운 MRS 배지에 2% 계대하여 24시간 배양하

였으며, 이후 배양액은 원심분리 (4000 ×g, 4oC, 5분)한 후,

phosphate-buffer saline (PBS, pH7.4)를 이용하여 2번 세척하

였다. 세척한 균체는 OD600 1.0 (108‒109 CFU/mL)으로 조정

하여 각각 인공위액과 인공담즙액에 대한 내성 실험에 사용

하였다. 인공위액에 대한 내성을 확인하기 위하여 pepsin

(Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA)을 pH 3, 4 PBS에 3 g/L

농도로 녹여 인공위액을 제작하였으며, 유산균 희석액

100 µL를 900 µL 인공위액에 첨가한 후 진탕한 뒤 37oC에서

배양하며 3시간까지 1시간 간격으로 생균수를 측정하였다. 인

공담즙액 내성을 확인하기 위하여 pancreatin (Sigma-Aldrich,

Saint Louise, USA)을 pH7, 8에 1 g/L 농도로 녹여 인공담즙

액을 제작하고, 유산균 희석액 100 µL를 900 µL 인공담즙액

에 첨가한 뒤 진탕하여 37oC에 배양하며 4시간까지 1시간 간

한국 여성의 질에서 분리된 유산균의 Gardnerella vaginalis와 Candida albicans 저해효과 및 프로바이오틱스 특성 93

격으로 생균수를 확인하였다.

2.5. Autoaggregation

장내 세포 부착능을 간접적으로 확인하기 위하여 Kassa의

연구 [14]를 변형하여 autoaggregation 실험을 진행하였다.

MRS 배지에 18시간 배양한 유산균 배양액을 새로운 10 mL

MRS 배지에 2% 접종한 뒤, 18시간 배양하여 실험에 사용하

였다. 배양한 유산균은 원심분리 (4,000 ×g, 4oC, 5분)한 후,

PBS에 2번 세척하였고, 균체는 OD600 1.0으로 조정하였다. 균

주 현탁액 5 mL을 10초간 진탕한 뒤 실험 시작 직후 (A0)와 5

시간 방치한 현탁액 (A)의 상등액 0.1 mL을 취해 0.9 mL PBS

와 혼합한 뒤 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 다음 계산식

에 따라 autoaggregation 비율을 계산하였다.

2.6. Hydrophobicity

장내 세포 부착능력을 간접적으로 확인하기 위한 방법으로

KOS의 microbial adhesion to solvents (MATS)실험 방법 [15]

을 변형하여 hydrophobicity 특성을 확인하였다. 선별 균주를

MRS 배지에 배양 (37oC, 24시간)한 후, 원심분리 (4,000 ×g,

4oC, 5분)하여 PBS에 2번 세척하였다. 균체는 PBS를 이용하

여 OD600 1.0 (A0)으로 현탁한 뒤 2 mL의 xylene, chloroform,

ethylacetate에 현탁액 2 mL을 각각 분주하였다. 각 시험관은

5분간 진탕한 후, 30분간 상온에 방치하였다. 이후 수용액을

회수하여 600 nm에서 흡광도를 측정 (A)하였으며 다음 계산

식에 따라 용매 부착능을 계산하였다.

2.7. 항생재 감수성 실험

선별된 균주의 항생제 감수성 실험은 clinical and laboratory

standard institute (CLSI) guidelines [16]를 따라 BHI (Brain

Heart Infusion Agar) 평판배지를 이용하여 수행하였다. 선별

균주는 MRS 배지에 1% 접종한 뒤, 18시간 배양하였으며 배

양액은 원심분리 (4,000 ×g, 4oC, 5분)한 후, PBS에 2번 세척

하였다. 이후 McFarland turbidity standard 0.5로 균액의 탁도

를 맞춘 뒤 멸균된 면봉을 이용하여 BHI 평판배지에 균주를

도말하였다. 배지가 마른 뒤 항생제 디스크를 균액이 도말

된 배지 위에 놓고 37oC에서 24시간 배양하였으며, 생성된

억제환의 크기를 mm 단위로 측정하여 표준 지표에 따라

sensitive, intermediate, resistant 3단계로 판정하였다. 확인한

항생제는 ampicillin (AM, 10 µg), cefotaxime (CTX, 30 µg),

cefepime (CEP, 30 µg), cefotetan (CTT, 30 µg), cephalothin

(CF, 30 µg), gentamicin (GM, 10 µg), kanamycin (K, 30 µg),

streptomycin (S, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, 5 µg), nalidixic

acid (NA, 30µg), trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT, 1.25/

23.75 µg), rifampin (RA, 5 µg), tetracycline (TE, 30 µg),

erythromycin (E, 15 µg), vancomycin (VA, 30 µg)이다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Gardnerella vaginalis와 Candida albicans에 대한 항

균 및 항진균 효과

세균성 질증은 질염의 약 40-50%를 차지하는 가장 흔한 질

병으로 질내 Gardnerella vaginalis, Prevotella spp.와 같은 혐

기성 세균 비율이 증가하게 되어 휘발성 아민화합물이 증가

하며 악취를 유발한다 [17]. 이에 본 연구에서는 질 내 환경

개선을 위한 유산균주 발굴을 위하여 세균성 질증의 주요 원

인균인 G. vaginalis에 대한 항균력을 확인하였으며 각 유산

균주 배양 상등액의 항균 효과는 Fig. 1과 같다. 실험 결과 G.

vaginalis에 항균 효과를 나타내는 유산균은 총 19균주였으

며 이중 MG4272와 MG4288 균주는 대조군 대비 각각

Autoggregation %( )A0 A–( )

A0----------------- 100×=

Adhesion rate %( )A0 A–( )

A0----------------- 100×=

Fig. 1. Antimicrobial activity of vaginal lactic acid bacteria against Gardnerella vaginalis. Viable cell counts of G. vaginalis were

determined after 24 h co-cultured with cell free supernatants of lactic acid bacteria. The data are expressed as the mean ± standard

deviation of two experiments.

94 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(2): 91-98 (2019)

61.36%, 79.60%의 저해효과를 보여 다른 분리 균주와 비교

하여 높은 항균 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

칸디다성 질염은 세균성 질증에 이어 두번째로 흔한 질염의

종류로 원인균의 70~90%는 Candida albicans이며, 짙은 흰 분

비물과 가려움증을 특징으로 한다. 여성의 70~75%는 살면서

한번 이상의 감염을 겪게 되고 40~50%의 여성은 1년에 2회

이상의 재발을 겪는다 알려져 있다 [7]. G. vaginalis에 항균력

이 우수한 MG4272, MG4288의 C. albicans에 대한 항진균 효

과를 보면, Fig. 2와 같이 억제효과를 확인할 수 있었다. 또한

C. albicans와 선별 균주의 혼합배양 시에는 각각 91.4%,

97.3%의 항진균 효과를 보였으며, 선별 균주의 상등액과 혼합

배양 시에는 각각 97.4%, 97.6%의 항진균 효과를 나타내었다.

3.2.선별된 유산균주의 동정 및 형태학적, 생화학적 특성

G. vaginalis, C. albicans에 대한 항균력이 우수한 두 균주는

16S rRNA sequencing 결과 Lactobacillus paracasei MG4272

와 Lactobacillus rhamnosus MG4288로 동정되었으며 (Fig.

3), 균주의 세포 형태는 주사전자현미경을 통하여 간균임을

확인하였다 (Fig. 4). API 50CHL은 Lactobacillus 속의 49가

지 탄수화물의 발효 여부를 연구하는데 사용되는 방법으로

이를 이용하여 확인한 선별 균주의 탄수화물 발효특성은

Table 1과 같다. 실험 결과 두 균주 모두 D-ribose, D-

galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-mannitol, D-

sorbitol, N-acethyl-glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin,

salicin, D-cellobiose, D-melezitose, gentiobiose, D-tagatose,

gluconate를 사용할 수 있었으며 glycerol, erythritol, L-

arabinose, xylose, D-adonitol, Methyl-β D-xylopyranoside, L-

rhamnose, Methyl-α D-Mannoside, Methyl-α D-glucoside, D-

lactose, D-melibiose, D-raffinose, starch, glycogen, xylitol, D-

lyxose, D-fucose, D-arabitol, 2-keto-gluconate, 5-keto-

gluconate를 사용할 수 없었다. 또한 apiwebTM (version 5.2)을

이용한 동정 결과 MG4272는 98.3% L. paracasei로 동정되었

다. 하지만 MG4288은 L. paracasei 또는 L. rhamnosus로 동

정되어 일반적인 L. rhamnosus에 비하여 L-rhamnose와 D-

lactose를 이용하지 못하는 상반되는 특성을 나타내었다.

최근 여성의 질 건강에 대한 관심이 증가하고 관련 연구가

많이 진행되고 있으나, 국내는 관련 연구가 매우 미비한 실

정이다. 여성의 질 내 세균총은 나라별, 개인별로 다르다 보고

[18,19] 되어 있으며, 이에 국내 여성의 질 내 유산균에 대한

균주 분리 및 확보를 통한 다양한 연구가 필요하다 [20]. 본 연

구에서 선별한 두 균주는 모두 식품의약품안전처 건강기능

식품의 기준 및 규격에 등재되어 안정성이 확보된 균주이다.

Fig. 2. The anti-candidal activity of selected strains. (a) Viable

cell counts of Candida albicans were determined after 20 h co-

cultured with selected strains. (b) Viable cell counts of C.

albicans were determined after 20 h co-cultured with cell free

supernatants of selected strains. The data are expressed as the

mean ± standard deviation of two experiments.

Fig. 3. Phylogenetic analysis of selected strains compared to other lactic acid bacteria.

한국 여성의 질에서 분리된 유산균의 Gardnerella vaginalis와 Candida albicans 저해효과 및 프로바이오틱스 특성 95

3.3. 선별된 유산균주의 인공위액 및 인공담즙액 내성

구강을 통해 섭취되는 유산균은 산도가 낮은 위와 소화효소

가 많은 장을 통과하게 되며, 위산의 낮은 pH와 펩신, 장내

답즙염과 소화효소에 노출되게 된다. 이에 미생물을 프로바

이오틱스로 활용하기 위해서는 낮은 pH와 효소에서 살아남

기 위한 위액 내성과, 장내 극한 환경에서 생존하기 위한 담즙

액 내성이 필수적이다. 본 연구는 G. vaginalis와 C. albicans에

대한 억제효과가 우수한 두 균주의 인공위액과 인공담즙액

에 대한 내성을 확인하였다 (Fig. 5). 체내 위액의 pH는 대략

3.0으로 유지되며 음식물이 위를 통과하는 시간은 3시간 정

Fig. 4. SEM images of selected strains. (a) Lactobacillus paracasei MG4272; (b) Lactobacillus rhamnosus MG4288.

Table 1. Biochemical characteristics of Lactobacillus paracasei MG4272 and Lactobacillus rhamnosus MG4288 using API 50 CHL

analysis.

Substrate MG4272 MG4288 Substrate MG4272 MG4288Control (Negative) − − Esculin + +

Glycerol − − Salicin + +

Erythritol − − D-cellobiose + +

D-arabinose − + D-maltose + −

L-arabinose − − D-lactose − −

D-ribose + + D-melibiose − −

D-xylose − − D-sucrose + −

L-xylose − − D-trehalose − +

D-adonitol − − Inulin + −

Methyl-β D-xylopyranoside − − D-melezitose + +

D-galactose + + D-raffinose − −

D-glucose + + Starch − −

D-fructose + + Glycogen − −

D-mannose + + Xylitol − −

L-sorbose + − Gentiobiose + +

L-rhamnose − − D-turanose + −

Dulcitol − + D-lyxose − −

Inositol − + D-tagatose + +

D-mannitol + + D-fucose − −

D-sorbitol + + L-fucose − +

Methyl-α D-Mannoside − − D-arabitol − −

Methyl-α D-glucoside − − L-arabirol + −

N-acethyl-glucosamine + + Gluconate + +Amygdalin + + 2-keto-gluconate − −

Arbutin + + 5-keto-gluconate − −

+: Positive reaction, −: Negative reaction.

96 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(2): 91-98 (2019)

도로 알려져 있어 일반적으로 pH 3에서 3시간 이상 생균수

를 유지할 경우 산성에 높은 내성을 보이는 것으로 판단한다

[21]. MG4272, MG4288 두 균주는 모두 pH 3에서 3시간 후

108 CFU/mL 이상의 생균수를 유지하는 것을 확인하여 내산

성이 우수함을 확인하였으며, 인공담즙액 내성 실험에서도

108 CFU/mL 이상의 생균수를 유지하여 매우 우수한 내성을

지니는 것을 확인하였다.

3.4. Autoaggregation과 Hydrophobicity

Autoaggregation과 hydrophobicity는미생물의 상피 세포 부

착능을 간접적으로 확인할 수 있는 방법으로, Kos의 연구

[15]에 의하면, autoaggregation능력과 세포 표면 소수성이 높

은 균주가 실제 세포 부착능력 또한 높다고 알려져 있다. 질

내 유산균주의 세포 부착능이 떨어질 경우 월경, 출산 등의

원인으로 유산균이 질에 정착하지 못하고 쓸려나가기 때문

에 질내 환경개선 효능을 가지는 유산균주의 경우 세포 정착

능이 매우 중요하다 [1]. 이에 선별된 L. paracasei MG4272,

L. rhamnosus MG4288 균주의 세포 부착능을 간접적으로 확

인하기 위하여 autoaggregation, MATS 실험을 진행하였다

(Fig. 6, Fig. 7).

선별된 두 균주의 autoaggregation 능력은 각각 57.99%,

65.65%였다. Malik의 연구 [22]에 따르면, L. plantarum

CMPG5300의 in vitro상의 autoaggregation이 약 67%일 때 질

상피세포에서의 부착능은 50% 이상임을 확인하였으며,

autoaggregation능력이 높은 균주는 세포 표면에 biofilm을 형성

하는 능력이 우수하다 보고되었다. 위 연구에서 L. plantarum

CMPG5300을 제외한 다른 8개 균주의 autoaggregation 능력

이 20% 이하임을 감안하면 본 연구에서 선별한 두 균주의

autoaggregation 능력이 우수한 것임을 확인할 수 있었다.

Fig. 5. The survival results of selected strains are shown the viable cell counts (log CFU/mL). (a) Lactobacillus paracasei MG4272 in

simulated gastric fluid pH 3, pH 4. (b) Lactobacillus paracasei MG4272 in simulated intestinal fluid pH 7, pH 8. (c) Lactobacillus

rhamnosus MG4288 in simulated gastric fluid pH 3, pH 4. (d) Lactobacillus rhamnosus MG4288 in simulated intestinal fluid pH 7, pH

8. The data are expressed as the mean ± standard deviation in triplicate.

Fig. 6. Autoaggregation rate of Lactobacillus paracasei MG4247

and Lactobacillus rhamnosus MG4288 for 5h. The data are

expressed as the mean ± standard deviation in triplicate.

한국 여성의 질에서 분리된 유산균의 Gardnerella vaginalis와 Candida albicans 저해효과 및 프로바이오틱스 특성 97

MATS 실험 결과, 세포의 소수성을 알 수 있는 xylene 부착

능은 MG4272 균주가 71.20%, MG4288 균주가 83.56%로 높

은 소수성을 나타내었다. 세포 표면 소수성은 세포 표면에 단

백질이 존재하는 것을, 친수성 특징을 나타낼 경우 다당류가

많은 것을 의미하며 단백질이 많아질수록 autoaggregation 능

력과 세포 부착능이 뛰어나게 된다. 본 실험에서도 MG4288

균주가 MG4272 균주보다 더 높은 autoaggregation 능력을 보

인 것과 비례하여 xylene 부착능도 더 높은 것을 확인할 수

있었다. 세포부착능이 뛰어난 균주는 세포에 자리를 잡아 병

원균의 세포 부착을 막아 감염을 막는 특성 [2]을 가진다. 선

별된 두 균주는 높은 autoaggregation능력과 xylene 부착능을

통해 질 내 상피세포부착능 역시 우수할 것이라 사료된다.

세포 표면 특성을 확인하기 위하여 진행한 chloroform과

ethylacetate 부착능 확인 결과, 산성 용매인 chloroform (전자

수용체)에 더 높은 부착능을 나타내었다. 이를 통해 두 균주

는 세포 표면에 전자공여체를 수용하고 있음을 알 수 있었다.

3.5. 항생제 감수성

본 연구에서 선별된 균주의 항생제 내성 특성은 Table 2와 같

다. MG4272, MG4288 두 균주 모두 CTX, CTT, K, S, NA,

SXT, VA에는 내성을 나타내는 것을 확인하였으며, AM, CIP,

TE, E, RA에는 저해되는 것을 확인하였다. Charteris의 연구

[23]에 따르면 실험에 이용된 모든 유산균이 K, S, NA, SXT

에 내성을 가지고 있었으며 TE, E, RA에 저해된다 보고되었

으며, Zhou의 연구 [24]에서도 사용한 모든 유산균주 10종이

GM, K, S, NA에 내성을 지니고 AM, CF, S, TE, E, RA에 저

해된다 보고되었다. 이는 본 실험의 결과와 유사하며 특히

K, S, NA의 내성과 TE, E, RA에 대한 감수성은 세 연구에서

공통적으로 나타나 유산균주가 가지는 특징으로 사료된다.

4. CONCLUSION

본 연구는 한국 여성의 질에서 분리한 유산균의 질내 환경

개선에 도움을 주는 프로바이오틱스로의 활용 가능성을 확

인하기 위하여 G. vaginalis와 C. albicans에 대한 억제 효과

와 프로바이오틱스의 생리적 특성을 확인하였다. 본 연구를

통해 총 30개의 균주 중 질염의 주요 원인균인 G. vaginalis

와 C. albicans 억제능이 우수한 L. paracasei MG4272, L.

rhamnosus MG4288을 선별하였으며, 두 균주는 인공위액과

인공담즙액에도 안정적인 것을 확인하였다. 두 균주의

autoaggregation 능력은 각각 57.99%, 65.65%, xylene 부착능

은 각각 71.20%, 83.56%로 우수한 autoaggregation 능력과 세

포 표면 소수성을 확인하여 향후 질 내 상피세포 부착능이

우수할 것이라 사료된다. 본 연구를 통해 선별된 MG4272,

MG4288은 향후 기능성 식품 및 건강관련 제품 개발의 소재

원로 활용할 수 있을 것이라 기대된다.

REFERENCES

1. Borges, S., J. Silva, and P. Teixeira (2014) The role of lactobacilliand probiotics in maintaining vaginal health. Arch. Gynecol. Obset.

289: 479-489.2. Charlier, C., M. Cretenet, S. Even, and Y. Le Loir (2009) Interac-

tions between Staphylococcus aureus and lactic acid bacteria: anold story with new perspectives. Int. J. Food Microbiol. 131: 30-39.

3. Antonio, M. A., S. E. Hawes, and S. L. Hillier (1999) The identifi-cation of vaginal Lactobacillus species and the demographic andmicrobiologic characteristics of women colonized by these spe-cies. J. Infect. Dis. 180: 1950-1956.

4. Gillor, O., L. M. Nigro, and M. A. Riley (2005) Genetically engi-neered bacteriocins and their potential as the next generation of

Fig. 7. Adhesion rate to xylene, chloroform and etylacetate of

Lactobacillus paracasei MG4247 and Lactobacillus rhamnosus

MG4288. The data are expressed as the mean ± standard

deviation in triplicate.

Table 2. Antimicrobial susceptibility test of selected strains.

Antibiotics (μg/disc)

Selected strainsLactobacillus

paracasei MG4272

Lactobacillus

rhamnosus MG4288

Ampicillin (AM, 10) S1 S

Cefotaxime (CTX, 30) R2 RCefepime (CEP, 30) S RCefotetan (CTT, 30) R RCephalothin (CF, 30) S RGentamicin (GM, 10) S RKanamycin (K, 30) R R

Streptomycin (S, 10) R RCiprofloxacin (CIP, 5) S S

Nalidixic acid (NA, 30) R RTrimethorim/Sulphamethoxazole

(SXT, 1.25/23.75)R R

Tetracyclin (TE, 30) S SErythromycin (E, 15) S SVancomycin (VA, 30) R R

Rifampin (RA, 5) S S1Sensitive, 2Resistant

98 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 34(2): 91-98 (2019)

antimicrobials. Curr. Pharm. Des. 11: 1067-1075.5. Srinivasan, S. and D. N. Fredricks (2008) The human vaginal bac-

terial biota and bacterial vaginosis. Interdiscip. Perspect. Infect.

Dis. 2008: 750479.6. Quan, M. (2010) Vaginitis: diagnosis and management. Postgrad.

Med. 122: 117-127.7. De Seta, F., F. Parazzini, R. De Leo, R. Banco, G. P. Maso, et al.

(2014) Lactobacillus plantarum P17630 for preventing Candidavaginitis recurrence: a retrospective comparative study. Eur. J.

Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 182: 136-139.8. Food and Agricultural Organization of United Nations and World

Health Organization (2001) Health and nutritional properties ofprobiotics in food including powder milk with live lactic acid bac-teria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evalua-

tion of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food

including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. October 1-4. Cordoba, Argentina

9. Fukushima, Y., Y. Kawata, H. Hara, A. Terada, and T. Mitsuoka(1998) Effect of a probiotic formula on intestinal immunoglobulinA production in healthy children. Int. J. Food Microbiol. 42: 39-44.

10. Isolauri, E., Y. Sütas, P. Kankaanpää, H. Arvilommi, and S. Salmi-nen (2001) Probiotics: effects on immunity. Am. J. Clin. Nutr. 73:444-450.

11. Reid, G., D. Beuerman, C. Heinemann, and A. W. Bruce (2001)Probiotic Lactobacillus dose required to restore and maintain anormal vaginal flora. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32: 37-41.

12. Chang, C. E., S. I. Pavlova, L. Tao, E. K. Kim, S. C. Kim, et al.(2002) Molecular identification of vaginal Lactobacillus spp. iso-lated from Korean women. J. Microbiol. Biotechnol. 12: 312-317.

13. Maragkoudakis, P. A., G. Zoumpopoulou, C. Miaris, G. Kalantzo-poulos, B. Pot, and E. Tsakalidou (2006) Probiotic potential ofLactobacillus strains isolated from dairy products. Int. Dairy J. 16:189-199.

14. Al Kassaa, I., M. Hamze, D. Hober, N. Chihib, and D. Drider(2014) Identification of vaginal lactobacilli with potential probi-

otic properties isolated from women in North Lebanon. Microb.

Ecol. 67: 722-734.15. Kos, B., J. Šušković, S. Vuković, M. Šimpraga, J. Frece, and S.

Matošić (2003) Adhesion and aggregation ability of probioticstrain Lactobacillus acidophilus M92. J. Appl. Microbiol. 94: 981-987.

16. CLSI. (2006) Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Sus-

ceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria;

Approved Guideline M45-A. Clinical and Laboratory StandardsInstitute, Waune, PA

17. Anderson, M. R., K. Klink, and A. Cohrssen (2004) Evaluation ofvaginal complaints. JAMA. 291: 1368-1379.

18. Pavlova, S., A. Kilic, S. Kilic, J. So, M. Nader-Macias, J. Simoes,and L. Tao (2002) Genetic diversity of vaginal lactobacilli fromwomen in different countries based on 16S rRNA gene sequences.J. Appl. Microbiol. 92: 451-459.

19. Jin, L., L. Tao, S. Pavlova, J. So, N. Kiwanuka, Z. Namukwaya, B.Saberbein, and M. Wawer (2007) Species diversity and relativeabundance of vaginal lactic acid bacteria from women in Ugandaand Korea. J. Appl. Microbiol. 102: 1107-1115.

20. Bang, J., H. Shin, H. Choi, D. Kim, C. Ahn, Y. Jeong, and W. Joo(2012) Probiotic potential of Lactobacillus isolates. J. Life Sci. 22:251-258.

21. Guo, X., J. Kim, H. Nam, S. Park, and J. Kim (2010) Screeninglactic acid bacteria from swine origins for multi strain probioticsbased on in vitro functional properties. Anaerobe 16: 321-326.

22. Malik, S., M. I. Petrova, I. J. Claes, T. L. Verhoeven, P. Busschaert,et al. (2013) The highly autoaggregative and adhesive phenotypeof the vaginal Lactobacillus plantarum strain CMPG5300 is sor-tase dependent. Appl. Environ. Microbiol. 79: 4576-4585.

23. Charteris, W. P., P. M. Kelly, L. Morelli, and J. K. Collins (1998)Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Lactobacillus spe-cies. J. Food Prot. 61: 1636-1643.

24. Zhou, J., C. Pillidge, P. Gopal, and H. Gill (2005) Antibiotic sus-ceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacte-rium strains. Int. J. Food Microbiol. 98: 211-217.