UNIVERZITET U NIŠU –PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET

DESTILACIJA ETARSKIH ULJA IZ SEMENA PAŠKANATA (Pastinaca hirsuta Pančić) I ODREĐIVANJE

SADRŽAJA KOMPONENATA ETARSKOG ULJA GASNOM HROMATOGRAFIJOM-MASENOM SPEKTROMETRIJOM

(GC-MS)

Predmet: Sekundarni metaboliti biljaka

profesor: student: Dr. Stojanović S. Gordana Negica Kostadinović 123

Niš, 2015.

ETARSKA ULJA (AETHEROLEA)

Opšte karakteristike:

Etarska ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte biljnih tkiva. To su složene smeše različitih isparljivih mono-, seskviterpena i fenilpropanskih

jedinjenja. Najjednostavniji način da se ove tečnosti izoluju iz biljne sirovine je destilacija vodenom

parom. Najčešća primena je u terapijske svrhe, zatim u kozmetičkoj, parfimerijskoj i

prehrambenoj industriji. Biljke koje sadrže etarska ulja nazivaju se aromatične biljke, pa se kao takve

svakodnevno koriste kao kulinarski začini.

Etarska ulja su uglavnom produkti viših biljaka (Asteraceae, Lamiaceae, Rutaceae, Myrtaceae, Lauraceae i druge ).

Lokalizovana su u različitim delovima biljaka (koren, stablo, list, cvet, plod). Interesantno je to da se u različitim delovima iste biljke, može naći sličan ili potpuno

drugačiji sastav etarskog ulja. Etarska ulja nastaju aktivnošću endogenih i egzogenih sekretornih biljnih tkiva. Tkiva se

mogu javiti kao pojedinačne ćelije u parenhimu (Lauraceae, Zingiberaceae), kao šupljine žlezdanog epitela (Rutaceae, Myrtaceae ) ili kao kanali (Apiaceae). Nekada se mogu naći u vidu žlezda i žlezdanih dlaka.

Biološka uloga: privlače insekte i pomažu u oprašivanju, mogu da inhibiraju klijanje semena kako drugih tako i sopstvene vrste, štite biljku od napada insekata i životinja, stvaraju specifičnu mikroklimu koja ih štiti od prekomerne transpiracije, sprečavaju razvoj mikroorganizama (štite biljku od infekcije).

Etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili polučvrstu konzistenciju. Lako su pokretljiva, bezbojna ili slabo obojena, bistra. Rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima i nerastvorna su u vodi. Najvažniji faktori koji mogu uticati na sastav etarskog ulja su:

1. genotip (produkcija etarskog ulja je genetski definisana) 2. fenofaza ontogenetskog razvoja (vreme prikupljanja materijala) 3.ekološki faktori (temperatura, vlažnost...) 4. način obrade biljne sirovine i 5. način izolacije etarskog ulja.

2

Pastinaca hirsuta Pančić

Opis: Dvogodišnja ili višegodišnja biljka. Stabljika rebrasta i duboko izbrazdana, naročito u donjem delu pokrivena stršećim kratkim dlakama, slabo razgranata. Listovi perasto deljeni, na licu i nalčju pokriven kratkim dlakama, režnjevi jajasti, perasto usečeni, krupno nepravilno testerasti, sedeći. Središnji štit sa 10-16 zrakova, bočni štitovi sa 3-7 zrakova. Listići involukruma i involuceluma linearni. Cvetovi žuti. Plod eliptičnog oblika dužine 5 mm. 6.

Opšte rasprostranjenje: Endemit istočnog dela Balkanskog polusotrva, raste u Srbiji i Bugarskoj.

Rasprostranjenje u Srbiji: Ozren kod Soko Banje, Stol kod Bora, Stara planina, Suva planina, okolina Niša i Vranja, Pirot (Basara, Vidlič, Kukla), Vlasotince, Ostrozub, Radan planina (Šapot), Vlasina, Kopaonik.

Stanište: Na planinskim livadama i oko planinskih potoka.

Dejstvo i hemijski sastav: Aromatičan miris i ukus potiču od eteričnog ulja koga ima najviše u plodovima. Pored eteričnog ulja paškanat sadrži obilje mineralnih materija, vitamina C, B i E, organskih kiselina, skroba i dr. Pored upotrebe u ishrani kao povrće i začin, paškanat se koristi i u narodnoj medicini. U zvaničnoj medicini nije priznata njegova lekovitost mada se alkaloid pastinacin koji se nalazi u svim delovima ove biljke, u nekim zemljma upotrebljava za lečenje neuroze, grčeva u želudcu i crevima , stenokardije i dr.

Pored vrste P. hirsuta u Srbiji živi i P. sativa

Slika 1. Pastinaca hirsuta Pančić Slika 2. Pastinaca sativa

Analize etarskog ulja dobijenog iz svežeg korenja, stabljika, cvetova i plodova paškanata Pastinaca hirsuta Pančić pokazale su da je jedna od glavnih komponenti etarskog ulja korena i stabla β-Pinene (50.6-24.1 %), (E)-β-Ocimene pronađen je u značajnom procentu u cvetovima i stabiljkama (31.6-57.3 %) . Najzastupljenij sastojak plodova i cvetova bio je heksil butanoat. Apiol, miristicin i (Z)- falkarinol

3

činili su 70% eteričnog ulja dobijenog iz korena, dok je γ-palmitolactone bio glavna komponenta etarskog ulja dobijenog iz stabla (51.9% u fazi cvetanja, 45.7 % u fazi plodonošenja).(Jovanović et al. 2014).

GASNA HROMATOGRAFIJA – MASENA SPEKTROMETRIJA (GC-MS)

Gasna hromatografija (GC) je tehnika koja se, najčešće koristi u kombinaciji sa masenom spektrometrijom (MS). Kompleksne smeše se mogu veoma lako razdvojiti gasnom hromatografijom, a MS se koristi za identifikaciju individualnih komponenata, jer maseni spektar daje informacije o njihovoj strukturi. Pojedinačne komponente smeše se pojavljuju na gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vreme može poslužiti kao veličina za kvalitativno definisanje, ali ovo nije pouzdan način, pa se nikako ne sme koristiti za određivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja.

Ono što je veoma bitno za GC – MS je da su dovoljne vrlo male količine uzorka (za etarska ulja 10mg ulja se rastvori u 1 mL etra ili heksana i od toga se injektuje 1 µL). Nedostatak. GC – MS metode je da se mogu analizirati samo komponente čiji je napon pare veći od 10-10 mbar, a maseni spektri izomernih komponenti se ne razlikuju.

GC se može direktno vezati za MS, što predstavlja kontinualni postupak vezivanja. Postoji više modela interfejsa koji povezuju ova dva instrumenta. U diskontinualnom postupku komponente se prvo razdvajaju pomoću GC, zatim se kondenzacijom u kapilarnoj cevi na izlazu izdvajaju, a potom se svaki uzorak unosi zasebno u MS. Kada se MS direktno vezuje za GC, postoji problem u razlici pritisaka. Na izlazu iz GC pritisak iznosi oko 1 bar, a MS radi pri visokom vakuumu, pritiska od 10-4 do 10-6 mbar. Danas je pojava viška gasa nosača prevaziđena, jer se koriste kapilarne kolone kod kojih je protok gasa nosača relativno mali. U sistemu GC – MS koriste se različiti sistemi za injektovanje, kolone, gasovi nosači, jonski izvori i maseni analizatori.

Tokom analize dobija se veliki broj podataka, koji se ne mogu obraditi ručno, pa je neophodno povezivanje instrumenata sa računarskim sistemom.

4

Slika 3. Šema aparature za GC-MS: 1. boca sa gasom nosačem, 2. injektor, 3. kapilarna kolona, 4. veza između GC i MS, 5. jonski izvor, 6. maseni analizator, 7. detektor, 8. vakum sistem, 9. računar

DESTILACIJA ETARSKIH ULJA

(Slika 4. Aparatura po Clevengeru)

POSTUPAK:

Usitnjena droga propisane mase se unese u destilacioni balon, promeša sa određenom zapreminom (1:5) vode i postavi nastavak za destilaciju. Kroz bočni otvor u mernu cev se unese toliko vode da se ona počne prelivati u balon za destilaciju preko cevi. Zatim se pomoću gumenih creva obezbedi protok hladne vode kroz plašt kondenzatora . Sadržaj balona se pomoću grejnog tela zagreva do ključanja i destilacija se od tog trnutka vrši naredna 2.5 do 3 sata. Nakon isteka tog vremena prvo se prekine grejanje i sačeka pola sata, zatim se pažljivim otvaranjem slavine, na dodnjem delu merne cevi, etarsko ulje se zajedno sa vodom ispusti u čist erlenmajer. Pomoću tečno-tečne ekstrakcije (3 puta po 20 ml etra) odvajamo etarski (gornji) sloj u kome je etarsko ulje rastvoreno. Sjedinjeni etarski sloj se zatim suši bezvodnim MgSO4 ili Na2SO4 i nakon desetak minuta procedi. Nakon uklanjanja rastvarača na rotacionom vakum uparivaču bez grejanja, meri se masa dobijenog ulja i računa prinos.

5

Aparatura po Clevengeru:

Aparatura za destilovanje etarskih ulja se sastoji od balona za destilovanje (1), grejnog tela I nastavka za destilaciju (2-7)

Nastavak za destilaciju se sastoji iz vertikalne staklene cevi (2), kondenzatora (3), bočnog otvora (4), graduisane–merne cevi (5), cevi koja spaja mernu I vertikalnu cev (6) I slavine (7)

PRINOS (%) = (MASA ULJA / MASA DROGE) * 100

Masa semena biljke (paškanat) = 100 g

Masa dobijenog etarskog ulja = 659 mg = 0.659 g

PRINOS= (0.659 g / 100 g) *100 = 0.659 %

EKSTRAKCIJA IZ RASTVORA

Ekstrakcija iz rastvora. tzv. tečno-tečna ekstrakcija, koristi se za izdvajanje organskih supstanci koje se nalaze u rastvoru (najčešće vodeni rastvor) pomoću rastvarača koji se ne mešaju sa vodom , a u kojima se supstanca rastvara (etar, petroletar, hloroform i dr.) . Izvodi se pomoću levka za odvajanje . Ekstrakcija je efikasnija ukoliko se izvodi više puta manjim porcijama rastvarača nego li odjednom sa celokupnom zapreminom rastvarača.

Levak za ekstrakciju biramo prema zapremini rastvora iz kojeg se ekstrahuje željena supstanca i prema zapremini rastvarača kojim vršimo ekstrakciju. Levak se puni pomoću staklenog levka najviše do 2/3 zapremine. Začepljeni levak se energično protrese – korak 1 , a otvaranjem slavine pritisak nastao u levku izjednačava se sa spoljašnjim pritiskom- korak 2. Potom se levak postavlja na metalni prsten kako bi se slojevi odvojili- korak 3.

(Slika 5. Levak za ekstrakciju)

Ukoliko se u toku ekstrakcije stvara emulzija ili se slojevi ne odvajaju dobro , pribegava se isoljavanju . Za isoljavanje se najčešće koristi NaCl (kuhinjska so). Pre odvajanja slojeva treba proveriti da li je tubus levka otvoren , a zatim otvaranjem slavine donji-vodeni sloj lagano ispusti u erlenmajer koji moye da bude vlažan. Posto se celokupni vodeni sloj ispusti , u levak ostaje gornji – organsi sloj koji se izlije kroz tubus u suv i čist erlenmajer. Vodeni sloj se vrati u levak za odvajanje i isti postupak se ponovi bar još dva puta , a organski sloj se sakuplja u istom erlenmajeru . Nakon ekstrakcije organski sloj se suši dodavanjem sredstva za sušenje , najčešće bezvodnog CaCl2, Na2SO4 ili MgSO4. Nakonpola sata

6

stajanja sredstvo za sušenje se uklanja dekantovanjem ili ceđenjem . Estrahovana supstanca se od organskog rastvarača odvija običnom destilacijom ili destilacijom pod sniženim pritiskom.

Ako se radi sa etrom , ugasiti plamenike u blizini i voditi računa da pri mućkanju ne dođe do izbacivanja zapušača pod pritiskom , pri čemu mlaz tečnosti može da isprska lice eksperimentatora!

ANALIZA I IDENTIFIKACIJA:

Hemijski sastav etarskog ulja analiziran je pomoću GC-MS metode snimanjem na aparatu 7890/7000B GC/MS/MS triple quadrupole system (Agilent Technologies, USA, equipped with a Combi PAL auto sampler) opremljenog kapilarnom kolonom (Agilent 19091S-433-5MS, 5 % fenilmetilsiloksan, 30 m x 0,25 mm, debljina filma 0,25 μm).

Režim rada GC/MS je bio sledeći: temperature injektora i interfejsa održavane su na 250 odnosno 300 °C. Temperatura peći je programirana linearno, 50-290°C, sa brzinom zagrevanja od 4 °C/min, a zatim "back flash" 1.89 min, na 280 °C, uz pritisak helijum od 50 psi. Kao noseći gas korišćen je helijum sa konstantnim protokom 1,0 mL/min. 1 μl rastvora ulja u etru je injektovan bez splitovanja. Uslovi rada elektrom impakt (EI) detektora su sledeći: jonizacioni potencijal 70 eV, pun maseni sken beležen je u intervalu m/z 50–650 (brzina skeniranja 5 skena/s), vreme skeniranja 0,32 s.

Identifikacija komponenata je vršena poređenjem masenih spektara sa spektrima iz biblioteka Wiley7 i Nist0 pomoću AMDIS softvera., kao i na osnovu slaganja izračunatih retencionih indeksa sa literaturno dostupnim retencionim indeksima (AI) (Adams, 2007). Retencioni indeksi komponenti ulja su izračunati na osnovu njihovih retencionih vremena (RI) i retencionih vremena n-alkana (C8-C25 smeša) snimljenih pod istim uslovima (Van den Dool i Kraty, 1963).

7

Slika 6. Totalni jonski hromatogram etarskog ulja ploda P. hirsuta

Tab.1 Hemijski sastav etarskog ulja dobijenog iz semena paškanata Pastinaca hirsuta Pančić

RI –

eksperimentalno određeni retencioni indeksi

8

R. br. Jedinjenje RT(min) RI* AI** %

1 Heksil butanoat 19.037 1192.3 1191 69.16

2 Heksil heksanoat 25.416 1385.2 1382 23.46

3 γ-Palmitolakton 44.314 2102 - 2.01

4 Oktil butanoat 25.499 1387.9 - 1.92

5 3-Oktenil acetat 25.111 1375.7 - 1.79

6 Oktil acetat 19.645 1209.9 1211 1.66

AI- Admsovi retencioni indeksi

Heksil butanoat Oktil acetat

3-Oktenil acetat Heksil heksanoat

Oktil butanoat γ-Palmitolakton

9

Slika 7. Strukturne formule identifikovanih jedinjenja iz etraskog ulja ploda P. Hirsuta

LITERATURA:

1. Josifović, M., (1973): Flora SR Srbije, Tom 5. – Srpska akademija nauke i umetnosti, Beograd

2. Pančić, J. (1874) : Flora Kneževine Srbije ili vaskularne biljke, koje u Srbiji divlje rastu. Državna štamparija, Beograd

3. Jovanović, Č. S., Jovanović, P. O., Petrović, M. G., Stojanović, S. G., (2015): Endemic Balkan Parsnip Pastinaca hirsuta: the Chemical Profile of Essential Oils, Headspace Volatiles and Extracts.- NATURAL PRODUCT COMMUNICATIONS 10(4): 661-664

4. Adams, R. P., (2007): Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy.- Allured Publishing Corporation, Illinois.

5. Van Den Dool, H., Kratz, P. D., (1963): A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography, - J Chromatogr 11: 463–471

10