Gayle Callis , MT , HTL ( ASCP ) HT Biologi Molekuler Hewan Montana State University Bozeman , MT gcallis@montana.edu Jaringan murine dapat hadir histologi dengan beberapa masalah cryomicrotomy mulai dari koleksi jaringan awal untuk bagian beku akhir . Formalinfixed , parafin - embedded ( FFPE ) jaringan tidak dapat digunakan ketika imunohistokimia ( IHC ) pewarnaan untuk tikus anti - tikus - CD4 limfosit dan - CD8 diperlukan . Antigen unmasking dan enzim pencernaan tidak berhasil di pulih antigens.These ini spidol CD murine terkenal untuk selalu memberikan hasil negative setelah persiapan jaringan FFPE . Karena laboratorium kami secara rutin noda untuk CD4 dan CD8 bersama dengan panel penanda CD lain pada seri bagian dari sampel jaringan tunggal ,kami telah meninggalkan jaringan FFPE di mendukung metode cryomicrotomy . Artikel ini akan membahas jaringan koleksi , jepret pembekuan , dan beku metode penyimpaBnan blok yang digunakan berhasil di laboratorium kami . pengkoleksian jaringan Hewan euthanasia dilakukan sesuai dengan protokol yang ketat mengatur maju dan dipantau oleh kami komite perawatan hewan universitas . Setelah euthanasia , jaringan yang membedah cepat dan snap dibekukan dalam beberapa menit untuk mencegah autolisis merusak dan potensi difusi antigen . Kebanyakan jaringan yang dihapus tanpa masalah tetapi beberapa organ harus ditangani cara khusus . Sebelum embedding , jaringan plastik - Tek Cryomold ( Sakura Finetek , Torrance , CA ) , dirancang untuk mendukung jaringan kaset , dihias untuk menghapus 3 plastik tepi ; sekarang menyerupai putaran Tissue - Tek Cryo3 biopsi cetakan dengan label yang diperpanjang. Label ini diadakan dengan forsep selama pembekuan dan dihias dngn bentuk lebih mudah untuk masukkan ke dalam tabung 50 ml untuk penyimpanan pembekuan . Jaringan yang lebih kecil seperti kelenjar getah bening , limpa , iris hati , dan otak (baik secara keseluruhan atau membelah di garis tengah ) yang tertempel secara terpisah . Jaringan yang berbeda , seperti limpa dan usus , memiliki sectioning berbeda kualitas dan tidak pernah disatukan dalam block.mengikuti jaringan memerlukan penanganan khusus dalam Untuk cryosection benar .Seluruh paru-paru diisi dengan Oct ( Sakura Finetek , Torrance , CA ) oleh membongkar trakea dan membuat potongan V - berbentuk kecil di atas trakea dengan hati-hati - jangan memotong melewati di structure tubular. ini terputus trakea ditarik ke dalam daerah dada dan tidak dapat diambil mudah untuk mengisi paru-paru dengan oct. Sebuah tumpul 18 mengukur suntik jarum melekat pada jarum suntik 3 ml adalah dimasukkan ke V memotong dan mendorong lembut menuju paru-paru tanpa menusuk dinding trakea . Sekitar 2,5 ml Oct adalah disuntikkan perlahan-lahan ke dalam paru-paru dan diamati dengan hati-hati untuk menghindari pengisian yg terlalu penuh tempat udara paruparu. Paru paru yang berwarna merah muda - putih kempes mengembang kedalam tembus cahaya, .Alveoli halus yang sangat rusak oleh pengisian paruparu yg terlalu penuh dengan oct . untuk mencegah kebocoran Oct, hemostat nyamuk digunakan untuk menjepit trakea sebagai jarum ditarik. paru dihapus dari rongga pleura dan dipisahkan dari hati. paru-paru dan jantung ditanam dalam Oct terpisah dalam tepat berukuran Cryomolds . Otak dapat tertanam keseluruhan , membelah pertengahan sagita , atau dipotong menjadi melintang bagian dari depan untuk kembali otak . Sumsum tulang belakang dihilangkan dengan memutuskan kolom vertebral di dasar tengkorak dekat lumbar terakhir kabel vertebra.The dipaksa keluar dari kolom vertebral dengan menyuntikkan fosfat buffered saline ( PBS ) ke dalam lubang lumbar vertebral sehingga kabelnya menyemburkan keluar dari luas serviks vertebral kabel opening.The dipotong menjadi lebih pendek panjang 3 mm dan tertanam dalam jumlah kecil Oct untuk mempertahankan datar , sisi-by side orientasi potongan-potongan ini . sebelum sectioning , blok kabel diaktifkan pada akhir dan dikelilingi oleh ekstra OCT pada pemegang blok untuk mendapatkan melintang (cross ) bagian dari sumsum tulang belakang . Usus kecil ( seluruh ) adalah transeksi bawah perut dan atas sekum dan dibedah keluar hati-hati untuk menghindari menusuk intestine. seluruh usus dibilas dengan PBS untuk menghilangkan kotoran materi, diikuti dengan injeksi Oct ke dalam lumen menggunakan 16 gauge jarum tumpul suntik 10 ml . Hindari gelembung udara di dalam suntikan dan di dalam usus lumen.kita melebihkan usus buncit dengan Oct untuk sectioning midsagittal , yang mengungkapkan patch Peyer ( gutassociated jaringan limfoid , atau GALT ) baik pada bagian luar ( serosa ) dan dalam ( lumenal ) permukaan dengan berbeda usus villi. duodenum dibedakan dengan penyempitan usus kecil sebelum jejunum . Sekitar 5 sampai 6 panjang usus dipotong dan panjang masing-masing adalah berorientasi ke dalam lingkaran konsentris di kosong , Cryomold besar. (Gambar 1 ) . Setiap panjang diberi label untuk perkiraan lokasi sepanjang usus kecil , misalnya , duodenum ( D ) , jejunum ( J1 , J2 ) , dan ileum ( I1 , I2 ) . Hal ini penting untuk dicatat bahwa jarum gauge ( ukuran) akan bervariasi sesuai dengan usia hewan , dengan lebih muda hewan membutuhkan ukuran yang lebih kecil ( dan sebaliknya , merupakan ukuran yang lebih besar dibutuhkan untuk hewan yang lebih tua ) , dalam rangka memiliki cocok ketat menjadi baik usus atau lumen trakea . menggunakan izin pengukur jarum yang benar penyisipan mudah dan mencegah robek jaringan dan bocornya Oct atau PBS selama prosedur injeksi . Tulang mengapur dapat menjadi tertanam langsung ke Oct atau dilapisi dengan 4 % polivinil alcohol ( PVA , larut dalam air, 35.000 untuk 70.000 MW , Sigma ) , kemudian jepret beku tanpa dilanjutin di OCT. kita berhasil diganti 4 % PVA dengan Oktober diencerkan 1:1 dengan PBS.A kering es / heksana perendaman Metode pembekuan digunakan untuk tulang.1 , 2 Tulang bisa pecah jika dibekukan langsung dalam nitrogen cair ( LiqN2 ) atau 2 - metil butana didinginkan oleh LiqN2 . Tikus hidung turbinat terlalu besar untuk Cryomolds sehingga mereka tertanam dengan ujung hidung berorientasi pada bagian bawah lebih 22 x 40 mm Peel - A - Way cetakan sekali pakai ( Polysciences , Warrington , PA ) . Ini menghasilkan lagi , blok berpotensi tidak stabil membentang jauh dari chuck logam selama cryosectioning . blok tulang yang dipasang pada pemegang blok dengan 2 % metil selulosa ( Aldrich ) untuk terus lebih kuat yang membantu mencegah getaran selama sectioning . Ada peringatan, namun; tidak semua cryomedia bekerja dengan baik dengan aplikasi jaringan murin kami. Kami memukan oleh percobaan dan kesalahan yang satu cryomedium gagal menahan usus buncit dengan benar selama cryosectioning dan mengakibatkan usus bagian beku dikompresi dengan menyimpang , robek vili . cryomedium yg lain selalu menarik diri dari limpa dan jaringan lain selama sectioning , menghasilkan meringkuk , melipat bagian jaringan . untuk beberapa Alasannya , cryomedia ini gagal antarmuka dengan jaringan tikus kita selama sekejap pembekuan , sectioning , atau keduanya . Disarankan bahwa laboratorium menguji beberapa cryomedia untuk mengoptimalkan khusus mereka cryosectioning kebutuhan . Kegagalan cryomedium untuk cryotomy murine tidak berarti bahwa media adalah cacat ; itu lebih mungkin bahwa cryomedium tidak pernah diuji awalnya untuk penelitian murine aplikasi , tapi hanya untuk manusia aplikasi jaringan . Snap Metode Pembekuan Laboratorium kami menggunakan tiga sekejap metode pembekuan untuk memproduksi sebanyak 30 atau lebih blok selama proses pembekuan.kita tidak lagi menggunakan LiqN2 -cooled 2 metil butana karena terlalu memakan waktu untuk recool pelarut antara masing-masing blok . lewat dingin ( -80 C ) dan freezer dengan cryostats Perangkat extractor Peltier atau panas yang pernah digunakan untuk mengambil jaringan membekukan untuk jaringan penelitian. jaringan membeku terlalu lambat dengan ini perangkat dan morfologi jaringan rusak karena air es Kristal pembentukan , atau artefak pembekuan . Meskipun kami belum diperbaiki pembekuan artefak pada jaringan murine , seseorang mungkin ingin mencoba baru-baru ini Metode diterbitkan untuk jaringan beku recovery.3 Sukrosa ( 20 % -30 % ) cryoprotection tidak digunakan untuk mengurangi pembentukan kristal air es dengan kami segar , jaringan tidak tetap , tetapi digunakan dengan paraformaldehyde tetap jaringan ditakdirkan untuk pembekuan sekejap . Kami lebih suka jepret jaringan beku dengan perendaman dalam ice/2-methyl kering campuran butana di sekitar -78 C (Gambar 3 )

Hexane dapat menggantikan 2 - metil butanauntuk setiap jaringan dan umumnya digunakan snap membekukan tulang mengapur. Metode pencelupan mengizinkan panjang sesi pembekuan , memproduksi sebanyak blok yang diperlukan tanpa recooling pelarut . lain Metode yang menghilangkan mudah menguap, pelarut beracun adalah cawan Petri mengambang di LiqN2 (Gambar 4 )

dengan hidangan didukung untuk menghindari terbalik ke dalam the LiqN2.We menggunakan salah besar , blok aluminium padat atau logam rak tabung ditempatkan di dalam styrofoam yang kotak dengan cukup LiqN2 ditambahkan ke kotak sehingga hidangan " kano " pada permukaan lewat dingin cairan ini . Cawan petri memisahkan Cryomolds dari kontak langsung dengan LiqN2 , yang harus dijaga dari piring ke mencegah retak Oct dan hancur jaringan . Jarang , blok es padat kering digunakan untuk mengambil membekukan getah bening sangat kecil node dalam cetakan kecil untuk memiliki blok benar-benar datar wajah (Gambar 2 ) , bahkan meskipun metode Petri dish/LiqN2 hasil sempurna datar blocks.The es balok method4 kering membeku jaringan lebih lambat dari baik atau perendaman Metode hidangan LiqN2/Petri dan kemauan menghasilkan pembekuan artefak dalam yang lebih besar jaringan seperti limpa . 2 Methyl butana dan heksana yang utama kesehatan , kebakaran , dan ledakan dan harus disimpan dalam explosionproof freezers.5 nitrogen cair harus digunakan dalam berventilasi ruang untuk menghindari mencekik nitrogen asap dan juga untuk mencegah parah radang dingin . Dry Ice Block MethodSebuah Cryomold dengan OCT tertanam jaringan yang digunakan pada es kering yang solid block ( -78 C ) . Es kering harus reflattened pada permukaan yang hangat untuk menghindari menggunakan kembali depresi ditinggalkan oleh block. Ini akan mencegah perlambatan beku karena ruang udara antara cetakan dan depresi es kering ( lihat Gambar . 2 ) . Dry Ice/2-Methyl Butana ( atau Hexane ) Campuran Metode Immersion Sebuah kotak styrofoam yang berisi hancur es kering sekitarnya 2 - metil butana - diisi gelas precools pelarut 30 menit sebelum menambahkan es kering langsung ke pelarut . Jangan menambahkan es kering langsung ke suhu kamar 2 - metil butana atau kekerasan menggelegak dengan tumpahan atas gelas rim akan menciptakan asap beracun pelarut . Tambahkan es kering cukup untuk mengisi dekat tepi atas gelas untuk memudahkan pemulihan beku blocks.To jepret freeze , yang Cryomold dengan jaringan OCT- tertanam diturunkan bottom pertama ke campuran sampai OCT mulai membeku , maka itu dibiarkan tenggelam ke es kering lapisan di dalam gelas . setelah blok beku , keluarkan dan biarkan duduk pada es kering atau di dalam cryostat yang ruang untuk menguapkan bahan peledak asap pelarut sebelum penyimpanan freezer( lihat Gambar . 3 ) .Petri Dish Terapung dalam Metode Liquid Nitrogen Sebuah platform logam dikelilingi oleh nitrogen cair dalam kotak Styrofoam dapat digunakan untuk membekukan OCTembedded sampel dalam cawan Petri . Platform ini mentransfer dingin untuk sampel sementara mencegah Petri dish dari tipping ke Metode nitrogen.This cair memungkinkan untuk kontrol yang lebih baik dari pembekuan proses karena sampel dapat terlihat di seluruh pembekuan proses , sehingga mencegah risiko overfreezing dan cracking blok, yang dapat terjadi dengan metode perendaman jika perendaman berkepanjangan ( lihat Gambar . 4 ) . Frozen Block Storage Toko laboratorium kami blok beku dalam lewat dingin ( -80 C hingga -86 C ) freezer untuk mencegah kedua antigenicity kerugian dan beku- pengeringan jaringan . Blok belah yang disegel kembali dengan lapisan tipis Oktober , dibungkus aluminium foil , dan kembali ke Penyimpanan lewat dingin . Blok Uncut di dipangkas Cryomolds dimasukkan ke berlabel 50 ml sekrup atas tabung centrifuge dan ditempatkan di rak tabung styrofoam dalam freezer ( -80 C ) . Kami beruntung bahwa dipotong dan / atau blok disegel kembali belah setelah 6 tahun penyimpanan pada -80 C masih memberikan immunostaining baik hasil . Jangka waktu beku blok penyimpanan dan sukses immunostaining dapat bergantung pada stabilitas antigen yang diberikan untuk menahan storage freezer kondisi dari satu laboratorium untuk lain . Lewat dingin freezer mahal dan terbatas blok penyimpanan menyajikan masalah karena ruang terbatas . temperatur rendah freezer ( -27 C sampai -40 C ) cocok untuk jangka pendek ( minggu atau bulan ) storage.Automatic diri pencairan freezer atau ruang cryostat yang tidak pernah digunakan sejak siklus freeze / thaw dapat merusak antigen dan menciptakan pembekuan artefak . Unembedded jaringan beku dapat dibungkus erat dalam aluminium foil dan disimpan pada -80 C sampai cryosectioning . Secara keseluruhan , pembedahan dan sekejap metode pembekuan bekerja dengan baik di kami laboratorium penelitian . Hal ini penting untuk membekukan murine dan hewan lainnya spesies jaringan dengan cepat untuk pewarnaan imunohistokimia untuk menghindari morfologi merusak pembekuan artefak dan untuk menstabilkan antigen . Pembekuan sekejap kami metode memungkinkan kita untuk menghasilkan sejumlah besar blok jaringan per hari . Tidak semua laboratorium memiliki freezer lewat dingin tapi mereka tidak bias membeli murah , di bawah thecounter minifreezers tanpa siklus defrost otomatis untuk menghindari menggunakan freezer auto defrost ditemukan di dalam banyak lemari es . artikel ini memberikan beberapa pedoman untuk persiapan awal jaringan untuk cryomicrotomy Histotechnology buku teks memiliki metode lain dan diskusi tentang Informasi cryomicrotomy.6 pada diseksi tikus dengan sangat baik foto tersedia di www.eulep.org / nekropsi of_the_Mouse / index.php atau http://icg.cpmc.columbia.edu/cattor etti / Protokol / MousePathology / main PageMousePath2.html . A membantu dan berwarna-warni dinding anatomi tikus grafik tersedia dari Asosiasi Amerika untuk Laboratorium Ilmu Hewan.