Gıda Örneklerinde ğiştirilmiş Organizma Analizleri...deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri

Bölüm 4

DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

M. Somma

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION R E

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

EGIONALBÜRO FÜR UROPA

DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 2

İçindekiler

Bölüm 4

DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Giriş 3

Ekstraksiyon yöntemleri 4

Saflaştırma yöntemleri 4

CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi 6

Spektrofotometre ile DNA miktar tayini 9

DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri 9

Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi 11

Deneysel 13

Kaynaklar 17

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 4


Giriş

Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması çoğu moleküler biyolojik çalışmada

ve rekombinant DNA tekniklerinin tümünde ilk adımdır. Nükleik asit ekstraksiyon

yöntemlerinin buradaki amacı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanarak bir GD

spesifik analiz için farklı kaynaklardan nükleik asit saflaştırılmasını sağlamaktır.

Nükleik asitlerin kalitesi ve saflığı PCR analizleri için en önemli faktörlerden

bazılarıdır. Yüksek saflıkta, inhibisyon bulaşanlarından arındırılmış nükleik asitleri

elde etmek için, uygun ekstraksiyon yöntemleri uygulanmalıdır. PCR analiz

performansını inhibe eden olası bulaşanlar Tablo 1’de listelenmiştir. Örnekteki PCR

inhibitorlerinin varlığından kaynaklanan yanlış (negatif) bir sonucun ortaya çıkmasını

engellemek için PCR inhibisyonu test edilerek kontrollü bir deney gerçekleştirilmesi

önemlidir. Bu amaçla, bir bitki-spesifik (ökaryot veya kloroplast) veya türe spesifik

PCR analizi sıklıkla kullanılır.

Tablo 1. PCR işleminin bazı inhibitörleri

İnhibitör İnhibisyon Konsantrasyonu

SDS >%0,005 Fenol >%0,2 Etanol >%1 İzopropanol >%1 Sodyum asetat >5 mM Sodyum klorit >25 mM EDTA >0,5 mM Hemoglabin >1 mg/ml Heparin >0,15 i.u./ml Üre >20 mM Reaksiyon karışımı >%15

Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için çok çeşitli yöntemler vardır, en

uygun tekniğin seçimi genellikle asağıdaki kriterlere bağlıdır:

Hedef nükleik asit

Kaynak organizma

Başlangıç materyali (doku, yaprak, tohum, işlenmiş materyal vb.)

İstenen sonuçlar (verim, saflık, pürifikasyon için gerekli süre)

Bir sonraki uygulama (PCR, klonlama, işaretleme, blotlama, RT-PCR, cDNA

sentezi),vs

Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için günümüzde en yaygın olarak

kullanılan bazı yöntemlerin ilkeleri aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.



Ekstraksiyon yöntemleri

Biyolojik materyalden nükleik asitlerin ekstraksiyonu hücre parçalanması, hücre

nükleazların inaktivasyonu ve nükleik asitlerin parçalanmış hücreden ayrımını

gerektirir. Genellikle ideal parçalama prosedürü birtakım tekniklerin bileşiminden

oluşur. Bu süreç karmaşık baslangıç materyalini (doku gibi) parçalayacak kadar sert,

ancak hedef nükleik asidi koruyacak kadar da yumuşak olmalıdır. Temel parçalama

prosedürü aşağıdaki yöntemlerle gerçekleştirilebilir:

Mekanik parçalama (öğütme, hipotonik parçalama gibi)

Kimyasal uygulama (deterjanlarla parçalama, tıol ile redükleme, kaotropik katkı

madeleri,vs gibi)

Enzimatik parçalama (Proteinaz K gibi)

Hücre içi nükleazların inaktivasyonu ve hücre membranının parçalanması işlemleri

birleştirilebilir. Örneğin, tek bir çözelti hücre membranını parçalamak için deterjanlar,

hücre içi enzimleri inaktive etmek için de güçlü kaotropik tuzlar içerebilir. Hücre lizizi

ve nükleaz inaktivasyonundan sonra hücre içi diğer faktörlerin uzaklaştırılması

filtrasyon veya presipitasyon(çökeltme) gibi işlemlerle kolayca yapılabilir.

Saflaştırma yöntemleri

Hücre ekstraktlarından nükleik asitlerin saflaştırılması yöntemleri genellikle aşağıdaki

tekniklerden iki veya daha fazlasının birlikte kullanımını gerektirir:

Ekstraksiyon / presipitasyon

Kromatografi

Santrifügasyon

Afinite kolon ayrımı

Bu tekniklerin kısa açıklamaları takip eden paragraflarda verilecektir (Zimmermann

ve ark., 1998).

Ekstraksiyon / Presipitasyon

Çözücü ekstraksiyonu nükleik asitlerden kontaminantları uzaklaştırmak için sıklıkla

kullanılır. Örneğin, fenol ve kloroform kombinasyonu proteinleri uzaklaştırmak için,

izopropanol ve etanol ile presipitasyon genellikle nükleik asitleri konsantre etmek için

kullanılır. Hedef nükleik asitlerin miktarı düşük olduğunda, presipitasyonun etkisini

artırmak için karışıma bir inert taşıyıcı (glikojen gibi) ilave edilebilir. Nükleik asitlerin

diğer presipitasyon yöntemleri yüksek konsantrasyonlu tuz (salting out) kullanılarak



yapılan seçici presipitasyon ve pH’daki değişiklikler kullanılarak yapılan protein

presipitasyonunu içerir.

Kromatografi

Kromatografi yöntemleri jel filtrasyonu, iyon değişimi, seçici adsorpsiyon veya affinite

ile bağlanma gibi farklı ayrıştırma tekniklerinden oluşabilir. Jel filtrasyonu, jel

partikülleri porlarının moleküler eleme özelliği ile işler. Belirli por çapına sahip bir

matriks daha küçük moleküllerin difüzyon yolu ile porlara girişine izin verir, daha

büyük moleküller porlar tarafından içeri alınmaz ve boş hacimle ayrıştırılılar. Böylece

moleküller molekül büyüklüğü azalışına bağlı olarak sırayla elüye edilir. İyon değişimi

kromatografisinde, bir hedef molekül ve kolon matrisindeki fonksiyonel gruplar

arasındaki elektrostatik interaksiyondan yararlanılır. Nükleik asitler (yüksek negatif

yüklü, lineer polianyonlar) iyon değişimi kolonundan basit tuz tamponları ile

ayrıştırılır. Adsorpsiyon kromatografisinde, nükleik asitler diğer biyolojik moleküllerin

aksine, belirli tuzlar varlığında (örn. kaotropik tuzlar vb.) seçici olarak silika veya cam

yüzeyler üzerine tutunur. Daha sonra düşük konsantrasyonlu bir tuz tamponu veya

su ile nükleik asitleri, bir sonraki uygulamada direkt olarak kullanabilen bir örnek

oluşturacak biçimde, ayrıştırmak mümkündür.

Santrifügasyon

Seçici santrifüj güçlü bir saflaştırma yöntemidir. Örneğin yüksek g-gücünde kendi

kendine oluşan CsCl gradientlerdeki ultrasantrifügasyon, plazmit saflaştıması için

uzun süredir kullanılmaktadır. Genellikle, santrifüj bir başka yöntemle kombine

edilerek kullanılır. DNA ve RNA’yi daha küçük kontaminantlardan (tuzlar, nükleotidler,

vb) tampon degişimi veya büyüklük tespiti amacıyla saflaştırmak için jel filtrasyonla

santrifügasyonu birleştiren spin kolon kromatografisi buna bir örnektir. Bazı

prosedürler, kromatografik bir matriks ( bknz. Bir üst paragraf) üzerindeki selektif

adsorpsiyon ile santrifugal elüsyonu bir nükleik asit çeşidinin seçici saflaştırılmasi için

kombine eder.

Afinite kolon ayrımı

Son yıllarda bir çok saflaştırma yöntemi nükleik asitlerin afinite immobilizasyonunu

manyetik ayrıştırmayla birleştirmiştir. Örneğin, poly(A)+mRNA, biyotin işaretli

oligo(dT) ile streptavidin kaplı manyetik partiküllere bağlanabilir. Bu bağlanmış

partiküller solusyondan ve bağlanmamış kontaminantlatdan bir mıknatıs yardımı ile

ayrıştırabilir. Bu katı faz tekniği, santrifugasyon, organik ekstrasyon ve faz



ayrıştırmanın bazı aşamalarını basit, hızlı bir manyetik ayrıştırma ile yaptığı için

nükleik asit saflaştırma olayını basitleştirir.

CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi

İlk kez Murray ve Thompson tarafından 1980’de geliştirilen CTAB

(Cetyltrimethylammonium bromide) protokolü Wagner ve arkadaşları tarafından

1987’de yayınlanmıştır (Wagner ve ark., 1987). Bu yöntem bitki ve bitki kaynaklı gıda

maddelerinden DNA ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için kullanılır. Yöntem özellikle

polisakkaritlerin ve polifenolik bileşenlerin elimine edilmesine uygundur; diğer bir

deyişle saf DNA eldesi ve dolayısıyla da DNA kalitesinde etkilidir. Bu prosedür bitki

moleküler genetiğinde yaygın bir biçimde kullanılmakadır ve GDO’ların

saptanabilmesi için yapılan validasyon denemelerinde test edilmiştir (Lipp ve ark.,

1999; 2001). Birkaç değişiklik tekniğin birçok ham ve işlenmiş gıda matriksinde

kullanılabilmesi için geliştirilmiştir (Hupfer ve ark., 1998; Hotzel ve ark., 1999; Meyer

ve ark., 1997; Poms ve ark., 2001).

CTAB yönteminin ilkeleri: Liziz, ekstraksiyon ve presipitasyon

Bitki hücreleri, az tuzlu bir ortamda nükleik asitlerle birlikte çözünmez bir kompleks

oluşturan, iyonik bir deterjan olan CTAB ile lize olabilir. Bu koşullarda, polisakkaritler,

fenolik bileşenler ve diğer kontaminantlar süpernatantta kalır ve ortamdan yıkama ile

uzaklaştırılabilir. DNA kompleksi tuz konsantrasyonu arttırılarak çözünülür ve etanol

ve izopraponal ile presipite edilir. Bu bölümde, bu üç temel aşamanın ilkeleri, hücre

duvarı lizizi, genomik DNA ekstraksiyonu ve presipitasyonu açıklanacaktır.

Hücre duvarı lizizi: Daha önce açıklandığı gibi, DNA ekstraksiyonunun ilk aşaması

hücre ve çekirdek duvarlarının parçalanmasıdır. Bu amaçla, homojenize örnek ilk

aşamada EDTA Tris/HCl ve CTAB içeren ekstraksiyon tamponu ile muamele edilir.

Bütün biyolojik membranlar kovalent olmayan bağlarla birbirine bağlı lipit ve protein

moleküllerinden oluşan temel bir yapıya sahiptir.



Şekil 1. Hücre membranlarının basit gösterimi (Şekil 1, 2, 3 Genetic Science

Learning Center, University of Utah http://gslc.utah.edu)

Şekil 1’de gösterildiği gibi, lipit molekülleri, içinde protein moleküllerinin bulunduğu,

süreklilik gösteren bir çift tabaka biçiminde dizilmiştir. Lipit molekülleri baş olarak

isimlendirilen hidrofilik uçlar ve kuyruk olarak isimlendirilen hidrofobik uçlardan

oluşur. CTAB yönteminde membran lizizi, ekstraksiyon tamponu içinde bulunan bir

deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu

icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB bileşeni hücre ve çekirdek membranını

oluşturan lipitleri tutma özelliğine sahiptir. Bir deterjan kullanılarak çözünen lipitlerin

mekanizmasi Şekil 2’de gösterilmektedir.

Şekil 2. Lipit çözünmesi

Şekil 3, hücre membranının CTAB ekstrasyon tamponuna maruz kaldığında

deterjanın genomik DNA’yı çıkararak lipitleri ve proteinleri nasıl yakaladığını

göstermektedir. Spesifik bir tuz (NaCl) konsantrasyonunda, deterjan nükleik asitlerle

çözünmez bir kompleks oluşturur. EDTA magnezyum dahil farklı metallere

bağlanabilen kelatlayıcı bir bileşendir. Magnezyum DNAaz enziminin kofaktörüdür.

Mg ve EDTA bağlanması ile, varolan DNAaz’ın aktivitesi azalır. Tris/HCl pH’yı

tamponlama kapasitesine sahip bir çözeltidir (düşük veya yüksek pH DNA’ya zarar

verir). Nükleik asitler saflaştırmanın bu aşamasında kolayca degrade olabildiği için

örneğin homojenizasyonu ve CTAB tampon çözeltisinin eklenmesi arasındaki

zamanın en aza indirilmesi önemli bir noktadır. Hücre ve organel membranları


http://gslc.utah.edu/


(mitokondri ve kloroplast gibi) parçalandıktan sonra DNA pürifikasyonu

gerçekleştirilir.

Şekil 3. Hücre membranının parçalanması ve genomik DNA’nın ekstrasyonu

Ekstraksiyon: Bu aşamada polisakkaritler, fenolik bileşikler, proteinler ve sıvı

çözeltide bulunan diğer hücre lizatları, CTAB nükleik asit kompleksinden ayrılır. Çok

sayıda enzimatik reaksiyonu inhibe etme yetenekleri nedeniyle fenolik bileşiklerin

olduğu gibi polisakkaritlerin de yok edilmesi özelikle önemlidir. Düşük tuz

konsantrasyonlarında ( 0,5 M NaCl), nükleik asit kompleksi kontaminantları çökmez

ve solüsyonun klorofomr ile ekstraksiyonu sırasında uzaklaştırlıbailir. Kloroform

proteinleri denatüre eder ve sıvı ile organik fazların ayrılmasını kolaylaştırır. Normal

olarak, sıvı faz formu üstteki fazdır. Ancak, sıvı faz tuz konsantrasyonu nedeniyle

yoğun ise alt fazı oluşturacaktır. Buna ek olarak, sıvı çözeltinin pH’sı 7,8-8,0

değerlerine yeteri kadar denkleştirilmemiş ise nükleik asitler organik faza

dağılacaktır. Gerektiğinde sıvı fazdaki kirleticileri tamamen ortadan kaldırabilmek için

kloroform ekstraksiyonu iki veya üç kez uygulanır. Nükleik asitleri en iyi şekilde geri

kazanabilmek için organik faz geri özütlenerek bir önceki ekstrakta eklenebilir.

Nükleik asit kompleksi bir kez saflaştırıldığında, prosedürün son aşaması olan

presipitasyon gerçekleştirilebilir.

Presipitasyon: Son aşamada, nükleik asitler deterjandan ayrılır. Bu amaçla, ilk

olarak sıvı solusyon yüksek konsantrasyonlu NaCl ( 0,8 M NaCl) ve CTAB

karışımından oluşan bir presipitasyon çözeltisi ile muamele edilir. Tuz nükleik asit

presipitatı oluşumu için gereklidir. Sodyum asetat tamponlama kapasitesi nedeniyle

NaCl yerine tercih edilebilir. Bu koşullar altında, alkol içerisinde suda olduğundan

daha çözünür olan deterjanlar, nükleik asitler presipite olurken yıkanıp atılabilirler.

Takip eden %70 alkol ile muamele, nükleik asitlerin geri kalan tuzdan arındırılarak ek

bir saflaştırma yapılmasını sağlar.



Spektrofotometre ile DNA miktar tayini

DNA, RNA, oligonükleotidler ve hatta mononükleotidler seyreltilmiş veya

seyreltilmemiş sıvı solusyonlar içinde, ultraviyole ışığı altında (aynı zamanda görünür

dalga boylarında) sahip oldukları absorbsiyon A (optik yoğunluk, OD) üzerinden

direkt olarak ölçülebilir. Örnek saf olduğunda (örneğin proteinler, fenol veya agaroz

gibi kontaminantlar çok düşük miktarlda mevcut yahut yoksa) nükleotid bazları

tarafından absorbe olan ultraviyole radasyonun miktarı spektrofotometrik olarak basit

ve doğru biçimde ölçülebilir. Bu yöntem için, düşük iyon konsantrasyonlu sıvı

tamponlar (örneğin TE tamponu) idealdir. Nüklek asitlerin konsantrasyonu genellikle

bir köre (boş örnek) karşı 260 nm’de A ölçülerek belirlenir. Kontaminantların varlığı,

oran hesaplaması ile ayırt edilebilir. Proteinler 280 nm’de absorbladığı için A260/A280

oranı nükleik asitin saflığını hesaplamak için kullanılır. Saf DNA yaklaşık 1,8 , saf

RNA ise yaklaşık 2,0 değerini vermelidir. 230 nm’de görülen absorpsiyon, örneğin

karbonhidratlar, peptitler, fenoller veya aromatik bileşenler gibi maddelerle

kontaminasyonu gösterir. Saf örneklerde A260/A230 oranı yaklaşık 2,2 olmalıdır.

Alternatif bir yöntem olan etidiyum bromidli agaroz yöntemi, nükleik asitlerin düşük

miktarlarda mevcut olduğu durumlarda kullanışlıdır. Nükleik asit miktarı, bir seri

konsantrasyon standardıyla karşılaştırılarak, UV ışığına maruz bırakıldığında

etidiyum bromid tarafindan ışınan floresanın yoğunluğundan hesaplanabilir.

DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri

Spektrofotometrik ölçümde, bir çözeltideki çözüntü konsantrasyonunu belirlemek için

ışığın çözeltide iletilme oranını kullanır. Cihaz, belirli bir dalga boyunda bir ışık

hüzmesinin bir örnekten geçtiği ve iletilen ışık enerjisi miktarının örneğin diğer

tarafında bir fotosel ile ölçüldüğü basit bir ilkeyle çalışır.

Şekil 4’te gösterildiği gibi tek ışık yolu olan bir spektrometre, ışık kaynağı, prizma,

örnek kuyucuğu ve fotoselden oluşur. Bunların her birine aydınlatma yoğunluğunu ve

dalga boyunu kontrol etmek ve fotoseldeki enerjiyi voltaj dalgalanmasına

dönüştürmek için uygun elektrik ya da mekanik sistemler bağlanmıştır. Oluşan voltaj

dalgalanması daha sonra metre ölçeğinde görüntülenir veya daha sonraki

incelemeler için bir bilgisayara kaydedilir.



Şekil 4. Işık iletimi şeması

Bütün moleküller ışık enerjisini belirli bir dalga boyunda emerler. Böylece bir çözelti

içindeki çözüntünün konsantrasyonunu bulmak olasıdır. Beer-Lambert kuralına göre

absorsiyon (emilim, soğurma) A (optik yoğunluk, OD olarak da adlandırılır) ile makro

molekülün konsantrasyonu (c) arasında aşağıdaki denklemde verilen doğrusal bir

ilişki vardır:

A=OD= ε.I.c

ε molar sönüm katsayısı (molar extinction coefficient), c konsantrasyon ve l küvetin

ışık yolu uzunluğudur. Proteinler ve nükleik asitler, ultraviyole alanda ışığı 210 ve 300

nm arasında emerler. Daha önce açıklandığı gibi DNA ve RNA çözeltilerinin

maksimum emilimi 260 nm’de, protein çözeltilerinin ise 280 nm’de olmaktadır. DNA

ve RNA çözeltileri ışığı kısmen 280 nm’de ve protein çözeltileri 260 nm’de

soğurduğundan 260 ve 280 nm (A260/A280) ölçüm aralığındaki bir oran, nukleik

asitlerin saflık değerini verir. DNA ve RNA yaklaşık olarak 1,8 ve 2,0 değerlerinde

A260/A280’e sahiptir. 10 mm’ lik bir ışık yolu ve 260 nm’lik bir dalga boyu için A=1

absorpsiyon, yaklaşık 50 µg/ml dsDNA, 37 µg/ml ssDNA, 40 µg/ml RNA veya 30

µg/ml oligonükleotidlere denk gelmektedir. Eğer proteinden kaynaklanan bir

kontaminasyon varsa A260/A280 yukarıda verilen değerlerden daha az olacaktır ve

nükleik asit miktarının doğru ölçümü mümkün olmayacaktır. Burada, DNA

çözeltilerinde RNA’dan kaynaklanan kirlenmelerin spektrofometre ile sağlıklı bir

şekilde tespit edilemeyeceğinin altını çizmek gerekir. 325 nm’de A ölçümü,

çözeltideki çöküntü varlığını ya da küvetin kirli olduğunu göstermede kullanılır.



Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi

Küvet seçimi: Absorbans (A) ölçümü için kullanılan nükleik asit miktarı küvet

kapasitesine bağlıdır. Örnek konsantrasyonuna, seyreltme faktörüne ve mevcut

örnek hacmine bağlı olarak uygun bir küvet, seçilmelidir. GDO saptaması için

kullanılan birçok prosedürde elde edilen genomik DNA’nın hacmi 50 ile 100 µl

arasındadır. Düşük hacimli nükleik asitlerin spektroskopik ölçümü için 5 ile 70 µl

kapasitede, mikro hacimli küvet çeşitleri kullanılır.

Kurulum : Spektrofotometrenin kalibrasyonu şu nedenlerle önemlidir :

Doğru ışık yolu uzunluğunu ayarlamak,

dsDNA, ssDNA veya RNA için doğru faktörü belirlemek,

Su ya da bir tampon solüsyonundan (A260=0) oluşan boş bir solüsyonu ölçmek

(kör),

Kurulum referansını belirli aralıklarla yenilemek,

Kurulum referansının güvenilirliliğini kontrol etmek için saf nükleik asitten belirli bir

miktar ölçmek

Bilinmeyen örneklerin ölçümü : Kullanılan küvetin kapasitesine bağlı olarak belirli

miktarda DNA çözeltisi konsantrasyon değerlendirmesi için kullanılır (örneğin 0,2

ml’nin altında kapasitesi olan bir küvet için 5 µl DNA 195 µl su ile seyreltilir).

Spektrofotometre ayarlandıktan ve nükleik asit çözeltisi eklendikten sonra küvetin

kapağı kapatılır, çözelti karıştırılır ve absorbans ölçülür. Pipetten kaynaklanan

hataları aza indirmek için ölçüm en az iki kere tekrarlanmalı ve her zaman en az 5 µl

DNA çözeltisi kullanılmalıdır. 0,02’den az veya 1 ile 1,5 (kullanılan cihaza bağlı

olarak) arasındaki A260 ölçümleri, yüksek hata payı olasılığı nedeniyle tavsiye

edilmemektedir.

Bir çözeltide bulunan belirli bir nükleik asitin c konsantrasyonu A260’ın 260 nm’de

ölçülen absorbans olduğu düşünülerek aşağıdaki denklemler kullanılarak hesaplanır.

Tek zincirli DNA c(pmol/µl) = A260/0,027

Çift zincirli DNA c(pmol/µl) = A260/0,020

Tek zincirli RNA c(pmol/µl) = A260/0,025

Oligonükleotid c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG+0,84NT



Referans DNA’nın, 50 µg/ml icin A260=1 olduğu dsDNA olduğu düşünülerek, 10 mm duvar

kalınlığı olan bir küvette 1x TNE tamponunda çözülmüş saf calf thymus DNA’nın absorbans

ölçümleri Tablo 2’de örneklenmiştir. DNA konsantrasyonu 25 µg/ml’dir.

Tablo 2. 1x TNE tamponundaki çok saf calf thymus DNA’nın absorbans ölçümleri

Dalga boyu Absorbans A260/A280 c (µg/ml)

325 0,01 - -

280 0,28 - -

260 0,56 2,0 28

230 0,30 - -



Deneysel

Ekipman

NOT

Ekipmanların tamamı kullanımdan önce sterilize edilmeli ve herhangi bir olası DNA kalıntısı

uzaklaştırılmalıdır. Kontaminasyondan kaçınmak için, aerosoldan korunmuş filtreli pipet

uçları kullanılmalıdır.

Steril bir jilet, veya bir havan gibi, örneğin boyutlarını küçültmede kullanılacak

aletler

Su banyosu veya ısıtıcı blok

Mikrosantrifüj

Mikropipetler

Vorteks karıştırıcı

1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri

Tartım kapları veya eşdeğeri

Spatüller

Terazi (0.01 g tartabilen)

Looplar

Mikrosantrifüj tüpleri için taşıyıcı raf

Opsiyonel : DNA peletlerini kurutmak için vakum desikatör

Çözeltiler

NOT

Kimyasalların tümü moleküler biyolojide kullanılabilir saflıkta olmalıdır. Deiyonize su ve

tamponlar kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. Ayrıca, hiçbir kimyasal, DNA ve DNaz

içermemelidir.

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) CAS 124-03-8

Kloroform

İsopropanol

Na2EDTA CAS 6381-92-6



Etanol

NaCl

Proteinaz K

RNaz A

Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)

Steril deiyonize su

CTAB tampon çözeltisi

20 g/l CTAB 4 g

1,4 M NaCl 16,4 g

0,1 M Tris HCl 3,15 g

20 mM Na2EDTA 1,5 g

100 ml deiyonize suya eklenir.

1 M NaOH ile pH 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ ye tamamlanır ve otoklavlanır.

4°C’de maksimum 6 ay depolanır.

CTAB presipitasyon çözeltisi

5 g/l CTAB 1 g

0,04 M NaCl 0,5 g

Deiyonize su ile 100 ml’ ye tamamlanır.

Çözeltinin pH’sı 1 M NaOH ile 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ye tamamlanır ve otoklavlanır.

Çözelti 4°C’ de maksimum 6 ay saklanır.

1,2 M NaCl

7 g NaCl deiyonize suda çözülerek 100 ml’ye tamamlanır.

Otoklavlanır ve oda sıcaklığında saklanır.

%70 (v/v) Etanol çözeltisi

70 ml saf etanol 30 ml steril deiyonize su ile karıştırılır.



RNAaz A 10 mg/ml -20°C’de saklanır.

Proteinaz K 20 mg/ml -20°C’de saklanır.

Prosedür

Bu prosedür steril koşullar gerektirir. Kontaminasyon, örnek hazırlama sırasında tek

kullanımlık ekipman ve dekontaminasyon çözeltileri kullanılarak ve toz oluşturmaktan

kaçınılarak engellenebilir.

Homojenize örnekten 100 mg steril bir 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpe aktarılır.

300 µl steril deiyonize su eklenir, bir loop ile karıştırılır.

500 µl CTAB-tampon çözeltisi eklenir, bir loop ile karıştırılır.

20 µl Proteinaz K (20 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 65°C 30-90 dakika inkübe

edilir.

20 µl RNaz A (10 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 5-10 dakika inkübe edilir.

Yaklaşık 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Süpernatant 500 µl kloroform içeren bir mikro santrifüj tüpüne eklenir, 30 saniye

karıştırılır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabakanın 500 µl’si, 500 µl kloroform içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne

aktarılır ve karıştırılır.

16000x g’de 5 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

2 hacim (çektiğimiz üst tabaka çözeltinin 2 katı) CTAB presipitasyon çözeltisi eklenir,

pipet ile karıştırılır.

60 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.


Süpernatant atılır.

Pelet 350 µl NaCI (1,2 M)’de çözündürülür.

350 µl kloroform eklenir ve 30 saniye çalkalanır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

0,6 hacim izopropanol eklenir ve çalkalanır.



%70’lik Etanol çözeltisinden 500 µl eklenir ve dikkatlice karıştırılır.





Pelet kurutulur ve 100 µl steril deiyonize suda DNA tekrar çözündürülür.

DNA çözeltisi buzdolabında maksimum iki hafta, veya dondurucuda -20°C’de daha

uzun bir süre saklanabilir.



Kaynaklar

Hotzel, H., Müller, W. and Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of

residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified

ingredients. European Food Research Technology 209, 192-196.

Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic

modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.

Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207.

Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and

Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction

for the detection of genetically modified organisms in various processed

foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC

collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and

maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.

Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in

processed food products: development and validation of PCR assay for the

specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia (Eds.).

Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1).

Authenticity and adulteration of food-the analytical approach. 24-26 September

1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN: 3-9521414-0-2.

Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight

plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.

Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of

specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research

Technology 213, 361-365.

Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and

Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines




and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84,

2097–2100.

Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative

evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean

food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,

81–90.

Documents

Gıda Örneklerinde ğiştirilmiş Organizma Analizleri...deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB