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Gene Cloning

메가MD 생물

김 재 윤

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1) Gene cloning의 1단계 - 원하는 유전자를 얻어낸다① Internet에서의 유전자 검색 – GenBank② GenBank 염기서열의 분석③ Polymerase Chain Reaction(PCR)Reverse④ Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)RNA의 분리⑤ PCR 산물의 전기영동(electrophoresis)

2) Gene cloning의 2단계 - 얻은 유전자를 vector에 삽입한다. ① Vector에 대하여 DNA ligation과 restriction enzyme ② T-vector를 이용한 PCR product의 cloning

3) Gene cloning의 3단계 -유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입한다.① Transformation ② 항생제와 LacZ를 이용한 selection

4) Gene cloning의 4단계 - 올바른 clone을 선택한다① Plasmid DNA 분리② Restriction enzyme mapping ③ DNA sequencing

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>>Gene cloning의 1단계 - 원하는 유전자를 얻어낸다 .

1. 어떤 유전자에서 찾을 것인가 ?

유전자는 RNA에서 얻을 수도 있고 DNA에서 얻을 수도 있다. DNA 에서는 exon 과 intron, cds(coding sequences)를 생각해야 한다. 우선 어떤 종(species)에서 실험해야 하는가를 결정해야 한다. Human, rat, mouse 등 각각의 종에 해당이 되어야 한다. 그 다음으로 중요한 것은 특히 mRNA를 이용하는 경우에 반드시어떤 장기를 사용해야 하는가를 명백히 해야 한다는 것이다. 각 장기들에서 DNA는 대개 같다고 볼 수 있지만 mRNA는 있을 수도있고 없을 수도 있다. 그리고 구조가 다를 수도 있습니다. 따라서 자신이 얻고자 하는 유전자가잘 발현되는 장기를 선택해야 한다.

2. 유전자를 어떻게 얻을 것인가 ?Library screening 과 PCR(polymerase chain reaction) 방법.

3. 유전자에서 증폭할 부분이 어디인가 ?

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>>Internet에서의 유전자 검색 - GenBank

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Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html

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<Genomic DNA, mRNA, CDS와의 관계>

사람의 유전자는 exon과 intron으로 구성되어 있다.

첫 exon 앞에는 이 유전자의 발현을 조절해주는 promoter가 존재합니다.

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The Universal Genetic Code

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>>Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR에는 다음과 같은 재료가 필요하다.

1.Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA .

2. 한 쌍의 primer : 증폭할 부분을 잡는 짧은 oligonucleotide 이다.

3. dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는재료가 되는 nucleotide들이다.

4. Taq polymerase : 열에 특별히 강한 유전자 합성효소.

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1. DNA 의 변성(denaturation)

90°C - 96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는

활성이 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 합니다. 첫 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킵니다.

2. Primer 의 결합(annealing)

50°C - 65°C에서 진행됩니다. 염기간의 결합은 G와 C는

세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서

결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋습니다. 사실 primer 를 만드는 것도 이 annealing temperature를 고려하여 합성해야 합니다. 일반적으로 GC content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직합니다.

3. DNA의 합성(polymerization)

70°C - 74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는

시간을 연장시킬 수도 있습니다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000-4,000 nucleotides를합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히

반응이 일어납니다. 마지막 cycle 에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋겠습니다.

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다음은 대표적인 PCR mixture의 예입니다.

example of PCR mix

DNA template 1 ulPrimer, upstream(10 pmoles/ul) 1 ulPrimer, downstream(10 pmoles/ul) 1 ul2.5 mM dNTP 4 ul10x Taq buffer (+MgCl2) 5 ulTaq DNA polymerase(1 u/ul) 1 ul

water to 50 ul

example of PCR cycle 94°C 5분94°C 30초 - 60°C 30초 - 72°C 30초 (30 cycle)72°C 5분

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Primer의 디자인

1) 관심있는 부분이 포함되어야 한다 –주로 ORF대개 단백질의 expression을 위해서는 ORF 전체가 필요하게 됩니다.

2) 증폭하려는 부위의 크기를 고려해야 한다 – 200-500 bp

3) GC content와 primer length

4) 이상한 염기서열은 피하라 –예, primer가 GGGGCCCCGGTTTTAATTAA경우.

5) 합성될 때의 사정을 고려하라

이것도 조금 어려운 내용이지만, primer에 포함되지는 않았어도증폭되는 부위에 너무 GC content가 높다거나 다른 secondary structure를형성할 수 있는 부위가 있으면 잘 안될 것입니다

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RT-PCR의 반응

cDNA 를 만드는 반응의 예

Total RNA 1 - 5 ugRandom hexamer or nonamer (100 ng/ul) 1 ul10x reverse transcriptase buffer 2 ul10 mM DTT 4 ul10 mM dNTP 1 ulReverse transcriptase (250 units/ul) 1 ul

(Mn 2+에서는 역전사 효소 기능이 유지되며Mn 2+를 chelate시키고 MgCl 2+를 처리하면DNA Polymerase 활성을 모두 가진다.

water to 20 ul

70°C 10분 RNA denaturation42°C 1시간 Reverse transcriptase reaction80°C 15분 Enzyme killing

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>>RNA의 분리

1) RNase로부터 RNA를 보호한다

주위 환경의 RNase contamination 방지하기 위해서 시약에DEPC라는 RNase inhibitor를 처리. 용기는 대개 1회용을 쓰고, 어쩔 수 없는 경우 autoclave, baking 등을 이용한다.

2) 단백질을 제거한다

Phenol/Chloroform을 처리하거나 ultracentrifuge 등 여러 방법.

3) DNA로부터 선택적으로 RNA를 분리한다.

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Spectrophotometry

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>>PCR 산물의 전기영동 (electrophoresis)

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Commonly used electrophoresis buffers Buffer Concentrated stock solution (per liter)

Tris-acetate (TAE) 50x242 g Tris base57.1 ml glacial acetic acid100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)Generally used for agarose EP

Tris-borate (TBE) 20x121.1 g Tris base61.7 g boric acid7.44 g Na2EDTA-2H2OGenerally used for DNA sequencing

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Gel loading buffers (6x)

I 0.25% bromophenol blue0.25% xylene cyanol FF40%(w/v) sucrose in water

II 0.25% bromophenol blue0.25% xylene cyanol FF15% Ficoll(Type 400)

in water

III 0.25% bromophenol blue0.25% xylene cyanol FF30% glycerol in water

IV 0.25% bromophenol blue40%(w/v) sucrose in water

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>>Gene cloning의 2단계 –얻은 유전자를 vector에 삽입한다

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Vector의 기능1) 세포 내에서 자가복제(self-replication) 을 합니다Vector로 쓰는 DNA들은 세포 내에서 자가복제를 한다. 박테리아 세포 내에는 박테리아가 고유하게 가지고 있는 chromosomal DNA가 있다. 한 세포당 하나 존재. Vector는 한 세포 내에서도 스스로 복제하여 수많은 copy가 존재할 수 있다. 이런 성질을 실험에 이용한다.

2) 항생제를 이용한 선택(selection) 이 가능하다 .Vector에 존재하는 항생제 내성 유전자를 이용하면 DNA가 세포 내로 주입되었는지 아닌지를판별할 수 있다. Gene cloning에서는 내가 원하는 유전자가 세포 속으로 들어갔는지가 중요하기때문에 이런 기능은 필수적이라고 할 수 있다. 이렇게 해서 세포 속으로 DNA가 들어간 세포만을선별하는 것을 selection이라고 한다.

3) Multiple cloning site(MCS)를 이용할 수 있게 해 준다.실험실에서 사용하는 vector는 일정부위에 제한효소 절단부위가 밀집된 부분이 있어서cloning에 용이하다. 때로는 이 부분을 이용하여 자신이 원하는 construct를 자유자재로 만들 수도있다. Multiple cloning site가 없는 vector는 이용 가치가 거의 없다.

4) Vector 부위를 이용한 DNA sequencing, 단백질 발현 등을 할 수 있게 해 준다.내가 원하는 유전자를 삽입하고 나면 여러 가지 실험이 용이 해진다. Vector에 존재하는 염기서열을 이용한 DNA sequencing을 하기도 편하고, vector에 달린 여러 부분을 이용하여 단백질 발현을 할 수도 있다.

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Vector의 종류

Vector의 종류에는 plasmid, bacteriophage, cosmid, phagemid 등 여러 가지가있다. 그 중 가장 널리 쓰이는 것은 plasmid 이다. Plasmid는 self-replicatable, extrachromosomal, double stranded, small circular DNA이다.

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• The lambda phage which infects E. coli demonstrates the cycles of a temperate phage.

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>>DNA ligation과 restriction enzyme

Recombinant DNA

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제한효소(restriction enzyme)

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Restriction enzyme type II

제한효소에는 type I, II, III가 있으며 실험실에서는 주로type II를 사용한다.

1) 이름은 발견된 세균, serotype, 발견 순서로 명명한다. 예) Hinf III : H emophilus influenza type f, 세번째(III) 효소

2) 인식부위와 절단부위가 같고 특이적(specific)`이다.

3) Palindrome을 주로 인식한다.

4) 절단 후 모양은 세가지가 가능하다.5'-overhang cohesive (sticky) end.3'-overhang cohesive (sticky) end.Blunt end.

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PCR product의 모습은 다른 blunt end DNA와는다른 다음과 같은 특징.

1) Primer의 5'쪽에는 phosphate가 없다 .

2) Taq DNA polymerase는 합성이 끝난 후 3' 끝에A를 하나 더 붙인다.

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>>Gene cloning의 3단계 - 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입한다

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<Transformation의 개념 >

Transformation(형질전환)이란 DNA를 bacteria 세포 내로주입하는 과정을 말한다.

Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때다음과 같이 조금 다른 용어를 사용한다. 이 실험에서는 prokaryote인 E.coli를 사용하므로'transformation'을 하는 것이다.

Cell DNA TermProkaryote Plasmid Transformation

Bacteriophage (virus) Infection

Eukaryote Plasmid TransfectionVirus vector Transfection

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<Transformation 방법>

• Chemical method - Calcium phosphate를 이용한 방법- Liposome을 이용한 방법

• Physical method- Electroporation- Microinjection

• Virus를 이용한 방법- Retrovirus- Adeno or adenoassociate virus

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<Competent cell 이란?>

Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미합니다. 화학처리에 쓰이는 시약은 다음과 같이 여러가지가있으며 이 중 가장 중요한 것은 calcium chloride입니다.

1. Calcium Chloride 2. Manganase Chloride 3. Hexamminecobalt Chloride 4. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

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<Transformation 과정 >

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1) Replication origin2) Antibiotics resistance gene 3) Multiple cloning site(MCS)와 LacZ'

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(1) IPTG (Isopropyl-B-D-1-Thiogalactoside)는 LacZ gene inducer역할을 합니다.

Lactose 대신 inhibitor와 결합하지만 분해되지 않습니다.

(2) X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galacto-pyranoside)은 lactose 대신 beta-galactosidase에 의하여대사되는 물질입니다.

일종의 변형된 galactose sugar로서 원래 무색이지만

beta-galactosidase에 의하여 대사되면 푸른색을 나타낸다.

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>>Gene cloning의 4단계 –올바른 clone을 선택한다

1) 우선 PCR product가 순수한 것이 아닙니다

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Plasmid 분리 방법-Alkali lysis method

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<Plasmid 분리에 사용하는 시약 >

Solution I50 mM glucose 25 mM Tris-Cl, pH 8.0 10 mM EDTA

Solution II0.2 N NaOH1% SDS (sodium dodecyl sulfate)

Solution III5 M potassium acetate, glacial acetic acid

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<Plasmid 분리에 사용하는 시약 >

Solution I 50 mM glucose 25 mM Tris-Cl, pH 8.0 10 mM EDTA

EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜줍니다. 뒤에서 설명하겠지만, 이 과정에서 실험상 vortex를해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 됩니다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는것입니다.

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Solution II0.2 N NaOH1% SDS (sodium dodecyl sulfate)

SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 일을 합니다. NaOH는 DNA를 denaturation시킨다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리.

Solution III5 M potassium acetate, glacial acetic acid

Renature시키는 산성용액입니다. 이렇게 해서Chromosomal DNA는 SDS와 potassium과 함께 엉김.

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DNA는 적당한 salt 농도와 적당한 alcohol 농도 하에서 침전. DNA 침전에 쓰이는 조건들은 다음과 같다.

1. Ethanol : 2 ~ 2.5 volume•final 0.3 M sodium acetate, pH 5.2 : •commonly used

•final 0.2 M sodium chloride •DNA containing SDS

•final 2 M ammonium acetate •triphosphate removal •inhibits T4 polynucleotide kinase and TdT

•final 0.8 M lithium chloride •RNA precipitation, very soluble in ethanol •inhibits reverse transcription

2. Isopropyl alcohol : equal volume

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DNA, RNA, Protein pellet TE buffer + RNase A 첨가

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Phenol + Chloroform처리 수용성 상층액만을 분리(위의 수용성층에 DNA 포함)

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Sodium acetate와Ethanol 첨가

TE buffer 에 DNA pellet 녹임

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Restriction enzyme mapping (제한효소 지도)

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반응조건

Plasmid DNA 1 ug10x buffer 2 ulEcoRI 5 unitHindIII 5 unitwater to 20 ul,

37°C, 1시간

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DNA sequencing

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<DNA sequencing gel>DNA sequencing gel은 다음과 같이 준비. Urea, acrylamide 용액, TBE, 증류수를 섞어 잘 녹인 다음 여과지로 한 번 거르면 된다. Gel cast를 모두 준비한 다음에 ammonium persulfate와 TEMED를넣으면 굳기 시작한다. DNA sequencing gel은 한 base 차이를 구분하고 해상도를 높이면서 denaturing 상태를 유지하기 위한 다음과같은 특성이 있다.

7 M Urea, 8% Acrylamide, TBE buffer Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) Long distance(40 cm) and thin(0.35 mm) High voltage electrophoresis(2,000 volts)

Urea, formamide, formaldehyde와 같은 시약은 DNA의 Tm 값을낮추는 시약들. 이 시약들이 들어간 상태에서 2,000 volts 의전기영동을 하게 되면 gel이 약 55°C 정도로 heating되면서 DNA가 denaturation 상태로 내려간다.

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<Sequencing Gel Mix >

Urea 42 g40% (38:2) Acrylamide : bisacrylamide 20 ml20x TBE 5 mlWater to 100 ml

30% Ammonium persulfate 260 ulTEMED 75 ul

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Cellular differentiation:

The structural and functional divergence of cells as they become specialized during a multicellular organism’s development;

dependant on the controlof gene expression.

<-> Dedifferentiation(탈분화)