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CROMATOGRAFÍA
SEPARAR-IDENTIFICAR-CUANTIFICAR
Permite separar analitos muy similares en sus propiedades físicas y químicas.
Preguntas que puedo resolver con una cromatografía:
1- ¿Qué alcoholes y en qué concentración tiene un vino?
2- ¿Hay residuos de pesticidas en las cáscaras de naranjas?
3- ¿Qué cantidad de proteínas formadoras de gluten tienenlos granos de trigo? (gluteninas y gliadinas)
Enfermedades
fúngicas
Generalidades de cromatografía
Cromatografía:
Fase estacionaria
Fase móvil
Soporte
Generalidades de cromatografía
Fase estacionaria contenida en un soporte
Se coloca la muestra en un extremo:punto de Inyección de la muestrapunto de siembra de la muestra
Muestra: dos analitos muy similares que necesito separar
Descripción general de una cromatografía
Generalidades de cromatografía
Fase estacionaria contenida en un soporte
Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra
Descripción general de una cromatografía
Generalidades de cromatografía
Fase estacionaria contenida en un soporte
Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra
Descripción general de una cromatografía
https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8Video de divulgación científica
Generalidades de cromatografía
FASE ESTACIONARIA (FE): fija en un soporte sólida o líquida gaseosa cuanto más homogénea sea , más eficiente será la cromatografía
FASE MÓVIL (FM): «empuja» a la muestra a través de la fase estacionaria líquida o gaseosa sólida
FM líquido: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDAFM gas: CROMATOGRAFÍA GASEOSA
la eficiencia de la cromatografía se relaciona con la velocidad de FM
SOPORTE: cromatografía plana: vidrio, vidrio con un sólido molido en su superficie (capa fina); papelcromatografía en columna: vidrio; vidrio con relleno sólido; capilares
1- Toda cromatografía pone en contacto dos fases inmiscibles.2- La FM «empuja» a los analitos atravesando la FE.
3- Los analitos se desplazan a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad por cada fase.
Generalidades de cromatografía
Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases:
Fase móvil Fase estacionaria Cromatografía
Gas Liquida CGL
Sólida CGS
Líquida Liquida CLL
Sólida CSL
Clasificación de las cromatografías según el soporte que contiene a la fase estacionaria:
PLANA COLUMNA
Placa de vidrio con un sólido finamente molido en su superficie
Tubo de vidrio relleno con un sólido finamente molido
Papel Whatman N°1 Capilar
Generalidades de cromatografía
Clasificación de las cromatografías según el proceso fisicoquímico que se pone en juego para la separación de analitos (mecanismo de separación):
Nombre Algunas características
C. de Adsorción FE sólida y FM líquido / gasDiferencias en la polaridad
C. de Reparto FE líquido y FM líquido / gas Diferencias en la polaridad
C. de intercambio iónico FE resina (sólido) con grupos cargados unidos covalentemente. FM líquidoReacción entre iones de carga opuesta.
C. de Exclusión molecular FE gel porosoFM líquido / gasTamaños
C. de Afinidad FE especialmente diseñada para atrapar a un analito particular. Muy selectiva
Trabajo
práctico
Trabajo
práctico
Generalidades de cromatografía
Cromatografía de reparto:
Los analitos se reparten entre dos líquidos inmiscibles (fase estacionaria y fase móvil) según la polaridad de cada analito y la polaridad de cada una de las fases.
Fase normal: FE polar FM apolar (lo van a usar en cromatografía de papel)
Fase reversa: FE apolar FM polar
Fase estacionaria: agua (retiene analitos polares)
Fase móvil: solvente (lleva con facilidad a los analitos menos polares)
Generalidades de cromatografía
Cromatografía de intercambio iónico
FE: resina con carga positivaIntercambiadora de aniones
cationes
aniones
FE: resina con carga negativaIntercambiadora de cationes
Trabajo práctico
Fase estacionaria puede ser: Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas)
Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)
Generalidades de cromatografía
C. PLANA
C. COLUMNA
Generalidades de cromatografía
CROMATOGRAFÍA PLANA
Cromatografía en capa finaSólido finamente molido y acomodado uniformemente sobre una placa de vidrio, aluminio o plástico.(Sólido seco o sólido con una mínima película de líquido)
Cromatografía en papelPapel secoPapel con una película mínima de líquido impregnada
Frente de la
fase móvil
Línea de
siembra
Fase móvil
(líquido)
Soporte Frente de la
fase móvil
Línea de
siembra
Parámetro
Rf: RELACIÓN DE FRENTES
Rf= distancia recorrida por el analito/distancia
recorrida por la fase móvil
Rfx=dx/dFM
CROMATOGRAFÍA PLANA
REVELADO: permite poner en evidencia donde
quedó cada uno de los analitos separados
C. plana ascendente
Fase estacionaria????
Cromatografía de reparto:
Los analitos se reparten entre dos líquidos inmiscibles (fase estacionaria y fase móvil) según la polaridad de cada analito y la polaridad de cada una de las fases.
FE polar FM apolar (lo van a usar en cromatografía de papel)
Fase estacionaria: agua (retiene analitos polares)
Fase móvil: solvente (lleva con facilidad a los analitos menos polares)
Generalidades de cromatografía
Ejemplos de cromatografía plana
Pigmentos de hojas de espinaca
Pigmentos de cáscara de mandarinas
Frente de la
fase móvil
Línea de
siembra
Parámetro
Rf: RELACIÓN DE FRENTES
Rf= distancia recorrida por el
analito/distancia recorrida por la fase
móvil
Rfx=dx/dFM
CROMATOGRAFÍA PLANA
0 ≤ Rf ≤ 1
Si la FE polar y la FM no polar entonces valores bajos de Rf para analitos polares y valores altos de Rf para analitos no polares.
RF como criterio de identificación
Solución X(mm) Y(mm) Rf
Maltosa 20 144 0,1388
Glucosa 30 144 0,2083
Sacarosa 25 144 0,1736
Fructosa 33 144 0,2292
JUGO25,429,7
1440,17630,2062Malt Gluc Sac Fruc JUGO
Placa de vidrio (soporte) con silicagel(FE)FM:butanol-acético-aguaRevelado: resorcinol (universal para azúcares)
Línea de siembra
Frente del solvente
Y
X
Rf como criterio de NO IDENTIDAD
Cromatografía plana para detectar un pesticida P en cáscaras de naranjas:
1- En el sistema cromatográfico utilizado el pesticida P tiene un Rf= 0,60
2- Preparo los extractos de cáscaras de naranja que voy a controlar
3- Siembro en una cromatografía plana los extractos preparados y un patrón conocido del pesticida P
Interpretación:
frente de FM
Línea de siembra
P N1 N2 N3 N4
Rf= 0,6Posible presencia del Pesticida P (debo confirmar)
N2 y N3 están libres de Pesticida P
Problema para resolver:
La tabla muestra los resultados de Rf obtenidos para muestras de hojas de avena de distintos lotes (A1, A2 y A3) derivados de una cromatografía en capa fina para analizar la presencia de un compuesto tóxico (T). En las hojas de avena de cada lote se encontraron más de un compuesto separado (más de un dato de Rf en la tabla). A)Explique el significado de Rf y sus valores extremos. B) En base a los resultados obtenidos qué conclusión puede obtener respecto a los lotes de avena? Justifique. C) Si la Fase estacionaria utilizada es polar y la fase móvil es un solvente de baja polaridad, los compuestos obtenidos en el lote 2 son más polares o menos polares que el compuesto T? Justifique.
Muestra Rfs
Compuesto T 0,68
Avena lote 1 0,27
0,69
0,78
Avena lote 2 0,25
0,54
Avena lote 3 0,34
0,67
https://www.youtube.com/watch?v=g71IWP2O5pgVideo de cromatografía en capa fina, adsorción.
Fase estacionaria
Fase móvil
Soporte: columna
muestra(A y B)
Cromatografía en columna
Parámetro en función del tiempo
tr: TIEMPO DE RETENCIÓN
tr neto= tr-t0
t0: tiempo muerto de la columna
ELUCIÓN
A B
FM= eluyente
Fase estacionaria
Fase móvil
Soporte: columna
muestra(A y B)
Parámetro en función del
volumen de fase móvil que
circuló por la columna
Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN
Vr neto= Vr-V0
V0: volumen muerto de la columna
Cromatografía en columna
ELUCIÓN
A B
FM= eluyente
Cromatógrafo gaseoso
FM: gas
Tubos de gas y válvulas
reguladoras de presión
https://www.youtube.com/watch?v=9nYpjtRx0Zs
Detector de CG: Conductividad térmicaFID (detector de ignición a la llama)
Componentes de un cromatógrafo gaseoso
Cromatógrafo HPLC (cromatografía líquida)
Detectores CL: índice de refracción; espectrofotometría UV-Vis.
Componentes de un HPLC (cromatógrafo líquido de alta resolución)
Reservorio de fase móvil
Ejemplos de cromatogramas registrados en un cromatógrafo
Señ
al d
el d
etec
tor
Tiempo
Separación cromatográfica de una mezcla de aminoácidos
tr corresponde al tiempo en el que se presenta el máximo de cada pico.
Comparación de la composición de ácidos grasos de distintos aceites
Columna rellena, 10 cm de largo y 0,3 cm diámetro
FE: Polímero Acclaim Trinity P2FM: Acetonitrilo – Buffer pH 4Temperatura 60° CCaudal: 0,50 mL/minVol de inyección: 5 µL
Contenido de azúcares en una etapa de la fermentación
Datos del cromatograma:
tr: identifica al analito.
Área bajo el pico: indica la
cantidad de analito.
Ancho de la base: relacionado
con la eficiencia de la
cromatografía.
grande
EFICIENCIA: prolijidad que se logra con cada analito, se relaciona con el tr y el W de cada pico.
N = 16 (tr/W) 2
RESOLUCIÓN: separación ente analitos, relaciona dos picos consecutivos.
R = Diferencia de los tr / promedio del ancho de base
Otros datos del cromatograma:
Bibliografía
Química analítica cuantitativa. R.A.Day, JR.A.L. Underwood. 5ta. Edición. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.1r. Edición 1989. Capítulos 17 y 18.
https://www.youtube.com/watch?v=dXR9wcK-LUo High Performance Liquid Chromatography HPLC . Fecha de acceso 6/11/19
https://www.youtube.com/watch?v=e_ZAsfZ1AUo Cromatografía gaseosa en español. Fecha de acceso 6/11/19
Cromatografía de intercambio iónico
FE: resina con carga positivaIntercambiadora de aniones
cationes
aniones
FE: resina con carga negativaIntercambiadora de cationes
Trabajo práctico
Fase estacionaria puede ser: Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas)
Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)
Generalidades de cromatografía