Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Gentica Microbiana

Aislamiento de bacterifagos de fuentes naturales5QV2

Equipo 10 Seccin 2

Salinas Patio Vernica AzeretRoque Ramos Gustavo Alberto

Fecha de entrega: 17-febrero- 2015

Prctica No. 4 Aislamiento de bacterifagos de fuentes naturales

Objetivos. Conocer aspectos de la metodologa empleada en el trabajo con bacterifagos. Establecer algunas caractersticas de las partculas fticas que permiten su identificacin. Aislar bacterifagos de muestras de aguas negras. Determinar la cantidad y ciclo de multiplicacin de los fagos aislados con base en su morfologa de placa

Introduccin. Los virus son molculas deDNAoRNArodeadas por unaenvoltura proteicaque necesitan clulas viables para poder replicarse. Los virus utilizan la maquinaria metablica de las clulas para sintetizar su material gentico y protenas de la envoltura. Existen distintos tipos de virus que pueden infectar clulas procariontes o clulas eucariontes. Losbacterifagosofagosson virus que infectan y se reproducen enclulas procariontes.BacteriofagosEl genoma de los fagos puede serRNA simple cadena(MS2, Q),RNA doble cadena(phi 6),DNA simple cadena(phi X174, fd, M13) oDNA doble cadena(T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4). Estos cidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por protenas del fago. En los T-pares el genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago alguna de las bases est parcialmente sustituida.Se pueden clasificar por su forma en: polidricos, esfricos, de bala, filamentosos.O por su ciclo de multiplicacin en lticos, no lticos y temperados.Bacterifago T4

Tipo de material gentico: DNA doble cadena lineal de 169kbCiclo de multiplicacin: ltico Morfologa de placa: placas circulares, claras de 1-2mm de dimetro con bordes regulares.Tipo de receptor: lipopolilisacridos (LPS) de la bacteria.Morfologa del fago: cabeza icosadrica, cuello y cola como se muestra en la siguiente figura Libera alrededor de 100-200 virones.

Ciclo de multiplicacin del bacterifago T4El ciclo de multiplicacin de un bacterifago T4 se puede dividir esquemticamente en distintas etapas, las que son comunes a otros virus lticos.1.Adsorcin:El virus se fija o adsorbe a componentes de la superficie celular que actan como receptores especficos. La zona de adsorcin del virus es complementaria al receptor celular, por lo tanto un determinado virus slo puede infectar un nmero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor.2.Inyeccin del material gentico viral: Despus de la adsorcin, se produce un cambio configuracional en las protenas de la placa basal, alguna de las cuales tienen actividad enzimtica y producen un poro en la membrana citoplasmtica de la clula. La vaina del fago se contrae y el material gentico viral ingresa en la clula, mientras que la envoltura proteica queda en el exterior.

3.Replicacin del material gentico viral: El material gentico viral que ingresa en una clula contiene bases modificadas que evitan la degradacin por nucleasas bacterianas. Esta modificacin consiste en la glicosilacin y/o metilacin de algunas determinadas bases. En el caso del fago T4 se glucosila la base 5'-hidroximetilcitosina. Para lograr una efectiva replicacin del genoma viral se deben sintetizar algunas protenas cuando el material gentico ingresa en la clula. Estas protenas tempranas reparan el poro de la membrana citoplasmtica por donde ingres el genoma viral, degradan el DNA bacteriano lo que proporciona una fuente de precursores, evita la sntesis de RNA y protenas bacterianas, y proporciona ribosomas para la sntesis de protenas del fago. Adems algunas de estas protenas tempranas participan en la sntesis de las bases inusuales. La forma de replicacin del genoma viral es dependiente del tipo de material gentico (si es RNA o DNA, si es simple o doble cadena). En el caso del fago T4, las molculas replicadas se aparean en los extremos y formando una molcula de DNA ms larga denominada concatmero. Despus una enzima corta esta larga molcula lineal en molculas ms pequeas de igual longitud.

4.Sntesis de las envolturas proteicas y empaquetamiento del DNA: Las protenas de la envoltura (cpside, vaina, fibras, etc.) son protenas tardas que se sintetizan despus de iniciada la replicacin del material gentico. La sntesis de cada componente proteico se realiza separadamente, el material gentico es encapsidado antes del ensamble del resto de los componentes.

5. Ensamblaje de las envolturas: Todas las protenas de la envoltura se ensamblan para formar una partcula viral madura capaz de infectar a otra clula cuando sea liberada.6.Lisis y liberacin de las partculas virales: La lisis celular se debe a la sntesis de protenas tardas codificadas en el genoma del fago. En el fago T4, estas protenas son enzimas que lesionan la membrana citoplasmtica y la pared celular se rompe permitiendo la salida de las partculas virales, para seguir con el proceso de infeccin y su ciclo de multiplicacin.Bacterifago lambda

Tipo de material gentico: DNA lineal de doble cadena de 50kb, que posee extremos cohesivos.Ciclo de multiplicacin: temperado Morfologa de placa: placas circulares, claras de 2-4mm de dimetro con bordes regulares, y formacin de microcolonias dentro de la placa ltica.Tipo de receptor: protena lamb transportadora de maltosa.Morfologa del virus: cabeza icosadrica, cuello y cola como se muestra en la siguiente figura

Ciclo de multiplicacin del bacterifago lambda

En este caso el bacterifago puede seguir dos vas de multiplicacin la lisognica o la ltica. En primer lugar deben ocurrir los dos primerosprocesos de cualquiera de los ciclos de multiplicacin (que ya han sido explicados con anterioridad en T4)1. Adsorcin2. inyeccin del material genticoSeguido de los procesos de cada una de las vas que siga. En el caso de la va lisognica ocurre lo siguiente: 3. Integracin del DNA viral al DNAl cromosomal: El material gentico del fagose une con elde la clula husped por medio de una recombinacin sitio especfico y as para comenzare ciclo lisognico. 4. Replicacin del DNA viral: En estecaso, la bacteria sigue su propio proceso de multiplicacin por lo cual al estar el DNA integrado al DNA cromosomal, ambos DNA se replican juntos sin consecuencias obvias. El DNA del fago que se integrdentro del cromosoma bacteriano se denomina profago y las bacterias que contienen profagosse denominan bacterias lisognicas. Posteriormente el bacterifago pude cambiar de ciclo pasando al ltico. Para ello primero se requiere de una escisin del DNA viral del DNA cromosomal para inicial el ciclo ltico que ya ha sido explicado con anterioridad. Ocurriendo los siguientes procesos: 1. Replicacin del material gentico viral2. Sntesis de las envolturas proteicas y empaquetamiento del DNA3. Ensamblaje de las envolturas4. Lisis y liberacin de las partculas viralesO bien desde un principio puede llevar a cabo la va ltica.Bacterifago M13 / Ciclo de multiplicacin del bacterifago M13

Tipo de material gentico: DNA circular monocatenario de 3.5kb Ciclo de multiplicacin: no ltico.Morfologa de placa: placas circulares, opacas de 1-2.2 mm de dimetro con bordes difusos, Tipo de receptor: reconoce al pili de las bacterias con carcter de donadora.Morfologa del virus: estructura filamentosa figura.

En este tipo de multiplicacin ocurre lo siguiente.1. Adsorcin2. inyeccin del material gentico3. sntesis de la cadena complementaria a la original4. replicacin del DNA viral: por crculo rotador usando como molde la cadena complementara para crear copias idnticas a la original.5. Liberndose las partculas virales por extruccin.

Amplitud de husped: es el nmero de bacterias puede infectar cada fago.Tamao de estallido: es el nmero de fagos liberados por cada clula monoinfectada.MOI= es la relacin que existe el numero de fagos y el numero de bacteria.Metodologa.Se sigui el protocol que se indica en el manual con los siguientes cambiosTratamiento de muestras: se llevaron a cabo 4 filtrados en total, el primero con gasas y papel filtro, el segundo y tercero con puro papel filtro y el ltimo con papel filtro whatman.Determinacin de la concentracin de bacterifagos en las muestras de agua. Se llevaron a cabo las siguiente serie de diluciones del filtrado de la muestra de agua, 100,10-1.Diferenciacin de fagos temperados, lticos y no lticos por morfologa de placa. Se realizaron las siguientes series de diluciones.BacterifagoDilucinSe sembraron por duplicado las primeras dos diluciones y la ultima solo una.

T410-4, 10-5, 10-6

M1310-5, 10-6, 10-7

10-2, 10-3, 10-4

Determinacin de la amplitud de husped de los bacterifagos T4, M13 y Solo se sembr cada cepa indicadora en medio L, previamente inoculada en agar blando para formar el csped correspondiente y se dejo solidificar perfectamente para poder adicionar una gota de los lisados fagicos utilizados en el experimento anterior.

Resultados.Descripcin del lugar de toma de la muestra.Ro de los remedios, tramo San Felipe de Jess Avenida Central.

Figura 1. Vista area del sitio donde se tomo la muestra de aguas negras usada en la prctica.Generalidades. El cauce del Ro de Los Remedios tiene una longitud total de 15.7 Km, de los cuales 4.1 Km se encuentra en el Distrito Federal y el resto en el Estado de Mxico; recibe las descargas reguladas del Vaso del Cristo y drena parte de la zona de Naucalpan, Atizapn, Tlalnepantla y el Distrito Federal. Durante la temporada de sequa nicamente transitan aguas residuales, incrementando su capacidad durante la temporada de lluvias debido a las aportaciones pluviales.Inicia en la regin de Tlalnepantla conocida como el Vaso del Cristo y recoge las aportaciones de otros ros de Tlalnepantla y San Javier que no son capturadas por el Emisor del Poniente o el Emisor Central. Actualmente descarga en el Gran Canal.En su recorrido atraviesa zonas densamente pobladas de la Delegacin Gustavo A. Madero, los municipios de Tlalnepantla, Ecatepec y Nezahualcyotl, fluyendo a travs de la complejidad de esta zona urbana donde la diversidad de las industrias establecidas vierten sus aguas residuales al cauce, le confiere caractersticas particulares.

figura 2 Imagen del lugar fsico de donde fue tomada la muestrafigura 3 Imagen del lugar fsico de donde fue tomada la muestra

Figuras 2 y 3. Imgenes del lugar fsico de donde fue tomada la muestra. Como se observa, este tramo del ro se encuentra abierto. Los habitantes de la zona estn expuestos a infecciones propiciadas por las condiciones del ro.Descripcin de la toma de la muestra.La muestra fue tomada el domingo 1 de Febrero, aproximadamente a las 8:00 am, la temperatura oscilaba entre los 9 y los 12 C; la corriente del viento era baja de 10 a 15 Km/h.Como se nota en las imgenes el ro no se encuentra entubado en esta parte de su recorrido por lo que el aroma peculiar de las aguas negras a pesar de la hora era muy penetrante, aunado a que los habitantes de la zona, tanto residenciales y comerciantes, han usado la ribera como un tiradero de basura.Por la temporada del ao el ro se encuentra muy por debajo de su nivel habitual, a pesar de ello el muestreo no represento dificultades extras.

Aqu van los resultados de la parte practica y cuando pongas la tabla de prueba de gota para la muestra de agua pones estas fotos y dices que son las del equipo 10

Figura 4. Placas del fago para Klebsiella pneumoniae. En esa placa se hizo crecer un csped bacteriano de Klebsiella pneumoniae y se hizo prueba de gota con el filtrado de aguas negras.

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Figura 5. Placas del fago para Escherichia coli TG1. Para esta placa se hizo crecer un csped bacteriano de Escherichia coli, cepa TG1 y tambin se realiz prueba de gota con el filtrado de aguas negras.

Figura 6. Placas del fago para Escherichia coli W3110. Se precedi de la misma manera que con las cepas anteriores, dando la prueba de gota positiva

Discusin.Los resultados obtenidos en la prueba de gota en el aislamiento de bacterifagos a partir de muestras de agua, muestra que existen fagos para las cepas Escherichia coli W3110, Escherichia coli TG1 y para Klebsiella pneumoniae, datos que nos hablan acerca del mal estado del lugar donde fue tomada la muestra. Al presentar fagos para estas cepas, nos hace pensar que por ende deben existir estos tipos de microorganismos en el ro de los Remedios, lugar de recoleccin de la muestra. La presencia de estos fagos y estos microorganismos, tambin nos habla que en el agua de este ro existe una importante contaminacin de materia fecal y como consecuencia de enterobacterias contenidas en ella, esto es hasta cierto punto normal, dadas las condiciones en las que se encuentra este canal de aguas negras y la cantidad de descargas de desechos a lo largo de su recorrido, no solamente desechos propios de zona habitacional, sino que adems de zonas comerciales e incluso industriales. En cuanto a la parte microbiolgica, no solo hay presencia de enterobacterias no patgenas, sino que tambin patgenas como lo es Klebsiella pneumoniae. Esto se puede deber a que cerca del lugar de la toma de muestra existe una clnica, que por ende sus desechos llegan al Rio de los remedios. Adems, cabe mencionar que los fagos presentes en la muestra fueron capaces de reconocer a dos de las cepas de Escherichia coli con las que trabajamos, lo que nos hace suponer que ambas cepas de poseen una estructura en comn que sirve como receptor para dicho fago, lo que puede ser resultado de un receptor en la membrana debido a que ambas cepas pertenecen al mismo linaje; si solo hubiera reconocido a la cepa F y no a la cepa F- nos da un indicio de que el receptor se trate del pili sexual. Con respecto al ttulo de fagos de la muestra de agua, recordemos que por el hecho de haber sido aislados de una fuente natural el nmero de fagos no ser directamente proporcional a la cantidad de microrganismos capaces de hospedar al virus. La cuantificacin solo nos proporciona la cifra de estos microrganismos, y una muy vaga idea de la cantidad relativa de las clulas que pueden infectar en el sitio de recoleccin de la muestra. Por ejemplo, para la cepa Escherichia coli W3110 hubo un mayor nmero de fagos capaces de hacer placas lticas en comparacin con la cepa Escherichia coli TG1, lo que nos representa que en el ro de los Remedios existe una mayor cantidad de la primer cepa que la segunda. En cambio con la cepa de Klebsiella pneumoniae, nos arroj un nmero bajo de placas lo que nos dice que a pesar de la presencia de fagos para esta bacteria se encuentran en una baja proporcin.Respecto a los resultados obtenidos en la determinacin de fagos en la muestra de agua, utilizamos la cepas que resultaron positivas en la prueba de gota (Escherichia coli W3110 y TG1, Klebsiella pneumoniae) las cuales aparentemente presentaron dos tipos de fagos que pueden infectar a cada cepa, esto se determino observando la morfologa de las placas obtenidas, en cuanto a la cantidad podemos ver que ser obtuvieron un mayor nmero de placas y por ende nos indica un mayor nmero de bacterifagos para Escherichia coli W3110, despus para la cepa Escherichia coli TG1 y por ltimo para Klebsiella pneumoniae.A pesar que las tres cepas utilizadas son entero bacterias se observa que hay una gran diferencia entre las cepas de Escherichia coli, esto se podra deber la las enzimas que contiene Escherichia coli W3110 que son enzimas de restriccin y al introducir el fago su material gentico y no presentar el patrn de metilacin correcto, estas enzimas de restriccin reconocen al material gentico como extrao y lo cortan de tal manera que es degradado y pierde su actividad, por lo cual Escherichia coli W3110 al observarse una mayor cantidad de placas se deduce que sus mecanismo de proteccin es ms eficiente que el de Escherichia coli TG1, que presento un mayor nmero de placas.Aqu tengo duda mecionas arriba que mayor nmero de placas y por ende nos indica un mayor nmero de bacterifagos para Escherichia coli W3110, despus para la cepa Escherichia coli TG1 y por ltimo para Klebsiella pneumoniae. Y abajo justificas la razn pero no coincide ocn esto y no puedoi verificarlo xk tu tienes los resultados pero si es correcto lo que justificas solo que seria el caso si obtuvimos mas en tg1 y no W3110.. chcalo si no debes cambiar esto . Y te falta mencionar la morfologa de placa de la smuestras del filtrado de muestras de aguas negras no las que tienes en la foto las que obtuvimos en las placas que mencionas arriba y decir uqe encontramos dos tipos de fagos que infectan a para enterobacerias lo que no me acuerdo ya es si las de klebsiella presentaban la misma morfologa que para las otras el punto es que para cada cepa encontramos dos tipos distintos de gfagosTe falta mencionar las discudiones sobre los lisados fagiocos proporcionados lo que es morfologa de placa, y ttulos Ya te puse mas conclusiones y te cheque las discusiones ya hcie unas corrccciones pero no las marque chcalo de todos modos lo que te puse de rojo son cosas que te faltaban poner o ideas y las que marque de colores son las cosas en las que tengo duda

Conclusiones. Se lograron cconocer aspectos de la metodologa empleada en el trabajo con bacterifagos. Se establecieron algunos criterios o caractersticas que permitieron la identificacin de las partculas fticas. Se aislaron bacterifagos de muestras de aguas negras. La muestra obtenida de aguas negras contena bacterifagos, para las enterobacterias Escherichia coli W3110, Escherichia coli TG1 y Klebsiella pneumoniae. Se determino la cantidad o tipo de fagos presentes en la muestra de aguas negras en base su morfologa en placa. Se determino el titulo fagico de las muestras de aguas negras Se propuso el ciclo de multiplicacin de los fagos aislados con base en su morfologa de placa Se determino la amplitud de husped de los lisados fagicos proporcionados para los fagos T4, y M13. Se determino el titulo fagico de los lisados fagicos proporcionados para los fagos T4, y M13.

Bibliografahttp://aprendendobiologia.com.br/?page_id=329https://books.google.com.mx/books?id=p3DCb9lTLx8C&pg=PA305&dq=bacteriofagos&hl=es&sa=X&ei=_k_hVPDpBMm3yATEj4HYBg&ved=0CEIQ6AEwBg#v=onepage&q=bacteriofagos&f=falsehttp://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBacteriofagos.htmhttp://www.academia.edu/7494030/Aislamiento_de_bacteriofagos