Nei sistemi modello approcci di modificazione

genetica che producono o sequenze genetiche

alterate o espressione genetica alterata

fenotipo alterato.

Correlazione tra fenotipo alterato, o a livello

cellulare, o di un embrione precoce, o di un

organismo intero, con cambiamenti di un gene

specifico indizi sul funzionamento normale

di un gene.

Nei sistemi modello sono stati usati due tipi di

analisi:

Genetica classica o in avanti (fenotipo gene);

Genetica inversa (gene fenotipo).

Organismo modello: topo.

Cellule umane in coltura (HeLA e HEK293).

Inattivazione genica selettiva (knock-out

genico).

Tecnologia antisenso (know-down).

Si progettano RNA od oligonucleotidi che

hanno una sequenza complementare a quella

dei trascritti di RNA prodotti da un gene di

interesse. Ibridandosi con i trascritti senso, i

costrutti antisenso bloccano l’espressione

genica (knock-down genico).

La tecnologia antisenso è stata sviluppata

negli anni ’80:

RNA antisenso;

Oligodesossinucleotidi antisenso (più stabili);

Morfolino oligonucleotidi antisenso.

E’ il metodo principale per valutare la funzione

di un gene nelle cellule di mammifero in coltura.

Sfrutta una via metabolica naturale delle cellule

nella quale la formazione di un dsRNA induce

un’inattivazione genica specifica.

RISC: RNA-incuced

silencing complex

Alterare direttamente un gene endogeno

Modificazione del gene

Gene mutato: per cambiare un aa, o motivi, o scambiare domini, ecc.

A livello del DNA: know-out genico cambiamento della linea germinale.

Inattivazione del gene

A livello del RNA: know-down genico.

Inattivazione del gene

Dominanti negativi

aptameri Intracorpi

A livello proteico: blocco della proteina legandosi ad altre molecole x eliminare la funzione

Inattivazione del gene

Interferenza dell’RNA (iRNA)

Oligonucleotidi morfolino antisenso

A livello del RNA knock-down genico

Inattivazione del gene

Knock-out casuali del gene: matagenesi casuale usando mutageni chimici

Knock-out genico mirato: inattivazione di un gene predeterminato

A livello del DNA knock-out genico

Aggiungere una copia di un gene esogeno

Sovra-espressione: accoppiandolo ad un promotore forte

Espressione ectopica: in cellule non usuali od in tempi diversi

Espressione del transgene

I modelli animali sono molto preziosi per aiutarci a

capire la funzione di un determinato gene e i

processi che portano ad una malattia, permettendo

dettagliate analisi fisiologiche, o biomolecolari, e

cellulari di una patologia. Sono anche fondamentali

per studiare l’effetto di farmici o nuove terapie

cliniche prima di passare alla sperimentazione

sull’uomo.

Primati non umani, altri mammiferi (topi, ratti), altri

vertebrati (polli, rane, pesce zebrafish), ed

invertebrati (C. elegans, D. melanogaster).

I roditori, in quanto mammiferi, sono abbastanza

simili all’uomo sotto l’aspetto fisiologico, biochimico

e genetico, ed hanno dei grossi vantaggi pratici.

Organismo transgenico: organismo che porta

materiale genetico trasferito che è stato

inserito in un sito casuale del suo genoma

(acquisizione di funzione).

Gene targeting: la sostituzione o la

mutazione di un gene fornisce il mezzo per

creare ceppi di organismi “knockout” con

mutazioni praticamente in qualunque gene.

La clonazione: la produzione di animali

geneticamente identici mediante

trasferimento del nucleo di una cellula

somatica adulta in un uovo non fecondato.

Metodo di

introduzione del

DNA

Cellula

ricevente

Risultato

Uso comune

nell’analisi di

espressione

genica

Tecnologia

Transgenica

Microiniezione nel

pronucleo

Uovo

fecondato

Integrazione

casuale del

transgene

Analisi di

guadagno di

funzione

Gene targeting Ricombinazione

omologa in cellule

staminali embrionali

Embrione

allo stato

di

blastocisti

Interruzione

o mutazione

del gene

bersaglio

Analisi di perdita

di funzione

Clonazione

mediante

trasferimento

nucleare

Trasferimento

dell’intero nucleo

Uovo non

fecondato

enucleato

Individuo

geneticament

e identico al

nucleo

donatore

Analisi della

riprogrammazione

del genoma

I transgeni possono essere inseriti nella linea

germinale per trasferimento genico diretto

nello zigote, nei gameti o nelle cellule

embrionali o somatiche.

Tre passaggi principali per creare topi

transgenici:

1. Microiniezione di DNA nel pronucleo di un

uovo fecondato di topo.

2. Impianto dell’embrione microiniettato in

una madre surrogata.

Analisi dei cuccioli della prima e successive

generazioni per stabilire l’integrazione

stabile e l’espressione del transgene.

Espressione

inducibile di

un transgene

Espressione del

transgene

regolata dal

sistema inducibile

della tetraciclina

XX

Sistema di induzione che agisce a livello

post-trascrizionale, ovvero direttamente sul

controllo dell’attività della proteina di

interesse. Sistema di induzione rapido.

Regolazione post-trascrizionale del recettore

degli estrogeni.

Gene targeting: 1990 Mario Capecchi topi

omozigoti per la perdita del protoncogene

int-1 con gravi anomalie dello sviluppo del

cervello e del cervelletto.

I cambiamenti mirati sono introdotti nella

sequenza della regione codificante o degli

elementi regolatori a monte del gene.

Sistemi di espressione inducibile e

condizionale per il gene bersaglio.

Dobbiamo conoscere la sequenza completa del

DNA del gene di interesse.

Si suddivide in cinque fasi principali:

1. costruzione del vettore di targeting;

2. gene targeting in cellule staminali embrionali

(ES);

3. selezione delle cellule in cui il gene targeting

ha avuto successo;

4. introduzione delle cellule ES modificate in

embrioni di topo ed impianto di in una madre

surrogata;

5.analisi ed incrocio dei topi chimerici.

Topo

knockout

(neo: neomicina fosfotransferasi; tk: timidina kinasi di herpesvirus)

Topi knockin: espressione di transgeni o

modificazione del gene di interesse. Questo

approccio è usato spesso per la mutagenesi

sito-specifica in vivo. L’allele knockin

sostituisce la regione codificante dell’allele

endogeno mentre sono mantenuti gli

elementi di regolazione endogeni.

Topi knockdown: inattivazione o

modificazione dei livelli di espressione di un

gene, modificando gli elementi regolatori cis-

agenti. Si possono creare sostituzioni o

delezioni di singole basi. La regione

codificante del gene è intatta, quella

endogena.

I geni knockout possono determinare letalità

embrionale necessità di mutazione

condizionale del gene bersaglio.

DNA ricombinasi sito-specifiche famiglia

Int delle ricombinasi uno dei membri più

noti è la ricombinasi Cre del batteriofago P1.

Cre riconosce specificamente un sito di 34 bp

nel genoma del P1, lox, e catalizza la

ricombinazione reciproca tra coppie di siti

lox.

Knockout

genetico

condizionale

La clonazione si divide in quattro passaggi:

1. preparazione delle cellule donatrici;

2. enucleazione delle uova non fecondate;

3. trasferimento nucleare mediante fusione

cellulare;

4. impianto dell’embrione in una madre

surrogata ed analisi dei cloni.

Il trasferimento nucleare

somatico è inefficiente

Clonazione per ottenere

cellule staminali

Le terapie basate su cellule staminali

permettono di trasformare il potenziale dei

trapianti.

Cellule staminali embrionali.

Cellule staminali da tessuto adulto.

Terapia cellulare eterologa e autologa.

Riprogrammazione nucleare

pluripotenza indotta in cellule somatiche.