genetická diverzita člověka

na úrovni SNP je nízká: asi 0.1% cca. 90% variace je uvnitř populací

cca. 10% mezi populacemi (kontinenty)

bottleneck

Nature

Science

variabilita genomu

personal genomes

PGP-10 George Church George Church, professor of genetics, Harvard Medical School.

Misha Angrist, scientific editor at the Duke Institute for Genome Sciences and Policy in Durham.

Keith Batchelder, CEO at Genomic Healthcare Strategies.

Esther Dyson, investor and adviser to multiple technology firms.

Rosalynn Gill-Garrison, chief science officer at Sciona.

John Halamka, chief information officer at Harvard Medical School.

Stanley Lapidus, chief executive officer of Helicos.

Kirk Maxey, president of Cayman Chemical.

James Sherley, stem cell researcher and associate professor, formerly of MIT.

individual #10

James Watson

Craig Venter

Marjolein Kriek

Afričané, Číňané, Korejci, Japonci, genomy nádorů

1000 Genomes (~2500) Wellcome Trust Sanger Institute in Hinxton, England,

Beijing Genomics Institute Shenzhen in China,

NIH National Human Genome Research Institute (NHGRI)

2001: 2 genomy

2009: 10 genomů

2010: 3,000 genomů

2011: 30,000 genomů

modifikováno podle http://www.nature.com/news/2010/101027/pdf/4671026a.pdf

fragmentace DNA

ligace adaptorů, denaturace

annealing fragmentů na partikule

sekvenování nové generace

vytvoření emulze

emulzní PCR, denaturace

zachycení partikulí v pikotitrační desce

pyrosekvenace a detekce záblesků

pyrosekvenace a detekce záblesků

DNA(n) + dNTP (polymeráza) DNA(n+1) + PPi

APS + PPi (sulfuryláza) ATP

ATP + luciferin (luciferáza) oxyluciferin +

dNTP, ATP (apyráza) dNDP, dNMP, ADP, AMP, Pi

A T G C A T G C A T G C

T G AA T GG A G

454/Roche http://www.454.com/

Solexa/Illumina http://www.illumina.com/

SOLiD/ABI http://www.appliedbiosystems.com/

Helicos http://www.helicosbio.com/

Pacific Biosciences http://www.pacificbiosciences.com/

Complete Genomics http://www.completegenomicsinc.com/

sekvenování exomů - po "exon capture"

2nd generation: s amplifikací DNA

3rd generation: sekvenace jednotlivých molekul DNA

http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk

sekvenování nové generace

http://www.youtube.com/watch?v=kYAGFrbGl6E&NR=1

genomy nádorů

RNA seq

genová exprese, malé RNA (miRNA)

chromatin immunoprecipitation (ChIP) seq

metagenomika, mikrobiomy

fetální DNA v mateřské krvi

další využití sekvenování nové generace

ATG ACC CAG CAG CCA ATG AAA normální sekvence

Met Thr Gln Gln Pro Met Lys čtecí rámec je označen mezerami

▼

ATG CCC CAG CAG CCA ATG AAA bodová substituce typu missense

Met Pro Gln Gln Pro Met Lys (threonin je nahrazen prolinem)

▼

ATG ACC TAG CAG CCA ATG AAA bodová substituce typu nonsense

Met Thr STOP - - - - (předčasné ukončení syntézy proteinu)

▼

ATG ACA CAG CAG CCA ATG AAA tichá substituce

Met Thr Gln Gln Pro Met Lys (threonin je kódován jiným kodonem)

▼▼▼

ATG --- CAG CAG CCA ATG AAA delece bez posunu čtecího rámce

Met - Gln Gln Pro Met Lys (chybí jedna aminokyselina)

▼

ATG -CCC AGC AGC CAA TGA AA delece s posunem čtecího rámce

Met Pro Ser Ser Gln STOP - (jiné aminokyseliny + předčasná terminace)

▼▼▼ ▼▼▼ ▼▼▼

ATG ACC CAG CAG CAG CAG CAG CCA ATG AAA expanze trinukleotidové repetice

Met Thr Gln Gln Gln Gln Gln Pro Met Lys (vložen polyglutaminový úsek)

dynamické mutace

základní typy mutací

▼

ATGCCCCAGCAGCCAAT chromozóm (jedinec) A

základní typy polymorfismů DNA

▼

ATGCCCTAGCAGCCAAT chromozóm (jedinec) B

tři možné genotypy

polymorfismus typu SNP

(Single Nucleotide Polymorphism)

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

ATGCCCCACACACACACACAGAAA alela A

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

ATGCCCCACACACACACACACAGAAA alela B

polymorfismus typu STR

(Short Tandem Repeat)

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

ATGCCCCACACACACACACACACACAGAAA alela C

mnoho možných genotypů

bodové substituce: SNP, bodové mutace

malé delece a inserce

krátké tandemové repetice polymorfismy typu STR, VNTR

dynamické mutace (zejm. expanze trinukleotidů)

polymorfní inserce retroelementů

velké strukturální varianty: delece, duplikace, inverze

(SV - Structural Variants, CNV - Copy Number Variants) většinou submikroskopické

přes 10 tis. lokusů, medián několik kb

mikrodelečním syndromy

často v oblastech segmentálních duplikací

referenční sekvence genomu = ?

klinická interpretace CNV = ?

typy variability

velké fragmenty

střední fragmenty

malé fragmenty

gelová elektroforéza (úterý/středa) blotting na membránu (středa/čtvrtek)

hybridizace se sondou (čtvrtek/pátek)

restrikční štěpení DNA (pondělí/úterý)

Southernova metoda

autoradiografie (pátek/pondělí, nebo déle)

Southern

1975

Northern

Western

denaturace DNA

hybridizace primerů (annealing)

(mají délku kolem 20 bází)

syntéza nové DNA

termostabilní polymerázou

po proběhnutí jednoho cyklu se

jedna molekula DNA zmnoží na dvě

vstup

do dalšího

cyklu

po proběhnutí dvou cyklů se

jedna molekula DNA zmnoží na čtyři

po proběhnutí n cyklů se jedna

molekula DNA zmnoží na 2n molekul

PCR

Polymerase

Chain

Reaction

Mullis

1985

▼

ATGCCCCAGCAGCCAAT chromozóm (jedinec) A

základní typy polymorfismů DNA

▼

ATGCCCTAGCAGCCAAT chromozóm (jedinec) B

tři možné genotypy

polymorfismus typu SNP

(Single Nucleotide Polymorphism)

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

ATGCCCCACACACACACACAGAAA alela A

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

ATGCCCCACACACACACACACAGAAA alela B

polymorfismus typu STR

(Short Tandem Repeat)

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

ATGCCCCACACACACACACACACACAGAAA alela C

mnoho možných genotypů

1/1

1/2

1/3

2/3

3/3

3/4

800

100

200

300 238

168

308

378 4

3

2

1

M

identifikace

osob

4

3

2

1

? ? M

paternita

jednolokusové sondy

jednolokusové sondy

multilokusové sondy

multilokusové sondy

Pemberton & Amos Trends Genet 1990

polymorfismus x mutace ~ varianta definice: polymorfismus nad 1% x mutace pod 1%

98

95

ale DF508 ~ 1.5% (nosiči CF 1/25, mutace CF 1/50, z toho DF508 70%)

polymorfismus x mutace ~ varianta neutralita x nepříznivý vliv pro nositele

výhoda heterozygotů

závislost na genotypu (heterozygot, homozygot)

závislost na prostředí (černoši v Americe)

ale projev alely (polymorfismu či mutace) může záviset

na prostředí, na genotypu

a frekvence polymorfismu/mutace může odrážet selekční tlaky

v minulosti, které se dnes již nemusí projevovat

polymorfismus x mutace ~ varianta alela původní (ancestrální) x alela nově vzniklá (“mutací”)

nelze se opřít o dnešní frekvenci, ancestrální alela může být z populace odstraněna

persistence laktázy x intolerance laktózy

i kulturní prostředí může určovat, který genotyp je výhodný a který ne

persistence laktázy

Jobling, Hurles, Tyler-Smith: Human Evolutionary Genetics

sestřihové mutace

GT AG

1 2 3 9 5 6 8 7 4

GT AT

1 2 3 9 5 6 8 7 4

syndrom sousedících genů (contiguous gene syndrome)

hot-spots pro variabilitu

dinukleotid CG (CpG): meCG mutuje na TG

ATG ACG CAG CAG CCC CCT ATG AAA

Met Thr Gln Gln Pro Pro Met Lys

▼

ATG ATG CAG CAG CCC CCT ATG AAA

Met Met Gln Gln Pro Pro Met Lys

▼

ATG ACG CAG CAG CCC CTA TGA AA

Met Thr Gln Gln Pro Leu STOP -

tandemové repetice: sklouznutí při replikaci (slippage) rozptýlené repeaty: rekombinace mezi nealelními kopiemi

▼▼▼ ▼▼▼ ▼▼▼

ATG ACG CAG CAG CAG CAG CAG CCC CCT ATG AAA

Met Thr Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Met Lys

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

vzorky 1-4:

úplná komplementarita,

sonda hybridizuje

vzorek 5:

neúplná komplementarita,

sonda nehybridizuje

alelově specifická

hybridizace

hybridizace s alelově

specifickými oligonukleotidy

(ASO)

DNA čipové technologie: paralelní hybridizace s mnoha oligonukleotidy

(nebo delšími klonovanými sondami) rozmístěnými hustě na pevném podkladu

GCGGCATGAACCGTAGGCCCATC

GCCGTACTTGGAATCCGG GCCGTACTTGGCATCCGG GCCGTACTTGGGATCCGG GCCGTACTTGGTATCCGG GCCGTACTTGG-ATCCGGG

CCGTACTTGGCATCCGGG CCGTACTTGGCCTCCGGG CCGTACTTGGCGTCCGGG CCGTACTTGGCTTCCGGG CCGTACTTGGC-TCCGGGT

5´ 3´

3´ 5´

DNA čipové technologie: resekvenace

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

3´CCGCGTGTCTCCTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCATTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCGTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCTTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTC-TTCTCTT 5´

A C

G T

del

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

3´CCGCGTGTCTCCTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCATTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCGTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCTTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTC-TTCTCTT 5´

A C

G T

del

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

3´CCGCGTGTCTCCTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCATTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCGTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCTTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTC-TTCTCTT 5´

A C

G T

del

5´CGGCGCACAGAGAAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

3´CCGCGTGTCTCCTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCATTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCGTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTCTTTCTCT 5´

3´CCGCGTGTCTC-TTCTCTT 5´

A C

G T

del

5´GCGCACAGAGAAAGAGAATC 3´

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´ homozygot pro normální sekvenci (GAA = Glu)

A C

G T

del

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

5´CGGCGCACAGAGAAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

heterozygot pro mutovanou sekvenci (GAA = Glu / AAA = Lys)

A C

G T

del

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

www.

affymetrix.com

A C G T

del

G C A C A G A G G A A A G A G A

heterozygot pro mutovanou sekvenci TP53 (kodon 286: GAA = Glu / AAA = Lys)

3´ TTCTCTTAGAGGCGTTCTT 5´

neznačená

testovaná

DNA

T

extenze oligonukleotidu

zakotveného v buňce čipu

o jeden značený dideoxynukleotid

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

červený fluorescenční signál v buňce B

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´ homozygot pro normální sekvenci (286 GAA (Glu))

heterozygot pro mutovanou sekvenci (286 AAA (Lys))

5´CGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

červený + modrý fluorescenční signál v buňce B

5´CGGCGCACAGAGAAAGAGAATCTCCGCAAG 3´

286 Glu/Lys

286 Glu/Glu

I.

II.

III.

1 2

1

1

2

2

pancreatic

cancer

(47y)

thyroid

cancer

(18y)

*

breast

cancer

(50y)

rhabdomyosarcoma

(3y)

non-Hodgkin lymphoma B

(7y)

*

*

G A G A A A G A G

Glu Glu Glu Lys

wild

type

III.1

blood

285 286 287

G A G G A G

G

G A A

Glu Glu Glu 285 286 287

GERMLINE p53 MUTATION

IN FAMILY 7

Glu286Lys (exon 8)

FAMILY 7

* proven carrier

* proven non-carrier

childhood cancer

normální DNA DNA nádoru

CGH comparative

genome

hybridisation

normální DNA DNA nádoru array

CGH

DNA čipové technologie: počet kopií v genomu (copy number)

G C A C A G C G A A T G G G A C G G T G A A C C A C G

17p 17q

fluorescenční in situ hybridizace (FISH)