Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer

Pankreatitis

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor medicinae (Dr. med.)

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von: Max Herms, geboren am 17.03.1984 in Erlenbach am Main

angefertigt am: Department für Innere Medizin, Neurologie und Dermatologie,

Klinik und Poliklinik für Gastroenterologie und Rheumatologie,

Universitätsklinikum Leipzig, AöR

Klinikdirektor Prof. Dr. med. Joachim Mössner

Betreuer: Prof. Dr. med. Joachim Mössner / Dr. med. Jonas Rosendahl

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 19.06.2012

Inhaltsverzeichnis

Bibliographische Beschreibung .......................................................................... 4

Abkürzungen ......................................................................................................... 5

Abbildungen .......................................................................................................... 7

Tabellen ................................................................................................................. 7

1 Einleitung ....................................................................................................... 8

1.1 Chronische Pankreatitis ............................................................................. 8

1.2 Ätiologie der chronischen Pankreatitis ....................................................... 9

1.3 Genetische Aspekte bei chronischer Pankreatitis .................................... 10

1.4 Cathepsine bei Pankreatitis ..................................................................... 12

1.4.1 Die Rolle des Cathepsin B bei der Pankreatitis ................................. 13

1.4.2 Die Rolle des Cathepsin-L bei der Pankreatitis ................................. 14

2 Fragestellung ............................................................................................... 16

3 Studienteilnehmer ....................................................................................... 17

3.1 Patienten ................................................................................................. 17

3.2 Kontrollgruppe ......................................................................................... 18

4 Materialien und Methoden .......................................................................... 18

4.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ................................................. 18

4.2 Laborgeräte ............................................................................................. 19

4.3 DNA-Extraktion ........................................................................................ 19

4.4 Polymerasekettenreaktion ....................................................................... 19

4.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................... 20

4.5.1 Herstellung der Agarose-Gelplatten .................................................. 20

4.5.2 Gelelektrophorese des PCR-Produktes ............................................ 21

4.6 Aufreinigung des PCR-Produktes ............................................................ 22

4.7 Sequenzierung ........................................................................................ 22

4.8 Statistik .................................................................................................... 24

5 Ergebnisse ................................................................................................... 24

5.1 Sequenzierung des CTSL1 – Seltene Varianten ..................................... 24

5.2 Häufige CTSL1- Varianten....................................................................... 26

5.3 Allelfrequenz der häufigen CTSL1-Varianten .......................................... 28

5.4 Haplotypenanalyse des CTSL1 ............................................................... 29

6 Diskussion ................................................................................................... 31

6.1 Seltene nicht-synonyme und synonyme Varianten des CTSL1 ............... 31

6.2 Häufige Varianten des CTSL1 ................................................................. 33

6.3 Hardy-Weinberg Gleichgewicht ............................................................... 34

6.4 Haplotypen-Analyse ................................................................................ 35

6.5 Promoter-Varianten des CTSL1 und deren funktionelle Konsequenz ..... 35

6.6 Ausblick ................................................................................................... 36

7 Zusammenfassung ...................................................................................... 40

8 Literaturverzeichnis .................................................................................... 43

9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ........................ 51

10 Lebenslauf ................................................................................................. 52

11 Danksagung .............................................................................................. 53

4

Bibliographische Beschreibung

Herms, Max Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer Pankreatitis Universität Leipzig, Dissertation 52 S., 74 Lit., 5 Abb., 5 Tab. Referat

Die chronische Pankreatitis (CP) ist eine wiederkehrende, entzündliche Erkrankung

des Pankreas. In den letzten Jahren wurden mehrere Kandidatengene, die zur

Entstehung einer CP prädisponieren, identifiziert. Zu diesen Genen gehören PRSS1,

PRSS2, SPINK1, CFTR und CTRC. Der Pathogenese der genetisch bedingten CP

scheint dabei eine frühzeitige, intrapankreatische Aktivierung von Trypsin zugrunde

zu liegen.

Cathepsin B (CTSB), eine in Lysosomen vorkommenden Protease, ist in der Lage

Trypsinogen zu aktivieren. Genetisch zeigte sich eine Assoziation der p.L26V

Variante bei tropisch-kalzifizierender CP, welche bei idiopathischer CP nicht bestätigt

wurde. Neben CTSB ist CTSL die am zweithäufigsten vorkommende lysosomale

Protease. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass CTSL ein inaktives Trypsin

freisetzt. Im Mausmodell zeigten sich bei Ctsl-/- Tieren bei experimentell induzierter

Pankreatitis zwei Effekte. Zum einen war die Trypsinaktivität erhöht, zum anderen

verlief die Pankreatitis milder, da vermehrt Apoptose anstelle von Nekrose der

Azinuszellen auftrat.

In dieser Studie wurde mittels uni-direktionaler DNA-Sequenzierung das gesamte

CTSL1 untersucht. Dabei fanden wir insgesamt drei seltene nicht-synonyme

Varianten. Die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750) fanden wir bei einem

Patienten, wobei diese Variante bereits bei Kontrollen beschrieben wurde. Die

Varianten c.126+1G>A und c.915A>C (p.E305D) lagen bei jeweils einer Kontrolle

vor. Sowohl seltene als auch häufige Varianten und die berechneten Haplotypen

zeigten keinen signifikanten Verteilungsunterschied zwischen Patienten und

Kontrollen. Demnach besteht keine Assoziation von Varianten des CTSL1 und CP.

5

Abkürzungen

°C Grad Celsius

µl Mikroliter

A Adenin

aqua dest. Destilliertes Wasser

BL Basenleiter

bp Basenpaare

C Cytosin

CF Zystische Fibrose

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

CI Konfidenzintervall

CP Chronische Pankreatitis

CTRC Chymotrypsin C, Caldecrin

CTSB Cathepsin B

Ctsb-/- Cathepsin knock-out

CTSL Cathepsin L

Ctsl-/- Cathepsin L knock-out

CTSL1 Cathepsin L-Gen

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytidintriphosphat

ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

dNTPs Desoxynukleosidtriphosphate

dTTP Desoxythimidintriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA enzyme-linked immunosorbent assays

ER endoplasmatisches Retikulum

F vorwärts

g Gramm

G Guanin

Kb Kilo-Basenpaare

KV kondensierende Vakuolen

6

LYS Lysosomen

M Molar

mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid

mild milde

min Minute

ml Milliliter

mM millimol

N Nukleus

n.s. nicht signifikant

NaAc Natriumacetat

OR Odds ratio

P PCR

p P-Wert

PCR Polymerasekettenreaktion

Poly Polymorphismen

PRSS1 Kationisches Trypsinogen

PRSS2 Anionisches Trypsinogen

PRSS3 Mesotrypsinogen

R rückwärts

RV rupturierte Vakuole

S Sequenzierung

sek Sekunde

sev harte

SNP Single Nucleotide Polymorphism

SPINK1 Serinproteaseinhibitor Kazal Typ 1

T Thymin

TAP Trypsinogen Aktivierungspeptid

TAP-IVG verlängertes Trypsinogen Aktivierungspeptid

TBE-Puffer TRIS-Borat-EDTA-Puffer

TCP tropische kalzifizierende Pankreatitis

UTR untranslated region

WT Wildtyp

ZG Zymogengranula

7

Abbildungen

Abb. 1: Ursachen der CP S.10

Abb. 2: Schema der genetischen und umweltbedingten S.12

Einflüsse auf die Pathogenese der CP

Abb. 3: Agarose-Gel Elektrophorese des CTSL1 Exon 5-6 S.22

Abb. 4: Elektropherogramm der c.5A>C (p.N2T) Variante und S.24

einer Wildtyp-Probe

Abb. 5: Schematische Darstellung einer Azinuszelle mit S.38

physiologischen und pathologischen Mechanismen

der Kolokalisation von Zymogenen und Proteasen

Tabellen

Tab. 1: Oligonukleotid-Sequenzen der Primer für die PCR S.20

und Sequenzierung

Tab. 2: Darstellung der seltenen nicht-synonymen, synonymen S.26

und in nicht kodierenden Abschnitten gelegenen Varianten

des CTSL1.

Tab. 3: Darstellung der Gentoyp Verteilung häufiger Varianten S.27

Tab. 4: Darstellung der Allelfrequenzen häufiger Varianten S.28

Tab. 5: Darstellung der Ergebnisse der Haplotypen-Berechnung S.30

mittels PHASE v.2.1

8

1 Einleitung

1.1 Chronische Pankreatitis

Als chronische Pankreatitis (CP) wird eine entzündliche Erkrankung des Pankreas

bezeichnet, die durch wiederkehrende Pankreatitisattacken als auch durch

permanente Schmerzen gekennzeichnet sein kann. Im Verlauf der Erkrankung

resultiert in vielen Fällen eine Fibrose des Pankreas. Durch den Verlust des

Pankreasparenchyms kann eine endokrine und/oder exokrine Pankreasinsuffizienz

mit konsekutivem Diabetes mellitus entstehen. Ebenso kann es zu einer

Mangelernährung kommen (Singer et al., 1985).

Die Inzidenz der CP wird in der industrialisierten westlichen Welt im

Erwachsenenalter mit 3,5 bis 10 Neuerkrankungen auf 100.000 Einwohner und Jahr

angegeben (Secknus et al., 2000). Ähnliche Zahlen konnten in einer räumlich stark

umschriebenen epidemiologischen Studie in Lüneburg mit einer Inzidenz von 6,4 pro

100.000 Einwohnern/Jahr ermittelt werden (Lankisch et al., 2002). Für das

Kindesalter liegen keine genauen Daten bezüglich der Häufigkeit der CP vor.

Der Schweregrad des akuten Schubs einer CP kann von einer leichten, interstitiell-

ödematösen bis zu einer schweren, hämorrhagisch-nekrotisierenden Entzündung

variieren. Das Hauptsymptom der CP ist meist der Schmerz, der attackenartig

ähnlich eines akuten Schubes (Typ A) oder dumpf und dauerhaft (Typ B) auftreten

kann (Hoffmeister et al., 2008). Nur ein kleiner Teil der Patienten (10%-15%) leidet

nicht unter Schmerzen, wobei dies häufig ältere Patienten mit idiopathischer CP sind

(Ammann, 2006). Im Endstadium der Erkrankung kann eine Schmerzlinderung

auftreten, die oft von einer endokrinen und exokrinen Insuffizienz begleitet wird und

unabhängig von der Ätiologie und vorangegangenen chirurgischen Interventionen ist

(Müllhaupt et al., 2005). Leitsymptom der CP im Kindesalter ist der rezidivierende

akut auftretende abdominelle Schmerz, der meistens mit Übelkeit und Erbrechen

einhergeht. Im Gegensatz zum Erwachsenenalter bestehen selten permanente

Schmerzzustände (Lal et al., 2010)

Morphologisch führt eine CP zu unregelmäßigen Sklerosierungen des Pankreas mit

fokaler, segmentaler oder diffuser Zerstörung des exokrinen Gewebes und

Veränderungen des Pankreasgangsystems wie Dilatationen, Strikturen sowie

intraduktalen Konkrementen in Form von Protein-ausfällungen oder Verkalkungen.

Eine exokrine Insuffizienz äußert sich im Auftreten von Meteorismus und Diarrhö und

9

einer Steatorrhö welche im Verlauf auftreten kann (Hoffmeister et al., 2008). Häufig

entwickelt sich die endokrine Insuffizienz mit Ausbildung eines Insulinmangeldiabetes

erst nach Manifestation der exokrinen Insuffizienz (Ammann et al., 1987).

Neben einer stark erhöhten Mortalitätsrate, circa 50% der Patienten versterben

innerhalb von 20-25 Jahren nach Krankheitsbeginn, ist das Risiko an einem

Pankreaskarzinom zu erkranken erhöht (Ammann, 2006, Secknus et al., 2000,

Raimondi et al., 2010).

1.2 Ätiologie der chronischen Pankreatitis

Die häufigste Ursache der CP ist in den industrialisierten westlichen Ländern der

Alkoholabusus (Thrower et al., 2010, Lowenfels et al., 2005). Während Alkohol vor

allem in älteren Studien in bis zu 90% der Fälle als Ursache angegeben wurde,

konnte in einer kürzlich veröffentlichten italienischen und amerikanischen Studie ein

Rückgang der Ätiologie auf 50% nachgewiesen werden (Frulloni et al., 2008, Yadav

et al ., 2010). Als Grenzwert für eine alkoholische CP gelten 60-80g reinen Alkohols

pro Tag über einen Zeitraum von mehr als zwei Jahren, wobei diese Definition nicht

generell akzeptiert wird und nicht durch Studien validiert wurde (Ammann, 1997).

Aufgrund des erhöhten Alkoholmissbrauchs bei Männern verwundert es nicht, dass

die Mehrheit der Patienten männlich ist (70%-75%) (Lankisch et al., 2002). Das

mittlere Erkrankungsalter der alkoholischen CP liegt zwischen dem 40. und 60.

Lebensjahr (Yadav, 2011) und die Erkrankung schreitet bei diesen Patienten

schneller voran als bei anderen CP Formen (Ammann et al., 1987, Müllhaupt et al.,

2005, Ammann, 2006).

Neben dem Alkoholabusus scheint das Rauchen ein Risikofaktor für die Entwicklung

einer CP zu sein (Maisonneuve et al., 2005). Zudem beeinflusst das Rauchen den

Krankheitsverlauf der CP negativ und führt früher zur Ausprägung von Kalzifikationen

und zur Manifestation eines Diabetes mellitus (Maisonneuve et al., 2005).

Bei der CP unterscheidet man zwei Verlaufsformen: Zum einen die „juvenile“ oder

„early onset“-Form welche sich mit einem mittlerem Erkrankungsalter von etwa 20

Jahren manifestiert, zum anderen die seltenere „senile“ oder „late onset“-Form

welche zwischen dem sechsten und achten Lebensjahrzehnt auftritt (Ammann,

2006). Im Vergleich zur alkoholischen CP zeigt sich bei beiden Formen eine

ausgeglichene Geschlechterverteilung, ein milderer Krankheitsverlauf mit später

10

einsetzender endokriner und exokriner Insuffizienz, eine verminderte

Kalzifizierungsrate sowie eine bessere Lebenserwartung (Layer et al., 1994,

Müllhaupt et al., 2005, Amman et al., 1987). Interessanterweise kann in bis zu einem

Drittel aller CP Fälle kein ätiologischer Faktor oder eine positive Familienanamnese

ermittelt werden (Witt et al., 2000).

Neben den genannten Ursachen spielt möglicherweise auch die Ernährung bei der

Entstehung einer CP eine Rolle. Andere Ursachen, wie beispielsweise anatomische

Anomalien, eine Hypertriglyzeridämie, Medikamente und eine traumatische Genese

sind selten (siehe Abbildung 1). Auf die genetischen Ursachen der CP wird im

folgenden Abschnitt eingegangen.

Abbildung 1: Ursachen der CP adaptiert von Rosendahl et Mössner (Die Medizinische Welt 2010). Neben dem häufigsten Umweltfaktor Alkohol können weitere Ursachen der Erkrankung zugrunde liegen. Ein Nikotinabusus scheint ebenfalls zur CP zu prädisponieren. Genetische Einflüsse können bei immer mehr Patienten identifiziert werden. Die Darstellung ist schematisch und die Schnittflächen der Kreise stellen nicht das wahre Verteilungsverhältnis der Ursachen der CP dar. Es besteht kein Anspruch auf Vollständigkeit.

1.3 Genetische Aspekte bei chronischer Pankreatitis

Ein Familienstammbaum mit genetisch bedingter CP wurde erstmals 1952 von

Comfort und Steinberg beschrieben (Comfort et Steinberg, 1952). Diese hereditäre

Form der CP mit autosomal dominantem Erbgang und unvollständiger Penetranz

manifestiert sich typischerweise im Kindesalter. Verkalkungen des Pankreas sowie

ein Diabetes mellitus treten erst nach längerem Krankheitsverlauf auf (Teich et al.,

11

2008, Keim, 2003). Als genetische Ursache konnte 1996 eine Mutation (p.R122H)

des kationischen Trypsinogen (PRSS1) identifiziert werden (Whitcomb et al, 1996).

Bei den Trypsinogenen werden drei verschiedene Isoformen unterschieden, die

entsprechend ihres Wanderungsverhaltens in der isoelektrischen Fokussierung als

kationisches (PRSS1) und anionisches Trypsinogen (PRSS2) sowie

Mesotrypsinogen (PRSS3) bezeichnet werden.

Nach Beschreibung der p.R122H Mutation sind mittlerweise viele weitere Mutationen

im PRSS1 nachgewiesen worden. PRSS1-Mutationen scheinen zu einer erhöhten

Trypsinogen-Aktivierung und/oder Trypsin-Stabilisierung und somit zu einer erhöhten

intrapankreatischen Trypsinaktivität zu führen (Teich et al., 2006).

Bei gleicher enzymatischer Aktivität wie das PRSS1 besitzt das PRSS2 eine

gesteigerte Selbstaktivierung und eine geringere Inaktivierungstendenz (Colomb et

al. 1978, Colomb et al. 1979). Anhand der p.G191R Variante des PRSS2 konnte

erstmalig eine protektive Variante bei CP nachgewiesen werden, die zu einer

vermehrten Degradierung von anionischem Trypsinogen führt (Witt et al., 2006).

Der Serin-Protease Inhibitor Kazal, Typ 1 (SPINK1) ist ein Protease-Inhibitor, welcher

intrapankreatisch aktiviertes Trypsin deaktiviert (Lal et al., 2010, Teich et al., 2008).

Eine p.N34S Variante des SPINK1 konnte mit verschiedenen Formen der CP

assoziiert werden (Witt et al., 2000, Witt et al., 2001, Drenth et al., 2002, Chandak et

al., 2002, Hassan et al., 2002, Bhatia et al., 2002, Schneider et al., 2002).

Interessanterweise zeigte eine funktionelle Analyse von rekombinantem SPINK1 mit

p.N34S Mutation eine unveränderte Funktion des Proteins (Kuwata et al., 2002). Da

diese Variante auch bei Kontrollen gefunden wurde, ist bis heute nicht verstanden,

auf welche Art und Weise sie zur Pathogenese der CP beiträgt.

Da 1-2% der Patienten mit Zystischer Fibrose (CF) an einer CP erkranken schien es

wahrscheinlich, daß Veränderungen im CFTR zur Entwicklung einer CP

prädisponieren (Shwachman et al., 1975, Atlas et al., 1993). Dieser Zusammenhang

konnte erstmals 1998 in zwei unabhängigen Studien nachgewiesen werden (Sharer

et al., 1998, Cohn et al., 1998). Im Verlauf der letzten Jahre wurde das CFTR bei CP

umfangreich untersucht. Die Ergebnisse der Studien bestätigten die Assoziation zur

CP und relativierten die Bedeutung von CFTR Varianten bei der Pathogenese der

CP (Audrezet et al., 2002; Weiss et al., 2005; Rosendahl et al., unveröffentlichte

Daten).

12

Im Jahr 1988 beschrieb Heinrich Rinderknecht erstmals in humanem Pankreassekret

eine Protein, welches er als Enzym Y bezeichnete, und das abhängig von der

vorliegenden Calciumkonzentration alle Trysinogen-Isoformen spalten konnte

(Rinderknecht et al., 1988). Nach weiteren 20 Jahren wurde Chymotrypsin C (CTRC)

als Enzym Y identifiziert. (Szmola et al., 2007). Kurze Zeit später konnten zwei

unabhängige Forschungsgruppen nachweisen, dass „loss-of-function“-Varianten des

CTRC mit der CP asoziiert sind (Masson et al., 2008, Rosendahl et al., 2007). In der

nachfolgenden Abbildung ist das pathogenetische Konzept der Entstehung der CP

schematisch dargestellt (Abbildung 2), welches zum einen auf der Charakterisierung

von genetischen Ursachen und zum anderen auf Einfüssen durch Umweltfaktoren

beruht. Umso schwerwiegender vorliegende CFTR Varianten sind umso häufiger

entsteht eine exokrine Insuffizienz, wobei die Cl--Kanal-Funktion abnimmt. Vor allem

bei Vorliegen milder Varianten der verschiedenen Gene (komplex bedingte CP)

scheinen Veränderungen auf mehreren Genen notwendig zu sein, damit eine CP

entsteht.

Abbildung 2: Schema der genetischen und umweltbedingten Einflüsse auf die Pathogenese der CP. Es gibt zwei Endpunkte (Zystische Fibrose und hereditäre CP) bei denen die Entstehung der Erkrankung wahrscheinlich wenig bis gar keine Umwelteinflüsse benötigt und vorwiegend genetisch determiniert wird. Zwischen diesen Endpunkten liegt in den meisten Fällen eine komplexe Interaktion von genetischen Faktoren und Umweltfaktoren vor. Abbkürzungen: CF=CFTR Varianten, mild=milde Varianten, Poly=Polymorphismen, sev=harte Varianten, SPINK1=Serin-Protease Inhibitor Kazal, Typ 1, CTRC=Chymotrypsinogen C, PRSS1=kationisches Trypsinogen, WT=Wildtyp.

1.4 Cathepsine bei Pankreatitis

Cathepsine sind Proteasen die an der Verstoffwechselung von Proteinen in

Lysosomen beteiligt sind. Über Endozytose oder Autophagozytose werden Proteine

13

in Lysosmen aufgenommen und degradiert. Im vergangenen Jahrzehnt wurden

weitere Lokalisationen und Funktionen der Cathepsine entdeckt. So können

Cathepsine sowohl extrazellulär als auch andernorts innerhalb der Zelle wie in

sekretorischen Vesikelen (Wartmann et al., 2010, Puri et al., 2008), dem Zytosol

(Sever et al., 2007, Faul et al., 2008, Reiser et al., 2004), und im Nucleus (Goulet et

al., 2004, Alcalay et al., 2008) gefunden werden. Interessanterweise sind Cathepsine

an der Antigen-Präsentation (Honey et al., 2003), dem Kollagen-Umsatz in Knochen

und Knorpel (Stoch et al., 2008, Deal, 2009) und an der Neuropeptid- und

Hormonbildung (Friedrichs et al., 2003, Funkelstein et al., 2008) beteiligt. Eine

übermässige oder ektope Expression von Cathepsinen kann bei der Entwicklung von

Krankheiten, wie beispielsweise einer Arthritis, als auch bei der Malignomentstehung

von Bedeutung sein (Reiser et al., 2010).

Heutzutage werden Cathepsine je nach Struktur und katalytischer Aktivität in Serin-,

Asparagin- und Cystein-Cathepsine unterteilt. Letztere werden auch als Papain-

ähnliche Proteasen bezeichnet, da sie Papain, der wichtigsten Protease der Papaya-

Frucht, ähneln (Reiser et al., 2010). Die Cystein-Cathepsine stellen die größte

Cathepsin-Familie dar, zu denen unter anderem Cathepsin B (CTSB) und Cathepsin

L (CTSL), zählen. (Rawlings et al., 2008) Ursprünglich wurden Cathepsine als

Proteasen in sauren zellulären Kompartimenten wie Lysosomen und Endosomen

identifiziert (Reiser et al., 2010). Eine Cathepsin-Aktivität wurde in den 20er Jahren

zum ersten Mal im Magensaft beschrieben. (Willstätter et al., 1929).

1.4.1 Die Rolle des Cathepsin B bei der Pankreatitis

Das CTSB (OMIM *116810) umfasst zwölf Exone und ist auf dem kurzen Arm des

Chromosom acht lokalisiert (8p22). CTSB ist in vitro in der Lage das Trypsinogen des

Menschen und von Rindern zu aktivieren (Greenbaum et al., 1959, Figarella et al.,

1988). Dabei spaltet CTSB das N-terminale Hexapeptid, welches auch als

„trypsinogen activation peptide” (TAP) bezeichnet wird, ab. Dieser Schritt entspricht

der Funktion der Enteropeptidase, dem physiologischen Trypsinaktivator im

Dünndarm. Da scheinbar die intrapankreatische Aktivierung von Trypsin bei der

Entstehung einer Pankreatitis entscheidend ist, wurde vermutet das CTSB an der

Pathogenese der CP beteiligt ist.

14

In Ctsb-/- Mäusen wurde in Modellen der experimentell induzierten Pankreatitis ein

milderer Verlauf der akuten Pankreatitis gezeigt. Weiterhin wurde bei der

Behandlung von Mäusen und Ratten in verschiedenen in vivo Modellen der

experimentellen Pankreatitis durch die Gabe eines CTSB Inhibitor (CA-074me) vor

Induktion der Pankreatitis, der Schweregrad der Pankreatitis substantiell vermindert.

(van Acker et al., 2002, van Acker et al., 2006, Halangk et al., 2000). Aufgrund dieser

Daten stellte das CTSB ein spannendes Kandidatengen der CP dar.

In einer Arbeit von Marhurkar und Mitarbeitern konnte bei indischen Patienten mit

tropischer kalzifizierender CP (TCP) eine Leucin zu Valin Variante an Position 26 des

CTSB (p.L26V) mit der Erkrankung assoziiert werden (P-Wert=0,009, Odds Ratio

2,15, 95% CI 1,6-2,9). Die Assoziation wurde in einem zweiten Kollektiv von

Patienten mit TCP bestätigt. (Mahurkar et al., 2006). In einer weiteren Arbeit konnte

die vorbeschriebene genetische Assoziation der p.L26V Variante bei kaukasischen

Patienten mit idiopathischer CP jedoch nicht bestätigt werden. (Weiss et al., 2007).

Auch in weiteren Untersuchungen kaukasischer Patienten zeigte sich keine

Assoziation (Professor Witt, persönliche Kommunikation). Möglicherweise erklären

sich die verschiedenen Ergebnisse durch Unterschiede des genetischen

Hintergrundes der untersuchten Kollektive oder durch einen anderen genetischen

Hintergrund der indischen Kontrollen (im Vergleich zu den TCP Patienten).

1.4.2 Die Rolle des Cathepsin-L bei der Pankreatitis

Das Cathepsin L (CTSL1, OMIM *116880) umfasst acht Exone und erstreckt sich

über 5,1 kb auf dem langen Arm des Chromosom neun (9q21-q22). Die Translation

beginnt in Exon 2. Wegen ihres teilweise überlappenden Substrat-Repertoires hatte

man angenommen, dass auch andere Cystein Cathepsine als CTSB an der

Trypsinogen-Aktivierung beteiligt sind, die möglicherweise zur Ausbildung einer

Pankreatitis führt. Da CTSL eine wesentlich stärkere proteolytische Wirkung aufweist

als CTSB (Kirschke et al., 1985), schien es ebenfalls ein wichtiger Regulator der

Trypsinogen-Aktivierung zu sein.

In einer interessanten Arbeit von Wartmann und Kollegen wurde festgestellt, dass

CTSL und CTSB sowohl in den Lysosomen als auch in Kolokalisation mit

Zymogenen in sekretorischen Vesikeln vorkommen können. (Wartmann et al., 2010)

Diese Kolokalisation nimmt bei Pankreatitis zu und kann sich sogar ins Cytosol

15

ausbreiten. Zudem zeigten Untersuchungen mit menschlichem und bovinem

Trypsinogen eine spezifische CTSL-Spaltungsstelle an Position G26-G27. Eine

Spaltung durch CTSL in diesem Bereich führt zur Bildung eines inaktiven Trypsins.

Da diese Spaltungsstelle drei Aminosäuren vor der Spaltungsstelle des

physiologischen Trypsinaktivators Enteropeptidase liegt, wird ein längeres Propeptid

(TAP) gebildet. Dieses verlängerte TAP-Molekül (TAP-IVG) wird zwar nicht durch

TAP-spezifische „enzyme-linked immunosorbent assays“ (ELISA) detektiert, durch

CTSB jedoch in ein immunoreaktives TAP konvertiert. Damit konnte gezeigt werden,

dass das TAP-Level nicht mit dem Schweregrad der Krankheit sowie der Menge an

aktivem Trypsin assoziiert ist.

Der Verlauf einer experimentell induzierten Pankreatitis wurde in Ctsl-/- Mäusen

untersucht. Hier zeigte sich, dass die intrapankreatische Trypsinaktivität stark erhöht

war, da CTSL als „Antagonist“ der CTSB vermittelten Trypsinogenaktivierung fehlte.

Der Schweregrad der Pankreatitis war als Ergebnis einer weniger starken

Entzündungsreaktion reduziert, da die Azinuszellen vermehrt der Apoptose zugeführt

wurden anstatt durch Nekrose unterzugehen. Zusammengefasst scheint CTSL vor

der Entstehung einer Pankreatitis zu schützen (weniger Trypsinaktivität), wobei in

Ctsl-/- Mäusen der Schweregrad einer experimentell induzierten Pankreatitis aufgrund

von vermehrter Apoptose geringer war.

16

2 Fragestellung

Für die Pathogenese der CP scheint eine Störung des Gleichgewichts von Proteasen

und Anti-Proteasen von Bedeutung zu sein. In den letzten Jahren wurden genetische

Assoziationen beschrieben, die dieses Gleichgewicht scheinbar zu Gunsten der

Proteasen verschieben. Bei vielen Patienten (ca. 30 Prozent) wurde bisher keine

genetische Veränderung detektiert.

Unter physiologischen Bedingungen werden Verdauungsenzyme als

Vorläuferenzyme sezerniert und in Zymogengranula gespeichert. Eine Aktivierung

erfolgt erst im Duodenum. Die in Lysosomen lokalisierten Cathepsine können die

Aktivierung und den Abbau von Trypsinogen beeinflussen. CTSB ist in der Lage

intrapankreatisch Trypsinogen zu aktivieren und könnte somit eine Pankreatitis

auslösen. Genetische Untersuchungen wiesen keine Assoziation zur CP nach.

Im Gegensatz zu CTSB degradiert CTSL Trypsinogen und könnte somit die

Entstehung einer CP verhindern. Eine Arbeit zeigte im Modell mit Ctsl-/--Mäusen nach

caeruleininduzierter Pankreatitis eine Reduktion des Schweregrades der Pankreatitis.

Dabei war die intrapankreatische Trypsinaktivität und die Apoptoserate der

Pankreasazinuszellen gesteigert.

Aus diesem Grund stellt CTSL ein vielversprechendes Kandidatengen der CP dar.

Entsprechend der Ergebnisse bei Ctsl-/--Mäusen könnten protektive Varianten bei

Kontrollen vorliegen, die über einen Funktionsverlust vor einer CP schützen. Ebenso

könnten bei Kontrollen oder bei Patienten Varianten vorliegen, die den

intrapankreatischen Abbau von Trypsinogen vermindern (oder bei Patienten

erhöhen). In dieser Arbeit soll geklärt werden, inwieweit Varianten des CTSL die

Pathogenese der CP beeinflussen. Hierfür werden die kodierenden Abschnitte und

die Übergänge zu nicht-kodierenden Abschnitten bei Patienten und Kontrollen mittels

uni-direktionaler Sequenzierung analysiert. Varianten mit einer Frequenz von über

einem Prozent werden mittels PHASE (Haplotypen-Analyse) ausgewertet.

17

3 Studienteilnehmer

3.1 Patienten

Die vorgelegte Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Leipzig

genehmigt (Registrierungsnummer 818 der Ethikkommission der Universität Leipzig).

Die Patienten wurden ausführlich über die Studienbedingungen und

molekulargenetischen Untersuchungen sowie über die wissenschaftliche

Verwendung ihres Blutes aufgeklärt. Nach Einwilligung der Patienten in schriftlicher

Form erfolgte die venöse Blutentnahme. Bei minderjährigen Patienten willigte ein

Elternteil schriftlich ein.

Die Diagnose einer CP wurde bei Patienten gestellt, wenn folgende Kriterien

vorlagen: mindestens zwei eindeutig voneinander unabhängige Episoden von

Oberbauchbeschwerden (normalerweise epigastrisch lokalisiert) mit einem über 3-

fach erhöhtem Lipase-Wert im Serum oder chronische Oberbauchbeschwerden

(chronisches Schmerzsyndrom). Gleichzeitig musste der Nachweis von

charakteristischen Zeichen einer CP in bildgebenden Befunden (z.B.

Abdomensonographie, Endosonographie, Computertomographie, Magnet-Resonanz-

Tomographie, Endoskopisch-retrograde-Cholangiopankreatikographie) vorliegen. Zu

diesen bildgebenden Zeichen zählten beispielsweise der Nachweis von

Verkalkungen, Konkrementen, Pseudozysten oder Pankreasgangveränderungen.

Eine hereditäre CP wurde bei positiver Familienanamnese mit mindestens einem

betroffenen Verwandten ersten Grades oder mindestens zwei Verwandten zweiten

Grades diagnostiziert, wenn keine weiteren offensichtlichen Risikofaktoren

vorhanden waren. Eine idiopathische CP wurde bei Patienten diagnostiziert, bei

denen prädisponierende Risikofaktoren wie beispielsweise Alkoholabusus, Trauma,

Medikamenteneinnahme, Infektionen, metabolische Störungen oder eine positive

Familienanamnese fehlten.

Insgesamt wurden im Rahmen der Studie 218 Patienten (110 weiblich, 108 männlich;

Altersspanne 3-75 Jahre, Median 29,5 Jahre, Mittelwert 31,4 Jahre), von denen 175

eine idiopthische und 43 eine hereditäre CP aufwiesen, untersucht. Die Patienten

wurden in ganz Deutschland rekrutiert. Im Rahmen eines genetischen Screening für

zur CP prädisponierende Veränderungen wurde bei allen Patienten das Exon 2 und

3 des PRSS1 und das Exon 3 des SPINK1 sowie das Exon 2, 3 und 7 des CTRC

mittels uni-direktionaler Sequenzierung untersucht. Innerhalb der Studie wurde bei

18

allen Patienten eine vollständige uni-direktionale Sequenzierung aller Exone des

CTSL1 und der Exon-Intron Übergänge durchgeführt.

3.2 Kontrollgruppe

Die Kontrollgruppe umfasste insgesamt 230 gesunde Blutspender (163 weiblich, 67

männlich; Altersspanne 20-81 Jahre, Median 47 Jahre, Mittelwert 47,2 Jahre),

welche in Leipzig rekrutiert wurden. Die Kontrollen wurden, ebenso wie die Patienten,

vollständig auf genetische Veränderungen des CTSL1 untersucht (siehe 2.1).

4 Materialien und Methoden

4.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

DNeasy Blood &Tissue kit

dNTPs

Oligonukleotid-Primer

MgCl2

GeneAmp 10 x PCR-Puffer II

AmpliTaq DNA-Polymerase

Agarose

Trisbase

Borsäure

0,5M EDTA Lösung pH 8,0

Ethidiumbromid 10 mg/ml

Bench Top 100bp DNA Leiter

Exonuklease I

Shrimp Alkaline Phosphatase

Big Dye Terminator v.3.1

NaAc (3M)

96 well Mikroplatte

Qiagen, Hilden

Epicentre Biotechnologies, Madison, USA

TIB MOLBIOL, Berlin

Applied Biosystem, Weiterstadt

Applied Biosystem, Weiterstadt

Applied Biosystem, Weiterstadt

Serva, Heidelberg

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Serva, Heidelberg

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Promega, Madison, Wisconsin, USA

USB, High Wycombe, UK

USB, High Wycombe, UK

Applied Biosystem, Weiterstadt

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Greiner, Frickenhausen

19

4.2 Laborgeräte

MSZ Minishaker (Vortex)

Thermomixer Compact

Biofuge pico (DNA-Extraktion)

Flex Cycler (PCR, Cycle Sequencing)

EPS 350 1XL (Gelelektrophorese)

Whatman, Gelelektrophoresekammern

Multimage II (Gelelektrophorese)

Centrifuge 5430R (Sequenzierung)

ABI 3100 Genetic Analyzer

IKA, Staufen

Eppendorf, Köln

Hereaus Instruments, Hanau

analytikjena, Jena

Amersham Pharmacia, Nümbrecht

Biometra, Göttingen

Alpha Innotech, Santa Clara, USA

Eppendorf, Köln

Applied Biosystem, Weiterstadt

4.3 DNA-Extraktion

Die Extraktion der DNA aus EDTA-Blut erfolgt entsprechend des Protokolls der Firma

Quiagen (Hilden). Die Lagerung des EDTA-Blutes wurde bei -20°C durchgeführt.

Aliquots der DNA Proben wurden für die Analysen aufgetaut und bei +4°C gelagert.

4.4 Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) dient der Vervielfältigung eines definierten

DNA-Abschnitts. Durch eine Temperaturerhöhung wird hierbei die DNA in-vitro in

Einzelstränge getrennt (denaturiert). Der Startpunkt der DNA-Synthese wird durch

einsträngige Primer, die sich der Original-DNA am 3`-Ende anlagern (Annealing),

markiert. Die Replizierung erfolgt durch temperaturbeständige DNA-Polymerasen

(Extension). Durch wiederholte Denaturierung und Extension kann eine exponentielle

Vermehrung des DNA-Produkts erreicht werden. Die beschriebene Methode wurde

von Mullis und Kollegen entwickelt (Mullis er al., 1986). Für die Herstellung eines

PCR-Reaktionsansatzes wurden 1,8 µl dNTPs (je 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP,

dTTP), 2,5 µl MgCl2, 3 µl Puffer (GeneAmp10 x PCR-Puffer II), 0,15 µl AmpliTaq

DNA-Polymerase, 16 µl aqua dest. und je 0,3 µl Primer (vorwärts, rückwärts)

eingesetzt, so dass ein Gesamtvolumen von 25 µl erreicht wurde. Nach Zugabe der

DNA erfolgte die PCR in einem FlexCycler (analytikjena, Jena) mit folgendem

Programm: Initialisierung zur vollständigen Trennung der DNA-Stränge für 6 min bei

95°C. Anschließend 48 Zyklen mit: 20 sek Denaturierung bei 95°C, 40 sek Annealing

20

bei 62°C (primerspezifische Annealing-Temperaturen, siehe Tabelle 1) und 90 sek

Extension bei 72°C. Nach den 48 Zyklen wurde eine einmalige Extension für 6 min

bei 72°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben auf 10°C gekühlt.

Exon Primer F Primer R Temperatur

1-4 P 5’-CGCATAAACTGTTTCAGCTCCT-’3 5’-GCCGGCTAATTTTCGTTGTATT-’3 62

5-6 P 5’-TAGCCTTTGCACAATCCTGTGA-’3 5’-ATGTCTTTGCAGCCAGATATGC-’3 62

7 P 5’-TGCCCTTAGGCATACTTCTGAAA-’3 5’-TGCTGCAATCAAGGATTGGTTA-’3 62

1 S 5’-ACTGTTTCAGCTCCTACAGCTC-’3 62

2-3 S 5’-TGTCTCAGTTTGGAGAACAGCA-’3 62

4 S 5’-TGATAGAGTCAAGGTTTCACCT-’3 62

5 S 5’-TGGAAGTAAACCCAGAGGTCTCA-’3 62

6 S 5’-TCCCTGGCCTTCTTATTGTTGT-’3 62

7 S 5’-GCATATCTGGCTGCAAAGACAT-’3 62

Tabelle 1: Oligonukleotid-Sequenzen der Primer, die für die PCR (P) (oberer Teil der Tabelle) und für die Sequenzierung (S) (unterer Teil der Tabelle) verwendet wurden. Die jeweilige Annealing-Temperatur (letzte Spalte) ist in °C angegeben. Abbkürzungen: P=PCR, S=Sequenzierung, F=vorwärts, R=rückwärts.

4.5 Agarose-Gelelektrophorese

Das PCR-Produkt kann, aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA,

in einem elektrischen Feld aufgetrennt werden. Dabei wandern die Moleküle,

entsprechend ihrer Größe und Ladung, mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in

Richtung Pluspol. Durch Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente

bekannter Größe enthält und parallel im Agarose-Gel mitläuft, kann die Größe des

PCR-Produktes bestimmt werden. Die DNA Leiter bestand aus 4 µl Marker, 8 µl

DNA-Probenpuffer und 36 µl TBE-Puffer. Von dieser Lösung wurden 5 µl eingesetzt.

Mit dieser Methode wurde kontrolliert, ob das amplifizierte PCR-Produkt die richtige

Größe (in Basenpaaren) aufwies und ob die Amplifikation erfolgreich war. Hierfür

wurden von jeder 96 well Mikroplatte nach der PCR 16 Proben auf ein Agarose-Gel

aufgetragen. Bei entsprechend guter Amplifikation wurden die PCR-Produkte weiter

verarbeitet.

4.5.1 Herstellung der Agarose-Gelplatten

Das Agarose-Gel für eine Biometra-Platte beinhaltete 60 mg Agarose und 60 ml

1%igen TBE-Puffer. Zur Herstellung eines 10%igen TBE-Puffers wurden 108 g

21

Trisbase, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) vermengt und auf einen

Liter Reagenz mit aqua dest. aufgefüllt. Dann wurde der 10%ige TBE-Puffer mit aqua

dest. auf eine 1%ige Konzentration verdünnt. Die Flüssigkeit (Agarose und TBE-

Puffer) wurde für wenige Sekunden in einer Mikrowelle zum Kochen gebracht und

anschließend unter kaltem Wasser abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurden 2 µl

Ethidiumbromid beigefügt. Die Flüssigkeit wurde in die Platte, welche abgedichtet

und mit Kämmen zur Bildung von 18 Aussparungen in zwei Reihen versehen war,

eingefüllt. Anschließend fixierte das Agarose-Gel beim Auskühlen.

4.5.2 Gelelektrophorese des PCR-Produktes

Die verfestigten Gelplatten wurden nach Entfernung der Kämme in mit 1%igem TBE-

Puffer gefüllte Elektrophoresekammern (Biometra, Göttingen) eingebracht. In die

erste Aussparung wurden 3 µl Bench Top 100bp DNA Leiter als Kontrolle, in die

folgenden 5 µl angefärbtes PCR-Produkt pipettiert. In die beiden letzten

Aussparungen jeder Reihe wurde H2O als Negativkontrolle eingefüllt.

Die Färbung des PCR-Produkts wurde mit 1 µl DNA Probenpuffer gewährleistet. Die

Herstellung dieses Puffers erfolgte aus 4 g Sucrose, 400 µl 0,5 M EDTA-Lösung (pH

8,0), 500 µl 10% Sodiumdodecylsulfat und 0,005 g Bromphenolblau, welche auf die

Gesamtmenge von 10 ml mit aqua dest. aufgefüllt wurden. Die Elektrophorese

erfolgte bei 110 Volt und 100 Watt über 30 min. Das Ergebnis der Elektrophorese

wurde im Multimage II (Alpha Innotech, Santa Clara, USA) ausgewertet (siehe

Abbildung 4).

22

Abbildung 3: Agarose-Gel Elektrophorese des CTSL1 Exon 5-6. In der ersten Aussparung ist jeweils die als Referenz verwendete Basenleiter (BL) und in der letzten Aussparung die Wasserkontrolle (H2O) erkennbar. In den 16 Aussparungen zwischen den Basenleitern sind ingesamt 32 Proben von zwei 96 well Mikroplatten zur Kontrolle der PCR aufgetragen.

4.6 Aufreinigung des PCR-Produktes

Zur Entfernung von überschüssigen dNTPs, kurzen oligo-Fragmenten, Enzymen und

anderen Proteinen wurde das PCR-Produkt mit Exonuklease I und alkalischer

Phosphatase (shrimp alkaline phosphatase) aufgereinigt. Hierfür wurde im folgenden

Verhältnis eine Stammlösung hergestellt: 0,25 µl Exonuklease I, 0,25 µl alkalischer

Phosphatase und 0,5 µl aqua dest.. Zu 20 µl PCR-Produkt wurden 2 µl der

Stammlösung hinzugegeben. Anschließend wurden die Platten zentrifugiert um eine

ausreichende Durchmischung zu gewährleisten (Eppendorf Zentrifuge, Centrifuge

5430R). Die Aufreinigung erfolgte in einem FlexCycler (analytikjena, Jena) mit

folgendem Programm: 40 min bei 37°C (Aufreinigung) und 20 min bei 80°C

(Denaturierung der Enzyme).

4.7 Sequenzierung

Die Sequenzierung wurde nach der Didesoxymethode nach Sanger durchgeführt

(Sanger et al., 1977). Hierbei wurde ein DNA-Segment mittels PCR amplifiziert.

Anschließend wurde mit Hilfe von dNTPs, fluoreszensmarkierten ddNTPs, Primern

BL

BL

H2O

H2O

23

(beide Richtungen; bei unidirektionaler Sequenzierung lediglich eine Richtung) und

einer DNA-Polymerase das aufgereinigte PCR-Produkt linear vervielfältigt (cycle

sequencing). Während des cycle sequencing wird anstelle eines dNTP ein ddNTP

mit fehlender Hydroxygruppe am 3`-C-Atom eingebaut. Dies geschieht mit gleicher

Wahrscheinlichkeit in jedem Abschnitt des PCR-Produkts. An dieser Stelle bricht die

Kettenverlängerung ab. So entstehen fluoreszensmarkierte Fragmente jeder Länge,

deren endständige Basen mittels Photodetektion erkannt werden können. So kann

die vorhandene Basenabfolge in ihrer Sequenz dargestellt werden.

Die Zusammensetzung eines 20 µl-Ansatzes beinhaltete 3 µl PCR-Produkt (DNA-

template) (in Abhängigkeit von der Bandendicke in der Gelelektrophorese wurden

teilweise bis zu 6 µl eingesetzt), 14 µl aqua dest. (abhängig von der Menge des

eingesetzten PCR Produkt teilweise weniger), 1 µl Primer sowie 2 µl Big Dye

Termiator v.3.1. Das cycle sequencing wurde in einem FlexCycler (analytikjena,

Jena, Deutschland) mit nachstehendem Programm durchgeführt: Initialisierung für 3

min bei 95°C, anschließend 30 Zyklen mit 30 sek Denaturierung bei 95°C und 4 min

Annealing und Extension (Temperatur der Primer siehe Tabelle 1). Nach den Zyklen

wurde einmalig für 5 min bei 60°C extendiert und anschließend das Produkt auf 15°C

abgekühlt.

Zur Reinigung des cycle sequencing Produkts wurde eine Natriumacetat-Fällung

angesetzt. Hierbei wurden zum 20 µl-Ansatz 2 µl NaAc und 60 µl 96%iges Ethanol

pipettiert. Nach kurzem Vortexen wurde das Reagenz für 15 min bei

Raumtemperatur inkubiert und hinterher zentrifugiert. Abhängig, ob der Ansatz in

einzelnen Pipettiergefäßen oder in einer Platte (96 well Mikroplatte) angesetzt

worden war, erfolgte die Zentrifugation für 15 min bei 13.000/min (Biofuge pico,

Heraeus Instruments) bzw. 30 min bei 4.500/min (Centrifuge 5430R, Eppendorf). Der

Überstand wurde abpipettiert, 100 µl 70%iges Ethanol beigefügt und erneut für 5 min

bei 13.000/min bzw. 10 min bei 4.500/min zentrifugiert. Nach Entfernung des

Überstandes wurde das Pellet mittels Kapillar-Sequenzierung (ABI 3100 Genetic

Analyzer, Applied Biosystems, Weiterstadt) analyziert. Die Sequenzen wurden mit

dem Chromas Lite 2.01 Programm ausgedruckt und visuell von zwei Personen

ausgewertet. Ein Beispiel einer Sequenzierung (Elektropherogram) ist für eine

veränderte und eine Wildtyp-Sequenz in Abbildung 5 hiernach aufgeführt.

24

Abbildung 4: Elektropherogramm der c.5A>C (p.N2T) Variante (A) und einer Wildtyp-Probe. Mit dem Pfeil ist die Variante in der linken Abbildung (Austausch von Adenin (A) zu Cytosin (C) gekennzeichnet. In der rechten Abbildung ist die Wildtyp-Sequenz (Adenin) durch den Pfeil gekennzeichnet.

4.8 Statistik

Die statistischen Auswertungen wurden mit dem Fisher-Exakt-Test durchgeführt. P-

Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Berechnungen

erfolgten mit GraphPad Prism v4.03. Wenn angebracht, wurde eine Korrektur nach

Bonferroni durchgeführt. Haplotypen wurden mit PHASE v. 2.1 berechnet (Stephens

et al., 2001, Stephens et Scheet, 2005).

5 Ergebnisse

5.1 Sequenzierung des CTSL1 – Seltene Varianten

Bei 218 Patienten und 230 Kontrollen wurde eine komplette Sequenzierung der

kodierenden und nicht kodierenden Abschnitte des CTSL1 mittels uni-direktionaler

Sequenzierung durchgeführt.

Als selten wurde das Vorkommen von Varianten dann eingestuft, wenn sie bei

weniger als 1% der Patienten/Kontrollen nachgewiesen wurden. Hierbei wurden

Varianten der kodierenden als auch von nicht kodierenden Abschnitten

zusammengefasst. Insgesamt wurden elf Varianten detektiert. Die Varianten c.-

160C>T, c.5A>C (p.N2T, rs112682750), c.120C>T ((p.(=))), c.849C>T ((p.(=))),

c.993C>T ((p.(=))) und c.*11G>C wurden jeweils bei nur einem Patienten (1/218,

0,5%) nachgewiesen wohingegen die Varianten c.126+1G>A, c.785-215G>A,

c.852A>C ((p.(=))) und c.915A>C (p.E305D) bei jeweils nur einer Kontrollperson

(1/230, 0,4%) vorlagen. Die Variante c.785-250G>A in Intron 5 konnte sowohl bei

25

zwei Patienten (2/218, 0,9%) sowie einer Kontrolle (1/230, 0,4%) gefunden werden.

Vier der gefunden Varianten (c.120C>T, c.849C>T, c.993C>T, c.852A>C) führen auf

Proteinebene zu keinem Aminosäureaustausch und haben damit

höchstwahrscheinlich keine funktionelle Relevanz.

Die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750), welche bei einem Patienten gefunden

wurde, führt zu einem Austausch der Aminosäure Asparagin zu Threonin an Position

fünf des Proteins. Diese Variante ist in der NCBI-Datenbank (National Center for

Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov) hinterlegt und wurde somit bereits

bei gesunden Probanden nachgewiesen.

Die bei einer Kontrolle nachgewiesene Variante c.126+1G>A, liegt im Bereich der

Splice-Site des Intron 1. Im 5’-Bereich des Introns ist die konservierte Basenabfolge

GT für das „splicen“ durch das Spliceosom wichtig. Daher können Mutationen in

diesem Bereich die Expression des Gens beeinflussen. Eine weitere Variante

(c.915A>C, p.E305D), welche ebenfalls bei nur einer Kontrolle gefunden wurde,

bedingt an Position 305 des CTSL1 einen Aminosäureaustausch von Glutamin- zu

Asparaginsäure. In diesem Fall liegt also ein Austausch von chemisch sehr ähnlichen

Aminosäuren vor.

Insgesamt wurden in der Summe acht seltene Varianten bei Patienten (8/218, 3,7%)

und fünf bei Kontrollen (5/230, 2,2%) identifiziert. Somit kann für keine der einzelnen

Varianten eine statistisch signifikanter Unterschied in der Verteilung zwischen

Patienten und Kontrollen berechnet werden. Die gleiche Aussage gilt für den

Vergleich der Summe aller seltenen Varianten bei Patienten und Kontrollen. Die

Ergebnisse für die seltenen Varianten die bei den Analysen identifiziert wurden sind

in der nachfolgenden Tabelle (Tabelle 2) zusammengefasst.

26

Variante Position Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio

c.-160C>T Promoter 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -

c.5A>C p.N2T rs112682750

Exon1 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -

c.120C>T (p.(=))

Exon1 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -

c.126+1G>A Intron 1 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -

c.785-250G>A Intron 5 2/218 (0,9%) 1/230 (0,4%) n.s. -

c.785-215G>A Intron 5 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -

c.849C>T (p.(=))

Exon 6 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -

c.852A>C (p.(=))

Exon 6 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -

c.915A>C p.E305D

Exon 7 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -

c.993C>T (p.(=))

Exon 7 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -

c.*11G>C 3’-UTR 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -

Summe 8/218 (3,7%) 5/230 (2,2%) n.s. -

Tabelle 2: Darstellung der seltenen nicht-synonymen, synonymen und in nicht kodierenden Abschnitten gelegenen Varianten des CTSL1. Die Nomenklatur der Varianten erfolgt nach Vorgabe der „Human Genome Variation Society“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Wenn vorhanden sind die „reference SNP“ Nummern (rs) angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test im dominanten und rezessiven Modell. Abbkürzungen: n.s.=nicht signifikant, UTR=untranslated region.

5.2 Häufige CTSL1- Varianten

Neben den bereits beschriebenen seltenen CTSL1-Varianten wurden häufige

Sequenzalterationen im Bereich der sequenzierten Region untersucht. Als häufig

wurden Frequenzen des selteneren Allels von >1% angesehen. Insgesamt wurden

anhand dieser Kriterien acht verschiedene CTSL1-Varianten gefunden.

Für die Varianten c.126+31C>T (rs2274611; Intron 1) und c.902+195A>C

(rs3128510; Intron 6) zeigte sich bei der Genotyp-Verteilung ein Unterschied

zwischen Patienten und Kontrollen. Der Genotyp CT der Variante c.126+31C>T

wurde bei 51,8% der Patienten (113/218) im Vergleich zu 40,9% bei Kontrollen

(94/230) nachgewiesen, wohingegen der Genotyp TT bei 19,7% der Patienten

(43/218) und bei 28,7% der Kontrollen (66/230) vorlag. Bei der Kalkulation der p-

Werte mittels Fisher-Exact Test resultierte im rezessiven Modell ein signifikanter p-

Wert (p=0,03, OR 1,6, 95% CI 1,1-2,5). Nach Bonferroni-Korrektur konnte der

signifikante p-Wert nicht aufrecht erhalten werden (p=0,24). Der Genotyp AC der

c.902+195A>C Variante wurde bei 51,7% der Patienten (104/201) und bei 40,5% der

27

Kontrollen (85/210) nachgewiesen. Der Genotyp CC zeigte sich bei 20,9% der

Patienten (42/201) und bei 30% der Kontrollen (63/210). Hier ergab sich im

rezessiven Modell ebenfalls ein statistisch signifikanter p-Wert (p=0,04, OR 1,6, 95%

CI 1,0-2,6) der nach Korrektur keinen Bestand hatte (pc=0,32).

Für alle häufigen Varianten führten wir eine Berechnung nach Hardy-Weinberg

durch. Dabei zeigten sich Abweichungen vom diesem Gleichgewicht (p<0,05) bei

den Kontrollen in Variante c.126+31C>T (rs2274611) und c.402G>A ((p(.=))) mit

Werten von p= 0,0057 und p=0,0074. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden

Tabelle (Tabelle 3) zusammengefasst.

Variante Genotyp Position Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio

c.-43C>G rs10123692

CC

Promoter

204/218 (93,6%) 217/230 (94,3%)

n.s. - CG 14/218 (6,4%) 13/230 (5,7%)

GG 0 0

c.126+31C>T

rs2274611

CC

Intron 1

62/218 (28,4%) 70/230 (30,4%)

n.s.* - CT 113/218 (51,8%) 94/230 (40,9%)

TT 43/218 (19,7%) 66/230 (28,7%)

c.402G>A (p(.=))

GG

Exon 4

203/217 (93,5%) 213/230 (92,6%)

n.s. - GA 14/217 (6,5%) 15/230 (6,5%)

AA 0 2/230 (0,9%)

c.621+56A>C

rs2378757

AA

Intron 4

88/217 (40,6%) 102/229 (44,5%)

n.s. - AC 108/217 (49,8%) 93/229 (40,6%)

CC 21/217 (9,7%) 34/229 (14,8%)

c.621+62T>G

TT

Intron 4

203/217 (93,6%) 216/229 (94,3%)

n.s. - TG 14/217 (6,4%) 13/229 (5,7%)

GG 0 0

c.621+79G>A

GG

Intron 4

203/217 (93,6%) 216/229 (94,3%)

n.s. - GA 14/217 (6,4%) 13/229 (5,7%)

AA 0 0

c.622-172T>C rs2296958

TT

Intron 4

202/217 (93,8%) 162/171 (94,7%)

n.s. - TC 15/217 (6,9%) 9/171 (5,3%)

CC 0 0

c.902+195A>C rs3128510

AA

Intron 6

55/201 (27,4%) 62/210 (29,5%)

n.s.& - AC 104/201 (51,7%) 85/210 (40,5%)

CC 42/201 (20,9%) 63/210 (30%)

Tabelle 3: Darstellung der Gentoyp Verteilung häufiger Varianten (Frequenz des selteneren Allels größer als 1%) des CTSL1. Die Nomenklatur der Varianten erfolgt nach Vorgabe der „Human Genome Variation Society“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Wenn vorhanden sind die „reference SNP“ Nummern (rs) angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test im dominanten und rezessiven Modell. Für die Varianten c.126+31C>T und c.902+195A>C zeigt sich bei der Berechnung des p-Wertes im rezessiven Model eine statistische Signifikanz (p=0,03, OR 1,6, 95% CI 1,1-2,5; p=0,04, OR 1,6, 95% CI 1,0-2,6). Nach Bonferroni Korrektur konnte die statistische Signifikanz nicht aufrecht erhalten werden (pc=0,24; pc=0,32).Abbkürzungen: n.s.=nicht signifikant.

Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Varianten wurden sechs Varianten c.-

43C>G (rs10123692), c.402G>A ((p(.=))), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G,

c.621+79G>A und c.622-172T>C (rs2296958) detektiert, von denen keine zu einer

28

Änderung der Aminosäuresequenz des CTSL führt. Diese Varianten zeigten in ihrem

Genotypverteilungsmuster nicht signifikante Unterschiede zwischen Patienten und

Kontrollen. Die Varianten c.621+62T>G und c.621+79G>A werden gekoppelt vererbt

und wiesen in unseren Kollektiven einen Korrelationskoeffizient von 1 auf (r=1). Auch

der in der Promotorregion gelegene SNP c.-43C>G (rs10123692) wurde bei

Patienten und Kontrollen mit vergleichbarer Frequenz nachgewiesen.

5.3 Allelfrequenz der häufigen CTSL1-Varianten

Zusätzlich zur Analyse der Genotypen führten wir bei den häufigen Varianten eine

Analyse der Allelfrequenzen durch.

Hierbei zeigten sich bei allen untersuchten Varianten (c.-43C>G (rs10123692),

c.402G>A ((p(.=))), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A, c.622-

172T>C (rs2296958, c.126+31C>T (rs2274611) c.902+195A>C (rs3128510)) im

Vergleich zwischen Patienten und Kontrollen keine signifikanten Unterschiede. Die

Kalkulationen wurden mittels Fisher-Exact Test durchgeführt. Die Ergebnisse sind in

Tabelle 4 aufgelistet.

Variante Allelfrequenz Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio

c.-43C>G rs10123692

C 422/436 (96,8%) 447/460 (94,3%) n.s. -

G 14/436 (3,2%) 13/460 (5,7%)

c.126+31C>T rs2274611

C 237/436 (54,4%) 234/460 (50,9%) n.s. -

T 199/436 (45,6%) 226/460 (49,1%)

c.402G>A (p.(=))

G 420/434 (96,8%) 441/458 (95,9%) n.s. -

A 14/434 (3,2%) 19/458 (4,1%)

c.621+56A>C rs2378757

A 284/434 (65,4%) 297/458 (64,8%) n.s. -

C 150/434 (34,6%) 161/458 (35,2%)

c.621+62T>G T 420/434 (96,8%) 445/458 (97,2%)

n.s. - G 14/434 (3,2%) 13/458 (2,8%)

c.621+79G>A G 420/434 (96,8%) 445/458 (97,2%)

n.s. - A 14/434 (3,2%) 13/458 (2,8%)

c.622-172T>C rs2296958

T 419/434 (96,5%) 333/342 (97,4%) n.s. -

C 15/434 (3,5%) 9/342 (2,6%)

c.902+195A>C rs3128510

A 214/402 (53,2%) 209/420 (49,8%) n.s. -

C 188/402 (46,8%) 211/420 (50,2%)

Tabelle 4: Darstellung der Allelfrequenzen häufiger Varianten (Frequenz des selteneren Allels größer als 1%) des CTSL1. Die Nomenklatur der Varianten erfolgt nach Vorgabe der „Human Genome Variation Society“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Wenn vorhanden sind die „reference SNP“ Nummern (rs) angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test. Abbkürzungen: n.s.=nicht signifikant.

29

Für die Varianten c.126+31C>T (rs2274611) und c.902+195A>C (rs3128510) zeigte

sich, ähnlich wie bei den Genotypen, ein Unterschied in der Verteilung der

Allelfrequenzen, welcher jedoch statistisch nicht signifikant war (c.126+31C>T:

Patienten: C-Allel 237/436, 54,4%; T-Allel 199/436 (45,6%); Kontrollen: C-Allel

234/460 (50,9%), T-Allel 226/460 (49,1%)) (c.902+195A>C: Patienten: A-Allel

214/402 (53,2%), C-Allel 188/402 (46,8%); Kontrollen: A-Allel 209/420 (49,8%), C-

Allel 211/420 (50,2%).

5.4 Haplotypenanalyse des CTSL1

Unter Einbeziehung der CTSL1 Varianten mit einer Allelfrequenz von mehr als einem

Prozent (siehe Tabelle 3 und 4) führten wir eine Haplotypenanalyse mittels PHASE v.

2.1 durch.

Bei der Haplotypenberechnung wurden folgende Varianten berücksichtigt: c.-43C>G

(rs10123692), c.126+31C>T (rs2274611), c.402G>A ((p.(=))), c.621+56A>C

(rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A, c.622-172T>C (rs2296958),

c.902+195A>C (rs3128510). Die Abfolge der Basensequenz der Haplotypen

entspricht der Abfolge der aufgeführten Varianten (beispielsweise Position 1

innerhalb eines Haplotyps wird durch die Variante c.-43C>G definiert usw.).

Insgesamt wurden 13 verschiedene Haplotypen identifiziert, wobei bei Patienten

neun und bei Kontrollen zwölf verschiedene Haplotypen ermittelt wurden. Acht dieser

Haplotypen wurden sowohl bei Patienten als auch bei Kontrollen gefunden. In der

Summation entsprechen diese acht Haplotypen einem Prozentanteil von 99,8% bei

Patienten und 98,5% bei Kontrollen.

Einzeln hatten diese acht Haplotypen, aufgelistet in der absteigenden Häufigkeit

ihres Auftretens, folgende Nukleotidreihenfolge und Verteilung: Haplotyp 11: C-T-G-

C-T-G-T-C (Patienten: 195/436 (44,7%), Kontrollen: 219/460 (47,6%)), Haplotyp 1:

C-C-G-A-T-G-T-A (Patienten: 149/436 (34,2%), Kontrollen: 155/460 (33,7%)),

Haplotyp 3: C-C-G-C-T-G-T-A (Patienten: 55/436 (12,6%), Kontrollen: 40/460

(8,7%)), Haplotyp 6: C-C-A-C-T-G-T-A (Patienten: 14/436 (3,2%), Kontrollen: 17/460

(3,7%)), Haplotyp 12: G-C-G-C-G-A-C-A (Patienten: 14/436 (3,2%), Kontrollen:

12/460 (2,6%)), Haplotyp 4: C-C-G-C-T-G-T-C. (Patienten: 4/436 (0,9%), Kontrollen:

5/460 (1,1%)), Haplotyp 10: C-T-G-C-T-G-T-A (Patienten: 2/436 (0,5%), Kontrollen:

30

3/460 (0,7%)) und Haplotyp 8: C-T-G-A-T-G-T-A (Patienten: 2/436 (0,5%),

Kontrollen: 2/460 (0,4%)).

Die restlichen Haplotypen fanden sich jeweils entweder nur bei Patienten oder

Kontrollen und wiesen eine Frequenz von unter einem Prozent auf. Der Haplotyp fünf

(Haplotyp 5: C-C-G-C-T-G-C-A) konnte bei ausschließlich einem Patienten (1/436

(0,2%)) nachgewiesen werden. Die Haplotypen zwei, sieben, neun und dreizehn

(Haplotyp 2: C-C-G-A-T-G-T-C (2/460 (0,4%)), Haplotyp 7: C-C-A-C-T-G-T-C (2/460

(0,4%)), Haplotyp 9: C-T-G-A-T-G-T-C (2/460 (0,4%)) und Haplotyp 13: G-C-G-C-G-

A-C-C (1/460 (0,2%)) traten ausschließlich bei Kontrollen auf. Die Ergebnisse der

Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Haplotyp Nukleotidreihenfolge Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio

1 C-C-G-A-T-G-T-A 149/436 (34,2%) 155/460(33,7%) n.s. -

2 C-C-G-A-T-G-T-C 0 2/460 (0,4%) n.s. -

3 C-C-G-C-T-G-T-A 55/436 (12,6%) 40/460 (8,7%) n.s. -

4 C-C-G-C-T-G-T-C 4/436 (0,9%) 5/460 (1,1%) n.s. -

5 C-C-G-C-T-G-C-A 1/436 (0,2%) 0 n.s. -

6 C-C-A-C-T-G-T-A 14/436 (3,2%) 17/460 (3,7%) n.s. -

7 C-C-A-C-T-G-T-C 0 2/460 (0,4%) n.s. -

8 C-T-G-A-T-G-T-A 2/436 (0,5%) 2/460 (0,4%) n.s. -

9 C-T-G-A-T-G-T-C 0 2/460 (0,4%) n.s. -

10 C-T-G-C-T-G-T-A 2/436 (0,5%) 3/460 (0,7%) n.s. -

11 C-T-G-C-T-G-T-C 195/436(44,7%) 219/460(47,6%) n.s. -

12 G-C-G-C-G-A-C-A 14/436 (3,2%) 12/460 (2,6%) n.s. -

13 G-C-G-C-G-A-C-C 0 1/460 (0,2%) n.s. -

Tabelle 5: Darstellung der Ergebnisse der Haplotypen-Berechnung mittels PHASE v.2.1. Für die Berechnungen wurden nur Varianten mit einer Allelfrequenz von >1% des selteneren Allels berücksichtigt (Darstellung in den Haplotypen erfolgte in der Reihenfolge: c.-43C>G (rs10123692), c.126+31C>T (rs2274611), c.402G>A (p.(=)), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A, c.622-172T>C (rs2296958), c.902+195A>C (rs3128510)). In Tabelle 4 ist die Verteilung der Varianten bei Patienten und Kontrollen ersichtilich. Insgesamt wurden 13 Haplotypen identifiziert. Die Reihenfolge der Nukleotide ist hinter dem jeweiligen Haplotyp angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test. Abkürzungen: n.s.=nicht signifikant.

31

6 Diskussion

6.1 Seltene nicht-synonyme und synonyme Varianten des CTSL1

Bei unserer umfangreichen genetischen Analyse des CTSL1 mittels uni-direktionaler

Sequenzierung der kodierenden Abschnitte und der Exon-Intron Übergänge konnten

wir drei seltene nicht-synonyme Varianten, die eine funktionelle Beeinträchtigung der

CTSL-Funktion bewirken könnten, nachweisen.

So führt die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750) im Exon 1 zu einem

Aminosäureaustausch von Asparagin zu Threonin an Position zwei des Proteins.

Diese Variante wurde ausschließlich bei einem Patienten nachgewiesen und könnte

aufgrund des Aminosäureaustauschs zu einer Funktionsänderung des CTSL führen.

Ob dieser Austausch zu einer Zunahme oder einer Abnahme der CTSL Funktion

führt ist unklar. Nennenswert ist, dass diese Variante in der NCBI-Datenbank

(National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov) hinterlegt ist,

und somit im Rahmen der Genomanalyse auch bereits bei einem gesunden

europäischen Probanden nachgewiesen wurde. Daher ist ein krankheitsauslösender

Effekt für diese Variante unwahrscheinlich.

Eine weitere möglicherweise mit einem Funktionsverlust einhergehende Variante

könnte c.126+1G>A darstellen. Diese liegt im Bereich der Splice-Site des Exon 1,

welche beim Splicen die Grenze zwischen Exon und Intron darstellt. Die Sequenzen

von Splice-Sites werden vom Spliceosom spezifisch erkannt und entfernt. Dabei ist

die hochkonservierte Basenabfolge GT im 5’-Bereich des Introns für die

ordnungsgemäße Funktion des Spliceosoms wichtig. Da die Variante c.126+1G>A in

jenem GT-Basenbereich liegt, ist es möglich, dass der Austausch von Guanin zu

Adenosin zu einem inkorrekten Splicevorgang führt. Hierdurch könnte der „splice“-

Vorgang gestört werden, was wiederum zu einer mangelnden Synthese von CTSL1

oder zu einer Synthese von in seiner Funktion eingeschränktem CTSL1 führen

könnte. Insgesamt wurde diese Variante jedoch nur bei einer Kontrollperson (0,4%;

1/230) nachgewiesen. Daher müsste diese Variante vor CP schützen, jedoch scheint

der Effekt dieser Variante für den Schutz vor CP eher vernachlässigbar.

Darüberhinaus kann diskutiert werden ob die Variante c.126+1G>A trotz ihrer Lage

keinen Funktionsverlust von CTSL bedingt, oder der Funktionsverlust von CTSL

phänotypisch keine pathologischen Konsequenzen hat.

32

Die dritte identifizierte nicht-synonyme Variante (c.915A>C, p.E305D) bedingt an

Position 305 des CTSL1 einen Aminosäureaustausch von Glutamin- zu

Asparaginsäure. Dieser Austausch könnte ebenfalls zu einem Funktionsverlust von

CTSL führen. Da diese Variante nur bei einer Kontrolle gefunden wurde und es sich

in diesem Fall um einen Austausch von chemisch sehr ähnlichen Aminosäuren

handelt, scheint ein relevanter Ausfall der CTSL-Funktion eher unwahrscheinlich.

Auch diese Variante müsste vor CP schützen, da sie lediglich bei einer Kontrolle

gefunden wurde.

Summiert man die nicht-synonymen Varianten bei Kontrollen (0,9%, 2/230) und bei

Patienten (0,5%, 1/218) zeigt sich kein statistisch signifikanter Unterschied in der

Verteilung der Varianten bei Patienten und Kontrollen. Ebenso wird die Schwierigkeit

der Interpretation der im Tiermodell erhobenen Daten verdeutlicht, da nicht-

synonyme Varianten bei Kontrollen und Patienten gefunden wurden. Bei

experimentell induzierter Pankreatitis zeigte sich im Tiermodell bei Ctsl-/- Mäusen ein

milderer Verlauf der Pankreatitis bei erhöhter Trypsinaktivität. Dieser Effekt wurde

durch eine vermehrte Apoptose anstelle von Nekrose erklärt. Demzufolge könnten

Varianten, die zu einem Funktionsverlust des CTSL (wie möglicherweise

c.126+1G>A oder p.E305D) führen, vor der Entstehung einer CP schützen

beziehungsweise den Verlauf einer akuten Pankreatitis mildern. Andererseits

müssten Varianten, die eine Funktionszunahme bedingen (wie möglicherweise

p.N2T) zur CP prädisponieren oder den Verlauf einer akuten Pankreatitis negativ

beeinflussen. Kompliziert wird diese Modellvorstellung durch die Tatsache, dass

möglicherweise Varianten mit einem Funktionsverlust nur bis zu einem bestimmten

Schwellenwert schützend wirken, da die fehlende Trypsin Inaktivierung zu vermehrter

Apoptose anstelle von Nekrose führt. Wird diese Schwelle jedoch überschritten,

sprich zu viel Trypsin aktiv, könnte es zu einer CP oder einer schwer verlaufenden

akuten Pankreatitis kommen.

Trotz der schwierigen Datenlage bezüglich der möglichen funktionellen

Konsequenzen der gefundenen nicht-synonymen Varianten, scheint eine genetische

Assoziation von CTSL1-Varianten zur CP unwahrscheinlich. Selbst eine Ausdehnung

des untersuchten Kollektivs wird, aus unserer Sicht, keinen zusätzlichen Nutzen

bringen, da die Datenlage gegen eine Rolle von CTSL1 Varianten bei CP spricht.

Neben den nicht-synonymen Varianten wurden noch weitere synonyme und im

Promoter bzw. Intron lokalisierte seltene Varianten detektiert.

33

Summiert man diese Varianten bei Patienten (3,2%, 7/218) und bei Kontrollen (1,3%,

3/230) sind diese häufiger bei Patienten zu finden, jedoch ist der Unterschied in der

Verteilung nicht statistisch signifikant. Aufgrund der Häufigkeit und der Lage der

Varianten im CTSL1 scheint es unwahrscheinlich, dass eine funktionelle Relevanz

besteht. Auch die Summation aller seltenen Varianten bei Patienten (3,7%, 8/218)

und bei Kontrollen (2,2%, 5/230) erbrachte keinen statistisch signifikanten

Unterschied in der Verteilung.

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse keine Assoziation von seltenen nicht-

synonymen und/oder synonymen CTSL1-Varianten mit der CP.

6.2 Häufige Varianten des CTSL1

Neben den seltenen Varianten konnten im untersuchten Bereich acht weitere

Varianten mit einer Allelfrequenz des selteneren Allels von über einem Prozent

nachgewiesen werden. Diese Varianten wurden als häufige CTSL1-Varianten

bezeichnet. Bei zwei dieser Varianten (c.126+31C>T, rs2274611; c.902+195A>C,

rs3128510) fiel ein Unterschied in der Verteilung bei Patienten und Kontrollen auf.

Bei der c.126+31C>T Variante war der CT-Genotyp häufiger bei Patienten (51,8%,

113/218) als bei Kontrollen (40,9%, 94/230) zu finden, wohingegen der TT-Genotyp

häufiger bei Kontrollen (28,7%, 66/230) als bei Patienten (19,7%, 43/218) zu finden

war. Für diese Variante konnte in der Berechnung mittels Fisher-Exact Test in einem

rezessiven Modell (CC+CT vs. TT) ein signifikanter p-Wert berechnet werden

(p=0,03). Da insgesamt acht Varianten untersucht wurden, ist eine Korrektur

notwendig, welche wir nach Bonferroni durchführten. Hiernach ergab sich kein

signifikanter p-Wert. Ähnliches zeigte sich für die Variante c.902+195A>C. Hier

wurde der AC-Genotyp häufiger bei Patienten (51,7%, 104/201) als bei Kontrollen

(40,5%, 85/210) gefunden, wohingegen der CC-Genotyp häufiger bei Kontrollen

(30%, 63/210) als bei Patienten (20,9%, 42/201) nachgewiesen wurde. Auch hier

zeigte sich im rezessiven Modell (AA+AC vs. CC) ein signifikanter p-Wert (p=0,04),

der nach Bonferroni Korrektur keinen Bestand hatte. Betrachtet man die

ursprünglichen p-Werte für beide Varianten (p=0,03; p=0,04) erkennt man, dass die

initial beschriebene Signifikanz schwach war. Dies bestätigt aus unserer Sicht die

nach der Korrektur fehlende Assoziation zur CP. Alle übrigen Varianten zeigten eine

34

ähnliche Verteilung bei Patienten und Kontrollen. Ebenso waren in den statistischen

Auswertungen keine signifikanten p-Werte zu berechnen.

Zur weiteren Abklärung einer Assoziation eines Allels der häufigen Varianten wurde

eine Analyse der Allelfrequenzen durchgeführt. Hier zeigte ebenfalls keine der

Varianten einen signifikanten Unterschied in der Verteilung. Dies galt auch für die

Varianten c.126+31C>T und c.902+195A>C.

6.3 Hardy-Weinberg Gleichgewicht

Bei der Berechnung des Hardy-Weinberg-Equillibrium stellten wir bei den Kontrollen

für die Varianten c.126+31C>T (rs2274611) und c.402G>A ((p(.=))) eine

Abweichung des Gleichgewichts (p<0,05) fest. Bei der c.126+31C>T Variante

errechnete sich dabei aus den Genotypvarianten (CC: 70/230, 30,4%; CT: 94/230,

40,9% und TT: 66/230, 28,7%) ein Wert von p=0,0057. Dieser SNP ist bereits in der

HapMap Datenbank hinterlegt. Aus der Genotypverteilung dieses SNPs, welcher

bereits bei 113 Europäern aus der Population HapMap-CEU, ss52074640 (National

Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov) (CC: 35,4%, CT: 40,7%

und TT: 23,9%) nachgewiesen wurde, errechnete sich für dieses Kollektiv in Bezug

auf das Hardy-Weinberg-Equilibrium ein p-Wert von 0,0597. Somit zeigte sich auch

in diesem Kollektiv nur ein grenzwertig eingehaltenes Hardy-Weinberg-Equilibrium

und die angegebenen Prozentzahlen wichen nur geringfügig von den von uns

erhobenen Werten ab.

Die zweite Variante die nicht im Hardy-Weinberg Gleichgewicht lag (c.402G>A)

zeigte einen p-Wert von 0,0074. Diese Abweichung wird durch die zufällig

aufgetretene, doppelte Detektierung des homozygoten Genotyps (c.402AA) für die

Variante erklärt. Dieser Fehler ist ebenfalls in der geringen Anzahl der Kontrollen zu

suchen.

Um methodische Fehler gering zu halten, haben wir eine ständige Qualitätskontrolle

bei unseren genetischen Analysen implementiert. Hierzu werden je 96er Platte

neben sechs Wasserkontrollen an fünf Positionen Qualitätskontrollen auf die Platten

pipettiert. Hierbei handelt es sich um Proben die an anderer Stelle ein zweites Mal

auf der jeweiligen Platte zu finden sind. Somit überprüfen wir bei 5,6% der Proben

(5/90) ob das Ergebnis der Genotypisierung stimmt. Bei der Analyse des CTSL1

zeigte sich für alle Qualitätskontrollen ein identisches Ergebnis im Vergleich zur

35

Vergleichsprobe. Daher ist davon auszugehen, dass bei den Varianten, die nicht im

Hardy-Weinberg Gleichgewicht sind die Probengröße zu klein war und somit ein

zufälliger Fehler besteht. Da die Aussage der Ergebnisse durch eine Ausdehnung

der analysierten Kontrollen für diese Varianten (c.126+31C>T, c.402G>A) mit hoher

Wahrscheinlichkeit nicht verändert werden, wurde von weiteren Analysen

abgesehen.

6.4 Haplotypen-Analyse

Unter Einbeziehung der häufigen Varianten wurden Haplotypen berechnet.

Insgesamt konnten 13 Haplotypen identifiziert werden. Fünf der identifizierten

Haplotypen machen über 96% der gesamten identifizierten Haplotypen aus. Bei der

Verteilung der Haplotypen zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied

zwischen Patienten und Kontrollen. Da die Haplotypen aus den häufigen Varianten

berechnet wurden und sich bei diesen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede

zwischen Patienten und Kontrollen zeigten, konnte dieses Ergebnis erwartet werden.

Dennoch ist die Berechnung der Haplotypen sinnvoll, weil durch sie zusätzliche

Informationen über die Vererbung des Genabschnitts auf dem CTSL1 lokalisiert ist,

erhalten werden. Im menschlichen Genom findet sich alle 100-300 Basenpaare ein

Austausch von Basen. Diese sind in den meisten Fällen ohne funktionelle Relevanz.

Da das menschliche Genom in sogenannten Haplotyp-Blöcken vererbt wird, kann die

Information dieser SNPs genutzt werden Hinweise auf mögliche funktionell relevante

Varianten innerhalb einer Region zu bekommen. Die von uns untersuchten

Haplotypen umfassten vom Promoter des CTSL1 bis hin zur 3’-Region Varianten, so

dass die Region umfangreich abgebildet wurde. Dementsprechend konnte auch

durch dieses Verfahren keine Assoziation von Varianten des CTSL1 mit der CP

beschrieben werden.

6.5 Promoter-Varianten des CTSL1 und deren funktionelle Konsequenz

In den letzten Jahren wurde in mehreren Studien die Regulation der Transkription

des CTSL1 untersucht. In einer 2001 veröffentlichten Arbeit wurden drei

verschiedene menschliche Cathepsin L Formen nachgewiesen, die sich in der Länge

des Exons 1 unterscheiden (hCTSL1-A 278 Nukleotide; hCTSL1-A2 188 Nukleotide;

hCTSL1-A3 132 Nukleotide), wobei die kürzeste Variante am häufigsten gefunden

36

wird (Abudula et al., 2001). Ebenso zeigte sich bei dieser Variante die höchste CTSL

Aktivität. Unsere Analysen deckten diese Variante ab, wohingegen wir die UTR-

Region („untranslated region“) im 5’-Bereich nicht untersuchten. Daher ist es möglich,

dass in diesem Bereich der 5’-Region regulatorische Varianten vorliegen, die die

Expression des CTSL1 beeinflussen und mit der CP assoziiert sind. Da unsere

Haplotypen Analyse zu einem Teil die 5’-Region mit abdeckt, scheint dies jedoch

unwahrscheinlich. Ebenso sind in der Literatur bisher keine Varianten in dieser

Region beschrieben, die mit Erkrankungen assoziiert sind.

Regulatorische Elemente im Promoter des CTSL1 scheinen im Bereich -1489 bis -

1646 „upstream“ des Translationsbeginns zu liegen (Jean et al., 2002). Hier konnten

in einer Arbeit zwei „GC-Boxen“ und ein „CCAAT-Motiv“ nachgewiesen werden, die

Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren darstellten (Sp1, Sp3, Nuclear factor Y).

Wie bereits erwähnt, könnten auch in diesem Bereich genetische Veränderungen die

Transkription des CTSL1 beeinflussen. Aus unserer Sicht scheint dies aber

unwahrscheinlich.

6.6 Ausblick

Als Mechanismus, welcher der Pankreatitis zugrunde liegt, wird eine

Selbstverdauung durch intrapankreatisch aktivierte Verdauungsenzyme

angenommen. Unter physiologischen Bedingungen ist das Pankreas durch eine

Vielzahl von Mechanismen geschützt. Dazu gehört beispielsweise die separate

Speicherung von Verdauungsenzymen als inaktive Zymogene in Vesikeln, das

Vorkommen von Proteaseinhibitoren wie SPINK1 oder die lokale Trennung des im

Duodenum vorkommenden, physiologischen Trypsinaktivator Enterokinase vom

Pankreas.

Eine besondere Rolle bei der Entstehung einer CP wird der Aktivierung von

Trypsinogen beigemessen, da es in der Lage ist, auch andere proteolytisch wirksame

Enzyme zu aktivieren. Wichtige Gene, die bereits in Zusammenhang mit CP und

erhöhter intrapankreatischer Trypsinaktivität gebracht werden konnten, sind PRSS1, ,

SPINK1 und CTRC.

Ein weiterer Mechanismus scheint die Aktivierung von Trypsinogen durch das

lysosomale Enzym CTSB zu sein. Dieser konnte sowohl in vitro als auch in vivo

37

bestätigt werden und soll bei Ctsb-/- Mäusen zu einem verminderten Schweregrad

der Pankreatitis führen.

Eine Voraussetzung für die Trypsinogenaktivierung ist eine Kolokalisation von in

Vesikeln befindlichen Zymogenen und lysosomalen CTSB. In der Theorie geht man

davon aus, dass die Kolokalisation als krankheitsauslösender Effekt gelten könnte,

welcher in der Frühphase der Pankreatitis zur Zymogenaktivierung und Schädigung

der Azinuszellen führt. Dieser Vorgang ist beim Menschen leider nicht zu

untersuchen, da beim Patienten mit akuter Pankreatitis erst nach dieser frühen

Phase, in welcher die Kolokalisation stattfinden sollte, Symptome auftreten. Die

Kolokalisation wurde daher in vielen Studien anhand von Tiermodellen untersucht.

Sie konnte dabei in unterschiedlichen Tiermodellen unabhängig von der induzierten

Pankreatitisart in der Frühphase, noch bevor eine Zellverletzung/Nekrose auftrat,

nachgewiesen werden. In diesen Studien konnte man drei wesentliche Mechanismen

identifizieren, die zu einer Kolokalisation führten: (1) Verschmelzung von

Zymogengranula mit Lysosomen und (2) defekte Sortierung von lysosmalen

Proteasen und Zymogenen im Golgi-Apparat sowie (3) Wiederaufnahme von bereits

sezernierten Verdauungsenzymen über Endozytose in die Azinuszelle und

anschließender Verschmelzung mit Lysosomen.

Das Zustandekommen der Kolokalisation ist in Abbildung 5 schematisch dargestellt

und zeigt somit neue Möglichkeiten auf, die die Entstehung einer Pankreatitis

erklären könnten.

38

Abbildung 5: Schematische Darstellung einer Azinuszelle mit physiologischen und pathologischen Mechanismen der Kolokalisation von Zymogenen und Proteasen. Kolokalisation kann zustande kommen durch eine (1) Falschverteilung von Zymogenen und lysosomalen Proteasen im Golgi-Apparat und durch (2) Fusion von Zymogengranula und Lysosomen sowie durch (3) Wiederaufnahme von bereits sezernierten Zymogenen in Lysosomen. Im Zentrum der Darstellung befindet sich die rupturierte Vakuole (RV) mit freigesetzten, aktivierten Verdauungsenzymen. (ER=endoplasmatisches Retikulum, N=Nukleus, LYS=Lysosomen, KV=kondensierende Vakuolen und ZG=Zymogengranula) Die Abbildung wurde nach Vorlage von Acker et al. modifiziert (van Acker et al., 2006).

Für CTSB konnte in genetischen Studien keine Assoziation nachgewiesen werden.

Daher war es naheliegend die am zweithäufigsten vorkommende Protease CTSL

genetisch näher zu charakterisieren, da interessante funktionelle Daten vorlagen.

Unsere umfangreiche Analyse spricht gegen eine Rolle von CTSL1 Varianten bei der

Pathogenese der CP.

Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre mit Entwicklung der Ko-

Lokalisationstheorie zeigen eindrucksvoll auf, dass die Entstehung einer Pankreatitis

möglicherweise auf vielen Wegen erfolgen kann. Andererseits ist es denkbar, dass

manche Mechanismen, die in den letzten Jahren untersucht wurden, für die

Krankheitsentstehung nicht relevant sind, weil sie möglicherweise durch andere

Mechanismen kompensiert werden können.

Interessanterweise zeigte sich im Tiermodell bei Mäusen mit erhöhter

intrapankreatischer Trypsinaktivität keine CP, sondern eine vermehrte Apoptose und

Zeichen einer akuten Pankreatits (Gaiser et al., 2011). Auch wenn die genetischen

39

Daten des Menschen auf eine zentrale Rolle des Trypsin und den Abbau frühzeitig

aktivierten Trypsin hindeuten, könnten andere Mechanismen die Entstehung der

Erkrankung mit beeinflussen. So könnte es beispielsweise zur fehlerhaften Bildung

von Zymogengranula kommen, die zu einer intrapankreatischen Freisetzung und

Aktivierung von Trypsinogen führt. Auch die verschiedenen an der Ko-Lokalisation

von Zymogenen und Proteasen beteiligten Proteine stellen interessante Kandidaten

dar. In der Zukunft wird die größte Schwierigkeit sicherlich weiterhin darin liegen,

dass nahezu alle funktionellen Daten nur in artifiziellen in vitro oder in in vivo

Modellen erhoben werden können, weil eine Untersuchung am Menschen oder an

menschlichem Gewebe kaum möglich ist.

Zusammengefasst wurden in unserer Studie keine signifikanten Unterschiede in der

Genotypverteilung von CTSL1-Varianten zwischen Patienten mit idiopathischer oder

hereditärer Pankreatitis im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen nachgewiesen.

Die Arbeit konnte somit keine Assoziation zwischen einem Funktionsverlust des

CTSL1 und der CP unterschiedlicher Ätiologie herstellen.

40

7 Zusammenfassung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor medicinae (Dr. med.)

Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer Pankreatitis

eingereicht von: Max Herms

angefertigt am: Department für Innere Medizin, Neurologie und Dermatologie,

Klinik und Poliklinik für Gastroenterologie und Rheumatologie

Universitätsklinikum Leipzig AöR

Klinikdirektor Prof. Dr. med. Joachim Mössner

betreut von: Prof. Dr. med. Joachim Mössner

mitbetreut von: Dr. med. Jonas Rosendahl

eingereicht: 10/2011

Als chronische Pankreatitis (CP) bezeichnet man eine wiederkehrende, entzündliche

Erkrankung des Pankreas, welche in eine endokrine und/oder exokrine Insuffizienz

münden kann. Häufigster Auslöser einer CP ist in den westlichen Industriestaaten die

toxische Wirkung des Alkoholabusus, wobei der Pathomechanismus der

Krankheitsentstehung nicht verstanden ist. Neben den Umwelteinflüssen konnten in

den letzten Jahrzehnten mehrere Kandidatengene, die zur Entstehung einer CP

prädisponieren, identifiziert werden. Zu diesen Genen zählen das PRSS1, SPINK1,

CFTR und CTRC. Eine protektive Variante wurde im PRSS2 beschrieben. Bei der

Entstehung einer genetisch bedingten CP scheint eine frühzeitige, intrapankreatische

Aktivierung von Trypsin entscheidend zu sein. Diese führt zu einer Verschiebung des

Gleichgewichts von Proteasen und Anti-Proteasen zu Gunsten der Proteasen,

woraus eine Selbstverdauung des Organs resultiert.

Auch das Cathepsin B (CTSB), eine in Lysosomen vorkommende Protease, kann

Trypsinogen zu Trypsin aktivieren. Eine genetische Assoziation mit einer CTSB-

Variante (p.L26V) wurde lediglich bei Patienten mit tropisch-kalzifizierender CP

beschrieben und konnte bei kaukasischen Patienten mit idiopathischer CP nicht

41

bestätigt werden. Bei der Analyse der neben CTSB am zweithäufigsten

vorkommenden lysosomalen Protease Cathepsin L (CTSL) zeigte sich, dass diese

durch Spaltung des Trypsinogens ein inaktives Trypsin freisetzt. Im Mausmodell

wurden bei Ctsl-/- Tieren bei experimentell induzierter Pankreatitis zwei wesentliche

Effekte nachgewiesen. Zum einen resultierte eine erhöhte Trypsinaktivität, zum

anderen verlief die Pankreatitis, aufgrund einer vermehrt auftretenden Apoptose der

Azinuszellen und fehlender Nekrose, milder. Aufgrund der funktionellen Daten stellte

das CTSL1 ein interessantes Kandidatengen dar, welches potentiell protektive

Varianten bei Kontrollen („loss of function“) oder schädigende Varianten bei

Patienten („loss of function“) aufweisen könnte. Bei Patienten müssten Varianten, die

mit einer Abnahme der Funktion einhergehen, zu einer Überschreitung eines

Schwellenwertes von Trypsin führen. Diese könnte dann durch andere Mechanismen

nicht mehr ausreichend „gepuffert“ werden. Andererseits könnten Varianten bei

Patienten, die zu einer Zunahme der Funktion des CTSL führen („gain of function“)

vor CP schützen (vermehrter Trypsinogen Abbau zu inaktivem Trypsin).

In dieser Arbeit wurde mittels uni-direktionaler DNA-Sequenzierung der gesamte

kodierende Bereich als auch die Exon-Intron Übergänge des CTSL1 untersucht.

Dabei wurden insgesamt drei seltene nicht-synonyme Varianten mit möglicher

funktioneller Relevanz nachgewiesen. Die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750)

fanden wir bei einem Patienten. Sie führt zu einem Aminosäureaustausch von

Asparagin zu Threonin an der zweiten Position von CTSL. Da diese Variante bereits

bei Kontrollen beschrieben wurde (rs112682750) dürfte sie für die Entstehung einer

CP keine Relevanz haben. Die Varianten c.126+1G>A und c.915A>C (p.E305D)

konnten wir bei jeweils einer Kontrolle nachweisen. Erstere befindet sich im Bereich

einer hochkonservierten Splice-Site und könnte somit auf die korrekte Prozessierung

der mRNA Einfluss haben. Die c.915A>C Variante führt zu einem

Aminosäureaustausch von Glutamin- zu Asparaginsäure an Position 305 des CTSL.

Hierdurch erfolgt ein Austausch chemisch sehr ähnlicher Aminosäuren, so dass

diese Variante wahrscheinlich keine funktionelle Relevanz aufweist. Neben den

seltenen nicht-synonymen Varianten wurden acht seltene synonyme oder im nicht

kodierenden Bereich gelegene Varianten identifiziert. Keine der seltenen Varianten

wies einen statistisch signifikanten Unterschied in der Verteilung zwischen Patienten

und Kontrollen auf. Auch der Vergleich der aufsummierten seltenen Varianten war

statistisch in beiden Gruppen nicht unterschiedlich.

42

Bei den Varianten mit einer Allelfrequenz des selteneren Allels von mehr als einem

Prozent zeigten sich bei den acht identifizierten Varianten (c.126+31C>T

(rs2274611), c.902+195A>C (rs3128510), c.-43C>G (rs10123692), c.402G>A

((p(.=))), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A , c.622-172T>C

(rs2296958)) sowohl für die Genotypverteilung, die Allelfrequenz, als auch für die

anhand dieser Varianten berechneten Haplotypen keine signifikanten

Verteilungsunterschiede zwischen Patienten und Kontrollen.

Somit können wir schlussfolgern, dass unsere umfangreiche genetische Analyse von

Varianten des CTSL1 keine Assoziation mit der Entstehung einer CP zeigt.

43

8 Literaturverzeichnis

Abudula A, Rommerskirch W, Weber E et al. Splice variants of human Cathepsin L

mRNA show different expression rates. Biol Chem. 2001;382(11):1583–1591.

Alcalay NI, Sharma M, Vassmer D et al. Acceleration of polycystic kidney disease

progression in cpk mice carrying a deletion in the homeodomain protein Cux1. Am J

Physiol Renal Physiol. 2008 Dec;295(6):F1725-34. Epub 2008 Oct 1.

Ammann RW, Buehler H, Muench R et al. Differences in the natural history of

idiopathic (nonalcoholic) and alcoholic chronic pancreatitis. A comparative long-term

study of 287 patients. Pancreas. 1987;2(4):368-77.

Ammann RW. A clinically based classification system for alcoholic chronic

pancreatitis: summary of an international workshop on chronic pancreatitis.

Pancreas. 1997 Apr;14(3):215-21.

Ammann RW. Diagnosis and management of chronic pancreatitis: current

knowledge. Swiss Med Wkly. 2006 Mar 18;136(11-12):166-74.

Atlas AB, Orenstein SR, Orenstein DM. Pancreatitis in young children with cystic

fibrosis. J Pediatr. 1992 May;120(5):756-9. Erratum in: J Pediatr 1992

Aug;121(2):329.

Audrézet MP, Chen JM, Le Maréchal C et al. Determination of the relative

contribution of three genes-the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

gene, the cationic trypsinogen gene, and the pancreatic secretory trypsin inhibitor

gene-to the etiology of idiopathic chronic pancreatitis. Eur J Hum Genet. 2002

Feb;10(2):100-6.

Bhatia E, Choudhuri G, Sikora SS et al. Tropical calcific pancreatitis: strong

association with SPINK1 trypsin inhibitor mutations. Gastroenterology. 2002

Oct;123(4):1020-5.

44

Chandak GR, Idris MM, Reddy DN et al. Mutations in the pancreatic secretory trypsin

inhibitor gene (PSTI/SPINK1) rather than the cationic trypsinogen gene (PRSS1) are

significantly associated with tropical calcific pancreatitis. J Med Genet. 2002

May;39(5):347-51.

Cohn JA, Friedman KJ, Noone PG et al. Relation between mutations of the cystic

fibrosis gene and idiopathic pancreatitis. N Engl J Med. 1998 Sep 3;339(10):653-8.

Colomb E, Figarella C. Comparative studies on the mechanism of activation of the

two human trypsinogens. Biochim Biophys Acta. 1979 Dec 7;571(2):343-51.

Colomb E, Guy O, Deprez P et al. The two human trypsinogens: catalytic properties

of the corresponding trypsins. Biochim Biophys Acta. 1978 Jul 7;525(1):186-93.

Comfort MW & Steinberg AG. Pedigree of a family with hereditary chronic relapsing

pancreatitis. Gastroenterology 1952; 21: 54–63.

Deal C. Potential new drug targets for osteoporosis. Nat Clin Pract Rheumatol.

2009;5(1):20–27.

Drenth JP, te Morsche R, Jansen JB. Mutations in serine protease inhibitor Kazal

type 1 are strongly associated with chronic pancreatitis. Gut. 2002 May;50(5):687-92.

Faul C, Donnelly M, Merscher-Gomez S et al. The actin cytoskeleton of kidney

podocytes is a direct target of the antiproteinuric effect of cyclosporine A. Nat Med.

2008 Sep;14(9):931-8.

Figarella C, Miszczuk-Jamska B, Barrett AJ. Possible lysosomal activation of

pancreatic zymogens. Activation of both human trypsinogens by cathepsin B and

spontaneous acid. Activation of human trypsinogen 1. Biol Chem Hoppe Seyler. 1988

May;369 Suppl:293-8.

Friedrichs B, Tepel C, Reinheckel T et al. Thyroid functions of mouse cathepsins B,

K, and L. J Clin Invest. 2003 Jun;111(11):1733-45.

45

Frulloni L, Gabbrielli A, Pezzilli R et al. Chronic pancreatitis: report from a multicenter

Italian survey (PanCroInfAISP) on 893 patients. Dig Liver Dis. 2009 Apr;41(4):311-7.

Epub 2008 Dec 20.

Funkelstein L, Toneff T, Mosier C et al. Major role of cathepsin L for producing the

peptide hormones ACTH, beta-endorphin, and alpha-MSH, illustrated by protease

gene knockout and expression. J Biol Chem. 2008 Dec 19;283(51):35652-9. Epub

2008 Oct 10.

Gaiser S, Daniluk J, Liu Y et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic

mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 2011 Oct;60(10):1379-88. Epub

2011 Apr 6.

Goulet B, Baruch A, Moon NS et al. A cathepsin L isoform that is devoid of a signal

peptide localizes to the nucleus in S phase and processes the CDP/Cux transcription

factor. Mol Cell. 2004 Apr 23;14(2):207-19.

Greenbaum LM, Hirshkowitz A, Shoichet I. The activation of trypsinogen by cathepsin

B. J Biol Chem. 1959 Nov;234:2885-90.

Halangk W, Lerch MM, Brandt-Nedelev B et al. Role of cathepsin B in intracellular

trypsinogen activation and the onset of acute pancreatitis. J Clin Invest. 2000

Sep;106(6):773-81.

Hassan Z, Mohan V, Ali L et al. SPINK1 is a susceptibility gene for fibrocalculous

pancreatic diabetes in subjects from the Indian subcontinent. Am J Hum Genet. 2002

Oct;71(4):964-8. Epub 2002 Aug 16.

Hoffmeiter A., Mössner J. Chronische Pankreatitis. Deutsche Medizinische

Wochenschrift 2008; 133:415–426

Honey K, Rudensky AY. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen

presentation. Nat Rev Immunol. 2003;3(6):472–482.

46

Jean D, Guillaume N, Frade R. Characterization of human cathepsin L promoter and

identification of binding sites for NF-Y, Sp1 and Sp3 that are essential for its activity.

Biochem J. 2002; 361(pt 1):173–184.

Keim V. Identification of patients with genetic risk factors of pancreatitis: impact on

treatment and cancer prevention. Dig Dis. 2003;21(4):346-50. Review.

Kirschke H, Barrett AJ. Cathepsin L-a lysosomal cysteine proteinase. Prog Clin Biol

Res. 1985;180:61-9.

Kuwata K, Hirota M, Shimizu H et al. Functional analysis of recombinant pancreatic

secretory trypsin inhibitor protein with amino-acid substitution. J Gastroenterol.

2002;37(11):928-34.

Lal A, Lal DR. Hereditary pancreatitis. Pediatr Surg Int. 2010 Dec;26(12):1193-9.

Epub 2010 Aug 10.

Lankisch PG, Assmus C, Maisonneuve P et al. Epidemiology of pancreatic diseases

in Lüneburg County. A study in a defined german population. Pancreatology.

2002;2(5):469-77

Lankisch PG, Lowenfels AB, Maisonneuve P. What is the risk of alcoholic

pancreatitis in heavy drinkers? Pancreas. 2002 Nov;25(4):411-2.

Layer P, Yamamoto H, Kalthoff L et al. The different courses of early- and late-onset

idiopathic and alcoholic chronic pancreatitis. Gastroenterology. 1994

Nov;107(5):1481-7.

Lowenfels AB, Sullivan T, Fiorianti J et al. The epidemiology and impact of pancreatic

diseases in the United States. Curr Gastroenterol Rep. 2005 May;7(2):90-5.

Mahurkar S, Idris MM, Reddy DN et al. Association of cathepsin B gene

polymorphisms with tropical calcific pancreatitis. Gut. 2006 Sep;55(9):1270-5. Epub

2006 Feb 21.

47

Maisonneuve P, Lowenfels AB, Müllhaupt B et al. Cigarette smoking accelerates

progression of alcoholic chronic pancreatitis. Gut. 2005 Apr;54(4):510-4.

Masson E, Chen JM, Scotet V et al. Association of rare chymotrypsinogen C (CTRC)

gene variations in patients with idiopathic chronic pancreatitis. Hum Genet. 2008

Feb;123(1):83-91. Epub 2008 Jan 3.

Müllhaupt B, Truninger K, Ammann R. Impact of etiology on the painful early stage of

chronic pancreatitis: a long-term prospective study. Z Gastroenterol. 2005

Dec;43(12):1293-301.

Mullis K, Faloona F, Scharf S et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro:

the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt

1:263-73.

Puri N, Roche PA. Mast cells possess distinct secretory granule subsets whose

exocytosis is regulated by different SNARE isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A.

2008;105(7):2580–2585.

Raimondi S, Lowenfels AB, Morselli-Labate AM et al. Pancreatic cancer in chronic

pancreatitis; aetiology, incidence, and early detection. Best Pract Res Clin

Gastroenterol. 2010 Jun;24(3):349-58. Review.

Rawlings ND, Morton FR, Kok CY et al. MEROPS: the peptidase database. Nucleic

Acids Res. 2008 Jan;36(Database issue):D320-5. Epub 2007 Nov 8.

Reiser J, Adair B, Reinheckel T. Specialized roles for cysteine cathepsins in health

and disease. J Clin Invest. 2010 Oct 1;120(10):3421-31. doi: 10.1172/JCI42918.

Epub 2010 Oct 1. Review.

Reiser J, Oh J, Shirato I et al. Podocyte migration during nephrotic syndrome

requires a coordinated interplay between cathepsin L and alpha3 integrin. J Biol

Chem. 2004 Aug 13;279(33):34827-32. Epub 2004 Jun 14.

48

Rinderknecht H, Adham NF, Renner IG et al. A possible zymogen self-destruct

mechanism preventing pancreatic autodigestion. Int J Pancreatol. 1988 Jan-

Feb;3(1):33-44.

Rosendahl J, Witt H, Szmola R et al. Chymotrypsin C (CTRC) variants that diminish

activity or secretion are associated with chronic pancreatitis. Nat Genet. 2008

Jan;40(1):78-82. Epub 2007 Dec 2.

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.

Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7.

Schneider A, Suman A, Rossi L et al. SPINK1/PSTI mutations are associated with

tropical pancreatitis and type II diabetes mellitus in Bangladesh. Gastroenterology.

2002 Oct;123(4):1026-30.

Secknus R, Mössner J. [Changes in incidence and prevalence of acute and chronic

pancreatitis in Germany]. Chirurg. 2000 Mar;71(3):249-52. Review. German.

Sever S, Altintas MM, Nankoe SR et al. Proteolytic processing of dynamin by

cytoplasmic cathepsin L is a mechanism for proteinuric kidney disease. J Clin Invest.

2007 Aug;117(8):2095-104.

Sharer N, Schwarz M, Malone G et al. Mutations of the cystic fibrosis gene in patients

with chronic pancreatitis. N Engl J Med. 1998 Sep 3;339(10):645-52.

Shwachman H, Lebenthal E, Khaw KT. Recurrent acute pancreatitis in patients with

cystic fibrosis with normal pancreatic enzymes. Pediatrics. 1975 Jan;55(1):86-95.

Singer MV, Gyr K, Sarles H. Revised classification of pancreatitis. Report of the

Second International Symposium on the Classification of Pancreatitis in Marseille,

France, March 28-30, 1984. Gastroenterology. 1985 Sep;89(3):683-5.

49

Stephens M, Scheet P. Accounting for decay of linkage disequilibrium in haplotype

inference and missing-data imputation. Am J Hum Genet. 2005 Mar;76(3):449-62.

Epub 2005 Jan 31.

Stephens M, Smith NJ, Donnelly P. A new statistical method for haplotype

reconstruction from population data. Am J Hum Genet. 2001 Apr;68(4):978-89. Epub

2001 Mar 9.

Stoch SA, Wagner JA. Cathepsin K inhibitors: a novel target for osteoporosis

therapy. Clin Pharmacol Ther. 2008;83(1):172–176.

Szmola R, Sahin-Tóth M. Chymotrypsin C (caldecrin) promotes degradation of

human cationic trypsin: identity with Rinderknecht's enzyme Y. Proc Natl Acad Sci U

S A. 2007 Jul 3;104(27):11227-32. Epub 2007 Jun 25.

Teich N, Mössner J. Hereditary chronic pancreatitis. Best Pract Res Clin

Gastroenterol. 2008;22(1):115-30. Review.

Thrower EC, Gorelick FS, Husain SZ. Molecular and cellular mechanisms of

pancreatic injury. Curr Opin Gastroenterol. 2010 Sep;26(5):484-9. Review.

van Acker GJ, Perides G, Steer ML. Co-localization hypothesis: a mechanism for the

intrapancreatic activation of digestive enzymes during the early phases of acute

pancreatitis. World J Gastroenterol. 2006 Apr 7;12(13):1985-90. Review.

van Acker GJ, Saluja AK, Bhagat L et al. Cathepsin B inhibition prevents trypsinogen

activation and reduces pancreatitis severity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.

2002 Sep;283(3):G794-800.

Wartmann T, Mayerle J, Kähne T et al. Cathepsin L inactivates human trypsinogen,

whereas cathepsin L-deletion reduces the severity of pancreatitis in mice.

Gastroenterology. 2010 Feb;138(2):726-37. Epub 2009 Nov 10.

50

Weiss FU, Behn CO, Simon P et al. Cathepsin B gene polymorphism Val26 is not

associated with idiopathic chronic pancreatitis in European patients. Gut. 2007

Sep;56(9):1322-3.

Weiss FU, Simon P, Bogdanova N et al. Complete cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator gene sequencing in patients with idiopathic chronic

pancreatitis and controls. Gut. 2005 Oct;54(10):1456-60. Epub 2005 Jun 29.

Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA et al. Hereditary pancreatitis is caused by a

mutation in the cationic trypsinogen gene. Nat Genet. 1996 Oct;14(2):141-5.

Willstätter R, Bamann E. Über die Proteasen der Magenschleimhaut. Erste

Abhandlung über die Enzyme der Leukozyten. Hoppe-Seyler’s Z Physiol Chem.

1929;180(1–3):127–143.

Witt H, Luck W, Becker M et al. Mutation in the SPINK1 trypsin inhibitor gene, alcohol

use, and chronic pancreatitis. JAMA. 2001 Jun 6;285(21):2716-7.

Witt H, Luck W, Hennies HC et al. Mutations in the gene encoding the serine

protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. Nat Genet.

2000 Jun;25(2):213-6.

Witt H, Luck W, Hennies HC et al. Mutations in the gene encoding the serine

protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. Nat Genet.

2000 Jun;25(2):213-6.

Witt H, Sahin-Tóth M, Landt O, et al. A degradation-sensitive anionic trypsinogen

(PRSS2) variant protects against chronic pancreatitis. Nat Genet 2006;38:668-673.

Yadav D, Whitcomb DC. The role of alcohol and smoking in pancreatitis. Nat Rev

Gastroenterol Hepatol. 2010 Mar;7(3):131-45. Epub 2010 Feb 2. Review.

Yadav D. Recent advances in the epidemiology of alcoholic pancreatitis. Curr

Gastroenterol Rep. 2011 Apr;13(2):157-65. Review.

51

9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige

Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich

versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte

Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland

noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde

zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt

wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene

Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen

wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen

genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

…………………………… ……………………………

Datum Unterschrift

52

10 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Max Herms

Geburtsdatum 17. März 1984

Geburtsort Erlenbach am Main

Familienstand ledig

Schulausbildung

1990 – 1994 Besuch der Grundschule in Erlenbach am Main

1994 – 2001 Besuch des Julius-Echter-Gymnasiums in

Elsenfeld, mehrjährige Arbeit im Schülerrat,

Schulsprecher während eines Schuljahres

2001 – 2003 Besuch der Ernst-Göbel-Schule in Höchst im

Odenwald

11.06.2003 Abitur an der Ernst-Göbel-Schule in Höchst im

Odenwald (Durchschnittsnote 1,8)

Wehrersatzdienst

01.09.2003 - Zivildienst am Universitätsklinikum in Ulm,

30.06.2004 Chirurgische Intensivabteilung

Hochschulausbildung

10/2004 – 05/2011 Studium der Humanmedizin an der Universität

Leipzig

04.09.2006 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Note 3,0)

03.05.2011 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Note 2,5)

53

11 Danksagung

Für meine Doktorarbeit schulde ich sehr vielen Menschen einen herzlichen Dank!

Zuallererst gilt der größte Dank meinem Betreuer Dr. med. Jonas Rosendahl für sein

unermüdliches Engagement mir und gegenüber seinen anderen Doktoranden, seiner

ständigen Motivation sowie gewissenhaften Korrektur. Auch seine Unterstützung

bezüglich anderen, nicht medizinischen Themen macht ihn zu einem Freund und

Mentor, wie man ihn sich nur wünschen kann.

Ein ganz besonderer Dank gilt Frau Claudia Ruffert für ihre geduldige Einweisung in

die medizinische Laborarbeit, konstruktive Kritik und unentwegte Hilfe. Auch für die

angenehme Arbeitsatmosphäre möchte ich ihr, den übrigen Mitarbeiten des Labors

sowie meinen Mitdoktoranden Moritz Jesinghaus und Robert Schober danken.

Herrn Prof. Dr. med. Joachim Mössner, Klinikdirektor der Klinik und Poliklinik für

Gastroenterologie und Rheumatologie, in dessen Abteilung diese Promotion

durchgeführt wurde, danke ich für die freundliche Unterstützung.

Nicht zuletzt gilt ein ganz großer Dank meiner gesamten Familie, insbesondere

meinen Eltern Andrea Herms (geb. Pfaff) und Prof. Dr. med. Volker Herms. Für die

stetige Unterstützung und dafür, dass sie mir immer ein Vorbild waren und sind,

möchte ich ihnen diese Arbeit als Dank widmen. Auch meiner Schwester Lena

Herms und meiner Freundin Caroline Michalski danke ich für ihre Hilfe und die vielen

anregenden und aufmunternden Gespräche.