Upload
selma-salihovic
View
355
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
Kolegij Genetiko inenjerstvo
Genska terapija 1. diodoc. dr. sc. Gordana Maravi Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakultetaGM2005
Genska terapijaPrijenos terapeutskog gena u oboljelo tkivo Vie vrsta:Transplantacija gena (kod delecija) Korekcija gena (ispravljanje mutacije) Poveavanje ekspresije ciljnog gena Ciljano unitenje pojedinih stanica unosom gena ubojice Ciljana inhibicija genske ekspresijeGM2005
Bolesti kod kojih se moe primijeniti genska terapijaBolestTeka kombinirana imunodeficijencija Hemofilija Cistina fibroza Rak Neuroloke bolesti Kardiovaskularne bolesti Autoimune bolesti Infektivne bolesti
DefektAdenozin-deaminaza 4 Faktor VIII, IX Gubitak gena CFTR Vie uzroka Parkinson, Alzheimer Ateroskleroza Dijabetes AIDS, hepatitis B
CIljna stanicaStanice kotane sri, Tlimfociti Jetra, mii, fibroblasti Zrani jastuii - plua Vie tipova stanica Izravno u mozak Endotel krvnih ila MHC, 2-mikroglobulin T-limfociti, makrofagiGM2005
Problemi s genskom terapijomKratkotrajnaVrlo teko je postii dugotrajan uinak bez integracije u genom, a ak i tada
Imuni odgovorReducira uinkovitost, onemoguava opetovanu terapiju
Problemi s virusnim vektorimaToksinost, imuni i upalni odgovor, mogunost povratka sposobnosti za izazivanje bolesti
Viegenske bolestiKombinirani uinak vie gena teko lijeenjeGM2005
Klinika ispitivanja genske terapijeInfektivne bolesti 13 % Ostalo 2% Markiranje gena 7%
Ljudi
Monogenske bolesti 9%
Rak 69%GM2005
Dva tipa genske terapijein vivo ex vivo
GM2005
GT ex vivo
GM2005
GT in vivo vs. ex vivoin vivoGenetiki materijal unosi se izravno u tijelo pacijenta Prilino nasumian proces, mala mogunost kontrole Jedina mogunost za tkiva koja se ne mogu uzgajati in vitro
ex vivoGenetiki materijal unosi se najprije u stanice u kulturi kontroliran proces, selekcija stanica s transgenom Stanice su obino autologne uzimaju se iz pacijenta i modificirane vraaju natrag GM2005
Nain unosa DNA ovisi o namjeni genske terapijeZamjena gena visoko uinkoviti virusni vektoriMonogenske bolesti cistina fibroza, teka kombinirana imunodeficijencija, hemofilija
Kratkotrajna ekspresija izravni unos DNApoticaj imunog odgovora
Prijenos putem liposoma uiniti stanice osjetljivijima za radioterapijuGM2005
Poeljna svojstva vektora za gensku terapijuVisoki titar (>108 estica/ml) Laka i reproducibilna metoda proizvodnje Precizno i stabilno uvoenje transgena Vektor ne bi smio inducirati imuni odgovor po unosu u organizam Kontrolirana ekspresija transgena (on/off sustav) regulatorni elementi unutar transgena Specifinost za pojedine tipove stanica2005 GM
Metode unosa terapeutskih konstrukata DNAUnos gole DNAJednostavnom iglom i pricom tumorsko tkivo Genskim pitoljem epiderma, neprikladno za tumore Unos liposomima dopremanje do ciljnog tkiva intravaskularnim, intratrahealnim, intraperitonealnim, intrakolonskim putem
Unos putem biolokih vektoraGenetiki modificirani virusi - ne mogu se replicirati u domainu Trenutno najuinkovitija metoda prijenosa DNA u genskoj terapijiGM2005
Unos gole DNAIntramuskularno, intravaskularno produena in vivo ekspresija niskog stupnja Jednostavno i jeftino, ali ne i univerzalno DNA vakcineInfektivne bolesti tradicionalne vakcine jo uvijek uinkovitije RakPoveanje postojeeg imuno-odgovora Poticaj imuno odgovora prema neprepoznatom ili slabo antigenom tumoru
Miina distrofija biolistika Cistina fibroza - liposomi
GM2005
DNA vakcina za malariju dananji pokuajiT-limfociti prepoznaju stanicu s parazitom malarije Proizvodnja INF- i stimulacija prezentacije antigena
GM2005
DNA vakcina za malariju imunoloki vane komponente patogenaNekoliko peptidnih epitopa koje prepoznaju Tlimfociti itavi protein TRAP (thrombospondin related adhesion protein)DNA vakcina koja kodira za imuno-prepoznatljiv produkt: poticaj imunolokog odgovora prikladnom prezentacijom antigenaGM2005
Biolistika primjenjiva i na stanicama sisavacaGenski pitolj plazmidna DNA se taloi na estice zlata ili volframa promjera 1-3 m Okidanje pod tlakom helija ili pod visokim naponom Snimka pod svjetlosnim elektronskim mikroskopom: estice zlata obavijene s DNA nakon upucavanja u kou
GM2005
Duchennova miina distrofijaX-vezana recesivna bolest, 1/3500 muke djece Odsutnost distrofina, membranskog proteina koji ini oko 0.01% proteina skeletnog miia Oslabljeni miii, gubitak miine mase Najprije zahvaeni miii udova i trupa invalidska kolica do 12. godine ivota Srana aritmija ili otkazivanje srca u 10% sluajeva Smrt u dobi od 10. do 20. godine ivota zbog plunih problemaGM2005
Normalni i MD mii
Detekcija distrofina monoklonskim protutijelima: miofibrili su obavijeni tamno obojenim distrofinom
Distrofina nema; Poveano vezivno tkivo; povean promjer miofibrilaGM2005
DistrofinPovezuje unutarstanini citoskelet i aktinske filamente s vanstaninim matriksom itavi kompleks stabilizira membranu Laminin 22 kongenitalna MD (k.6) Sarkoglikani 4 tipa MD Distrofin Duchennova i Beckerova MDGM2005
Duchennova miina distrofija: intramuskularni unos DNA biolistikomProblem gen za distrofin i mRNA su preveliki za unos putem vektoraNativni gen 2.4 Mb mRNA 14 kb
IDEJA: distrofin zadrava dio funkcije i kada mu nedostaje velik dio gena (Beckerov fenotip puno blai od potpune DMD)GM2005
Delecijske varijante distrofina za GT
ABD= actin-binding domains
Vei dio ponavljajuih sljedova nalik spektrinu moe se izostaviti da bi distrofin jo uvijek bio funkcionalan.Scott Harper et al., 2002.GM2005
GT s minigenom za distrofin u mievima s DMD fenotipomDMD mievi s preuranjenim stop kodonom u eksonu 23: nema distrofina!
tretirani GT
netretirani
GM2005
Rezultati 1. faze klinike studije genske terapije MD5. lipnja 2003. Francuska udruga miinih distrofiara i Transgene objavili su rezultate 1. faze klinikih ispitivanja genske terapije Duchennove i Beckerove miine distrofije 9 pacijenata u 3 skupine:Jedna injekcija 200 g plazmida s genom za distrofin Jedna injekcija 600 g plazmida s genom za distrofin 2 injekcije 2x600 g plazmida s genom za distrofin
Ispitani uzorci miia pokazuju:Ekspresija distrofina prisutna u 1-10% miinih vlakana za skupinu 1 i 2; potpuna ekspresija u skupini 3! Nema imune reakcije niti popratnih uinaka!!
GM2005
LiposomiNastaju spontanom agregacijom lipidnih molekula u vodenom okruju Kationski liposomi veu negativno nabijenu DNA Tako omotana DNA zatiena je od razgradnje Lipofektin, lipofektamin slue i za transfekciju stanica u kulturi Pozitivno nabijene lipidne glave
GM2005
Modificirani liposomiNedostatak jednostavnih liposoma - vrlo se brzo uklanjaju iz cirkulacije putem makrofaga iz jetre Dodatak povrinskih liganada smanjuje degradaciju liposoma:Monosijalogangliozidi Polioksietileni Kolesterol Glukuronska kiselina
Produljeni polu-ivot liposoma zbog reducirane opsonizacije (omatanja) proteinima iz plazmeGM2005
Kokleati vieslojni liposomiDugotrajna i jednostavna pohrana barem godinu dana kao liofilizirani prah na sobnoj temperaturi Trajne vezikule preivljavaju viestruke fuzije s membranom Preivljavanje u gastrointestinalnom traktu prikladni za oralnu primjenuliposom
kokleat
GM2005
ImunoliposomiZa aktivno usmjeravanje DNA Na povrini nose specifina protutijela Protutijela na unutarstanini miozin usmjeravaju imunoliposome na podruja sranog miia zahvaena infarktom Protutijela na molekule specifine za tumore usmjeravaju imunoliposome na stanice tumora
GM2005
Liposomi mogu posluiti kao tumor-specifine vezikule ak i bez posebnog usmjeravanjaLiposomi lake ulaze u krvne ile s oteenim endotelom tumorska tkiva
GM2005
Liposomi u genskoj terapijiNEDOSTACI PREDNOSTI potrebno 100Jeftiniji od virusnih 1000 puta vie vektora DNA da bi se Ne izazivaju imuni postigla ista odgovor uikovitost kao Iznimno prikladni kod virusnih za dopremu DNA u vektora plua putem nisu prikladni za aerosola cistina tretman mnogih fibroza bolesti
GM2005
Cistina fibrozaVrlo esta bolest u bijelaca (1 na 2000 roenih) Defekt u genu CFTRCystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
Nepravilno provoenje natrijevih i kloridnih iona u epitelnim stanicama mnogih organaZnojne lijezde previe slanog ekskreta Probavni sustav opstipacija Oteenje pankreasa dovodi do dijabetesa Gusti mukozni sekret u pluima osjetljivost na infekcije, konstantni kaalj, glavni uzrok smrtnostiGM2005
Plua u cistinoj fibrozi
Normalne alveole
CF proirene kripte ispunjene mukusom i bakterijama
CF plua ne kolabiraju nakon smrti CF plua GM2005
CF plua su osjetljiva na infekcijePseudomonas aeruginosa lako kolonizira mukus konstantna aktivacija neutrofila
Mukus titi bakterije i promovira hipermutacije
Neutrofili ne mogu eliminirati bakterije konstantna upala i oteenje plunog tkiva GM2005
Guteraa u cistinoj fibrozi
Normalna guteraa
CF guteraa proirene kripte ispunjene mukusom
Enzimi guterae ne mogu napustiti lijezdu to dovodi do oteenja Proizvodi se manje inzulina dijabetes Meu bolesnicima koji doive 25 godina 1/3 s poremeenom tolerancijom na glukozu i 1/3 s dijabetesomGM2005
Lijeenje cistine fibrozeUestala uporaba antibiotika za suzbijanje bakterijskih infekcija
Staphylococcus aureus, Haemophilius influenzae, Aspergillus fumigatus
- ista slika ...
GM2005
CFTR gen - kromosom 7: 27 eksona; protein od 1480 a.k.
ATP binding domain
GM2005
CFTR produktDelecija F508 50% pacijenata homozigoti 30% heterozigoti (normalna verzija/delecija) Nastaje nepotpuno smotani oblik osjetljiv na razgradnju proteazama Rapidna degradacija prije ulaska u Golgijev aparat
GM2005
Genska terapija cistine fibrozeSijeanj 1995. tretman liposomima intranazalni sprej 12 pacijenata privremeno olakanje u 20% pacijenata Maksimum 3. dan, prestanak 7. dan Nema imunoloke reakcije 2000. g. - mjesene aplikacije takoer uzrokuju poboljanjeGM2005
Viestruke doze prijenosa genaPrijenos gena detektiran nakon svake doze: Doza 1 56% (5/9) Doza 2 66% (6/9) Doza 3 66% (6/9) DNA mRNA protein funkcija 60% 44% 28% 22%
Prijenos gena CFTR putem kationskog lipidnog nosaa znaajno utjee na kliniku sliku bolestiGM2005