Genética Medicina Nicolás Jouve Curso 2010-2011

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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011

7. Los antecedentes metodológicos de los Proyectos

Genoma. Historia del Proyecto Genoma Humano.

Fundamentos y Objetivos. Metodología básica: corte

de ADN, separación de fragmentos, clonación,

librerías genómicas, ensamblado de cóntigosy

secuenciación.Las dos estrategias para el análisis de

las secuencias: restricción a gran escala y

secuencias de genes expresados.

http://www2.uah.es/webgenetica/

Docencia Fac. Medicina Genética

Genómica = Conocimiento de organización = Mapas

Los mapas genéticos tienen muchas utilidades:

conocer los sistemas de organización de los genes,

desarrollar sistemas de detección mediante técnicas

moleculares,

hacer diagnósticos de la presencia o ausencia de

determinadas secuencias o genes.

Realizar diagnóstico molecular encuentra sus aplicaciones

en:

genética clínica,

genética forense,

diagnósticos de paternidad,

experimentos de transformación para terapia génica

Genética – N.Jouve 2

adulto

Fecundación: 22” + XX (2n = 46)

22” + XY(2n = 46)

♂ = Gametos: 22’ + X ó 22’ + Y (n = 23)

♀= Gametos: 22’ + X (n = 23)

♀ ♂

Soma

mitosis

Linea germinal

meiosis En la Meiosis se produce la

«recombinación» Cada gameto,

genéticamente diferente. La

combinación genética que surge

es diferente para cada gameto


1900 (1865) El nacimiento de la Genética, (Mendel).

1944 (1869) El descubrimiento de que los genes,

tienen su base química en el ADN.

1953 El descubrimiento de la estructura de doble

hélice del ADN.

1960-65 El conocimiento del código genético

universal.

1970 El Dogma Central de la Biología Molecular

1975-90 La aparición de técnicas para aislar, clonar,

y secuenciar el ADN

Los antecedentes metodológicos de los

Proyectos Genoma


Ser-Pro-Ile-Ser-Cys-Asp-Thr-STOP

Proteína

Las proteínas son el producto de los genes y forman

Parte de estructuras ó funcionan como enzimas…

1961-65 - El código genético universal

Núcleo

Citoplasma

AGTGGCTATTCGACGCTATGCATTAAGCACGTATCGCATCGTA ADN (Gen)

UCACCGAUAAGCUGCGAUACGUAAUUCGUGCAUAGCUAGCAU ARNm

1970 El Dogma Central de la Biología Molecular


1978 – W. Arber, D.Nathans, y

H.O. Smith:

Endonucleasas de restricción

1980 - P. Berg, F. Sanger

y F. Gilbert:

Ingeniería Genética

1975-90 La aparición de técnicas para aislar,

clonar y secuenciar el ADN


http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3b/CentralDogma1970.es.png

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Premios Nobel de 1980 por el desarrollo de un método eficaz para la secuenciación del ADN




MS2 (ARN) 3.568 b 3 1976

FX174 (ADNs) 5.386 b 9 1977

SV40 (ADNd) 5.224 pb 5 1978

Fago l (ADNd) 48.502 pb 61 1982

Fago T (ADNd) 35.400 pb 55 1983

Epstein-Barr (ADNd) 172.281 pb 68 1984

ADN mit. humano (ADNd) 16.569 pb 37 1981

Virus o ADN Tamaño genoma Nº genes Año




Historia del proyecto genoma

humano


Historia del Proyecto Genoma Humano

1984

Reunión científica en Alta (California): conveniencia de poner en

marcha un programa de gran envergadura y coste económico, para

facilitar la detección de mutaciones génicas causantes de

enfermedades.

1986

Reunión en la ciudad de Santa Fe (California): se hizo la primera

propuesta de un Proyecto Genoma Humano como requisito

indispensable para comprender el cáncer.


“El orgullo nacional norteamericano está en juego: del mismo modo que en 1961 el Presidente Kennedy tomó la decisión de enviar un hombre a la luna, ahora la nación se ha comprometido a sí misma en un objetivo altamente visible e importante... Aunque el costo global de la secuenciación total del ADN humano será inferior en un orden de magnitud al de enviar al hombre a la luna, las repercusiones serán mucho más grandes”.

James Watson 1990


1984-1988

Planteamiento y definición del Proyecto

1988-1990

Lanzamiento del proyecto en EE.UU

1990

Internacionalización del Proyecto;

establecimiento de una organización

denominada HUGO (Human Genome

Organization).


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•NHGRI National Human Genome Research Institute (USA)

*Baylor College of Medicine en Houston

*Washington University School of Medicine en St. Louis

*Whitehead Institute for Biomedical Res, Cambridge, MA

Whitehead Institute, Boston

•NIH The National Institutes of Health (USA)

•DOE The Department of Energy (USA)

*Joint Genome Institute in Walnut Creek, California

•Wellcome Trust *Sanger Centre, Hinxton (Inglaterra)


CROM. 22

2 diciembre 1999

CROM. 21

8 mayo 2000

Eucromatina: 34.491 kb 34.000 kb

Secuenciado: 33.464 kb 35.202 kb

% terminado: 97 % 103.5 %

Nº de contigs: 12 6

“Working draft”

26 junio 2000



1995 - Secuenciada la primera bacteria

Haemophilus influenzae -1740 genes (1.8 Mb

12 de Febrero de 2001, la publicación en Nature y Science

21 de abril de 2003

publicación en Science y Nature

(50 aniversario del descubrimiento de la doble hélice). Genética – N.Jouve 16

Fundamentos y objetivos


Objetivos del Proyecto- 1988

Descifrar todo el mensaje del genoma humano

Desarrollar una tecnología eficiente para la secuenciación de todo el genoma

Identificar variaciones alélicas (SNPs = single nucleotide polymorphisms).

Interpretar las funciones: genómica funcional

Descifrar y analizar las secuencias de organismos modelo (levadura, nemátodo, Drosophila y ratón)


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Examinar las Implicaciones Eticas, Legales y Sociales, ELSI, de la Investigación genómica

Desarrollar herramientas de bioinformática y estrategias de computación para el uso de los datos de genes y secuencia

Entrenamiento de científicos para la investigación y análisis de genomas

Almacenar esta información en bases de datos

Transferir tecnologías relacionadas al sector privado


Metodología básica


Metodología básica: técnicas de localización y detección, corte de

ADN, separación de fragmentos, clonación, amplificación y

secuenciación


Craig Venter Francis Collins

Dos estrategias para abordar el PGH

A la caza de genes específicos… Todo: genes y otras secuencias 22 EGG 2010-11 - N. Jouve

Consorcio Internacional, Director Francis

Colins.

6 pasos sucesivos:

1. Aislamiento del ADN genómico

2. Fragmentación

3. Clonación (mantenimiento de

fragmentos)

4. Conservación de todos los fragmentos

en “librerías genómicas”

5. Estudio del orden = cóntigos

6. Secuenciación de cada fragmento


2. Fragmentación

3. Clonación

1000 kb

5. Mapa de cóntigos

1. Aislamiento ADN

4. Librería

genómica

6. Secuenciación

2. Fragmentación

3. Clonación

1000 kb

5. Mapa de cóntigos

1. Aislamiento ADN

4. Librería

genómica

6. Secuenciación6. Secuenciación

1

2

3 4

5

6 Genética – N.Jouve 24

5


Extremos

cohesivos

Extremos

cohesivos

Extremos

cohesivos

Extremos

romos

2. Fragmentación

Acción de las Endonucleasas Tipo II


3. Clonación

Utilización de plásmidos (u otros vectores)


ADN donante

Vector

Ligasa de ADN

3. Clonación


Los vectores pueden ser

plásmidos naturales, u

otras formas modificados

genéticamente. Tienen

que tener capacidad de

replicación.

Tipos Tamaño inserto

•Plásmidos -15 kb

•Fagos 20 kb

•Cósmidos 40 kb

•BACs 100-300 kb

•YACs 1.000 kb


4. Librerías genómicas

Cada fragmento del genoma se inserta en un vector

y cada vector se introduce en un cultivo bacteriano.

Cada cultivo conserva por replicación en las

bacterias

un fragmento distinto del genoma (clonación de

fragmentos de ADN).

Entre todos los cultivos deben completar de forma

fragmentada

El genoma completo. Su conservación constituye de

este modo una librería genómica.


Solapamiento

Solapamiento

Solapamiento

5. Ensamblado de cóntigos

Supuestos 3 fragmentos A, B y C, se trata de encontrar su orden

Relativo, mediante la búsqueda de regiones solapantes en los

Extremos. Para ello se utilizan “marcadores moleculares”

La flecha señala un marcador (detalle de secuencia de ADN) común en B y C.


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6. Secuenciación automática

4 Reacciones de síntesis

de ADN que se interrumpen

en una base dada (A, C, G ó T)

seguido de la separación de

los productos de síntesis por

electroforesis Genética – N.Jouve 31



TERMINADORES (ddNTPs) MARCADOS FLUORESCENTEMENTE

-REACCIÓN EN UN SOLO TUBO

- UN SOLO CARRIL

- CUALQUIER PRIMER

- NO SE DETECTAN LAS PARADAS FALSAS (no se incorpora ddNTP)


33 EGG 2010-11 - N. Jouve

TIPOS DE SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS

GELES DE

POLIACRILAMIDA CAPILARES


34 EGG 2010-11 - N. Jouve

CUATRO FLUOROCROMOS QUE EMITEN

A DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA

CUATRO BASES DETECTADAS Y DISTINGUIDAS

EN UN SOLO CARRIL O INYECCIÓN CAPILAR

(5’-PRIMER; 3’-ddNTP)


35 EGG 2010-11 - N. Jouve



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Sanger Center 6. Secuenciación automática


Celera Genomics, Director Craig Venter

pasos sucesivos

1. Obtención de copias en versión ADN, ADNc,

de ARN mensajeros de células especializadas.

2. Búsqueda en las librerías genómicas de los

clones de los ADN copias anteriores.

3. Secuenciación del ADN de dichos clones.


ARN pol

ADN c

Transcriptasa

inversa

Aislamiento de

ARNm

ARN-m Proteína

Células

específicas

Clonación

Búsqueda de la secuencia del gen en Las librerías genómicas

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