6° CONGRESSO NAZIONALE AIC3 Novembre 2017 - Genova

Nuove Tecnologie Alimentari del Senza Glutine

Carmen GianfraniIstituto di Biochimica delle Proteine, CNR, Napoli

c.gianfrani@ibp.cnr.it

Laceliachia è unamalattia complessamultifattorialemaconununicoagente responsabile:

leproteine delglutine

glutine

+

-mucosanormale mucosaceliaca

Assoluta, da seguire per la vitaü Sicuraü Qualità della vita compromessa (alimentazione fuori casa)

Terapia attuale:dieta senza glutine

048

121620242832

CD061204 CD171204 CD310504 CD200206

Celiaci con mucosa atrofica

γ-IF

N (n

g/m

l)

controllo

gliadina

0

5

10

15

20

25

30

CD230204 CD280900 CD090401 CD041052

γ-IF

N (n

g/m

l)

Celiaci in remissione, a dieta senza glutine

LadietaacausadellapresenzadilinfocitiTpro-infiammatorireattivialglutineconmemoriaimmunologicanellamucosaceliaca

Camarca,JImmunol,2009Gianfrani,Gastroenterology,2007Gianfrani,JImmunol,2003Vader,Gastroenterology 2002Shan,Science2002

ProteinedelGlutineü Proteinadiriserva (endosperma) delsemedigrano,segale,orzo

ü Piùdicentoproteinediverse

ü Sidivideingliadineeglutenine

ü Altocontenutodiglutamina (40%)andprolina(20%):prolammine

ü Elevataresistenzaalladigestionedelleproteasigastro-intestinali

ü MolteplicisequenzepeptidicheattivesuilinfocitiTdiceliaci

TCRαβ

LinfocitaTCD4

HLA-DQ2/DQ8glutine

1. SipuòPRETRATTARELAFARINAedetossificare ilglutineprimachevenga ingerito?

2. Esistonograniconglutineprivodellesequenze tossiche,equindigranitolleratidaiceliaci?

3. Sipossonoottenere inlaboratoriograninontossici?

NuoveTecnologieAlimentaridelSenzaGlutinedeicerealicontenentiglutine

ü Fermentazione prolungata (24 hours at 30°C.) degli impasti di farina con batterilattici (L. sanfranciscensis L. alimentarius, L brevis, L hilgardii) ottenuti da impastinaturali e con proteasi fungine (Aspergillus oryzae, Aspergillus niger)

ü Totale idrolisi del glutine, dosato con saggio immunoenzimatico R5 (12 mg/kg,ppm) e dei peptidi tossici (analisi proteomiche e spettrometria di massa)

ü Perdita delle proprietà immunostimolanti (test su linfociti T e biopsie di celiaci)

ü Assenza di tossicità in vivo, valutata con challenge orale a breve e a lungotermine

Pretrattamentodellefarinedifrumentoconagentifermentanti

Rizzelloetal.Appl EnvironMicrobiol.2007GrecoetalClin Gastroenterol Hepatol.2011Mandile etal.AlimPhar Ther.2017

Aspetti tecnologici delle farine di grano deglutinateattraverso fermentazione prolungata

ü L’idroslisi spinta, con totale distruzione della rete di glutine, riduce le proprietàtecnologiche (viscoelasticità) dell’impasto che vengono sostituite conl’aggiunta di agenti strutturanti, come amido pre-gelatinizzato, o idrocolloidi

ü Le farine ed i prodotti finiti sono sul mercato per i celiaci

Detossificazione dellefarinedigranomediantemascheramentodelglutine

+mTGasi

K-CH3K-CH3

Trattamento enzimaticodellefarinecontranglutaminasi microbicaemetil lisina(food grade)

tTGasi

F P Q P E L P Y P Q P

F P Q P Q L P Y P Q P

Deamidazione

F P Q P Q L P Y P Q P

K-CH3

F P Q P Q L P Y P Q P

mTGasi +K-CH3

Trans-amidazione

Inflammazione NO Inflammazione

Ilglutinetransamidato (mTGasi +K-CH3)nonattivalecelluleTdiceliaci

Iltrattamentodellefarinetransamidate èinfasedisperimentazioneclinica

Primo studio:Singolo cieco, 47 celiaci adulti consumano 50 g/die di pane controllo (N=12) o trattato (N=35).10/12 dei controlli e 14/35 nei trattati escono dallo studio dopo soli 15 giorni per la presenza disintomi o alterazioni permeabilità intestinale.Normale funzionalità epatica e renaleNei 20 volontari che terminano lo studio (57%), non si osserva danno della mucosa né comparsadi autoanticorpi (Mazzarella et al., Clin Dev Immunol 2012).

Secondo studio:Doppio cieco, 21 celiaci adulti consumano 100 g/die di pane controllo (N=10) o trattato (N=11). Il70% completa lo studio a 90 giorni in entrambi i gruppi.14% gruppo trattato e 57% gruppo controllo sviluppano autoanticorpi ed atrofia dei villi(Marino et al., Int Immunopharmacol. 2017).

80.00080

1. SipuòPRETRATTARELAFARINAedetossificare ilglutineprimachevenga ingerito?

2. Esistonograniconglutineprivodellesequenze tossiche,equindigranitolleratidaiceliaci?

3. Sipossonoottenere inlaboratoriograninontossici?

NuoveTecnologieAlimentaridelSenzaGlutine

Ilmonococco (Triticummonococcum)ètraigranicandidati

Ø GranodiploideAA,notoanchecomepiccolofarrooEinkorn

Ø Lasuacoltivazionerisaleacirca10000annifaedèrimastoinalteratogeneticamente

Ø Ottimeproprietàpanificatorie epastificatorie

Ø Lafarinaintegraleèpoveradifibrealimentari,mariccadiproteine,lipidi(ingranparteacidigrassiinsaturi),fructani,ferroedantiossidanti(carotenoidiepolifenoli)

Ø LapresenzadelsologenomaAAcomportaunaridottavarietàdiproteinedelglutine(edipotenzialipeptiditossiciimmunitari),rispettoalgranoduro(tetraploide)etenero(esaploide)

Ø PresenzadisequenzepeptidicheprotettiveQQPQRPQQPF

Ø DiversicentridicoltivazioneinItalia

Hidalgo&Brandolini.J SciFood Agric 2014Lamacchia etal.Nutrients 2014DeVitaetalJ Cerela Sci2012

Ilgrano monococco contieneunglutinepiù digeribile edimmunologicamentemenoattivo

Riproduzione in vitro del processo di digestione gastrointestinale (PTCCE-BBM)

1 Gliadin proteins

2 Pepsin

3 Trypsin

4 Chimotrypsin

5 Carboxypeptidase A

6 Elastase

7 Brush Border Membraneenzymes (BBM)

Gianfrani etal,MolNutr FoodRes. 2015Gianfranietal,AmJClin Nut.2012

Analisi proteomica e della tossicità immunologica su biopsie intestinali e cellule linfocitarie da soggetti celiaci

min20 30 40 50 60 70 80 90

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

DAD1 B, Sig=220,10 Ref =of f (AURICCHI\MOLLIS_0.D)

Gli_Mollis

53.

390

76.

587

77.

445

55.

089

59.

053

50.

015

70.

811

46.

378

72.

891

57.

452

48.

370

69.

827

43.

226

68.

198

74.

225

64.

398

21.

692

28.

846

32.

311

36.

439

25.

706

23.

558

20.

261

min20 30 40 50 60 70 80 90

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

DAD1 B, Sig=220,10 Ref =of f (AURICCHI\ID331_00.D)

Gli_ID331

53.

390

76.

873

77.

768

55.

117

49.

793

59.

235

51.

542

71.

403

46.

446

73.

282

48.

408

57.

610

70.

344

61.

676

43.

310

67.

523

64.

675

36.

287

28.

764

32.

516

30.

848

21.

958

T.monococcum (Monlis) T.monococcum (ID331)T.aestivum (grano tenero)min10 20 30 40 50 60 70 80 90

mAU

0

200

400

600

800

DAD1 B, Sig=220,10 Ref =of f (LUIGIA\SAGIT.D)

65.

278

64.

276

52.

439

57.

940

53.

476

55.

447

51.

697

57.

471

74.

264

60.

630

66.

933

33.

213

49.

618

82.

541

68.

375

44.

485

47.

632

46.

069

54.

394

61.

740

70.

460

72.

034

34.

146

15.

941

19.

859

43.

698

80.

520

39.

193

85.

563

90.

346

31.

187

4.7

45

28.

735

13.

725

26.

841

3.1

80

37.

126

18.

694

21.

421

7.0

90

25.

409

23.

865

11.

264

Peptidi 76α-gliadin 50

ω-gliadin 9

γ-gliadin 17

Peptidi 68

α-gliadin 51

γ-gliadin 17

Peptidi 241

α-gliadin 108

ω-gliadin 22

γ-gliadin 111

α-γ-

α−γ-ω-

γ- α-

Ridotto rilascio dipeptidi dopo idrolisi gastrointestinale

Gianfrani etal,MolNutr FoodRes. 2015

ü E’notalaquantità minina diglutine perscatenare lapatologia,soglia di20ppm(20mg/kg)nelle linee guida

ü Qual è lasoglia diglutine perindurre lapatologia?

ü Qualeè il ruolo dei diversi aplotipi HLAdirischio nella risposta immuneavversa?

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0,001 0,01 0,1 1 10

Infla

mm

ator

yre

spon

se

Gluten stimulatory peptides

DR3/3 DR3/5

DR1/3

Threshold

Catassi, AmJClin Nutr 2007Gibert,AmJClin Nutr 2013Pisapia,J Autoimmun,2016

É possibile prevenire laceliachia nei soggetti arischio conunaalimentazione abasedigrani meno tossici?

1. SipuòPRETRATTARELAFARINAedetossificare ilglutineprimachevenga ingerito?

2. Esistonograniconglutineprivodellesequenze tossiche,equindigranitolleratidaiceliaci?

3. Sipossonoottenere inlaboratoriograninontossici?

NuoveTecnologieAlimentaridelSenzaGlutine

Ø SelezionedigenotipidigranoteneroegranoduroprivideilociGli-A2eGli-D2attraversol’analisidellesequenzediglutine inbanchedatiridottocontenutodeipeptidi immunotossici (vandeBroeck etal.Mol BioSyst 2010;Theor Appl Genet 2010).

Ø Regolazionedell’espressione deigenidellegliadineconlatecnicadelsilenziamentogenico(conRNAi)RidottaattivazionedeilinfocitiTinfiammatori (Gil-Humanes etal.PNAS2010).

Ø Selezionedinuovicerealimediante ibridizzazionedivarietànaturali.ConcettodiLowCDToxic:Tritordeum,unanuovaspeciedaincrociogranoduroeorzoconridottaimmunotossicità (VaqueroetalJ SciFoodAgric 2017).

Ø Silenziamento digeniprolaminici mediantemutagenesie nuovetecnologie digeneeditingCRISPR/Cas9(Jouanin etalICDSNewDelhi2017).

Sipossonoottenereinlaboratoriograninontossici?

Conclusioni

ü La complessità genetica del grano si traduce in una molteplicità di peptidi tossici(repertorio molto ampio)

ü Diverse strategie per rendere deglutinate le farine dei cereali tossici:1)fermentazione naturale con batteri lattici/funghi, 2)enzimatica permascherare i peptidi tossici, utilizzandola transglutaminasi e metil lisina

ü Esistono piante ancestrali diploidi (monococco) che hanno meno copie dei geniche codificano per le proteine del glutine

ü Possibilità di incrocio di queste piante per la selezione di grani meno tossici

ü La ridondanza del genoma (poliploidia) rende molto difficile manipolazionigenetiche che silenzino tutti i geni codificanti i peptidi immunotossici