giao_trinh_visinh

8/9/2019 giao_trinh_visinh

1/56

AI HOC QUOC GIA THANH PHO HO CH MINHTRNG AI HOC KHOA HOC T NHIEN

---oOo---

Thac sNGUYEN TIEN DUNG

Tai lieu mon

PHNG PHAP KIEM NGHEM

VI SINH VAT TRONG THC PHAM(Tai lieu s dung noi bo)

Thanh pho Ho Ch Minh - 2007


2/56

http://www.ebook.edu.vn

1

Chng I

CH TIEU VI SINH VAT THNG C KIEM SOAT TRONG NC,THC PHAM VA MY PHAM

Co rat nhieu vu ngo oc hay cac benh gay ra do thc pham a va ang di n ra, mat duco cac luat ve an toan v sinh thc pham a c ban hanh va ngay cang cht ch va c squan tam cua cong ong.

Cho en nay van con co nhng cach hieu va phan biet khong thong nhat ve khai niemcac benh gay ra do thc pham hay ngo oc thc pham. Song e phan biet hai van e nay thongthng da vao cac khai niem nay nh sau:

- Ngo oc thc pham la cac bieu hien benh do tieu thu thc pham co cha so lng ln visinh vat, chung nhan len nhanh trong qua trnh che bien hay bao quan. Cac vi sinh vatco the hien dien mot so lng rat t ban au trong thc pham hay nhiem vao do s tiepxuc qua qua trnh che bien.

- Cac benh co nguon goc t thc pham do tieu thu nhng thc an cha cac vi sinh vat haysan pham cua chung, khong phu thuoc vao so lng nhieu hay t do o khong phu thuocvao s che bien hay bao quan.

1. Ngo oc thc phamNgo oc thc pham dien ra nhieu ngi, co cung mot trieu chng va cung mot thi

iem sau khi tieu thu thc pham. Tuy nhien mc o tac ong en tng ngi se khac nhau biv kha nang ap ng vi oc to cua tng ngi khac nhau phu thuoc vao the trang va kha nangtrung hoa oc to cua tng ngi.

Trieu chng cua ngo oc thc pham thng co cac bieu hien nh tieu chay, chong mat,non ma, au nhc ngi, sot, au au. Cac bieu hien trieu chng phu thuoc vao tng loai visinh vat gay nen. Mc o nguy hiem va trieu chng cua benh co the gay nen do oc to cuachung tiet vao thc pham hay do chnh te bao cua chung gay nen. e co the gay ngo oc thcpham, vi sinh phai hien dien vi so lng te bao ln va phu thuoc lieu lng cua tng chung

loai nhiem vao, thc pham phai co cac eu kien ly hoa thch hp cho vi sinh vat o phat trien,nhiet o va thi gian phai thch hp cho qua trnh tang trng cua chung t khi chung nhiemvao cho en khi tieu thu e vi sinh vat nhan len en u lieu lng hay san xuat u lng octo gay hai.

2. Cac vi sinh vat co the gay ngo oc thc phamSalmonellaSo lng Salmonella u e gay ngo oc la khi chung hien dien ca trieu te bao trong mot

gam thc pham. Cac trieu chng do Salmonella gay ra thng la tieu chay, oi ma, buon non.Thi gian u benh cho en khi cac trieu chng bieu hien thng sau 12-36 gi ke t khi tieu thuthc pham b nhiem. Trieu chng thng keo dai t nhat t 2-7 ngay. Khong phai tat ca moingi khi tieu thu thc pham b nhiem Salmonella ieu co bieu hien benh, ngc lai mot songi khong co trieu chng lam sang khi tieu thu phai thc pham nhiem vi sinh vat nay khi ochung c bai tiet ra ngoai. Cac loai thc pham co nguy c b nhiem Salmonella nh tht giacam, san pham tht, trng va cac san pham cua trng, thuy san. Nguon nhiem vi sinh vat vaocac loai thc pham thng co nguon goc t ng ruot cua ngi va cac loai ong vat, chungco the c nhiem gian tiep hay trc tiep. Salmonella gay nen benh sot thng han thuoc cacserotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. cac dong nay thng khong gay benhcho cac loai ong vat.

Campylobacteray la vi sinh vat gay nen benh viem nhiem ng ruot, bang cac phng phap phan

lap a chng minh vi sinh vat nay hien dien khap ni. Campylobacters la mot trong nhng he vi


3/56


2

sinh vat cua nhieu loai ong vat va chim. Nhng cac dong co kha nang gay ngo oc thc phamkhong the phat trien khi nhiet o thap hn 30oC, ay la vi sinh vat a nhiet bat buot. San phamsa va tht gia cam la nhng nguon co the gay nen ngo oc do vi sinh vat nay. Nc cung lamot trong nhng nguon mang benh nay. Campylobacters la vi sinh vat rat nhay vi nhiet o,chung b tieu diet hoan toan bang phng phap thanh trung Pasteur, chung khong the song sottrong thc pham co moi trng acid. Chung khong the phat trien trong thc pham bao quantrong ieu kien hieu kh ma ch phat trien trong cac loai thc pham hut chan khong.

Khi xam nhiem Campylobacter, thi gian u benh thng t 2-11 ngay. Cac trieu chngdo vi sinh vat nay gay nen nh au nhc, tieu chay, sot, au au, kho chu, chuot rut, lanh cong,me san. Thnh thoang co nhng bieu hien benh giong nh cam cum.

Clostridium perfringensQuan niem ve s ngo oc thc pham do Clostridium perfringens gay ra a co nhng thay

oi trong nhng nam gan ay. Theo nhng quan niem trc ay cho rang cac dongC.perfringens khang nhiet, tao bao t va khong lam tan mau mi co the gay ngo o thc pham.Nhng trong nhng nam gay ay cac dong nhay cam vi nhiet, khong lam tan mau cung ctm thay trong cac vu ngo oc do vi sinh vat nay gay nen.

V cac bao t cua C. perfringen khang nhiet nen chung thng song sot qua qua trnh

nau chn. Tuy nhien cung phu thuoc vao thi gian tiep xuc vi nhiet. Neu nhng bao t songsot, khi gap ieu kien thch hp chung se nay mam va nhan len. Khi un nau thc an nhiet othap va thi gian ngan co the lam cho cac dong khang nhiet ton tai v the chung se gay tainhim sau khi bao quan. Cac nguon thc pham co the gay ngo oc vi cac vi sinh vat naythng la tht gia cam, nhat la cac loai gia cam ln ong lanh sau, tht trong cac ham cha. C.

perfringens cung c tm thay trong at, trong phan ngi va trong cac loai thc pham khac.Cac trieu chng do vi sinh vat nay gay ra thng la au that vung bung, tieu chay. Thi gian ubenh t 12-24 gi. Cac trieu chng lam sang gay nen do oc to cua chung.

Clostridium botulinum.ay la vi sinh vat phan bo khap ni trong at, trong nc va trong cac gia suc va cac

loai thuy san. Vi sinh vat nay sinh oc to gay benh ngo oc tht cho ngi (botulism). Benh bieuhien rat nghiem trong ngi. Benh gay ra do oc to c hnh thanh bi C.botulinum nhiemtrong thc pham. Trieu chng lam sang cua benh la oi ma, buon non, sau o co nhng bieuhien roi loan thanh kinh nh choang vang, roi loan th giac, roi loan cac c co va mieng, au vung ngc, kho th va te liet, co the dan en t vong. Cac trieu chng tren bieu hien sau 12-36 gi sau khi tieu thu thuc pham nhiem oc to. Cac trieu chng thng keo dai 2-6 ngay tuytheo tnh trang nhiem oc va sc khoe cung tng benh nhan.

Cac loai thc pham nh tht, rau qua khong c bao quan ung qui nh hay lay nhiemt at, phan ong vat hay do che bien khong u nhiet o trc khi dung, cac san pham onghop khong ung qui cach cung co nguy c nhiem vi sinh vat nay ray cao. ieu kien thch hpcho viec hnh thanh oc to cua vi sinh vat nay ieu kien moi trng k kh, pH trung tnh,

khong co cac vi sinh vat khac canh tranh. oc to botuline do C. botulinum tiet ra gom mot soloai khac nhau nh A, B, C1, C2, D, E, F, G. cac oc to nay la nhng protein co trong lngphan t ln khoang 1 trieu danton. Nhng nhng dang co tac ong manh en con ngi la A, B,va E. ay cung la mot trong nhng loai oc to sinh hoc co cng o manh nhat. Trong nhngnam gay ay, cac vu ngo oc botulism gay ra do C.botulinum dong E thng c phat hien khitieu thu ca va cac san pham thuy san. Dong vi sinh vat nay thng xuyen phan lap c t cacmau bun ay tai cac ca song.

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus la VSV co kha nang san sinh mot so loai oc to ng ruot ben

nhiet, khong b phan huy khi un 100oC trong khoang 30 phut. Khi vi sinh vat nay xam nhiem


4/56


3

vao trong thc pham, chung tiet oc to vao trong san pham va gay oc. Khi con ngi tieu thuloai thc pham co cha oc to nay, sau 4-6 gi u benh se boc phat cac trieu chng lam sangnh tieu chay, non ma, cac trieu chng nay keo dai t 6-8 gi. Cac loai thc pham co chaham lng muoi cao thng co nguy c nhiem vi sinh vat nay nh jambon, kem tong hp, ncsoup v cac loai thc pham nay t khi c x ly nhiet o cao hn 40oC. Cac loai thuy sanhay thc pham ong hop cung thng hay b nhiem loai vi sinh vat nay. Cac nguon lay nhiemvao thc pham chu yeu t cac khau che bien trong nha bep. Trong t nhien cac vi sinh vat naythng tnh thay tren da, mui, toc hay long cua cac loai ong vat mau nong.

Vibrio sppCac loai Vibrio co nguon goc t bien, chung can ion Na+ e phat trien. Giong Vibrio co

mot so loai co kha nang gay benh cho ngi nhV. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus,V. hollisae, V.furnsii, V. mimicus, V. fluvialis, V. alginolyticus.

V. cholerae la tac nhan gay nen cac vu dch ta tren toan the gii. Loai vi sinh vat nayc chia thanh hai kieu huyet thanh chnh o la O1 va non-O1, kieu huyet thanh O1 bao gomba kieu huyet thanh phu nh sau: Ogawa; Inaba (hai kieu nay c goi chung la kieu co ien Classic) va kieu Eltor (kieu Eltor con c goi la kieu O139). Hai kieu huyet thanh Inaba vaOgawa ngay nay ch con c tm thay tai cac nc thuoc khu vc chau A. Trong khi o cac vu

dch ta tren khap the gii gay ra do kieu Eltor. Khi co cac tran dch do V. cholerae gay rathng lan truyen rat nhanh vao trong nc, gay nhiem vao thc pham, neu ieu kien ve sinhkem, vi khuan se lan truyen qua con ngi va dch benh cang them nghiem trong. Vi sinh vatnay san sinh oc to cholaratoxin, ay la loai oc to ng ruot co cng o manh, ch can 5 ggay nhiem qua ng mieng co the gay tieu chay cho ngi trng thanh. Mot so oc to khaccung c vi sinh nay tiet ra nh hemolysine co oc tnh tng t tetrodotoxin (oc to ca noc)hay oc to tng t shiga-toxin.

Cac loai thc pham co the lan truyen V. cholerae nh nc uong, nc trai cay, rau qua,sa va cac san pham sa, tham ch bia cung co kha nang nhiem vi sinh vat nay. Cac loai sanpham thuy san ti song, khong qua gia nhiet, gia nhiet nhe hay do s nhiem cheo sau khi gia

nhiet cung c khuyen cac la co nguy c mang V.cholerae kha nghiem trong.V. parahaemolyticus la loai vi sinh vat ton tai va phat trien trong moi trng co hamlng muoi cao, chung thng xuyen c phan lap t cac san pham thuy san, trong cac vungnc am ven b bien. Chung san sinh oc to hemolysine ben nhiet, chat nay chu trach nhiemcho ac tnh khang nguyen Kanagawa. Nhng trong nhng nam gan ay cac dongV.parahaemolyticus co phan ng Kanagawa am tnh cung co the gay benh. Trieu chng bieuhien cua benh co the xuat hien trong khoang 2-96 gi sau khi tieu thu thc pham b nhiem, thigian nay phu thuoc vao lieu lng xam nhiem va the trang cua tng benh nhan, loai thc phamtieu thu va ham lng acid trong da day. Cac bieu hien benh ly khi vi sinh vat nay xam nhiemva au that vung bung, viem nhiem ng ruot va tieu chay nhe.

Cac loai Vibrio khac khi xam nhiem vao trong thc pham cung co the gay nen cac benh

ng ruot va co bieu hien benh ly tng t nh hai loai tren. D nhien tuy tng loai va lieulng ma co nhng bieu hien benh nang nhe khac nhau. Ch rieng loai V. vulnificus khong gaycac trieu chng benh ng ruot ma chung gay nhiem trung mau cho ngi.

Escherichia coliE. coli la vi sinh vat hieu kh pho bien trong ng tieu hoa cua ngi va cac loai ong

vat mau nong. Hau het cac dongE. coli ton tai mot cach t nhien va khong gay hai trong ngtieu hoa, ngc lai chung con ong vai tro quan trong trong viec on nh sinh ly ng tieuhoa. Tuy nhien co t nhat 4 dong sau ay co the gay benh cho ngi va mot so loai ong vat:

Enterobathogenic E. coli (EPEC)EnterotocigenicE. coli (ETEC)


5/56


4

EnteroinvasiveE. coli (EIEC)EnterohaemorrhagicE.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli O157: H7Ro rang E.coli co the phan lap c de dang khap ni trong moi trng co the b o

nhiem phan hay chat thai. Vi sinh vat nay co the phat trien va ton tai rat lau trong moi trng.Trong nhng nam gan ay cac nha nhien cu cung chng minh rang E. coli cung co the phanlap c t nhng vung nc am, khong b o nhiem hu c. Vi s phan bo rong rai nh vay,

E.coli cung de dang phan lap c t cac mau thc pham do nhiem vao t nguyen lieu haythong qua nguon nc.

Cac dongE. coli gay benh khi chung xam nhiem vao ngi qua con ng thc pham cothe gay nen cac benh roi loan ng tieu hoa, cac bieu hien lam sang bien ong co the t nheen rat nang, co the e doa mang song cua con ngi phu thuoc vao lieu lng, dong gaynhiem va kha nang ap ng cua tng ngi.

ShigellaGiong Shigella cung la mot thanh vien cua ho vi khuan ng ruot Enterobacteriacae,

chung gom co 4 loai sau: S. dysenteriae, S. sonnei, S. plexneri, S. boydii. ay la giong vi sinh vatco te bao chu ac hieu, chung ch thch nghi va phat trien trong te bao chu la ngi va cac loailinh trng. S hien dien cua chung trong moi trng la do s nhiem phan cua ngi va cac loai

mang vi sinh vat nay. Shigella co the ton tai hn 6 thang trong moi trng nc. Cac vu ngo octhc pham do Shigella gay ra chu yeu tap trung cac nc kem phat trien, che bien thc phamtrong ieu kien kem ve sinh. Benh cung co the truyen trc tiep t ngi qua ngi.

Shigella chu yeu gay nen cac benh l trc trung. Thi gian u benh sau khi tieu thu thcpham b nhiem la 1-7 ngay. Cac bieu hien trieu chng benh co the nhe, bieu hien khong ro, chthoang qua nh tieu chay nhe, nhng oi khi cung co nhng bieu hien nghiem trong nh i tieura mau, co nhng manh niem mac ruot, mat nc, sot cao va b co rut thanh bung. Cac trieuchng tren co the keo dai 12-14 ngay hay lau hn. oi vi ngi ln, cac trng hp t vong doShigella hiem khi dien ra, nhng benh bieu hien rat nghiem trong oi vi tr em va ngi gia.Hang nam co khoang na trieu ngi t vong do vi sinh vat gay ra tren khap the gii.

S lay nhiem vi khuan Shigella chu yeu ng mieng. Nc la mot moi trng truyenbenh quan trong, ac biet nhng ni kem ve sinh. Tuy nhien cac loai thc pham cung languyen nhan gay nen cac benh do Shigella. Vi sinh vat nay nhiem vao thc pham qua nguyenlieu hay qua trnh che bien. i khi nhiem benh do ve sinh ca nhan kem.

Listeria monocytogenesTrong nhng nam gan ay L. monocytogenes noi len nh mot mot tac nhan gay benh

nguy hiem. oi tng gay benh cua vi sinh vat nay la tre em, phu n mang thai hay nhngngi gia. oi vi nhng vi sinh vat gay benh go oc thc pham khac, chung boc phat benh khicon ngi hap thu u lieu lng, sau thi gian u benh cac trieu chng lam sang bieu hien.Ngc laiL. monocytogenes hien dien vi mot so lng nho trong thc pham, khi c a vaoc the, chung ton tai va ch c hoi. Khi co ieu kien thuan li, chung nhan len xam nhiem vao

cac mo sau va gay benh. Cac benh do vi sinh vat nay gay nen bat au t ng tieu hoa nhtieu chay, sot nhe. Sau o chung xam nhiem vao cac ai thc bao gay nen benh nhiem trungmau, tac ong len he than kinh trung ng, tim mat, va co the xam nhap vao bao thai gay nensay thai, e non hay nhiem trung thai nhi.

L. monocytogenes thuoc loai vi sinh vat a lanh, chung co the phat trien nhiet o t 2-44oC. Chung thng c phan lap t cac loai thc pham nh phomat sa, tht ca rau qua vatham ch phan lap c t trong nc mat. Trong tat ca cac cong o n che bien thc pham, sahay rau qua eu co kha nang xam nhiem vi sinh vat vat nay. at biet trong cong oan bao quancac san pham nhiet o thap, vi sinh vat nay co c hoi phat trien thanh so lng ln. Cac san


6/56


5

pham thanh trung Pasteur va c bao quan nhiet o thap trong cac tu lanh co nguy c nhiemvi sinh vat nay rat cao.

Cac virus gay benh trong thc phamCac t dch benh gay ra t thc pham do tac nhan virus cho en nay van la van e b

an. Nhng mot so tac gia van tin rang virus trong thc pham la tac nhan gay nen cac benh hiemngheo. Nhng tien bo trong cac nhien cu ve virus thc pham van con han che. Cho den naycac ac iem sinh ly cua virus ng ruot van con biet rat han che. Cho en nay cac phngphap nuoi cay e phat hien virus trong thc pham cho en nay van cha the thc hien c.Nhng vi cac tien bo ve ky thuat sinh hoc phan t nh ky thuat lai phan t, ky thuat PCR cothe phat hien c cac virus co hai cho con ngi trong thc pham.

S lan truyen virus cho ngi qua con ng thc pham c biet t nhng nam 1950.Cac virus gay benh ng ruot cho ngi chu yeu co nguon goc t cac san pham thuy san. Choen nay c biet co khoang hn 100 loai virus ng ruot. Nhng ch mot vai loai trong so oco kha nang gay benh cho ngi. Theo Kilgen va Cole (1991) cac loai vieus sau ay co the gaynguy hiem cho ngi.

Hepatitis type A (HAV)Virus Norwalk

CalicivirusAstrovirusVirus NonA va Non B.Virus ton tai the khong hoat ong khi ben ngoai te bao, chung khong the t nhan len

trong nc hay trong cac san pham thc pham cho du bat ky ieu kien hoa ly nh the nao.Chung xam nhiem vao thc pham hoan toan do qua trnh che bien, t nc b o nhiem. Cac loainhuyen the an loc co kha nang tch luy nhieu virus trong nc. Hang ngay mot con nguyen theco the loc 1500 lt nc, theo o mot so lng ln virus co the vao c the cua con vat nay vatch luy tai o. V the mat o virus trong c the nhuyen the cao hn rat nhieu so vi moi trngnc chung ang sinh song.

Lieu lng gay benh cua virus co the thap hn rat nhieu so vi vi khuan khi con ngitieu thu thc pham b nhiem. Lieu lng gay nhiem toi thieu cua mot so loai vurus ng ruottng ng vi so lng hien dien trong thc pham ma cac phong th nghien co the phat hienc bang phng phat nuoi cay.

C the ngi va cac loai ong vat la nguon cha cac virus ng ruot. Virus c tmthay vi so lng ln trong phan cua nhng ngi b nhiem va ton tai trong nhieu ngay ennhieu tuan. S nhiem phan vao trong thc pham bang con ng gian tiep hay trc tiep la conng xam nhiem virus vao thc pham.

S song sot cua virus trong moi trng hay trong thc pham phu thuoc vao yeu to nhnhiet o, nong o muoi, cng o bc xa mat tri hay s hien dien cua cac thanh phan hu ckhac. Virus ng ruot cung co kha nang ton tai nhieu thang trong nc bien nhiet o


7/56


6

Coliform va Feacal coliform c xem la vi sinh vat ch th, bi v so lng cua chunghien dien trong mau ch th kha nang co s hien dien cua cac vi sinh vat gay benh khac trongthc pham. Cac nha nghien cu cho rang so lng Coliform cao trong thc pham th kha nanghien dien cac vi sinh vat gay benh khac cung rat ln. Tuy vay moi lien he gia so lng vi sinhvat ch th va vi sinh vat gay benh con ang c tranh cai ve khoa hoc. Cho en nay moi lienhe nay van khong c s thong nhat trong cac hoi ong khoa hoc. Theo nh ngha, nhomColiform bao gom ca nhng vi sinh vat hieu kh va k kh tuy nghi, co Gram am, khong sinhbao t, co hnh que, len men ng lactose va sinh hi trong moi trng nuoi cay long.

Can c vao nhiet o vi sinh vat co the phat trien e chia nhom Coliform thanh hainhom. Nhom Coliform co nguon goc t phan cua cac loai ong vat va, nhom nay c goi laColiform phan va nhom khong co nguon goc t phan ong vat. Tren thc te, cac phng phapkiem nghiem ch xac nh Coliform phan la xac nh nhom coliform co nguon ngoc t ruotngi va cac ong vat mau nong bao gom cac giong nh Escherichia; Klebsiella va

Enterobater. Mot cau hoi c at ra la co phai tat ca cac thanh vien cua nhom Coliform phanco y ngha ch th ve sinh nh nhau hay khong? Cho en nay van e nay van con ang c banluan, tuy nhien trong cac thanh vien cua nhom nay th E. coli la loai c s quan tam nhieunhat cua van e ve sinh an toan thc pham.

Bang 1: Cac loai benh va cac bieu hien lam sang do cac vi sinh vat trong thc pham gay raThi gian u

benhVi sinh vat Non

maTieu

chayauthat

Sot Thi giankeo dai

Cac loai thc phamthng gap

30 phut4 gi B.cereus (emertic) +++ (+)a (+)a - Ngan Gao

8-12 gi B.cereus (diarrhoeal) - ++ ++ - 1-2 ngay Soup va cac san pham sa

4-6 gi S. aureus ++ + ++ - 6-12 gi Tht lanhSan pham sa, salad, kem,trng, san pham len men ...

8-22 gi C. perfringens - ++ ++ - 12-24 gi San pham tht qua gia nhiet

8-48 gi V. paraheamolyticus - +++ - + 2-3 ngay Hai san

12-48 gi Salmonella (+) ++ - + 48gi-7 ngay Gia cam, th va san phamtrng

24-72 gi C.botulinum - - - -b 3 ngay o, rau qua ong hop, tht2-11 ngay Campylobacter - +++ ++ ++ 3 ngay-3 tuan Sa, c uong, tht gia cam,

tht ti, ca nam, sa thanhtrung Pasteur

a: Co the bieu hien hay khong, b: Bieu hien roi loan


8/56


7

Chng II

KY THUAT TRUYEN THONG TRONG PHAN TCH VI SINH VAT

1. nh lng vi sinh vat bang phng phap em trc tiep tren knh hien viSo lng Vi sinh vat trong mau co the c xac nh bang cach em trc tiep tren knh

hien vi. Qui trnh en trc tiep cho phep xac nh c so lng vi sinh vat vi ket qua cao

nhat. Mat du phng phap em trc tiep bang knh hien vi cho phep c lng nhanh chong solng vi sinh vat co trong mau. Tuy vay phng phap nay co nhng iem han che nhat nh nhkhong phan biet c so lng te bao song va so lng te bao chet, de nham lan te bao vi sinhvat vi cac manh v nho cua mau va khong cho phep tm hieu cac ac iem khac cua cua visinh vat c c quan sat.

oi vi cac vi sinh vat co kch thc ln nh nam men, nam moc, tao va protozoa,phng phap em trc tiep de dang thc hien vi cac loai buong em. Co rat nhieu loai buonem vi sinh vat khac nhau phu hp vi tng the tch va kch thc cua tng nhom vi sinh vat.V du co the s dung buong em hong cau Petroff Hauser e em vi khuan. oi vi cac maunc va cac mau khac, buong em Holber c s dung rong rai nhat. Buong en Holber lamot lam knh day 2-3mm co mot vung a em nam gia lame knh vung nay c bao quanh

bi mot ranh. a em thap hn be mat cua lame knh khoang 0,02mm, co hnh tron v the khiphu len tren bang knh ay vat th o sau cua a em se ong eu nhau. Vung a em co ientch 1mm2 va c chia thanh 400 o vuong nho hn, moi o co dien tch 0.0025mm2. the tch cuamoi o la 0,02 x 0,0025 mm2, the tch nay tng ng vi 0,00005ml.

Them vai giot formalin vao trong nhng lo cha mau, tron eu. Pha loang mau can emsao cho trong moi o nho cua buong em co khoang 5 - 10 te bao vi sinh vat. e at c o phaloang nh vay can phai c lng c so lng vi sinh vat trong mau, ong thi phai th vailan trong qua trnh pha loang. Mau phai c pha loang bang dung dch pha loang cha 0,1%pepton va 0,1% laurylsulphat va 0,01% methyl blue. Tat ca cac dung dch pha loang eu phaican loc trc khi s dung.

at mot got mau c pha loang vao trong a em tren buong em, ay bang knh ayvat. Tat ca cac buong em va knh ay vat phai c lau that sach. The tch mau cha trongbuong em la khoang khong gian gia a em va knh ay vat, khong e mau trang ra benngoai ranh cua a. Sau khi at mau, e yen khoang 5 phut e on nh v tr cua cac te baotrong buong em. em ngau nhien khoang 50-100 o nho. Tnh trung bnh so lng vi khuantrong tat ca cac o a em. Sau o nhan vi 20 000 va vi o pha loang mau trc khi em eco c so lng te bao trong 1ml. Lap lai hai lan hay nhieu hn e lay gia tr so em trungbnh. oi vi cac vi sinh vat tu thanh tng cum, khong the phan biet tng te bao th moi cumc xem la mot vi khuan.

Vi nhng kinh nghiem cua moi ca nhan ve o pha loang, thao tac ky thuat thanh thao

co the nhan c cac so em chnh xac. Tuy vat ket qua co chnh xac hay khong con phu thuocvao s sach se cua buong em, knh ay vat nham am bao khong co vi khuan khac khong phait mau hien dien trong buong em va trong knh ay vat.

Ky thuat em BreedKy thuat nay rat hu ch trong viec xac nh tong so vi sinh vat bang phng phap em trc

tiep. Lame knh Breed co mot vung co dien tch 1cm2 c anh dau tren lame. Dung bmtiem, hay que cay vong cho 0,01ml mau can em vao trong vung nay, say kho bang ngon lasau o nhuom vi methyl blue. Khi em, cho dau nhung len dien tch vung can em. Thong


9/56


8

thng vung nay co ng knh 0,16 mm. Dien tch vung em la r2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08=0,02mm2. Vi dien tch nay chiem 1/5000 trong tong dien tch at mau la 100mm2 hay the tchtrong vung em la 1/5000 x 0,01ml. Nh vay neu co 1 vi sinh vat trong vung em th tngng vi 5000/0,01ml hay 500 000 te bao/ml. So em cua cac vi sinh vat trong cac vung khacnhau cua vung qui c c tnh bang cong thc nh sau:

2

4104

d

NC

=

d: ng knh vua vung emN: so lng te bao trong 1 vungC: so te bao trong 1ml

Khi s dung knh hien vi huynh quang vi cac chat nhuom khac nh acridin cam(AODC), 4,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC) cung c sdung rong rai e em so lng vi khuan. Cac nghien cu cua K.G. Porter va Y.S. Feig cho thayrang khi s dung DAPI e em so lng vi khuan trong nc cho ket qua tot hn khi s dungchat nhuom AODC khi trong mau nc co nhieu chat dinh dng va nhieu phieu sinh vat khac.Ve o ben tnh phat huynh quang cua DAPI cung cao hn AODC. Hai tac gia tren cung chngminh rang khi nhuom vi DAFI co the bao quan trong toi en 24 tuan ma cng o phat quankhong thay oi. Trong khi o AODC cng o va so lng phat quang b giam khi bao quantrong vong 1 tuan cung ieu kien.

Mot ky thuat khac da tren nguyen tac nhuom mau ac hieu DNA c goi la Hoechst33258 cung c s dung e nhuom va em so lng vi sinh vat tren knh hien vi huynh quang.Phng phap nay nh sau: Bisbenzumide ket hp vi vung DNA giau adenine va thyamine saukhi gan phc hp nay se phat huyng quang. Hoechst 33258 c s dung nhieu trong viec nhlng vi sinh vat tren be mat. at biet tren be mat co gan cac acridine orange. Mot s thuan li

khac khi s dung phng phap nhuom mau bisbenzimide cho phep em so lng vi sinh vattrong cac dung dch chat tay ra, trong muoi dung cho cac phong th nhiem hay trong cac chepham sinh hoc khac ma khong co s hien dien cua DNA. Phng phap em so lng vi sinhvat bang phng phap phat huynh quang c ng dung rong rai trong viec phan tch cac maumoi trng nh nc at .

S dung dau nhung phat quang thap la mot phat minh quan trong trong viec han che sphat huynh quang cua cac mang loc. Mang carbonate Nuclepore la mot mang cellulose cao capdung trong viec em trc tiep vi khuan bi v chung co kch thc lo ong nhat va be mat mangphang, chung co the gi lai tat ca cac vi sinh vat tren be mat cua chung. Mang Nuclepore cothe nhuom vi thuoc nhuom Irgalan en hay cac loai thuoc nhuom phu hp khac e tao nen

mot nen mau en tng phan vi mau phat quang cua vi sinh vat v the viec em c thchien de dang. Khi s dung thuoc nhuom la acridine cam vi khuan va cac vi sinh vat khac phatquang mau xanh hay mau cam. Mau phat quang xanh hay cam la phu thuoc vao tnh trang sinhly cua tng vi sinh vat. Nhng kha nang phan biet te bao ang song hay te bao a chet bi mauphat quang oi khi a en s nham lan. S dung ADPI nhuom DNA cua te bao vi khuan chunga en s phat quang mau xanh dng c cho la toi u hn so vi viec s dung acridin came nhuom cac vi khuan co kch thc nho.

So em nhan c t phng phap em trc tiep tren knh hien vi phat huynh quangluon cho ket qua cao tng ng hai lan so vi ket qua nhan c bang ky thuat nuoi cay


10/56


9

khac. Nhng vi khuan co kch thc nho, co hnh dang bat thng khac cung eu co the nhnthay bang phng phap phat huynh quang. Mot so dang vi sinh vat khong the nuoi cay trong cacmoi trng tong hp trong phong th nghiem. Hien tng khong the nuoi cay cua cac vi sinh vatcho en nay van cha ro la do chung thoai hoa, khong the nhan len trong cac moi trng nhantao hay do khong ap ng c cac ieu kien sinh ly can thiet cho s phat trien cua chung.Trong mot so trng hp, s tng quan cao gia phng phap em trc tiep bang phng phap

phat huynh quang va phng phap em khuan. Tuy nhien trong mot so trng hp khac stng quang nay rat kem. S khac biet gia phng phap em trc tiep va phng phap emkhuan lac phan anh s chon loc cua moi trng va ieu kien nuoi cay, mot phan te bao b chethay b thng ton va so loai cu the trong mau.

Bang 2: Ket qua tong so vi khuan nhan c t phng phap em trc tiep tren knh hienvi va phng phap em khuan lac 20oC va 4oC.

em khuan lacMau em trc tiep

4oC 20oC

Nc bienNc aNc t nhienNc t vnhAlaskaAlaska

9.9 x1048.2 x1051.8 x1055.2 x1053.0 x1051.4 x105

6.6 x1019.6 x1036.1 x1025.0 x1041.0 x1021.3 x102

4.5 x1017.3 x1031.1 x1012.7 x1045.2 x1022.4 x102

Gia tr cua so em trc tiep bang phng phap phat huynh quang tren knh hien vi tngng vi vi so lng vi sinh vat that s co the co vi tat ca cac loai khac nhau. ieu o chophep c oan c c so lng that s trong nc bien, trong nc t nhien, trong trong motloai mau nao o, mat du cac loai nay co s khac biet ln ve so lng cua tng chung loai, khacbiet ve ac iem sinh ly dien ra trong cung ieu kien cua mau. So em trc tiep thng phan

anh ung vi sinh khoi, v the thng c dung e c lng sinh khoi vi sinh vat co trongmau. Tuy nhien e co c so em chnh xac bang knh hien vi phat huyng quang can phai emnhieu lan va nhieu v tr khac nhau tren mau.

Them vao o neu em nhieu te bao ang phan chia co the cho phep c oan toc ophat trien cua vi sinh vat trong mau. Tan suat cua te bao ang phan chia c nhn thay co moilien he vi ch so o khac cua toc o phat trien vi sinh vat nh toc o tong hp RNA c obi s phong thch cua adenine c anh dau. Tang xuat cua te bao ang phan chia c tnhbang thi gian gia luc bat au s that cua te bao en khi te bao phan chia la mot hang so. Conso nay khong phai la bat bien. That kho khan e nhan ra s phan chia te bao khi s dung knhhien vi quang hoc ma khong s dung knh hien vi phat huynh quang.

2. Cac ky thuat nh lng vi sinh vat trong mau bang phng phap nuoi cayCo hai cach e xac nh so lng vi khuan bang phng phap nuoi cay: phng phap

em khuan lac va phng phap c oan so lng vi khuan (MPN Most probable number).Tat ca cac phng phap nh lng vi khuan trong mau bang phng phap nuoi cay eu yeu caucac te bao phai c tach ri nhau, qua qua trnh nuoi cay cac te bao nay phat trien thanh cacdong rieng biet. Tat cac qui trnh nh lng bang phng phap nuoi cay nham chon loc mothay nhieu nhom vi khuan nhat nh nao o, mc o chon loc phu thuoc va tng qui trnh quitrnh cu the. e xac nh tong so vi sinh vat trong mau phai chon qui trnh giam toi thieu kha


11/56


10

nang chon loc. Nhng du mc o chon loc mc toi thieu cung ch nh lng c so lng visinh vat co the nuoi cay. Con mot so lng ln vi sinh vat khac khong the phat trien c trongqua trnh nuoi cay th khong the nh lng c bang phng phap nay. Co cac phng phapnh lng nuoi cay nh sau nh sau:

1.1Phng phap em khuan lacPhng phap em khuan lac tren a c s dung rong rai e nh lng vi sinh vat,ac biet la vi khuan, nhng phap nay co nhng khuyet iem va a co nhng cach nhn nhan

khac nhau ve mat khoa hoc. Khuyet iem cua phng phap nay nam trong s lam dung e bieuat sai cac ket qua. Tat ca moi ngi eu mac sai lam khi nhan ra rang phng phap nay khongthe dung e thu c ket qua tong so vi sinh vat.

Phng phap em khuan lac s dung nhieu loai moi trng va cac ieu kien nuoi cay khacnhau. Agar la chat thng c dung e lam ac cac moi trng nuoi cay v hau her cac vi sinhvat eu mat cac gen tong hp enzym phan giai agar. Cac mau a c pha loang e trai len bemat moi trng agar (phng phap trai) hay khuyet tan vao trong noi trng trc khi lam ac(phng phap o a). Mot van e can phai can nhac la cac vi sinh vat can xac nh co the tontai va phat trien trong moi trng agar hay khong. Mot so vi sinh vat co the b chet khi trai tren

be mat moi trng trong qui trnh cay trai be mat. Mot so loai vi khuan khac khong the songtrong ieu kien nhiet o duy tr trang thai long cua agar trong qui trnh o a. Bi v agar ch latac nhan lam ran moi trng nuoi cay trong qui trnh nh lng vi sinh vat v the trong mot sotrng hp agar co the c thay the bang cac tac nhan lam ran khac. Trong mot so trng hpcac vi sinh vat co cac nhu cau dinh dng ac biet khac, cac chat nh silicagel co the c thaythe e lam ran moi trng. Nh ng v chuan b moi trng silicagel kho khan hn chuan b moitrng agar nen ch dung moi trng silicagel khi khong the thay the c moi trng agar.

Phng phap ong cuon c dung e nh lng cac vi sinh vat k kh bat buoc. ay lamot phng phap cai bien cua phng phap o a. Cac a hay cac ong sau khi cay vi khuanc u trong ieu kien nhiet o ac biet trong mot thi gian nhat nh e cho sinh vat phat trien

thanh cac khuan lac co the nhn thay bang mat trng, so lng khuan lac xuat hien tren a sec em. So lng khuan lac se c gan cho so te bao n le trong mau ban au. e solng khuan lac phan anh c so lng te bao vi khuan, mau phai c phan tan eu vaotrong moi trng hay tren be mat moi trtng ran. Nhng a co qua nhieu khuan lac xuat hienth khong the cho so lng em chnh xac bi v chung co the chong lap len nhau. Nhng a coqua t khuan lac cung phai bo i v theo nguyen tac cua xac suat.

Nhng van e chnh yeu can xem xet trong qui trnh em khuan lac la thanh phan moitrng, ieu kien va thi gian nuoi u. Moi trng e nh lng cac vi sinh vat d dng khongthe co nh nit phai cha cac nguon nit, carbon, phosphate de s dung va cac cation, anioncan thiet nh sat, mangie, calci, natri, clo va sulphate. Thanh phan cua cac ham lng khongnhat nh, chung at thu cho tng loai moi trng va tng loai mau nhat nh e co the nhanc so lng vi sinh vat muc tieu cao nhat. Nh vay moi trng nuoi cay phai co cac thanhphan dinh dng phu hp vi tng yeu cau cua loai vi sinh vat, bao gom ca cac nhan to canthiet khac cho s phat trien cua mot he vi sinh vat nhat nh. Muc ch chung cua moi trng laham lng dinh dng phai cao hn cac thanh phan co trong cac mau ang phan tch. Hamlng dinh dng trong cac loai moi trng em tong so vi sinh vat phai u cao, va oc tnh cuamoi trng oi vi sinh vat mc thap nhat.

e nang cao hieu qua cua qui trnh nh lng vi sinh vat bang phng phap em khuanlac, cac ieu kien can phai ieu chnh sao cho ch co cac thanh vien vi sinh vat can phat hien


12/56


11

theo nh ngha c em. Cac moi trng em a c chon loc hay phan biet vi cac thanhvien vi sinh vat khac. Qui trnh em a chon loc c thiet ke cho thch hp vi s phat triencua vi sinh vat mong muon. S phat trien cua cac nhom vi sinh vat khac c loai bo bi cacthanh phan cua moi trng hay ieu kien nuoi u. Moi trng phan biet la moi trng khong loaibo cac nhom vi sinh vat khong mong muon ma ngc lai cho phep chung phat trien cung trenmoi trng o nhng co the biet phan biet cac nhom vi sinh vat mong muon vi cac nhom khac

bang cac ac iem nhan dang.Moi trng cung co the c thiet lap e chon loc cac loai nam moc. Mat du ky thuatem khuan lac khong phai la phng phap c chon cho viec xac nh so lng nam moctrong cac mau thc pham va trong moi trng. Bi v ky thuat nay ch thch hp cho viec nhlng cac loai vi sinh vat khong co si hay bao t. D nhien phng phap em khuan lac cungthch hp cho viec nh lng cac loai nam men. V so lng cua vi khuan luon nhieu hn solng cua nam moc nen e ngan can s phat trien cua vi khuan trong cac khuan lac cua nammoc, cac tac nhan c che vi khuan c them vao trong cac moi trng nuoi cay. Cac thuocnhuom bengal rose va cac khang sinh nh streptomycine, neomycine thng c s dung lanhng tac nhan c che vi khuan. Mot bien phap n gian e c che s phat trien cua vi khuanla ha thap pH cua moi trng nuoi cay xuong khoang 4,5 - 5,5. Hau het cac nam moc eu

khong b tac ong khi phat trien trong khoang pH nay nhng khi o vi khuan b c che.Moi trng chon c xac lap cong thc e c che s phat trien cua nhom vi sinh vat va

cho phep mot nhom vi sinh vat khac phat trien. V du moi trng Saubouraud Dextrose Agarc dung e nh lng nam moc da tren nguyen tac pH thap va nguon carbohydrate. Bosung vao moi trng cac chat khang sinh khac nh peniciline hay methyl bule la nhng tac nhanc che vi khuan gram am. Cac vi sinh vat khang khang sinh cung co the c nh lng trenmoi trng bang cach them vao o mot lieu lng khang sinh.

Moi trng phan biet c thiet lap da tren nhieu cach. Cac thuoc th c them vaotrong moi trng e cho phep nhan ra cac s khac biet cua nhng vi sinh vat mong muon. Cothe them thuoc th vao moi trng sau khi nuoi cay e nhan ra cac loai vi sinh vat ac trng

can tm. Cha khoa nang cao kha nang phan biet cua moi trng la qui trnh nuoi cay e chophep moi trng phan biet mot cach tot nhat vi vi sinh vat can nh lng va cac vi sinh vatkhac co trong mau.

Moi trng Eosin methyl blue (EMB) va MacConkey agar la nhng moi trng c sdung rong rai trong viec phan tch vi sinh vat trong nc. Nhng moi trng nay bao gom tnhchon loc va tnh phan biet. Chung chon loc cho s phat trien cua cac vi khuan gram am bitrong o co them vao cac tac nhan c che cac vi khuan gram dng. Moi trng nay co thephan biet cac vi khuan co the s dung lactose bi s hnh thanh cac khuan lac co the phan bietbang mau sac. Tren moi trng EMB, vi khuan thuoc nhom coliforms la nhom gram am tao nennhng khuan lac co mau tm anh kim. nh lng so lng coliform bang cach em so lng

khuan lac co cac ac iem nay. Cach nay thng xuyen c s dung trong viec phan biet cacvi sinh vat ch th trong nc va trong thc pham.Vi ky thuat en khuan lac, cac mau can phan tch phai c pha loang thanh chuoi pha

loang lien tiep va c xac nh mot vai nong o pha loang nhat nh e cay vao cac moitrng a chon phu hp vi cac oi tng can xac nh. Moi khuan lac c hnh thanh cgan cho mot n v hnh thanh khuan lac (cfu-colony forming units). Ky thuat thng qua cacbc nh sau:

Dung dch pha loang: mot so dung dch dung e pha loang co the lam chet te bao nh:nc muoi, nc cat. Cac dung dch pha loang khong c dung ngay khi lay ra t tu lanh co


13/56


12

the gay soc va lam cho vi sinh vat khong the phat trien c. Dung dch pepton water la dungch pha loang c s dung nhieu nhat va c xem la dung dch pha loang cho tat ca cac loaimau. Neu trong mau con co mot t cac chat kh trung th phai them vao dung dch pha loang tacnhan giam thieu kha nang kh trung cua chung, v du: neu trong mau con d lng cua cac hpchat amonium (NH4

-) th co the them vao o Tween 80 hay lecithin. Ngc lai neu trong mauco cha cac hp chat chlorin hay iodin th can them vao o cac muoi nh sodium thiosulphate.

Chuan b cac chuoi pha loang mauBm chnh xac 9ml dung dch pha loang vao trong ong nghiem co nap ay. Neu s dungcac ong nghiem co nap khong ong chac c th phai kh trung ong nghiem, sau o bm dungdch pha loang vao, cac thao tac nay phai c thc hien mot cach vo trung. Phan phoi dungdch pha loang vao cac ong sau khi kh trung con co y ngha am bao the tch dung dch phaloang khong b mat do qua trnh kh trung. Cac thao tac pha loang tuy thuoc vao tng loai mau.Cu the nh sau:

- Neu pha loang cac mau la chat long, trc khi pha loang mau phai c lac ky, camau pippette sau vao trong mau khoang 1 hut ra 1ml, cho vao trong ong cha dung dch phaloang au tien, lac ky ong nghiem cha mau, bo pippette va s dung, dung mot pipptte mithc hien lai thao tac nh tren vi cac o pha loang tiep theo. C tiep tuc nh vay cho en khi

at c o pha loang mong muon. Moi o pha loang ch c phep s dung 1 pippette. Hamlng mau trong 1ml dung dch cac o pha loang cua day nh sau:

Ong so 1 2 3 4T le pha loang 1/10 1/100 1/1000 1/10000

The tch mauban au (ml)

0,1 0,01 0,001 0,0001

o pha loang 10-1 10-2 10-3 10-4

- oi vi cac mau ran hay ban long, cac thao tac c tien hanh nh sau: can 10 g mau

vao trong cac bao dap mau hay cac may xay vo trung, them 90ml dung dch pha loang va ongnhat mau, phai am bao sao cho vi khuan phan tan eu vao trong dung dch. Sau khi mau vadung dch pha loang c ong nhat ta c dung dch pha loang 1/10. Cac o pha loang sauc tien hanh tng t nh phan pha loang mau long. Trong 1ml cac dung dch pha loang chaham lng mau nh sau:

Ong so 1 2 3 4T le pha loang 1/10 1/100 1/1000 1/10000

Khoi lng mauban au (g)

0,1 0,01 0,001 0,0001

o pha loang 10-1

10-2

10-3

10-4

Cac ong nghiem cha cac o pha loang khac nhau phai c anh dau e tranh nham lan.

Cay mau bang phng phap o aCac moi trng agar c un chay trong cac chai hay trong cac ong nghiem co the tch

phu hp. c lam mat trong cac be ieu nhiet 45oC.Hut 1ml moi dung dch pha loang cho vao trong a petri vo trung. Moi o pha loang

thng c cay vao hai a petri hay nhieu hn. Cung s dung cac pippette sach cho moi opha loang. Ch chon cay vao a petri nhng o pha loang co mat o vi sinh vat phu hp, thng


14/56


13

trong khoang 25-300 te bao/ml. o vao moi a a cay 10-15ml moi trng a c un chayva lam nguoi, lac a theo chieu va ngc chieu kim ong ho khoang 5-6 lan, ac a len matphang ngang va i cho en khi moi trng trong a ong ac. Lat ngc a va u trong ieukien nhiet o va thi gian xac nh.

Cay mau tren be matay la phng phap thay the cho phng phap o a e phan tch cac ch tieu vi sinh trong

thc pham, nhat la cac ch tieu vi sinh vat nhay cam vi nhiet o nhPseudomonas, cac vi sinhvat nay se b suy yeu khi tiep xuc vi nhiet o cua moi trng agar trang thai long. Phngphap nay cung c dung e phan tch cac ch tieu ma cac dong nhan c phai cay chuyen cac bc tiep theo.

Cay 0,1ml hay the tch phu hp len be mat bang pipettes hay bang que cay len a moitrng a c lam kho va trai eu bang que cay trang hay que cay vong e trai mau tren khapbe mat moi trng. U cac a a cay ieu kien nhiet o va thi gian xac nh tuy theo tngch tieu phan tch, em cac khuan lac ac trng hay tat ca cac khuan lac xuat hien tren a.

Khi em cac khuan lac, trong mot so trng hp xuat hien cac khuan lac moc lan, thongthng cac khuan lac khac cung c nhn thay ben trong cac vet khuan lac loang. Khi em tach coi khuan lac loang la mot n v hnh thanh khuan lac va en cac khuan lac khac trong

khuan lac loang. Cac khuan lac loang nay la do cac vi khuan tap trung thanh tng tap oantrong qua trnh phat trien.

em khuan lac trong trng hp cay trang hay o aem tat ca cac khuan lac n le tren cac a cay a chon, thong thng chon cac a co

so lng khuan lac trong khoang 30 - 300 khuan lac. Thng dung cac but co the viet len thuytinh e anh dau cac khuan lac a em pha sau a petri. Co the dung cac thiet b ho tr trongqua trnh em so lng khuan lac nh may em hay knh lup. Tnh toan so n v hnh thanhkhuan lac theo cac cong thc thong ke da tren the tch mau cay, so lng khuan lac tren caca, o pha loang a cay va so lng a cua moi o pha loang. Thong thng so n v hnhthanh khuan lac trong mot gram mau hay 1ml c tnh toan t nhat t hai nong o pha loang

lien tiep cua mau. Cac tng trnh ket qua c bieu dien di dang so n v hnh thanh khuanlac/g (ml) (cfu/g). Khong bieu dien ket qua di dang so vi khuan/g(ml).

Phng phap em khuan lac tren ongThay v dung a petri, co the dung ong nghiem co ng knh ln hay cac chai nho co

nap e thay the. Cay mau vao, cho moi trng vao, lac theo chieu ngang cho en khi moitrng trong chai hay ong ong ac.

Phan phoi 2-4 ml moi trng co ham lng agar cao hn cac moi trng dung cho o akhoang 0,5-1% vao ong nghiem co nap vi the tch 25ml, moi trng a c lam nguoi en45oC, cay vao ong nghiem 0,1ml mau a c pha loang. Lac cac ong theo chieu ngang trongnc lanh cho en khi agar ong ac tao thanh mot mang film ong nhat tren thanh ongnghiem. V the ky thuat nay can co nhng ky nang kheo leo. Mot phng phap khac co thec dung la s dung mot mau nc a, at len tren mot manh vai va lam mot ng ranhbang vi ong nghiem bang cac xoay tron ong nghiem at ngang tren mieng bang. Cac ongnghiem a cay mau va moi trng c xoay tren manh cua mieng bang. Vi phng phap nay,cac ngi thc hien co the tiet nhien c nhieu thi gian va sc lao ong.

Cac ong sau khi cay mau c lat ngc e tranh s ngng tu hi nc gay nen vetloang sau khi u. em cac khuan lac xuat hien trong lp mang fiml agar xung quanh ong, cackhuan lac nang sau ben trong co the c quan sat bang knh lup.


15/56


14

Phng phap dung ky thuat ong xoay c s dung nhieu trong viec phan tch cac mausa va cac san pham cua sa, cac loai mau thc pham cong nghiep. Cho en nay a co nhngthiet b thay the cho viec xoay ong, am bao cac mang film tren thanh ong ong nhat va tietkiem c thi gian cung nh cong lao ong.

Phng phap cay theo ng xoan ocPhng phap nay da tren s ho tr cua mot thiet b xoay. Thiet b nay co the hoat ong

hoan toan t ong va cung co the hoat ong khong t ong. Thiet b nay se phan phoi motlng mau xac nh len be mat a ang xoay tron. iem tiep xuc cua mau va a moi trngbat au t trung tam a va di chuyen dan ra ben ngoai theo ng xoan oc. Sau khi lam kho bemat moi trng, a c u trong ieu kien xac nh, vi khuan se phat trien theo ng xoan oc.Cang xa tam cua a, mat o vi sinh vat se giam dan va se xuat hien cac khuan lac rieng biet.

Can c vao toc o xoay cua thiet b, the tch mau phan phoi va kch thc cua a, mato khuan lac xuat hien vong xoan cuoi cung se tnh c mat o vi sinh vat trong mau. Ketqua tong so n v hnh thanh khuan lac c xac nh bang phng phap nay c cho la tngng vi phng phap o a hay cay trai tren be mat. Cac he thong t ong c thiet ke datren nguyen tac cay xoay c thiet ke vi s ho tr cua cac may em khuan lac ban tia lasera c ban ngoai th trng rat thuan tien cho viec phan tch tong so vi sinh vat va cho ket qua

chnh xac trong thi gian nuoi cay ngan.Phng phap em khuan lac tren mang locPhng phap nay thng c ap dung cho cac mau long nh nc, sa va c anh

gia la cho ket qua chnh xac hn so vi phng phap c oan MPN. Cac mau chat long cloc qua mang loc co kch thc lo loc nho hn kch thc cua vi sinh vat. Vi sinh vat c gialai tren mang loc. Mang c at tren moi trng agar hay tren giay tham c ngam sun moitrng nuoi cay long a chon va u trong ieu kien xac nh. Sau khi u, em cac khuan lac sexuat hien tren be mat mang loc.

Thiet bi loc co the bang thuy tinh, bang kim loai hay bang nha, bao gom pheu loc gia mang loc, bo thiet b ho tr hut chan khong va bnh cha. Mang loc c lam bang cellulose

ester co lo loc mam trong khoang 0,1-1 m, cac loai mang loc dung cho viec phan tch tong sovi sinh vat thng co kch thc lo loc la 0,47m, ng knh mang loc co nhieu kch c khacnhau phu hp vi ng knh cua pheu loc, be day cua mang khoang 120m. Khi loc tat ca cacvi khuan eu c gi lai tren mang. Khi ac mang loc sao cho be tren cua mang hng lenpha tren, vi khuan khong tiep xuc trc tiep vi moi trng nhng, cac thanh phan cua moitrng de dang tham qua mang va nuoi vi khuan phat trien thanh khuan lac. Mot so loai mangloc co gan cac li k nc ch cho phep khuan lac phat trien trong moi o cua li va khong cholan sang cac o khac nham tao ieu kien thuan tien khi em.

1.2Phng phap c oan so lng vi sinh bang ky thuat MPN (Most Probable Number):Phng phap MPN la phng phap co the thay the phng phap em khuan lac e xac nh

mat o vi sinh vat trong mau, phng phap nay c da tren nguyen tac xac suat thong ke sphan phan bo vi sinh vat trong cac o pha loang khac nhau cua mau. Moi o pha loang cnuoi cay lap lai nhieu lan trong cac moi trng long a c chon, thong thng phai cay laplai t 3-10 lan tai moi nong o pha loang. Cac o pha loang c tien hanh sao cho trong caclan lap lai co mot so lan cho dau hieu dng tnh va mot so lan cho dau hieu am tnh. So lan laplai cho dau hieu dng tnh va am tnh c ghi nhan e oi chieu vi bang thong ke se cgia tr c oan so lng vi sinh vat trong mau. Qui trnh MPN cho gia tr so lng vi sinh vattrong mau co y ngha thong ke theo xac suat phan bo vi sinh vat trong mau khi s dung mot so


16/56


15

lan lap lai, v the khoang tin cay la rat ln. Phng phap MPN e nh lng vi sinh vat cho ennay a co nhieu cai tien cho phep tien hanh qui trnh de dang va ton t sc lao ong hn va chogia tr chnh xac cao hn.

Chon nong o pha loang sao cho trong cac lan lap lai co mot so lan cho ket qua dngtnh va mot so lan cho ket qua am tnh , s la chon nay rat quan trong. Trong nhieu trng hpqui trnh MPN c thiet lap sao cho gia tang so lng lan lap cho ket qua dng tnh bang tn

hieu phat trien cua vi sinh vat. Trong mot so trng hp khac, qui trnh c thiet lap co nhieuth nghiem khang nh sau khi cac lan lap lai cac o pha loang cho tn hieu phat trien cua visinh vat nh phat hien protein hay mot emzym nao o. Cac th nghiem sau nay cho ket quadng tnh th cac lan lap lai ban au mi c khang nh la dng tnh. Cung giong nh quitrnh em khuan lac, qui trnh MPN cung c s dung cac moi trng chon loc, khong chon lochay moi trng phan biet.

Phng phap MPN cung c dung e nh lng virus ng ruot. Trong phng phapnay, mot chuoi pha loang cua mau can kiem tra c cho vao trong cac ong nghiem cha te baochu thch hp c nuoi cay. Sau khi u, cac ong nghiem c kiem tra hieu ng cytopathic(CPE), o la cac bieu hien lam chet te bao b xam nhiem. So lng virus trong mau cung nhanc t bang MPN bang s tham chieu so lng cac ong nuoi cay cho hieu ng CPE dng tnh.

So lng cua virus cung co the c nh lng bang ch so TCID 50 (Tissue culture infectiousdose 50%). Nong o pha loang thap nhat co s hien dien cua virus o la nong o co t so CPE la50% trong cac ong nghiem.

Cung giong nh qui trnh em a, trong phng phap MPN, moi trng va nong o nuoicay cung c ieu chnh e chon loc cho mot nhom vi sinh vat hay phan biet cac nhom vi sinhvat nay vi cac nhom vi sinh vat khac vi cac ac iem mong muon, ro rang rang s ket hpgia ieu kien nuoi cay va moi trng cung co the nh lng nhng nhom vi sinh vat ac bietnao o theo nh ngha cu the. Moi qui trnh phai c chon loc mot cach cu the va can than eco the thu c ket qua mot cach chnh xac.

Theo quan iem cua C.H. Collins va Patricia M. Lyne thc chat con so MPN bieu dien

so lng vi sinh vat trong mau la so lng trung bnh sau cac lan lap lai. Neu so lng vi sinhvat trong mau ln th s khac biet cua cac mau gia cac lan lap lai la nho, ket qua rieng le cuatat ca cac lan lap gan vi ket qua trung bnh. Neu so lng vi sinh vat trong mau nho, s khacbiet nay se ln. Neu trong mot mau chat long cha 100 vi sinh vat/100 ml, th trong 10 ml mause cha trung bnh 10 te bao. D nhien co mot so phan mau nhieu hn 10 te bao, tham ch conhng phan mau co the cha 20 te bao trong 10ml mau va mot so phan mau cha t hn. Neutat ca cac phan mau tren c nuoi cay trong moi trng va ieu kien thch hp, cac vi sinh vattrong mau se phat trien va cho tn hieu dng tnh.

Tng t nh vay, 1ml se cha trung bnh 1 te bao vi sinh vat, nh vay co nhng lan layse co 2 hay 3 te bao va co nhng lan lay se khong co te bao nao. Neu cac lan hut nay c

nuoi cay trong moi trng va ieu kien thch hp se thu c nhng ong nghiem cho ket quadng tnh va nhng ong cho ket qua am tnh.Neu hut 0,1ml th sau 10 lan hut mi co kha nang nhan c 1 lan hut co 1 te bao, nh

vay hau het cac lan nuoi cay khi lay 0,1ml th eu cho ket qua am tnh.Co the tnh toan con so chac chan so lng vi sinh vat trong trong 100ml mau bang s

ket hp cac ket qua nhan c t cac chuoi cay nh tren. Bang gia tr MPN khi s dung hethong cay vi cac day 5 ong 10ml, 5 ong 1ml va 5 ong 0.1ml a c tnh san va dung cho phantch cac mau nc hay cac mau a pha loang. Cho en nay co rat nhieu bang gia tr MPN c


17/56


16

s dung vi o chnh xac va cac khoang tin cay khac nhau va c s dung cho cac muc chkhac nhau.

Phng phap MPN c dung chu yeu e phan tch Coliforms va cac vi sinh vat khackhi chung phat trien trong moi trng nuoi cay long cho cac tn hieu de dang nhan dang nhsinh hi, lam uc moi trng chon loc, thay oi pH moi trng V du nam men va nam moc

trong nc trai cay hay rau qua, vi sinh vat k kh hay cac bao t Clostridia.1.3Phng phap lai khuan lacLai khuan lac la phng phap ket hp gia phng phap lai phan t va phng phap

nuoi cay truyen thong trong viec phan tch cac ch tieu vi sinh vat trong cac mau. Sau thi giannuoi cay tren be mat moi trng thach, cac khuan lac vi khuan c chuyen len mang lai, cackhuan lac nay c ly giai trong moi trng kiem hay x ly bang emzym, sau o tien hanh laiphan t. Phng phap nay phu thuoc vao kha nang phat trien cua vi sinh vat muc tieu tren moitrng, chung khong phu thuoc s phat trien cac cac quan the vi sinh vat khac. S phat triencua vi sinh vat muc tieu trong moi trng lam gia tang so lng ban sao cua cac gen muc tieu,v the chung se gia tang kha nang phat hien cua cac mau do.

Nguyen tac cua phng phap nay c phat trien au tien bi M. Grunstein va S.D.

Hogness (1975) nham muc ch sang loc tren a co mat o cao cho cac dong nuoi cay thuan.Trong qui trnh nuoi cay khuan lac vi khuan phat trien tren moi trng ran c chuyen lenmot gia phu hp nh mang nitrocellulose, ly giai e tach DNA va bien tnh chung sau o conh chung tren mang. Mang loc co nh DNA c u vi mau do. Mau do c tach ra t motoan thong tin di truyen. Va c anh dau bang cac cac ong v phong xa nh32P hay cacchat phat quang khac nh biotin. Hien tng lai c din ra neu cac trnh t base cua cac te baoc ly giai tng ong vi cac trnh t tren mau do e hnh thanh cac oan lai mach oi. Cacoan lai nay c phat hien bang bang cac film phong xa t ghi khi cac mau do c anh daubang cac ong v phong xa, hay cac film nhay sang khi cac mau do c anh dau bang biotin.Bang phng phap nay, cac ac iem di truyen ac trng c phat hien mot cach chuyen biet.

Neu chon mau do ac trng cho mot nhom vi sinh vat, phng phap nay co the phat hien vanh lng nhom vi sinh vat o trong mau.

Mau do c lai vi cac vi sinh vat co nguon goc t mau, hay cac dong thuan c phanlap va nuoi cay th cap. Bang phng phap nay co the cai thien c cac bat tien trong quatrnh phan tch bang phng phap nuoi cay thuan tuy nh:

- Tranh c nhng sai lech trong qua trnh em khuan lac tren moi trng nuoi caychon loc.

- Chac chan phat hien c cac dong mang kieu gen muc tieu can phat hien du cacgen o khong hay bieu hien rat kem trong mot so ieu kien nuoi cay.

- Co the phan tch c cac vi sinh vat b tress hay khong the nuoi cay c tren cacmoi trng chon loc bang cach thay the bang moi trng khong chon loc hay moitrng dinh dng toi a.

- Giam c thi gian phan tch bang cach giam thi gian nuoi cay, qua trnh nhlng gia nh va thi gian khang nh kieu gen hay kieu hnh.

Phng phap lai khuan lac cung c s dung e khang nh cac dong vi sinh vat nghing a c lam thuan.

ng dung chu yeu cua phng phap lai khuan lac la phat hien, nh lng va phan lapcac vi sinh vat co kieu hnh va kieu gen ac trng. Va c s dung ac biet trong viec kiemsoat s hien dien va hoat ong cua cac dong vi sinh vat trong moi trng. Nghien cu s phan


18/56


17

bo cac vi sinh vat khang khang sinh, khang kim loai nang trong nc trong cac mau moi trngva trong thc pham.


19/56


18

Chng 3CAC PHAN NG SINH HOA TRONG XAC NH VI DINH VAT

e xac nh vi sinh vat da tren nhng ac iem ve kieu hnh th nhng vi sinh can phathien trong mau phai co cac ac iem e nhan ra chung va co cac bieu hien khac biet ve kieuhnh trong suot thi gian nuoi cay In vitro (Atlas 1991). Trong mot so trng hp, quan sat mot

ac iem rieng biet co the u e nhan ra mot so vi sinh vat muc tieu. Trong nhng trng hpkhac, can thiet phai xac nh lan lc nhieu ac iem khac biet nhau e phan biet cac vi sinhvat muc tieu vi cac vi sinh vat khac. Viec xac nh ro rang mot vi sinh vat tren c s kieu hnhla cong viec kho khan bi v ngay ca nhng vi sinh vat co moi quan he ho hang xa cung co theco kieu hnh tng t mot so ac iem.

Phng phap co ien e xac nh vi sinh vat la cay chung len moi trng ran (qui trnhcay a) hay trong moi trng canh (qui trnh tang sinh) cha tat ca cac chat dinh dng canthiet cho s phat trien cua vi sinh vat muc tieu, u moi trng a nuoi cay trong ieu kien thchhp cho s phat trien cua vi sinh vat ong thi chung bieu hien kieu hnh co the nhan ra.

Qua trnh cay len a nham tach biet cac te bao cac vi sinh vat e cho chung ri nhau nhng v tr oc lap tren moi trng ran, khi te bao vi sinh vat nhng v tr rieng re sinh san,chung hnh thanh nhng khuan lac rieng biet bao gom nhng te bao co nguon goc t mot te baokhi au. Qui trnh cay a bao gom hai giai oan: 1. Phan lap cac vi sinh vat t tap hp cac visinh vat trong quan the t nhien sao cho kieu hnh cua moi vi sinh vat c xac nh tren c scua phong phap nuoi cay thuan khiet cua vi sinh vay hoc, 2. Chung phat trien va the hiennhng dau hieu (kieu hnh) e co the nhan ra thong qua s sinh san cua te bao. ac iem kieuhnh cua hang trieu te bao c cho la giong nhau trong mot khuan lac co the c quan sat dedang hn nhieu so vi cac vi sinh vat rieng le.

Phng phap em a co hieu qua trong viec xac nh mot vi sinh vat cu the khi nhngvi sinh vat muc tieu o hien dien mot so ln trong tap hp vi sinh vat, s hien dien vi so lngthap co the khong c phat hien trong phng phap nay. Trong trng hp mot loai vi sinh vat

ch chiem mot so lng nho trong tap hp o, th co the dung moi trng nuoi cay long trongieu kien thch hp at hieu cho s phat trien cua vi sinh vat o e tang sinh chung.

Vi s ieu chnh cac thanh phan hoa hoc trong moi trng va ieu kien nuoi cay, quitrnh cay a va tang sinh c ap dung e phan biet hay chon loc e phat hien cac vi sinh vatmuc tieu. Kha nang phat trien cua mot vi sinh vat tren mot moi trng cu the da vao kha nangs dung cac thanh phan dinh dng hu c hay vo c ac hieu trong moi trng o. Moi trngnuoi cay co tnh chon loc la do cac thanh phan cau thanh nen chung (nh la ngn carbon cuthe, nong o muoi va cac phan khac). ieu kien nuoi cay cung co the gay chon loc bi s ieuchnh ieu kien sinh ly tang trng (nh nhiet o, nong o oxygen...). Bo sung them cac hpchat gay c che vao moi trng e han che s phat trien cua mot so ln cac vi sinh vat va kch

thch s phat trien cac loai khac mong muon.V ac iem kieu hnh cua vi sinh vat phu thuoc vao ac iem trao oi chat ac hieu vi

thanh phan dinh dng co mat trong moi trng, thuoc nhuom, tac nhan oxy hoa va nhieu thanhphan khac co mat trong moi trng e phan anh s trao oi chat cac chat dinh dng ac hieubi cac quan the khac nhau va t o a en s bieu hien khac nhau gia cac vi sinh vat muctieu.

Phng phap phat hien vi sinh vat bang cac dung moi trng nuoi cay thng theo motqui trnh co he thong nham vao s tien li cua nhng ac iem ac hieu cua vi sinh vat nh lakha nang s dung dinh dng, tnh khang vi cac loai khang sinh, t o vi sinh vat muc tieu co


20/56


19

u the phat trien hn so vi cac loai khac. Tom lai, ac iem co the nhan thay (nhu la sac to),kha nang s dung mot c chat ac hieu hay tnh khang lai cac khang sinh hay kim loai nangc dung e phan biet cac vi sinh vat muc tieu t tap hp cac vi sinh vat.

Trong kiem nghiem vi sinh vat, cac th nghiem sau day thng xuyen c s dung:

1. Th nghiem Bile esculinNguyen tac: Nham xac nh kha nang cua mot vi sinh vat co the thuy giai glucoside

esculin thanh escuiletin va glucose khi co s hien dien cua muoi mat.C s sinh hoa: Esculin la mot glucoside, ay chnh la dan xuat acetal cua motmonosaccharide. Khi mot goc khong phai la mot hydratcarbon lien ket vi mot ng taothanh mot hp chat goi la mot glycoside, phan khong phai ng c goi la aglucon. Agluconlien ket vi ng qua nguyen to oxy (lien ket glucoside).

HO CH2OHCH2OH H OH

H HH HO OH H H

OH H H OH

OH HH OH

Trong phan ng nay esculin b thuy giai tai lien ket vi goc acetal b thuy giai bi acidtao thanh esculetin va giai phong phan t glucose t do.

Esculetin c phong thch phan ng vi muoi sat tao thanh phc hp mau en haymau nau en. Trong th nghiem nay muoi nitrat sat c s dung trong moi nh la c chat nhandang esculetin c hnh thanh. Sau khi cay moi trng c u qua em, cac vi sinh vat cho

phan ng dng tnh la nhng vi sinh vat phan huy c esculin, chuyen moi trng thanh mauen hay mau nam en.

Cac chung vi sinh vat oi chng cho cac th nghiem nay nh sau: oi chng dng: S.marcessens; oi chngam: E. tarda.

2. Th nghiem kha nang len men cac nguon CarbonhydrateNguyen tac:Nham th nghiem kha nang len men mot nguon carbohydrate xac nh nao o trong moi

trng nuoi cay e tao acid va co the tao hi.C che sinh hoa:Carbonhydrate c chia thanh cac nhom nh sau 1. monosaccharide, polyhydroxylic

aldehyde hay ketone, 2. polysaccharide hay oligosaccharide, 3. polyhydric alcohol va caccyclitol, cac san pham kh cua monosacchride.Mot so alcohol c goi la ng nh adonitol, mannitol, sorbitol, tat ca cac san pham

nay la ket qua cua qua trnh kh cac monosaccharide. Cac polysachcaride, trisaccharide vadisaccharide la nhng hp chat phc tap, vi sinh vat khong the hap thu mot cach de dang choqua trnh chuyen hoa. e chung co the s dung c cac carbonhydrate nay, vi sinh vat phaitng hp va tiet ra ngoai cac emzym ngoai nao nham phan huy cac cac phan t nay thanh cacphan t n gian hn, sau o tham qua thanh te bao e chuen hoa ben trong.

+

Esculine (C15H16O9)6,-Glucosido-7-hydroxycoumarin

HO

HO

Esculetin (aglycone)6,7-dihydroxycoumarin

-D-glucose


21/56


20

Len men la mot qua trnh trao oi chat oxy hoa kh ma chat nhan ien t cuoi cungkhong phai la oxy ma la c chat hu c khac. S len men cua cac c chat hu c nhcarbohydrate thu uc hai san pham la chat kh va chat oxy hoa. Cac san pham cuoi cung nhanc t s len men cac c chat hydrate carbon nay phu dthuoc vao cac nhan to nh: (1) dong visinh vat len men; (2) c chat t nhien dung e len men; (3) thi gian, nhiet o va pH cua moitrng. Cac san pham cuoi cung cua qua trnh len men cac nguon hydrate carbon va cac alcohol

thng la cac dang kh (H2, CO2), cac acid hu c, cac alcohol va mot vai keton oi vi nguon carbon la glucose, mot so vi sinh vat co the len men nguon c chat naytrong ieu kien k kh, ngc lai, trong ieu kien hieu kh chung chuyen hoa theo con ngoxy hoa. Mot so dong vi sinh vat khac co the chuyen hoa c chat nay bang ca hai cach. S khacbiet ve cac con ng chuyen hoa cac nguon c chat hu c phu thuoc vao nhom vi sinh vat,giong hay loai, v the can c vao cac con ng khac biet nay cung co the phan biet c cacloai vi nhau.

Cac th nghiem kha nang chuyen hoa cac nguon hydrate carbon c tien hanh tren cacmoi trng long hay ran. Trong moi trng cha mot hay mot vai nguon hydratecarbon can tienhanh th nghiem va mot chat ch th, thong thng s dung chat ch th pH e phat hien cac sanpham acid c tao ra trong qua trnh chuyen hoa. e phat hien cac chat kh c tao ra, mot

ong nghien co kch thc nho lat ngc c cho vao trong cac moi trng long, cac ong nay segi cac san pham kh tao ra trong qua trnh nuoi cay. Trong cac moi trng ran, phat hien cacsan pham kh tao ra bang cach cay sau vao trong phan thach ng. Cac san pham kh tao ra sepha v phan thach nay. Thong thng phat hien s tao thanh cac san pham kh c tien hanhtrong cac phan ng len men cac nguon mono hay disaccharide va c thc hien trong moitrng nuoi cay long. e gay k kh trong qua trnh nuoi cay th nghiem cac chat kh thngc them vao trong moi trng nuoi cay. Mot lng nho muoi sat cung co the gay nen moitrng k kh.

Cac th nghiem kha nang s dung cac nguon Carbonhydrate c tien hanh tren moitrng ran phai them vao cac chat ch th pH, khi cac vi sinh vat phat trien tren be mat hay, cac

san pham acid c tao thanh lam thay oi mau cac chat ch th xung quanh khuan lac.


22/56


21

Cac san pham tao thanh trong qua trnh chuyen hoa cac carbonhydrate)

3. Th nghiem catalase

HCOOHAcid formic

H2 + CO2

CarbonhydrateDisaccharide, trisaccharide, polysaccharide

HOOCH2CH2COOHAcid succinic

CH3CH2COOH + CO2Acid propyonic

CH3COCHOHCH3 + CO2Acetylmethylcarbinol

CH3CHOHCHOHCH

3

2,3-Butylence glycol

CH3COCH3CO2 + acetone

CH3CHOHCH3Isopropyl alcohol

C6H12O6Glucose

CH3COCOOHAcid pyruvic

CH3CHOHCOOHAcid lactic

CH3COOHAcid acetic

+

CH3CHO + CO2Acetaldehyde

CH3CH2OHEthyl alchol

CH3COOHAcid acetic

CH3COCH2COOHAcetoacetic acid

CH3CHOHCH2COOH-hydroxybutyric acid

CH3CH2CH2COOH

Butyric acid

CH3CH2CH2COOHButyl alcohol


23/56


22

Nguyen tac: th nghiem nham phat hien s hien dien cua enzym catalase vi sinh vat.C s sinh hoa: Enzym catalase hien dien trong hau het cac vi sinh vat hieu kh va k

kh co he thong cytochrom. Thong thng nhng vi sinh vat khong co he thong cytochrom thcung khong co enzym catelase, v the chung khong co kha nang phan huy hydropeoxide. Nhngvi sinh vat ky kh bat buoc nh Clostridium co he thong peroxydase thay cho enzym catalase.Tuy the enzym catalase hoat ontg khong chuyen biet va chung co the can thiep vao hoat ong

cua enzym peroxydase. Ca hai enzym catalase va oxydase c chia vao nhom enzymhydroperoxydase, ay la hai nhopm enzym thng c tm thay trong thc vat (peroxydase) vatrong ong vat (catalase). Catalase la mot homoprotein bao gom bon cau t protein va mot nhanFe3+.

Nhng theo Burrow va Moulder co nhng bang chng cho rang mot so vi khuan conhng emzym catalase khong cha nhan Fe3+, cac nghien cu cua Dacre va Sharpe cho thayhoat tnh catalase co hai dang manh va yeu trong lactobacillus, cac nghien cu cua Whittenburycho thay cao hai dang catalase trong vi khuan lactic: nhom catalase phan huy hydroperoxyde,nhom nay khong nhay vi ieu kien moi trng acid; va nhom gia catalase, nhom nay bi mathoat tnh trong moi trng acide. Mot so nghien cu khac cung chng minh rang co hai kieucatalase.

Catalase xuc tac phan ng phan huy hp chat hydroperoxide, trong phan ng nay motphan t hydroperoxide ong vao tro la mot chat cho ien t va mot phan t ydroperoxide khacong vai tro la mot chat nhan ien t. C chat b kh bi nhan hydrogen cung cap t phan tcho ien t, qua trnh dien ra giai phong oxy phan t. C che phan ng nh sau:

Catalase

H2O2 + H H2O + O2H

C che phan ng phan huy hydropeoxyde bi catalasePhng phap tien hanh th nghiemCach 1: Cho hon hp nuoi cay vi sinh vat vao 0,5ml dung dch Tween 80, tat ca cho vao

trong ong nghiem co nap ay. Them vao 0,5ml dung dch hydroperoxyde 20% vao, lac va quansat. Neu co hien tng sui bot kh la co s hien dien cua catalase.

Cach 2: Nho hon hp co t le 1:1 hydroperoxyde va Tween 80 len cac khuan lac vi sinh vatphat trien tren moi trng agar. Quan sat sau 5 phut, neu co hien tng sui bot kh th khuan lacvi khuan co catalase.

Cac chung vi sinh vat oi chng: oi chng dng S. epidermidis, oi chng am:E. feacalis

4. Th nghiem citrateNguyen tac: Nham xac nh kha nang vi sinh vat s dung nguon citrat nh la nguon

carbon duy nhat.C s sinh hoa: Nang lng cung cap cho vi sinh vat khi trong moi trng khong co

nguon nguyen lieu s dung cho qua trnh len men hay tao cac san pham lactic bang cach sdung citrate nh la nguon carbon duy nhat. Trong thng, s trao oi chat citrate bao gom cacbc ket hp acetyl-CoA e tao thanh oxalacacetate e cho chung i vao chu trnh Kreb. Conng ong hoa citrate cac vi khuan thng rat nhanh qua chu trnh tricarboxylic acid hay conng len men citrate. vi khuan s tach citrate bao gom mot he thong enzym khong co s

C chat Chat choC chat b

khChat cho b

oxy hoa


24/56


23

tham gia cua enzym acetyl CoA, enzym nay c c goi la citratase (citrate axaloacetat lyase) hay citate demolase. Enzym nay oi hoi mot cation co hoat tr 2 cho hoat ong cua chung, thong thng cac cation nay la magne ( Mg2+) hay mangan (Mn 2+).

Bc au tien vi sinh vat tach citrate thanh oxaloacetate va acetate. ay la hai sanpham trung gian trong qua trnh ong hoa citrate, con san pham nhan c t qua trnh nay phuthuoc vao pH cua moi trng. Neu pH kiem th trong moi trng se nhan c nhieu acetate va

formate, neu pH acid th san pham tao ra la lactate va CO2. pH tren 7,0 khong co san phamlactate trong moi trng va san pham nhan c nh sau:Citrate CO2 + Formic acid + 2 Acetic acide

pH acid acetyl methycarbinol (acetoin) va latate la san pham chnh cua qua trnh sdung citate.

Moi trng s dung cho qua trnh len men citrate con cha muoi vo c amonium. Motvi sinh vat co kha nang s dung citrate la nguon carbon duy nhat cung co the s dungammonium nh la nguon nit duy nhat, amonium b phan huy e tao thanh amonia, chat nay selam kiem moi trng nuoi cay.

Deffner va Franke thanh lap cong thc cho moi trng citrate cho cac vi sinh vat ngruot, san pham thu c sau qua trnh nuoi cay nh sau:

4 Citrate - 7 acetate + 5 CO2 + formate + SuccinateS s dung cac acid hu c dang muoi cua chung nh la nguon carbon tao nen cac

carbonate hay bicarbonate kiem tnh.e s dung cho viec th nghiem citrate, co the s dung moi trng Simmon citrate agar

hay moi trng long Koser. Nen cay mot lng vi sinh vat va phai, neu cay vi mat o quaday co the gay nen hien tng dng tnh gia. Sau khi cay, u nhiet o 30-37oC, quan sat sphat trien cua vi sinh vat va s chuyen sang km cua moi trng.

Cac chung vi sinh vat oi chng: oi chng dng: P. rettgeri; oi chng am: S.epidermidis.

5. Th nghiem coagulase.Nguyen tac: Th nghiem kha nang cua mot so vi sinh vat lam ong tu huyet tng bihoat ong cua emzym coagulase.C s sinh hoa: Coagulase la emzym c tao ra bi S. aureus, la mot enzym lien quan en khanang ben nhiet, co the ben en nhiet o 60oc trong gian 30 phut. Enzym nay la mot protein tnhien, chung c tiet ra ben ngoai te bao bi cac vi sinh vat S. aureus, chung cung de dang bathoat bi cac protease.

Coagulase la enzym ong vai tro ong tu huyet tng, chung ket hp cac cau t tronghuyet tng thanh tng khoi hay thanh cuc.

Coagulase vi khuan

Huyet tng khoi FibrinC che thong thng bieu dien qua trnh ong tu huyet tng nh sau:

Prothrombin

Fibrinogen Fibrin

Thrombokinase enzym (throboplastin)Ca++

Thrombin


25/56


24

Mo hnh c che ong tu huyet tng

Oginsky va Umbreit cho rang co nhng bang chng chng minh rang coagulase co motc che ngng ket huyet tng khac, chung la nhng tac nhan hoat hoa cac thanh phan tronghuyet tng e chuyen fibrinogen thanh khoi fibrin. Smith va cac ong s cho rang coagulase la

mot c chat giong priothrombin, chat nay phan ng vi cac huyet tng tao thanh phc chatgiong thrombin va chat nay ket hp cac fibrinogen thanh khoi fibrin.Theo Burrow va Moulder, s ong tu huyet tng dien ra qua hai bc nh sau:

BcI: Phan ng gia enzym do vi khuan tiet ra (proenzym) vi cac nhan to hoat onghien dien trong huyet tng e tao thanh coagulase.

Bc II: Coagulase hoat ong ngng ket cac thanh to fibrinogen thanh fibrin.Cung theo Burrow va Moulder nhan to do vi khuan tiet ra la procoagulase ket hp vi

nhan to trong huyet tng la mot dang globulin, nhng chat nay khong c chng minh co phaila prothrombin hay khong. Tacgia Dithrie chng minh rang enzym coagulase do Burrow vaMoulder thanh lap chnh la procoagulase, chung hien dien dien hai dang: dang coagulase giihan ben trong te bao va dang t do. Trong cac th nghien cogulase c tien hanh tren lam

knh ch co cac coagulase gii han tham gia vao viec chuyen fibrinogen thanh fibrin con trongth nghien coagulse tren ong ca hai dang gii han va t do tham gia vao viec ngng ket nay

Con theo cac nghien cu cua Soulier, Tager va Zajden ket luan rang, coagulase vaprothrombin khong co hoat tnh enzym, nh s tham gia cua chung tao nen cac phc hp benvi cac hoat ong ly giai ac hieu goi la taphylothrombin, staphylocogulase khong co hoat tnhly giai, chung phan ng mot cach chuyen biet vi cac prothrobin va hoat hoa hp chat nay ea en s ket hp cac figrinogen thanh cac khoi fibrin. S o hoat ong nh sau:

S o c che tac o cua Staphylocoagulase len s ngng ket huyet tng

Cach tien hanh: e phat hien coagulase cua vi khuan co hai cach tien hanh nh sau:Cach I: Tien hanh th nghiem tren Lam knhLay 1 hay 2 khuan lac cua vi khuan huyen phu vao trong got nc tren lam knh, quan

sat trong khoan 10 giay, neu khong co hien tng ngng ket, dung que cay a huyet tng thohay ngi a c co nh bang EDTA hoa vao trong huyen phu vi khuan. Quan sat trong sau10 giay. Hien tng ngng ket xay ra co the quan sat c bang mat thng. Tien hanh kiemchng song song vi cac dong vi sinh vat co coagulase dng tnh a biet.

Cach II: Tien hanh th nghiem tren ong, ay la phng phap nham khang nh cac maua th nghiem am tnh tren lame.

Cho 0,2ml huyet tng vao 0,8ml moi trng Nutrient Broth a cay vi khuan khong coglucose at trong be ieu nhiet 37oC, quan sat sau 3 gi, neu khong co hien tng ngng ketdien ra, co the e nhiet o phong qua em va quan sat tr lai.

Tren th trng hien nay co cac loai huyet tng c co nh trong cac gia the khacnhau nh EDTA, citrate hay trong oxalate. Neu s dung huyet tng citrate co the gay ngng

Staphylocoagulase

Prothrombin

Staphylothrombin

Fibrinogen Fibrin


26/56


25

ket bi cac dong vi sinh vat s dung citrate hay fecal Streptococci. V the e kiem traStaphylocoagulase ch nen s dung loai huyet tng co nh trong EDTA hay trong oxalate.

Cac th nghiem tren lam ch phat hien cac coagulase gii han, chung se hoat ong trctiep len cac fibrinogen. Th nghiem tren cac ong nghiem nham phat hien ca cogulase t do vacoagulase gii han, chung hoat ong lam ngng ket cac thanh phan trong huyet tng. Hien nayco nhieu kit a c thng mai hoa nham phat hien S. aureus nh nha ngng ket (latex kit)

nh slidex (biomerieux); Staphylex (Oxoid); Staphynuclease (API) 6. Th nghiem decarboxylase va dehydrolase cua cac amino acidNguyen tac: Th nghiem dehydrolase va decarboxylase nham xac nh kha nang cua

mot vi sinh co the tong hp cac emzym kh nhom carboxyl hay tach hydrogen t cac acid aminnh lysine, ornithin, hay arginine, qua o chung lam kiem moi trng nuoi cay.

C s simh hoa: kh nhom carboxyl cua mot acid amin la qua trnh vi sinh vat tac onglen nhon carboxyl (-COOH) cua mot acid amin e giai phong ra cac amin, hay di amin va CO2.

R-CH-NH2-COOH RCH2-NH2 + CO2Amino acid aminEnzym decarboxylase co nhat nhieu loai khac nhau, trong o mot loai se tac ong len

mot c chat khac nhau. Trong cac phong th nghiem nghien cu vi sinh vat gay benh ba nhom

enzym decarboxylase quan trong thng hay s dung la lisine, ornithine, arginine. ay la nhngenzym cam ng, chung ch c tong hp khi trong moi trng nuoi cay co pH acid va co cchat ac hieu. Cac san pham cua chung se lam cho moi trng chuyen sang kiem. Qua trnhnay dien ra tren cac aminoacid co nhieu hn mot goc NH 2 ngoai nhom NH2 C. trong ieukien moi trng k kh, va can co mot coenzym, thong thng coenzym nay la pyridoxalphosphate.

Khi enzym lisine decarboxylase tac ong len amino acid L-lisin va kh nhom carboxyl,chung tao thanh mot i amin la cadaverine va CO2, qua trnh dien ra theo phan ng nh sau:

NH2 NH2

CH2 CH2(CH2)3 Lisine decarboxylase (CH2)2 + CO2

CH2 CH2

NH NH2

COOH

Phan ng kh amin bi lysine decarboxylase

NH2 NH2

CH2 CH2

(CH2)2 (CH2)2 +

CH NH3 CH2

COOH NH2

L-lisine Cadaverine (diamin)

CO2

Phan ng kh amin bi Ornithinedecarboxylase

Ornithinedecarboxylase

-CO2

L-Ornithine Putrescine (diamin)


27/56


26

Acid amin L-ornithine b kh nhom carboxyl bi enzym onithine decarboxylase se thuc mot diamin la putrescine va CO2. Ca hai chat putrescine va cadaverine eu ben trong ieukien k kh. V the khi nuoi cay vi sinh e th nghiem, phai nuoi trong ieu kien k kh, tren bemat moi trng nuoi cay phai c phu mot mi parafin hay dau khoang e ngan can s khuech

tan cua oxy. Sau qua trnh nuoi cay, pH cua moi trng se thay oi ve pha kiem, pH cua moitrng co the c kiem soat do o co the nhan biet phan ng trong moi trng nuoi cay bicac chat ch th pH. Cac chat ch th pH thng c s dung trong th nghiem nay laBromcresol purple hay cresol red.

Rieng oi vi L-arginine co the c trao oi bi hai con ng trong qua trnh nuoi cay,thong qua hai enzym: arginine dehydrolase va Arginine decarboxylase. Hai con ng nay cothe dien ra ong thi trong qua trnh nuoi cay hay co the dien ra rieng le:

+ Phan ng arginine decarboxylase: qua trnh trao oi arginine nh enzym argininedehydrolase c tien hanh theo s o sau:

NHCNH2 CH2 NH2

NH (CH2)2 + CO2

(CH2)2 CH2 NH2

CH NH2

COOH

Hoat ong cua toan he thong nh sau

Decarboxylase

L-Arginine Putrescine

L-Arginine L-Agmatine + CO2

Arginine dehydrolase

Agmatinase (agmatineureohydrolase)

Agmatinase (agmatineureohydrolase)

Putrescine + Urea

Urease

2 NH3 + CO2

NH3+

Monocarbaminyl-putrescine

Putrescine+

CO2+

2 NH3


28/56


27

Theo he thong nay, san pham sau qua trnh trao oi chat nhan c agmatine va mot

lng ln putrescine, nhng chat nay khong phai la san pham trao oi chat cuoi cung ma chungtham gia vao mot loat cac phan ng khac, cuoi cung se thu c cac san pham la CO2 va NH3.

+ Phan ng arginine dehydrolase: qua trnh trao oi chat theo hng kh hydro cuaarginine dien ra theo s o nh sau:

He thong hoat ong cua vi khuan co he enzym arginine dehydrolase

Bc au tien cua qua trnh la tach hydro cua goc NH2 t arginine bi enzym argininedehydrolase e tao thanh citrulline va NH3 va mot phosphate vo c. Bc tiep theo citrullinedi tac dung cua enzym citrulline ureidase co s hien dien cua H3PO4 e tao thanh ornithineva carbarmyl phosphate, chat nay se c thuy giai e thu nhan ATP. Nh vay ket thuc quatrnh se thu nhan c ATP cho cac hoat ong khac cua vi sinh vat.

San pham cuoi cung cua qua trnh phan huy arginine cung nhng san pham NH3 vaCO2, ay la nhng chat lam kiem moi trng nuoi cay. Co the nhan biet phan ng nay qua cacchat ch th pH hien dien trong moi trng.

Phng phap th nghiem cua Falkow c s dung oi vi cac vi sinh vat co hnh que,gram am, nhng phng phap cua Moeller cho ket qua tot hn oi vi cac vi sinh vat thuoc ho

Enterobacteriaceace. Moi trng Falkow c s dung ch cho th nghiem LisineDecarboxylase, trong khi o moi trng Moeller c s dung cho tat ca cac th nghiem oi viLysine, Arginine va Ornithine.

Vi sinh vat c nuoi cay trong moi trng Falkow, u 37oC trong 24 gi, chat ch thtrong moi trng la bromocresol purple. Neu phan ng dng tnh, moi trng gi nguyen mautm ban au, canh khuan uc, neu phan ng am tnh, moi trng chuyen t mau tm sang vang.

Neu s dung moi trng Moeller cho cac th nghiem nay, phai nuoi cay vi sinh vat trongieu kien k kh vi dau parafin hay dau khoang tren be mat, u 37oc trong thi gian 24-28

ArginaseL-Arginine Ornithine + Urea

Urease

2 NH3 + CO2Arginine dehydrolase

L-citruline + NH3

Citrulline ureidase

2 NH3 + CO2 + L-ornithine

Ornithinedecarboxylase

Putrescine + CO2


29/56


28

gi. Trong moi trng co hai chat ch th pH: brommothymol blue va cresol red. Neu sau khinuoi cay moi trng chuyen thanh vang la tn hieu am tnh, ngc lai moi trng gi nguyenmau ban au va uc canh nuoi cay la tn hieu dng tnh.

Cac vi sinh vat oi chng:Lisin: dng tnh: S.marcescens,am tnh: P.rettgeriArginine: dng tnh:E.cloacae, am tnh:E.aerogenes

Ornithine: dng tnh: S.marcescens, am tnh: P.rettgeri

7. Th nghien DNAse va thermonucleaseNguyen tac

- th nghiem DNAse nham phat hien kha nang tong hp enzym deoxyribonuclease(Dnase) e phan huy DNA.

- Th nghiem thermonuclease nham th nghiem tnh ben nhiet cua Dnase tStaphylococcus aureus khi vi sinh vat c un nong.

C s sinh hoa

Th nghiem DNAse: Enzym nuclease la enzym phan huy acid nucleic c chia thanhhai nhom nh sau: Nhom 1. Endonuclease la nhng enzym phan huy cac noi phosphodiester ben trong mach DNA e tao ra cac au 3-hydroxyl va 5-phosphoryl hay 5-hydroxyl va 3-phosphoprryl. Nhom 2. Exonuclease ch phan huy cac nucleotide cac au tan cung cua chuoiDNA . Mot so nuclease co the phan huy ca hai mach tren si DNA, mot so khac ch co the phanhuy mot mach n. DNA co cac ac tnh vat ly va hoa hoc khac vi nucleotide vaoligonucleotide. S khac biet nay c dung e phat hien s ly giai DNA bi cac enzymDnase.

Dnase la mot enzym ngoai bao, chung ch phan huy cac acid nucleic. Hau het tat ca cacDnase vi khuan eu can mot cation hoa tr hai e cho enzym nay hoat ong. Cation thong

thng hien dien trong cac pepton c s dung trong moi trng nuoi cay th nghiem. Hoatong cua enzym xay ra trong khoang pH 5,5-8,5 nhng thch hp nhat tai pH 7,2. Co the phanbiet nhieu loai DNAse bang cac khang the hay bang cac tac nhan c che.

Khi phan giai, khoan so noi phosphodiester hay noi hydrogen b phan huy va thu cmot hon hp cac oligonucleotide trong moi trng nuoi cay. Trong hon hp nay gom co cacoan DNA co tan cung la 3-hydroxyl va 3-phosphoryl; 5hydroxyl va 5-phosphoryl. Khi DNAcon lai cac mach ngan, nang nhiet o hay pH cao qua bnh thmg se lam bien tnh cac oannay. Khi co hien tng bien tnh, hon hp DNA se giam o nht va gia tang mc o hap thu UV bc song 260nm. Hieu ng thay oi nay la do co nong o deoxyribonucleotide gia tang trongdung dch so vi c chat DNA ban au.

DNA hien dien trong cac dch chiet vi sinh vat. Nhng DNAse ngoai bao ch hien dien mot so loai nh S. aureus hay Streptococcus nhom A

- Thermonuclease cua S. aureus: cung nh tat ca cac vi sinh vat khac S. aureus eu cothe tong hp DNAse ngoai bao, nh co iem khac biet so vi tat ca cac loai vi sinh vat khac,DNAse cua S. aureus ben nhiet hn va can ligand Ca2+ cho s hoat ong cua chung, chung phanhuy DNA manh pH kiem 8,6-9,0. S hien dien cua DNAse ben nhiet S. aureus co lien quanen s co mat coagulase loai vi sinh vat nay. DNAse cua S. aureus co the bao toan hoat tnhkhi nang nhiet o en 100oC trong 15phut.


30/56


29

Phng thap th nghiem: trai mot tham vi khuan day len moi trng Dnase agar, u quaem. Cho acid gap tren be mat moi trng sau khi u. Quan sat hien tng tua cua cac muoi cotrong moi trng. Neu xung quanh khuan lac hay tren a co nhng quang trong suot do khongco tua cac cac muoi trong moi trng la phan ng dng tnh.

8. Th nghiem kha nang sinh H2SNguyen tac: Xac nh kha nang sinh H2S t cac hp chat hu c va vo c cha lu huynhtrong qua trnh phat trien cua vi khuan tao nen cac vet mau en tren moi trng nuoi cay,C s sinh hoa: Khi phan giai protein thu c cac aminoacid, cac vi sinh vat d dng

co the s dung cac aminoacid e trao oi trong qua trnh sinh trng va phat trien va phongthch kh H2S t nhng amonoacid cha lu huynh. Cac nguon pepton, cystein, cystine, sulphite,thiosulphate la nhng nguon cha lu huynh, nhng cac loai vi sinh vat khac nhau ch co the sdung mot so hp chat cha lu huynh nhat nh e tao H2S. Cac enzym cua vi sinh vat tham giavao qua trnh nay la desulphohydrase.

Mot vi sinh vat tao H2S khi nuoi cay trong moi trng cha cac hp chat lu huynh machung co kha nang ong hoa se kh cac hp chat nay e tao nen kh H2S.

CH2 SH Cysteine desulfurase CH3

CH NH2 + H2O C = O + H2S + NH3

COOH COOH

Trong moi trng co cha cac ion kim loai nh ion sat la dau hieu e nhan biet H2S. Cachp chat co the nhan biet H2S nh sat, FeSO4, ferric amonium sulphate, sodium thiosulphate,bismuth sulphite. Nguyen tac e nhan biet H2S bang cac hp chat tren nh sau:

H2S + Fe2+ = FeS + 2 H+

Cac hp chat sulphur kim loai eu co dau hieu mau en.Trong cac moi trng khac nh Kligler Iron agar chat ch th e nhan biet H 2S la cac

muoi ferric ammonium citrate va mot chat vo c sodium thiosulphate. Ca hai chat ch th nayeu phai hien dien ngay t au trong moi trng. Ket qua nhan biet s tao thanh H 2S qua haibc nh sau:

Bc I: Vi sinh vat phat trien trong moi trng se kh hp chat thiosulphate e tao thanhsulpite va sulphate. Cac nguon carbohydrate co trong moi trng se tao thanh moi trng acidtrong phan sau cua moi trng KIA thong qua qua trnh ho hap k kh. Moi trng acid trongphan sau cua ong nghiem se ho tr cho phan ng kh tren. Qua o lu huynh ong vai tro lachat nhan dien t cho qua trnh oxy hoa-kh cac hp chat hu c. Thiosulphate thay the

sulphate nh la chat nhat ien t va la nguon cung cap sulphur cho vi sinh vat.

4H+ + 4e + 3S2O32- 2SO3

2- + 2 H2S

H2S tao thanh la mot chat kh khong mau. Mot chat ch th th hai can thiet e nhandang chat kh nay.

Bc II: Chat kh khong mau H2S phan ng vi cac muoi kim loai nh ferric ammoniumcitrate e hnh thanh cac hp chat ket tua co mau en FeS. Ferric Ammonium citrate c s

Thiosulphate

Reductase Sulphite Hydrogen sulphurThiosulphate

Cysteine Acid pyruvic


31/56


30

dung nhieu hn citrae sat bi vi chung tan nhieu hn trong moi trng. FeSO4 cung co the cthay the cho nguon sat trong moi trng. Ngoai ra kh H2S cung co the c phat hien bi cackim loai khac nh ch, bismuth, e hnh thanh nen cac hp chat sulphur kim loai co mau en.

9. Th nghiem kha nang sinh indolNguyen tac: Phat hien kha nang cua vi khuan co the tao indol trong moi trng canh

tryptonC s sinmh hoa:Tryptophan la mot aminoacid co the b oxy hoa bi mot so vi sinh vatnhat nh tao nen cac hp chat indol hay cac dan xuat cua chung nh: indol, skatol (methylindol) va indolacetic. Mot so enzym noi bao c goi chung la trytophanase tham gia trong quatrnh tao thanh san pham indol trong hoat ong thuy giai tryptophane.

Cac hp chat trung gian trong qua trnh thuy giai tryptophan la acid indolepyruvic, t oindol c hnh thanh trong qua trnh kh amin, hnh thanh skatol la qua trnh kh carboxyl cuaacid indol acetic. Qua trnh thuy giai tryptophan co the c mo ta qua qua trnh nh sau:

NH3CH3 C COOH

NH

CH3 C COOH

N NH H

CH2CHO

NH

CH2COOHNH

CH3

NH

Enzym tryptophanase xuc tac phan ng kh amin bi s tan cong vao phan t tryptophan v tr mach nhanh va tach nhan thm ra khoi phan t tryptophan hnh thanh indol.

CH3 CH - COOHNH2 + CH3 C COOH + NH3

N NH H

H

L-Tryptophane

Indolepyruvic

Indoleacetaldehyde

Indole

Indoleacetic acid

Skatole

Tryptophanase


32/56


31

S tach amin t tryptophane la mot dang phan ng kh. Qua qua trnh nay nhom aminc tach ra va chuyen thanh NH3, qua trnh kh giai phong mot phan nang lng c s dungcho hoat ong tang trng cua vi sinh vat. ong thi qua trnh nay con tao thanh acid pyruvic,c chat tham gia vao chu trnh Krebs e tiep tuc thu nang lng.

Phat hien indol va cac dan xuat cua chung trong moi trng nuoi cay bang thuoc thKovacs hay Ehrlichs. C chat chnh tham gia phat hien indol trong moi trng nuoi cay la p-

dimethylaminobenzaldehyde (DMAB). Chay nay phan ng vi indol tao thanh mot phc hpmau o. Phan ng nay la do nhan pyrrol cua indol phan ng vi nhom aldehyde cua DMAB quahai giai oan e tao thanh nhan quinone co mau o, phan ng nh sau:

Phng phap th: Vi sinh vat th nghiem c nuoi trong moi trng canh trypton khoan24 - 48 gi. Nho vai giot ether vao canh khuan nham keo indol len be mat mot trng, them vaigiot thuoc th Kovacs hay Erhlich. Quan sat sau vai phut, phan ng dng tnh neu tren be matmoi trng co vong mau o xuat hien. Ngc lai neu khong co s xuat hien cua mau o hong

c coi la phan ng am tnh.Thuoc th

- Thuoc th Erhlich: Hoa tan 4g p-dimethylaminobenzaldehyde trong hon hp gom 80mlacid HCL am ac va 380 ethanol tuyet oi. Dung dch sau khi pha co mau vang nau.

- Thuoc th Kovacs hoa tan 5g p-dimethylaminobenzaldehyde trong hon hp gom 75 mlamyl alcohol va 25 ml H2SO4 am ac.

10. Th nghiem tren moi trng Kligler Iron Agar hay tren moi trng Triple Sugar Iron agarNguyen tac: Th nghien nay nham phat hien kha nang s dung cac nguon

carbonhydrate co mat trong moi trng, kha nang sinh H2S va sinh kh trong moi trng.

C s sinh hoa: Moi trng Kligler Iron agar (KIA) va Triple Iron agar (TSI) la cac moitrng ran dung trong th nghiem sinh hoa. Moi trng c phan phoi vao trong cac ongnghiem, gom hai phan: phan ng sau khoang 2,5cm va phan nghieng ben tren. Th nghiemnay nham hai muc ch: phat hien kha nang len men cac nguon Carbonhydrate co trong moitrng va phat hien kha nang sinh H2S.

Moi trng KIA cha hai nguon carbohydrate: 1% lactose va 0,1%. glucose, moi trngTSI tng t nh moi trng KIA nh co them 1%. Sucrose. C che sinh hoa cua hai moitrng nay tng t nhau.

Tren moi trng KIA, vi sinh vat co the s dung ca hai nguon carbohydrate tren hay chs dung glucose. Qua trnh len men nay co the tao kh trong moi trng hay khong tuy thuocvao tng loai vi sinh vat. S s dung cac nguon carbonhydrate khac nhau hai ieu kien hieukh tren phan nghieng va k kh trong phan ng. Tren phan nghieng, glucose c trao oitheo con ng oxy hoa trong chu trnh Krebs e tao san pham la H2O va CO2 ong thi thuc nang lng. Lactose la ng oi, e vi sinh vat co the s dung chung phai phan giaithanh galactose va glucose, cac ng n nay se i vao trong te bao va tham gia vao qua trnhchuyen hoa noi bao.

Co ba trng hp se xay ra khi nuoi cay vi sinh vat tren moi trng KIA: ch len menglucose, len men ca hai nguon carbonhydrate trong moi trng, khong len men ca hai nguontren.


33/56


32

Neu vi sinh vat ch len men glucose sau 18-24 gi nuoi cay, tren phan nghieng cua moitrng co pH kiem va phan sau cua ong co pH acid. Hien tng nay c quan sat khi cochat ch th pH trong moi trng nuoi cay, thong thng tren moi trng nay thng s dungchat ch th pH la phenol red. Tren phan nghieng, sau 24 gi nuoi cay, mot lng nho glucosetrong moi trng c vi sinh vat s dung het hoan toan. Sau o vi sinh vat s dung peptontrong moi trng, qua trnh trao oi pepton lam giai phong NH3, san pham nay se lam kiem

phan nghieng cua ong moi trng. phan sau moi trng co pH acid bi s len men k khglucose, cac san pham thu c la nhng acid hu c, chnh cac acid nay lam cho pH giam. Neutrong moi trng co chat ch th pH la phenol red th tren phan nghien se co mau o va phan sause co mau vang.

Neu vi sinh vat co the s dung ca hai nguon carbohydrate: ca hai phan sau va phannghien eu co tnh acid sau 18-24 gi nuoi cay v lng ng lactose u e vi sinh vat s dungtrong thi gian nay, cac san pham tao thanh la cac acid hu c. Neu keo dai thi gian nuoi cayen sau 24 gi, tren phan nghien co the thu c mau o do moi trng chuyen sang kiem.

Trong trng h

Documents

giao_trinh_visinh