GK-07

CalorMicroondasUV radiaciónAgitación fuerteDetergentesMetales pesadosSolvente orgánicos Ácidos y bases fuertesSales > Temperatura

> pH

> detergente

> sustancias solubles en agua

efecto de

DENATURACION de PROTEINAS

Preparación de proteínas

factor atención durante la preparación

temperatura evitar alta temperatura, dejar en HIELO

congelar-descongelar determinar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado

denaturación física no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas

efecto de diluciónoxidaciónmetales pesadoscrecimiento de bacterias

proteasas

mantener conc. > 1mg/mlincluir 0,1 – 1mM DTT en el tamponincluir 1 – 10mM EDTA en el tamponutilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelarincluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO

PURIFICACION DE PROTEINAS

- necesario para revelar su estructura- desarrollo de inhibidores- desarrollo de vacunas- aislar proteínas recombinantes para vacunas-- etc...

Vacuna de proteína recombinanteVacas clonadas y geneticamente

modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia)

Taste receptors

Diseño de drogas

Estrategia de purificación de proteínas

- selección del tejido- homogenización- clarificación – precipitación- solubilización y PURIFICACIÓN

- captura- purificación mediana pureza- purificación, ultra pureza

necesario test para monitorearej. detección inmunológica o test funcional

John Kendrew, mioglobina,

Max Perutz, hemoglobina

Cachalote (Physeter catodon)                                                                                       

17,8 kDa

Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,

Localización de los átomos

Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.

Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria)

FUNCION

Para obtener cristales proteína pura

Proteína, Purificación

-Fraccionamiento celular-Centrifugación-Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH -Cromatografía exclusión por tamaño -Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un “bead”, selectivo, unión proteina-proteina

Fraccionamiento celular

TIPOS DE CENTRÍFUGAS

SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA

DE BAJA VELOCIDAD MICRÓFUGA

DE ALTA VELOCIDAD ULTRACENTRÍFUGA

TIPOS DE ROTORES

ROTORES FLOTANTES

ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES

ROTOR VERTICAL

centrífuga baja velocidad Ultracentrífuga

ROTORES FLOTANTES

DESPUÉS

PELLET

SOBRENADANTE

ANTES

HOMOGENEIZADO

CENTRIFUGACIÓN

En gradiente de densidad:

Centrifugación diferencial:

Fraccionamiento celular

Fraccionamiento celular

Fraccionamiento celular

Fraccionamiento celular

CROMATOGRAFIA

-por carga: intercambio iónico ej. DEAE (+), CM (-)

-por tamaño: exclusión, los grandes primero ej. Sephadex = filtración por gel

- por especificidad: afinidad entre proteína-proteína

ej. anticuerpo

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa

las proteínas con carga negativa pasan de largo

Ej. intercambiadorcationico

Cromatografía de Intercambio Ionico

CM-agarosa CARGA NEGATIVAcarboximetil-agarosa

DEAE-columna CARGA POSITIVADietilaminoetil

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

Intercambio iónico

- intercambiador cationico (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-)

proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna

-intercambiador aniónico (tiene carga positiva, ej. DEAE+)proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

Cromatografía de filtración en gel

Cromatografía de filtración en gel

DIALISIS

Separación por tamañoeliminación de sal

bolsa de diálisis

solución concentrada

tampón

al principio de la diálisis en equilibrio

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Cromatografía de Afinidad

Proteína retenido por interacción con ligando

Elusión por adición de exceso de ligando

Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación

ELECTROFORESIS

electro-foresis; del griego, estar llevado

Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno

Las proteínas se separan por

- carga eléctrica- tamaño y forma

S

S

A1

A2

el -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox

( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro)

-mercaptoetanol

SH

HS

A1 A2

+

El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol

Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH

a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada

negativamente

SH

El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el

desplegamiento de las mismasSDS

–– –– –––– –– ––––

– – ––––

––

La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va

a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)

Fuente de poder

electrodo de platinum

reservorio de tampón superior e inferior

única conexión eléctrica vía el gel

Ele

ctro

do d

e pl

atin

um

+

CÁTODO

ÁNODO

SDS-PAGEcondiciones denaturantesfraccionamiento por tamañocomparación con estándar de tamaño molecular

Proteína purificada

C:\Documents and Settings\Usuario\Mis documentos\Clases Bioqu<ED>mica\Bioq 010\Animaciones\SDSGEL.MOV

Determinación de la secuencia de proteínas

ESTRUCTURA PRIMARIA

- composición de aa digestión con 5M HCl, análisis HPLC

- determinación del aa amino terminal 2,4-dinitrophenyl, DNFB-amino-aa y aa libres

- secuenciación de péptido (25-30aa) degradación Edman, del amino-aa sucesivamente

Pero: proteínas > 100 aa

Proteínas

- fragmentar

- secuenciar péptidos

- ordenar secuencia

Tratamiento Punto de ruptura

tripsina

quimotripsina

proteasa V8

bromuro de cianogeno (CNBr)

Lys, Arg

Phe, Trp, Tyr

Asp, Glu

Met

- C – C – N – C – C – N – C – C – N -

O

O

O

H

H

HR1

R2

R3

cortan el enlace peptídico

tratamiento

Ej.

péptidos secuenciados

Tyr-LysGlu-Met-Leu-Gly-ArgPro-Met-ArgMet-Gly-Cys-Lys

Leu-Gly-Arg-MetTyr-Lys-Glu-MetGly-Cys-Lys-Pro-Met+ amino acido básico

Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Cys-Lys-Pro-Met-Arg

hidrólisis con tripsina

hidrólisis con CNBr

fragmentos con tripsina

fragmentos con CNBr

SECUENCIA deducida: