A.O. Ospedale S.Anna Como - Giovedì 16 Aprile 2015“Formazione e Sicurezza nella Diagnostica Immunoematologica”

Bruno Brando Direttore dei Servizi Trasfusionalie Laboratori di EmatologiaA.O. Ospedale Civile di Legnano (MI)

e-mail: bruno.brando@ao-legnano.it

Gli Schemi di External Quality Assessment

UK NEQAS FMH e LI nel Laboratorio Trasfusionale

...in Italia de a trasfusiòn feto-materna

no ghe ne frega un casso a nissùn ...

Anonimo Veneziano 2007

Per la serie ‘Italia Pittoresca’

Blood Transfusion 2013 n°4

• 164 su 208 (78.8%) SIMT hanno risposto

• 41 (25%) SIMT eseguono i test per FMH

Pregnant women who are Rh-D negative must be considered for

anti-D prophylaxis for the following potentially sensitising events:

• Amniocentesis

• Cordocentesis

• Other in-utero therapeutic intervention/surgery

(e.g. intrauterine transfusion, shunting)

• Ante partum vaginal haemorrhage (APH, especially >24th week)

• Chorionic villus sampling

• Ectopic pregnancy

• External cephalic version

• Fall / Abdominal trauma

• Intrauterine death / Stillbirth

• Miscarriage

• Termination of pregnancy

BCSH, Transfusion Medicine 1999; 9:87-92 http://www.bcshguidelines.com/

FMH evaluation can be of diagnostic help in emergency

events that complicate pregnancy:

• Amniocentesis (Tannirandom Y 1999)

• Cordocentesis (Chitrity Y 1998; Rujiwetpongstorn J 2005)

• Ante partum vaginal haemorrhage (Zizka Z 2001; Weisberg L 2004)

• Chorionic villus sampling (Katiyar R 2007)

• Ectopic pregnancy (Krause HG 1996)

• External cephalic version (Khoo CL; Shankar M 2004)

• Fall / Abdominal trauma (Muench MV 2004; Hagmann CF 2004;

Sherer DM 1997; Emery CL 1995)

• Evidence of severe fetal anemia (Bowers LA 2006; Sueters M 2003)

• Reduced Fetal Movements (Malcus P 2006; Weisberg L 2004)

• Intrauterine death (Biankin SA 2003)

• Miscarriage (Banerjee K 2004; Biankin SA 2003;

Weinberg L 2001)

• Pre-eclampsia (Jansen MW 2001)

• As an Unexpected Finding (Pourbabak S 2004)

Nucleated fetal RBC (para)physiologically circulating in maternal blood have been sought for since the ’80s for antenatal diagnostic studies (Rare Event Analysis).

Detection of Fetal Cells in Maternal Blood

• All individuals have circulating nucleated, immature RBC.• All individuals have HbF+ RBC (0.5-7.0% of total RBC, with a 10-fold lower

HbF concentration).• Increased levels of HbF+ RBC in Thalassaemic trait, during pregnancy and in

hereditary persistence of HbF.• Mature RBC have cytoplasmic Carbonic Anhydrase.

The hallmarks of fetal RBC are: The presence of a nucleus

Immature RBC surface phenotype (CD71+, CD36-, GLF-A-)

Cytoplasmic HbF at high concentration

Cytoplasmic Carbonic Anhydrase absent or very low

Fetal RBC AB0/RhD phenotype can be detected in selected cases only.

The Kleihauer-Betke (KB) Test• Acid elution of Hb A (citric or hydrochloric/FeCl acid buffers)

• Staining with erythrosin or eosin the acid-resistant fetal RBC

KB TEST IS POSITIVE IF > 5 Fetal RBC / 10 000 Maternal RBC

Estimation of the FM haemorrhage: V (ml) = 2,500 x n / 10,000. One fetal cell in 10,000 maternal cells corresponds to an haemorrhage

of ~ 0.25 ml of fetal RBCs (~ 0.5 ml fetal blood).

Fetal Cell

Densely red

Refractile

Maternal RBC

Ghost

WBC can be

counterstained

Se in un campo sonopresenti almeno 100 GRsi procede al conteggiodelle emazie fetali:

• <10 emazie in 25 campiFMH è < 2 ml.

• >10 emazie in 25 campisi deve procedere allaquantificazione

BCSH Guidelines - KB Test

Maternal RBCs(Rh-D neg woman)

Fetal D + RBCs(0,085 %)

IDENTIFICATION AND ENUMERATION OFFETAL D+ RBCs IN MATERNAL BLOOD

• Quanti-D PE Millipore Monoclonal Ab• EDTA blood, Wash x2, Stain for 20 min, Wash x1, Read ≥300,000 RBC)

• WARNING: If the Mother Has Received Anti-D Prophylaxis theBinding of Fuorescent Anti-D MoAb is INHIBITED !

The Fetal Cell Count® Kit

(ImmunoQuality Products, Groeningen, NL)

1) Monoclonal antibody to Fetal Hemoglobin - PE

Clone NaM16-2F4Origin MouseClass IgG1Specificity Fetal hemoglobin (g chain)References Maier-Redelsperger et al. Blood 84: 3182, 1994

Navenot et al., Cytometry 32: 186, 1998

2) Polyclonal antibody (rabbit) to Carbonic Anhydrase - FITC

Test Procedure Fetal Cell Count Kit (~ 90 min)

Initial Washing of Peripheral Blood with PBS x 1-2

Fixation and Permeabilization:

• Fixation: 10μL EDTA blood + 100μL Fixative A + 100μL Fixative B

• Vortex, Incubate 30 min at RT°, shake every 10 min

• Wash by adding 2 mL Washing Solution D, resuspend

• Centrifuge @ 300g x 3 min, decant, Repeat washing

• Permeabilization: (SDS) add 100μL Reagent C, vortex, incubate 4 min

Immunofluorescence staining:

• Incubation with pAb anti-CA FITC + mAb anti-HbF PE x 20 min.

• Washing X 1 PBS-BSA

Data Acquisition:

• Setting Log FSC, Log SSC, and Log fluorescence signals for FITC & PE

• RUN: at least 300,000 (Better 500,000) erythrocytes

Fetal Cell Count Kit-Acquisizione & Analisi delle Popolazioni

R1

Emazie Fetali HbF+ / CA neg

Emazie Materne MatureHbF neg/CA+

EmazieMaterne HbF+dim/CA+

Emazie Fetaliin maturazione

HbF+ /CA± +

Cattura Eritrociti3-500.000

RBC

HbF+

500.000Emazie Totali

Emazie MaterneHbF - / CA +

Emazie FetaliHbF ++ / CA -

=0,165%

Dalla percentuale di cellule HbF+ si ricava la STIMA della FMH in mL di emazie fetali:mL FMH = (1800 x HbF+%) / 100 (non corretto per VGM fetale).In questo caso: mL FMH = (1800 x 0,165) / 100 = 2,97 mLFattore di correzione: VGM fetale (in media il 22% maggiore di quello materno) per cui: mL FMH = 2,97 + (2,97 x 0,22) = 3,62 mL (corretto per VGM fetale)

Fetal Cell Count Kit - Analisi & Calcoli

La dose standard di 500 ui di Anti-D (RHO-Gamma)neutralizza fino a 4 ml di emazie fetali D+

Input datiAnalitici

Input datiTerapeuticiAnti-D

FMHScheme

‘Learning Curve’Tipica di ogni SchemaUKNEQAS

Report Esercizi FMH (Prima di introduzione di Z-Score)

Lo Zeta ScoreIntrodotto

Per gli Schemi QUANTITATIVI:

- Immune Monitoring, CD34+ Stem Cells, Low Level Leucocyte Count,- Leukaemia Immunophenotyping (Part 1)- Minimal Residual Disease- BCR-ABL Quantitativo- Post-Transplant Chimerism Monitoring

Vecchio Scoring System UKNEQAS_LI

• Nel tempo sono stati sviluppati 10 diversi sistemidi Scoring, ritagliati su ciascun analita e schema.

• In alcuni schemi: Score Alto= Tutto bene,In altri schemi: Score Alto= Tutto male (Confusione!)

• Il vecchio sistema identificava comunque in modoaccurato i laboratori con prestazioni insoddisfacenti.

Caratteristiche e Proprietà dello Zeta Score

http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=1384

Definite dall’ Algoritmo A di questo documento ISO.Il calcolo assicura l’inclusione di TUTTI i risultati dei partecipanti,minimizzando gli effetti dei valori estremi (Outliers).

Calcolo dello Zeta Score

z =( x - X )

Dato Partecipante Media ‘Robusta’

SD ‘Robusta’

La ‘Media Robusta’ e la ‘SD Robusta’ vengono calcolate usando l’Algoritmo A (ISO 5725-5).

Hai fattoCentro !0

Valori POSITIVISOVRASTIMA

Valori NEGATIVISOTTOSTIMA

Come Interpretare lo Zeta Score (1)

Z-Score compresotra -2 e +2: Tutto OK

Z-Score tra -2 e -3 o tra +2 e +3: ACTIONCerca di capire cosa succede e prendi provvedimenti

Critical Critical

Z-Score < -3 o > +3: CRITICALC’è veramente qualcosa che non va. Rivedere l’intero processo!

Esempio di Z-Score conSottostima: ACTION

Due Z-Score ACTIONin 2 esercizi consecutivigenerano uno Score CRITICAL

Esempio di Z-Score conSovrastima: CRITICAL

• United Network for Organ Sharing (UNOS - USA): • ~ 78000 pazienti attivi inseriti in lista per trapianto d’organo• Trapianti di organo eseguiti negli USA nel 2014: 29532

• Sistema Informativo Trapianti del Centro Nazionale Trapianti: • 9143 pazienti inseriti in lista per trapianti d’organo• Trapianti di organo eseguiti in Italia nel 2014: 2980

• Organ Procurement and Transplantation Network ( OPTN): • Tempi di attesa per trapianto di rene suddiviso per gruppi ABO nel periodo 2003-2004:

• Rene di gruppo O: 5.07 anni• Rene di gruppo A: 3.31anni• Rene di gruppo B: 5.31 anni• Rene di gruppo AB: 2.34 anni

La discrepanza tra numero di pazienti in lista di attesa e trapianti eseguiti sulla base della disponibilità degli organi rende evidente la necessità di ampliare il bacino dei donatori obiettivo ilsuperamento della barriera AB0 nel Tx d’organo solido.

I TRAPIANTI DI ORGANI SOLIDI AB0-INCOMPATIBILI

IL TRAPIANTO DI CSE ABO-INCOMPATIBILE

In caso di incompatibilità maggiore AB0: correlazione tra anticorpi anti A/ anti B e conta reticolocitaria.La ripresa eritropoietica è significativamente ostacolata per titoli anticorpali al di sopra di 1:8

Stussi G. Transfus Apher Sci 2006; 35: 59-69.

Mentre la compatibilità HLA è un pre-requisito per il buon attecchimento in riceventi condizionati, la compatibilità ABO non è una limitante, anche se possono comunque verificarsi delle complicanze legate a questa incompatibilità.

Procedure cliniche in cui è possibile praticare un Tx contro barriera AB0:

• Trapianto di Rene • Trapianto di Fegato• Trapianto di Cuore (in neonati)

Non esiste un valore basale del titolo delle agglutinine universalmente accettato da tutti i centri per l’inclusione dei pazienti in un programma di Tx ABO incompatibile. Tuttavia i pazienti con titolo

≥ 512 presentano elevato rischio di rigetto acuto rispetto a

quelli con titolo basale ≤ 256.

Il titolo delle agglutinine anti-A e anti-B raccomandabile pre trapianto

varia in ogni centro: il cut off è generalmente compreso tra 8 e 32.

Dosaggio delle Isoemoagglutinine Anti-A e Anti-BNel Trapianto d’Organo Solido ABO-Incompatibile

• Fine 2014: 90 centri iscritti al programma UKNEQAS BTLPPilot AB0 TITRATION

• 34 in UK • 19 in Italia • 37 centri in altre 16 nazioni

• La maggioranza dei centri iscritti esegue titolazioni delle agglutinine Anti-A e Anti-B nel trapianto di cellule staminali emopoietiche e nel trapianto di rene.

• La maggior parte dei Centri che eseguono titolazioni delle agglutinine Anti-A e Anti-B anche per altri scopi (es. per MEN ABO o altri trapianti) effettua questi test circa 10 - 20 volte all’anno al massimo.

Programma UK NEQAS BTLP Pilot AB0 TITRATION

Invio 12/13 AB0 T4:

n. 3 Plasma 0Emazie test A1 Rh-

Confronti Metodo StandardvsMetodo in-House

• Variabilità dei risultati ancora elevata malgrado metodo standard.• P1 aveva anche un Anti-D. Non importante nell’esercizio ma rilevante in clinica.• NIBSC sta per distribuire uno standard biologico titolato Anti-A e Anti-B.

Consiglio d’Europa - Raccomandazioni sul Controllo delle CelluleContaminanti Residue nel Plasma e negli Emocomponenti Leucodepleti

Council of Europe - Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Recommendation No. R (95) 15 - 16th Edition, 2010, pg. 314

PFC

RBC & PLT

LINEE-GUIDA SIMTI 2007 e 2010:L’ Unità Leucodepleta non deve contenere più di 500.000 rWBC

6.000/µL

100/µL

50.000/µL

U

Medium di Colorazione DNA - WBC Residui

• Sodio 1g / Litro

• Propidio Ioduro 50 mg / Litro Sigma P 4170

• IGEPAL CA630 200 µL / Litro Sigma I 3021

• RNAsi A III 6 mg / Litro Sigma R 5125

Preparare 100 mL alla volta, filtrare con 0.22 µm Millipore,

Conservare a 4° C in vetro scuro, stabile ≥ 1 mese.

Uso con Microsfere di Conteggio (Qualunque tipo)

Marker Events Mean

All 22884 1496.19rWBC 39 94.50

Beads 20845 1499.88

res WBC

rWBC

Beads

BEADS

FLOWCOUNT 1026/µL

Flow-Count

Beads

rWBC = 39 / 20845 * 1026 = 1.91/µL

- 0.11

Facscanto

Tutte le valutazioni prestazionali relative a risultati quantitatitivinumerici vengono oggi espresse come ZETA SCORE in accordo alleregole ISO 17043.

Manufacturer Mean rWBC/µL rWBC/Unit x10^6 % Rejected Process Time

Baxter 1 0.001 ± 0.003 0.0003 ± 0.0001 0 6.2 min

Baxter 2 3.09 ± 2.86 0.83 ± 0.75 30 11.2 min

Braun 5.97 ± 4.20 1.53 ± 1.17 70 5.2 min

Fresenius 1 1.72 ± 1.55 0.47 ± 0.44 20 7.6 min

Fresenius 2 0.86 ± 0.59 0.23 ± 0.19 0 8.7 min

Pall 2.48 ± 1.58 0.67 ± 0.47 20 5.2 min

Terumo 2.59 ± 2.04 0.67 ± 0.59 20 6.9 min

Studio di comparazione di 7 diversi sistemi di filtrazione in-linea

(Gara di aggiudicazione - Sacche quadruple T&B con filtro)

Valutata una campionatura di 10 sacche per ogni concorrente.Parametri valutati: Recupero emazie, Emazie residue nel filtro,Tempo di processamento, rWBC/µL e rWBC/Unità.

M

• Le linee-guida SIMTI prevedono il controllo dell’ ~1% delle unità

prodotte per diversi parametri, tra cui Hb g/L e Hct% per i GRC

e n. PLT (x 109/L) per concentrati da pool o aferesi.

• Nella preparazione degli emocomponenti si ottengono prodotti

con concentrazioni cellulari molto maggiori di quelle ordinarie.

• Occorre quindi che le misure di questi parametri siano accurate

poiché da queste deriva la valutazione globale della buona qualità

del processo di scomposizione e manifattura emocomponenti.

Non tutti i contaglobuli sono sempre in grado di valutare accuratamentei parametri degli emocomponenti concentrati: possibili problemi di sovra-o sottostima, con conseguenze sul giudizio di qualità dei prodotti.

SVILUPPI DEGLI SCHEMI UKNEQAS BTLP

• Tecnicamente molto difficile ottenereRBC stabilizzati con Ig e C’ a basso titolo.

• Primo schema nella seconda metà 2015.• Seconda misura dopo 15gg per stabilità.

• Complessità crescente del sistema ‘Antigeni’ (678 Ag)• Difficile identificazione Ag di nicchie etniche• Terminologia Antigeni ancora molto variabile.• Anticorpi di limitata reperibilità e reattività• 46 Geni, 1653 Alleli (al Marzo 2015)• Genotipizzazione e previsione del Fenotipo (anche fetale).• Eseguito un primo pre-pilot su 56 laboratori.• Previsto un primo schema pilota nel 2015.

CONTEGGIO DEI PBSC CD34+ NELL’ AUTO- e ALLOTRAPIANTOApplicazioni e Pericoli

• Conteggi dei PBSC CD34+ in numerosi punti CRUCIALI del processo:

• Monitoraggio ripresa post-chemio

• Decisione di eseguire o meno l’aferesi

• Calcolo della resa aferetica

• Calcolo del quantitativo raccolto nella sacca di aferesi

• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del congelamento

• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI dopo manipolazioni (purging)

• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del TRAPIANTO

• Applicazioni extra-trapianto del conteggio dei CD34+ periferici(Mielodisplasie, Mielofibrosi, Leucosi acute e croniche...)

IL VERO PERICOLO E’ QUELLO DI SOVRASTIMARE I CONTEGGI DI CD34+

(Raccolgo con troppo pochi CD34+ in giro, Credo di avere raccolto abbastanza, Credo di avere CD34+ vitali a sufficienza...)

PUNTI FERMI DELLE TECNOLOGIE DICONTEGGIO DELLE CELLULE CD34+

• MARCATURA CD45 FITC / CD34 PE (di Classe III)

• ACQUISIZIONE DI ALMENO 100 EVENTI CD34+

• CONCENTRAZIONE DEL CAMPIONE < 25.000 /µL

• TEST IN SINGOLA PIATTAFORMA (Microsfere)

• PIPETTAMENTO INVERSO DI PRECISIONE

• ATTENTO E MIRATO ADDESTRAMENTO TECNICO

• PROTOCOLLO ISHAGE MODIFICATO EWGCCA

• DISPONIBILI EQAS E STANDARDS BIOLOGICI

IL CONTEGGIO DELLE CELLULE CD34+ IN CITOMETRIA FORNISCE INFORMAZIONI DI IMPORTANZA CRUCIALE AL MEDICO TRAPIANTISTA

• SINGOLO MIGLIOR PREDITTORE DI UNA RACCOLTA EFFICACE

• SINGOLO MIGLIOR PREDITTORE DI ATTECCHIMENTO

• > 5 x 106 CD34+ / Kg REINFUSE = SICURO ATTECCHIMENTO

• CONTROLLO DELLA RESA AFERETICA COME RAPPORTO TRA

CD34+ DISPONIBILI E CD34+ EFFETTIVAMENTE RACCOLTE

• POSSIBILE ACCURATO CONTROLLO DELLO STATO DI APOPTOSI

O DI VITALITA' DELLE CD34+ CONSERVATE O SCONGELATE

• TEST IN SINGOLA PIATTAFORMA ACCURATO E FLESSIBILE

(Sangue Periferico, Leucaferesi, Donatore Normale Mobilizzato,

Sangue Cordonale, Midollo Osseo)

CD34+

776 VERI CD34+

Flow-Count

CD45+

Cellule Nucleate

Gate su Cellule Nucleate

NO BeadsGate su CD45+

Gate su Nucleate CD45+ CD34+

4089 BeadsCD34+ 45+ SSC Low

776 CD34+ eventi

4089 Bead eventix 1012 = 192 CD34+ PBSC/µL(# beads/µL)

Metodo EWGCCA – ISHAGE in Singola Piattaformaper l’Identificazione e il Conteggio dei PBSC CD34+

Gate su Nucleate CD45+ CD34+ SSC Low

57%32%

1%

1%

2%1%

5%

1% Correct

Missing gate

Gating on wrong parameter

Using wrong antibody

Missing plot and gate

Wrong gate and parameter

Wrong gate and parameter and

missing gate

Using different protocol to that

stated

Inchiesta su COME viene usato il protocollo ISHAGEdai partecipanti allo schema UKNEQAS CD34+

(Survey 2008)

CD34 SchemeCytometry Part B 2008; 74B: 364-376

Conta solo il valore assoluto di CD34+

-0.15

SSC/FSC SSC/CD45 SSC/LDS751

CD34+

0,012% 0,016% 0,018%

CALCOLO DEL VALORE

PERCENTUALE

DI CD34+

COEFFICIENTE DI

VARIAZIONE (CV)

TRA I DIVERSI

DENOMINATORI:

30 - 80 % Per Valori

di CD34+ Inferiori

all' 1%

Gli Esercizi EQA Controllano l’Effetto dell’Introduzione

di Cambiamenti nella Pratica di Lavoro

Introduzione delleguardie notturne

Brando - Ospedale Niguarda 2002-2003

Immune Monitoring Scheme

Alcuni campioni vengono depleti di T CD4+ mediante Clinimacs, in modo da offrire casi con livelli patologici di CD4+ % e /µL

See what happens with bad monoclonals

Strange performancediscrepancy betweenCD4 & CD3 / CD8

BD Mabs resumedThe cause was an excessnon-specific binding with CD3 and CD8