Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis Doctoral

Glicómica: la espectrometría deGlicómica: la espectrometría demasa UV-Maldi-Tof comomasa UV-Maldi-Tof como

herramienta en la determinación deherramienta en la determinación dela vía biosintética de esfingolípidosla vía biosintética de esfingolípidos

de hemoparásitosde hemoparásitos

Landoni, Malena

2010

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:

Landoni, Malena. (2010). Glicómica: la espectrometría de masa UV-Maldi-Tof comoherramienta en la determinación de la vía biosintética de esfingolípidos de hemoparásitos.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Landoni, Malena. "Glicómica: la espectrometría de masa UV-Maldi-Tof como herramienta en ladeterminación de la vía biosintética de esfingolípidos de hemoparásitos". Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2010.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA

GLICÓMICA: LA ESPECTROMETR ÍA DE MASA UV-MALDI -

TOF COMO HERRAMIENTA EN LA DETERMINACIÓN DE LA

VÍA BIOSINTÉTICA DE ESFINGOLÍPIDOS DE

HEMOPARÁSITOS.

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires

en el área Química Orgánica.

Malena Landoni

Director de Tesis: Dra. Alicia S. Couto. Consejero de Estudios: Dra Alicia S. Couto. Lugar de trabajo: CIHIDECAR, Dp to. Química Orgánica, FCEyN, UBA. Buenos Aires, 2010.

A Salvador, mi gran amor, por compartir todo conmigo por su ayuda invalorable A Felipe, mi pequeño gran amor que llegó a tiempo

para compartir este momento

A mis padres, Julia y Osvaldo, por el apoyo incondicional en todo

la ayuda y el amor que me dan día a día por todo lo que me enseñaron A mi hermano, Kelo, por ser como es por su apoyo, a su manera

A la Dra. Couto, por enseñarme y ayudarme durante todos

estos años, por compartir conmigo todos sus conocimientos y experiencia, por hacerme sentir como en casa.

AGRADECIMIENTOS A las Instituciones y personas que durante estos años posibilitaron y contribuyeron a la realización del presente trabajo de tesis: Al CONICET y a la Agencia Nacional de Ciencia y Tecnología por las becas otorgadas para la realización de este trabajo. Al Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires donde se desarrolló el presente trabajo. A la Dra. Alicia Couto por su gran afecto, todas sus enseñanzas invalorables y los momentos compartidos. A la Dra. Vilma Duschak por su ayuda y gran colaboración y por su afecto. A la Dra. Rosa Erra-Balsells por su afecto. Por compartir su gran experiencia. Al grupo de trabajo del Dr. Nonami, de la Universidad de Ehime, Japón, por su especial colaboración en la realización de los espectros UV-MALDI de los esfingolípidos ácidos. Al Instituto Dr. Mario Fatala-Chaben por los cultivos de Trypanosoma cruzi. Al Dr. Alejandro Katzin y colaboradores de la Universidad de San Pablo, Brasil, por los cultivos de Plasmodium falciparum. Al Departamento de Química Biológica de la FCEyN, por el equipamiento prestado. A los Drs. Marks y Pagano de la Mayo Clinic Foundation, Rochester, U.S.A., por los anticuerpos anti-GCS humana gentilmente cedidos. A todos los profesores, auxiliares y no docentes del Departamento de Química Orgánica de la FCEyN por su cordialidad permanente. A mis compañeras de laboratorio: Mariana, Adriana, Tamara y Juliana. Por compartir alegremente el trabajo cotidiano. Por el compañerismo y la amistad que continúa. Por esas pequeñas ayudas en el momento justo. A mis compañeros del Dpto. de Química Orgánica por los momentos compartidos, especialmente a Ma. Florencia, Teresa, Marianela, Gastón, Laura y Lucia por la tan agradable convivencia diaria. A Diana, Luciana y Maximiliano, por la ayuda con los parásitos y los pequeños prestamos. A Carlos Lima por prestarme siempre las cubetas para el espectrofotómetro.

A mi familia, Mamá, Papá y Kelo, por apoyarme siempre en todos mis emprendimientos. A Salvador por formar parte de mi vida y ayudarme en todo momento. A Felipe por alegrarme la vida con su llegada. A mis suegros, cuñados, sobrinos y Abuelita, por su cariño. A mis amigos de siempre que siguen estando.

Indice

2

INDICE

Resúmen / Abstract 7

Abreviaturas 9

Introducción 11

1. Malaria y Plasmodium falciparum. 11

1.1. Malaria, la enfermedad. 11

1.2. El vector. 12

1.3. El agente etiológico. 14

1.3.1. Ciclo de vida de Plasmodium falciparum. 15

1.3.2. Morfología y estructura de las formas intraeritrocíticas. 17

1.4. La malaria en el mundo. 22

1.5. El problema de la malaria en la actualidad. 24

2. Esfingolípidos. 26

2.1. Esfingolípidos en mamíferos. 26

2.1.1. Metabolismo de los esfingolípidos. 28

2.1.2. Esfingolípidos biológicamente activos. 34

2.2. Esfingolípidos en parásitos. 37

2.2.1. Plasmodium falciparum. 37

2.2.2. Toxoplasma gondii. 41

2.2.3. Leishmania spp. 43

2.2.4. Trypanosoma brucei. 45

2.2.5. Trypanosoma cruzi. 47

3. Herramientas para el estudio de esfingolípidos. 50

3.1. Análogos de esfingolípidos. 50

3.2. Análogos fluorescentes. 51

Indice

3

Resultados y Discusión 57

1. Biosíntesis de esfingolípidos en Plasmodium falciparum. 57

Objetivos. 57

1.1. Glicoesfingolípidos neutros. 58

1.1.1. Efecto del tamoxifeno en la biosíntesis de glicoesfingolípidos

neutros.

67

1.2. Glicoesfingolípidos ácidos. 70

1.2.1. Efecto del DL-t-PPMP en la biosíntesis de glicoesfingolípidos

ácidos.

79

2. Biosíntesis de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi. 84

Objetivos. 84

2.1. Biosíntesis de glicoesfingolípidos neutros. Efecto de diferentes

inhibidores.

85

3. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Plasmodium

falciparum.

92

Objetivos. 92

3.1. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum. 93

3.1.1. Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum. 94

3.1.2. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a

colorantes.

98

3.2. Localización subcelular de la GCS de Plasmodium falciparum. 101

4. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de

Trypanosoma cruzi.

106

Objetivos. 106

4.1. Determinación de la presencia de una GCS activa en Trypanosoma cruzi. 107

4.2. Caracterización de otros productos de la reacción in vitro. 112

4.3. Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi. 115

4.4. Localización subcelular de la GCS de Trypanosoma cruzi. 119

Indice

4

5. Actividad de Glucosilceramida Sintasa en otros parásitos. 121

Objetivos. 121

5. Actividad de GlucosilCeramida Sintasa en otros parásitos. 122

6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.

124

Objetivos. 124

6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. 125

7. Sintesis de conjugados proteína – hidratos de carbono.

134

Objetivos. 134

7. Sintesis de conjugados proteína – hidratos de carbono. 134

7.1. Preparación de conjugados proteína – hidratos de carbono. 135

7.2. Caracterización de oligosacáridos provenientes de la degradación de

heparina.

144

Materiales y Métodos 160

Reactivos y equipamiento utilizado. 160

Cultivo de Plasmodium falciparum. 161

Purificación de los diferentes estadios intraeritrocíticos. 161

Preparación de los complejos NBD-DHCeramida, NBD-Ceramida y NBD-

esfingomielina con seroalbúmina bovina.

161

Incorporaciones metabólicas en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium

falciparum.

162

Incorporación de sustratos fluorescentes 162

Incorporaciones de precursores radioactivos 162

Ensayos con inhibidores en cultivos de Plasmodium falciparum 163

Determinación de la IC50 del tamoxifeno en cultivos de Plasmodium falciparum 163

Cultivo de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, cepas Tulahuen 2 y CL Brener 164

Incorporaciones metabólicas en epimastigotes de Trypanosoma cruzi 164

Ensayos con inhibidores en cultivos de Trypanosoma cruzi 164

Indice

5

Extracción y purificación de los esfingolípidos marcados 165

Extracción de los lípidos 165

Cromatografía de intercambio aniónico 165

Saponificación 166

Ensayo de actividad de la glucosilceramida sintasa (GCS) 166

Cromatografía en capa delgada 166

Cromatografía en capa delgada en fase reversa 167

Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) 167

Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-galactosil (NBD-DHGalCer) y

N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-glucosil (NBD-DHGlcCer)

168

Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfingosina--D-galactosil-3-sulfato(NBD-

Sulfátido)

168

Inmunofluorescencia indirecta 169

Microscopia electrónica 169

Fraccionamiento subcelular de Trypanosoma cruzi 170

Purificación de inmunoglobulinas G presentes en un suero de conejo anti-GCS-

humana

171

Acoplamiento de las inmunoglobulinas G purificadas a Sepharosa 4B activada con

bromocianógeno

171

Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum 172

Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a colorantes 172

Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi 174

Obtención de una fracción enriquecida en membrana 174

Precipitación con sulfato de amonio 174

Ultracentrifugación 174

Cromatografía de afinidad a colorantes 175

Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 176

Revelado con Nitrato de Plata 176

Ensayos de transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y reacción con

antisueros (Western Blot)

177

Cuantificación de proteínas 178

Método de Bradford 178

Método de Lowry 178

Indice

6

Degradación de heparina con ácido nítrico 179

Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detector de pulso

amperométrico (HPAEC-PAD, sistema DIONEX)

179

Síntesis de 1-aminomaltosa 179

Reacción de acople de hidratos de carbono a proteínas 180

Espectrometría de masa UV-MALDI-TOF 181

Equipo utilizado 181

Calibración 181

Matrices utilizadas 181

Preparación de la muestra 182

Conclusiones 184

Trabajos publicados 188

Referencias

189

Resumen

7

GLICÓMICA: LA ESPECTROMETRÍA DE MASA UV-MALDI -TOF COMO HERRAMIENTA EN LA DETERMINACIÓN DE LA VÍA BIOSINTÉTICA DE

ESFINGOLÍPIDOS DE HEMOPARÁSITOS.

Un estudio de “glicómica” sobre un sistema biológico en particular, intenta

determinar los hidratos de carbono que una célula u organismo en particular es capaz de sintetizar bajo condiciones fisiológicas específicas. Este tipo de estudio por lo tanto, refleja el perfil de expresión de genes que codifican glicosiltransferasas, glicosidasas y otros componentes dentro de un camino biosintético. La glicómica es un nuevo campo de investigación que permitirá determinar nuevos blancos para diseñar drogas que tendrán un impacto sobre problemas relevantes. La inherente complejidad de los hidratos de carbono exige la utilización de un gran número de técnicas para ese fin. En los últimos años, la espectrometría de masa de alta resolución UV-MALDI-TOF ha sido una de las herramientas más útiles.

El presente trabajo presenta un estudio glicómico en la vía biosintética de

glicoesfingolípidos de Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi. Además de la caracterización estructural de los productos de dicha vía, se ha aislado y caracterizado la UDP-glucosa:ceramida glucosiltransferasa, enzima clave de este camino biosintético de ambos hemoparásitos y posible blanco quimioterapéutico.

Por otra parte el presente trabajo ha contribuido con el desarrollo de dos

metodologías de análisis por espectrometría de masa que trascienden el campo de la química de parásitos:

1- La utilización de esfingolípidos unidos covalentemente a un grupo fluorescente donde el mismo actúa como fotosensibilizador permitiendo el análisis directo por EM.

2- Siendo conocido que los hidratos de carbono pueden ser responsables de la antigenicidad de un glicoconjugado, se llevó a cabo la síntesis de diferentes conjugados carbohidrato-proteína y su caracterización por EM como herramienta para su utilización en ensayos biológicos.

Palabras claves: Glicómica, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi,

Esfingolípidos, Glucosilceramida sintasa.

8

GLICOMICS: UV-MALDI-TOF MASS SP ECTROMETRY AS TOOL FOR THE DETERMINATION OF SPHINGOLIPIDS BIOSYNTHETIC PATHWAY IN

HEMOPARASITS.

A “Glycomic” study on a particular biological system, attempts to identify the carbohydrate in a particular cell or organism is able to produce under specific physiological conditions. This type of study therefore reflects the expression profile of genes that encode glycosyltransferases, glycosidases and other components in the biosynthetic pathway. The Glycomics is a new field of research that will identify new targets for designing drugs that may have an impact on relevant issues. The inherent complexity of the carbohydrate requires the use of a large number of techniques for this purpose. In recent years, high-resolution mass spectrometry, UV-MALDI-TOF has been one of the most useful tools. In this work we present a glycomic study on the biosynthetic pathway of glycosphingolipids of Plasmodium falciparum and Trypanosoma cruzi. In addition to the structural characterization of the products of this pathway, the UDP-glucose: ceramide glucosyltransferase has been isolated and characterized. This key enzyme of the biosynthetic pathway of both parasites arises as a putative chemotherapeutic target. Moreover this work has contributed to the development of two methods of analysis by mass spectrometry that exceeds the chemistry of parasites:

1 - The use of sphingolipids covalently bound to a fluorescent tag which acts as photosensitizer allowing direct analysis by MS.

2 - Being known that carbohydrates may be responsible for the antigenicity of a glycoconjugate, the synthesis of different carbohydrate-protein conjugates and their characterization by MS was carried out as a tool for use in biological assays

Key words: Glycomics, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi, Sphingolipids,

Glucosylceramide synthase

Abreviaturas

9

ABREVIATURAS 3KSR 3-cetoesfinganina reductasa ADN ácido desoxirribonucleico AnhManOH anhidromanitol APMSF fluoruro de 4-amidinofenil-metansulfonilo -NAD -nicotinamida BODIPY 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diazo-s-indaceno BSA seroalbúmina bovina CCD Cromatografía en capa delgada Cdasa ceramidasa Cer ceramida CerS ceramida sintasa CGalT galactosilceramida sintasa CHCA ácido -ciano-4-hidroxicinámico CK ceramida kinasa CoA Coenzima A CPP ceramida-1-fosfato fosfatasa Da dalton DAG diacilglicerol DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol DDT 1,1,1-Tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etano (Dicloro Difenil

Tricloroetano), DEAE dietilaminoetil DHB ácido 2,4-dihidroxibenzoico DHCD dihidroceramida desaturasa DHCer dihidroceramida DHCerS dihidroceramida sintasa DHGlcCer glucosildihidroceramida DHHexosilcermidas hexosildihidroceramidas DMSO dimetilsulfóxido DTT ditiotreitol EM Espectrometría de masa GA ácido gentísico GalCer galactosilceramida GalCer-SO4 sulfogalactosilceramida GCS glucosilceramida sintasa GlcCer glucosilceramida GlcNAc N-acetil-D-glucosamina GlcNS N-sulfo-D-glucosamina GSL glicoesfingolípidos HPAEC-PAD Cromatografía de alta resolución de intercambio aniónico con detector de pulso amperométrico HPLC Cromatografía líquida de alta resolución IgG inmunoglubulina G IPC inositolfosfoceramida longitud de onda LacCer lactosilceramida LDI laser desorption/ionization (desorción/ionización laser)

Abreviaturas

10

MALDI matriz-assisted laser desorption/ionization (desorción/ionización laser asistida por matriz) mb membrana min. minutos NBD nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol nHo nor-Harmano NP-40 Nonidet P-40 PC fosfatidilcolina PI fosfatidilinositol PM peso molecular PNGasa F péptido: N-glicosidasa F Ppdo precipitado PPMP DL-threo-1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol rpm revoluciones por minuto S1P esfingosina-1-fosfato SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio SK esfingosina kinasa SM esfingomielina Smasa esfingomielinasa SMS esfingomielina sintasa Sn sobrenadante So esfingosina SPP esfingosina-1-fosfato fosfatasa SPT serin-palmitoil transferasa SSI esfingomielina sintasa insensible SSS esfingomielina sintasa sensible TAME N--p-tosil-L-argininmetil éster TBS Tris-buffer salino TFA ácido trifluoroacético THAP 2,4,6-trihidroxiacetofenona TOF time of flight (tiempo de vuelo) Tris 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol UDP-Galactosa uridina difosfogalactosa UDP-Glucosa uridina difosfoglucosa UV ultravioleta v volumen

Introducción

Introducción

11

1. Malaria y Plasmodium falciparum.

1.1. Malaria, la enfermedad.

La malaria es una de las enfermedades parasitarias más importantes en el mundo y

su historia se extiende hasta la antigüedad. Actualmente se acepta que la malaria surgió

en nuestros ancestros primates en África y ha evolucionado junto con el hombre,

dispersándose con las migraciones humanas dentro de las zonas tropicales y

subtropicales del Viejo Mundo y luego al Nuevo Mundo a través de misioneros,

exploradores y esclavos (Cox, 2002).

Las fiebres periódicas, características de la malaria, están registradas desde el

comienzo de la civilización con escritos Chinos del año 2700 a.C. y a través de escritos

Griegos, Romanos, Indios, Árabes y Europeos hasta el siglo XIX. Los primeros detalles

de los síntomas de la enfermedad son los mencionados por Hipócrates en el siglo V a.C.

A partir de ahí se encuentran numerosas referencias de la enfermedad en Grecia e Italia

y en todo el Imperio Romano. Durante este período se asocia la enfermedad a los

pantanos de donde deriva el nombre de la enfermedad (del Italiano “mala aria” que

significa “aire malo”) (Tuteja, 2007).

Sin embargo, el conocimiento de la malaria como enfermedad producida por un

organismo patógeno no comenzó hasta finales del siglo XIX. Luego del establecimiento

de la teoría de los gérmenes y el nacimiento de la microbiología, cuando se volvió

necesario descubrir la causa de la enfermedad que estaba amenazando a gran parte de

Europa.

El parásito responsable de la enfermedad fue visto por primera vez en 1880 por el

cirujano francés Alphonse Laveran. Posteriormente, en 1897, Ronald Ross, observó la

presencia del parásito en el mosquito anophelino, determinando que el mosquito

actuaba como vector de la enfermedad. Un año mas tarde se publicaba el ciclo de vida

del Plasmodium falciparum en el mosquito. Sin embargo, fue recién 50 años después

que se comenzó a elucidar el ciclo de vida del parásito dentro de hospedador vertebrado

(Harrison, 1978).

La malaria puede causar una gran variedad de síntomas, que pueden ir desde

síntomas muy leves a complicaciones serias de la enfermedad e incluso la muerte

(www.cdc.gov ).

Introducción

12

Luego de la picadura del mosquito, existe un período de incubación hasta que

aparecen los primeros síntomas. Este período puede ir de 7 a 30 días y depende de la

especie del parásito. Los síntomas que se manifiestan en los casos de la malaria sin

complicaciones son: fiebre en períodos cíclicos de 48 o 72 horas, acompañada de dolor

de cabeza, nauseas, vómitos y un malestar general.

La malaria severa ocurre cuando las infecciones debidas a Plasmodium falciparum

se complican por fallas serias en algún órgano o por anormalidades en el metabolismo

sanguíneo del paciente. Las manifestaciones de la malaria severa incluyen:

Malaria cerebral, comportamiento anormal, pérdida de conciencia, coma u

otras complicaciones neurológicas.

Anemia severa debida a la hemólisis (destrucción de los glóbulos rojos).

Hemoglobinuria (hemoglobina en sangre) debida a la hemólisis.

Edema pulmonar (fluido en los pulmones) o síndrome agudo respiratorio,

que puede manifestarse incluso después de que haya bajado el número de

parásitos en respuesta al tratamiento.

Problemas en la coagulación y trombocitopenia (disminución en las

plaquetas).

Colapso cardiovascular y shock.

Otras manifestaciones que pueden observarse son: la falla renal aguda,

hiperparasitemia (cuando más del 5% de los glóbulos rojos están infectados con

parásitos), acidosis metabólica (un exceso de acidez en la sangre y los fluidos tisulares)

e hipoglucemia (baja cantidad de glucosa en sangre).

La malaria severa ocurre más frecuentemente en personas que no tienen una

respuesta inmunológica a la malaria o en aquellas cuya inmunidad adquirida ha

disminuido fuertemente. Por lo tanto los grupos de mayor riesgo son las personas que

no residen en zonas donde la malaria es endémica y los niños pequeños y mujeres

embarazadas que habitan en zonas de alta transmisión de la enfermedad (Suh et al,

2004).

La malaria severa es una enfermedad seria que puede terminar en la muerte del

paciente y en consecuencia debe ser tratada urgentemente y de forma agresiva.

Introducción

13

1.2. El vector.

La malaria es transmitida a través de la picadura del mosquito del Género

Anopheles. Existen aproximadamente 400 especies de Anopheles alrededor del mundo,

siendo cerca de 60 las que actúan como vectores de la malaria en condiciones naturales

y 30 de las mismas son las de mayor importancia (Tuteja, 2007).

La transmisión de la enfermedad ocurre a través de la picadura de la hembra del

mosquito, la cual requiere la sangre para la correcta producción de sus huevos.

Como todos los mosquitos, los anophelinos atraviesan cuatro etapas durante su

ciclo de vida, huevo, larva, pupa y adulto. Las tres primeras etapas transcurren en el

agua y duran entre 5 y 14 días dependiendo de las especies y las temperaturas del

medioambiente, y se desarrollan en un amplio rango de hábitats prefiriendo cursos de

agua limpia y sin contaminación. Es en la etapa adulta cuando la hembra actúa como

vector de la malaria. Las hembras adultas pueden vivir hasta un mes en cautiverio pero

probablemente no vivan más de 1 o 2 semanas en la naturaleza.

El conocimiento de la biología y el comportamiento de los mosquitos Anopheles

puede ayudar a entender como la malaria se transmite y puede ser importante para el

diseño de estrategias de control apropiadas. Los factores que afectan la habilidad del

mosquito para transmitir la malaria incluyen la susceptibilidad innata a Plasmodium

spp., su fuente alimentaria y su longevidad.

No todas las especies de Anopheles se alimentan del hombre, existen algunas que

solo lo hacen de animales y otras que se alimentan de ambos. Las principales especies

de Anopheles que se encuentran en África, An. gambiae y An. funestus, se alimentan

casi exclusivamente del hombre lo que las hace vectores muy eficientes (Beier, 1998).

La longevidad del mosquito es importante para su acción como vector ya que una

vez que el parásito es ingerido por el mosquito, el mismo debe atravesar las diferentes

etapas hasta alcanzar la forma que es infecciosa para el hombre. El tiempo requerido

para el desarrollo del parásito en el hospedador invertebrado es de 10 a 21 días

dependiendo de la especie de Plasmodium y de la temperatura. Si el mosquito no vive

un tiempo mayor al tiempo requerido para la incubación, el mismo no será capaz de

transmitir la enfermedad (Aguilar et al, 2005; Boete, 2005).

Introducción

14

1.3. El agente etiológico.

El agente etiológico que causa la malaria es un parásito que pertenece al Phylum

Apicomplexa, Orden Eucoccidia, Familia Plasmodidae, Género Plasmodium. Solo 4

de las más de 100 especies de Plasmodium infectan al humano, Plasmodium

falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae, siendo la

primera la más letal.

Plasmodium falciparum: esta especie se encuentra en todo el mundo en zonas

tropicales y subtropicales. La enfermedad causada por esta especie se caracteriza por

presentar ciclos de fiebre alta a intervalos de 36 - 48 horas. Es la única especie capaz de

causar la malaria severa, potencialmente fatal y es en consecuencia la responsable de

todas las muertes (World Malaria Report, 2008). Es la especie predominante en África.

Plasmodium falciparum causa malaria severa debido a su habilidad de multiplicarse

rápidamente en la sangre causando una fuerte anemia por la lisis de los glóbulos rojos.

Además, los glóbulos rojos infectados pueden obstruir pequeños vasos sanguíneos

evitando la normal irrigación sanguínea de los tejidos y órganos. Cuando esto ocurre en

el cerebro, se denomina malaria cerebral, la cual es una complicación de la enfermedad

que puede llegar a ser fatal.

Plasmodium vivax: esta especie se encuentra principalmente en Asia, América

Latina y en algunas regiones de África. En este caso la fiebre producida se manifiesta

cada 48 horas. Mientras que P. vivax solo ocasionalmente causa la muerte (debido a la

ruptura del bazo por esplenomegalia), puede causar síntomas que son incapacitantes.

Por lo tanto, P. vivax contribuye al problema de la malaria generando un impacto social

y económico (al igual que P. ovale). Esta especie presenta estadios latentes en el hígado

(“hipnozoítos”) que pueden activarse e invadir la sangre (“recaída”) varios meses o

incluso años después de la picadura del mosquito infectado.

Las otras dos especies son considerablemente menos abundantes:

Plasmodium ovale: se encuentra principalmente en África (especialmente en el

oeste del continente) y en las islas del oeste del Pacífico. Es biológica y

morfológicamente muy similar a P. vivax. En este caso también la fiebre alta se

manifiesta cada 48 horas.

Plasmodium malariae: se encuentra en todo el mundo. Es la única especie que

infecta al hombre que tiene un ciclo de 72 horas. P. malariae causa una infección

crónica de larga duración que en algunos casos puede durar toda la vida del paciente. En

Introducción

15

algunos individuos, P. malariae puede causar complicaciones serias como el síndrome

nefrótico (Muller et al, 2007).

1.3.1. Ciclo de vida de Plasmodium falciparum.

El ciclo de vida del parásito Plasmodium falciparum presenta dos fases cada una

en un huésped diferente (Fig. 1.) (Bannister and Mitchell, 2003; Khan and Waters,

2004).

-Ciclo en el hospedador vertebrado: en esta fase del ciclo de vida del parásito ocurre

su reproducción asexuada. Este ciclo puede dividirse en la fase hepática y el ciclo

intraeritrocítico.

Al picar al hombre, el mosquito infectado inyecta una pequeña cantidad de

saliva que actúa como anestésico y anticoagulante, la cual contiene los esporozoítos.

Los esporozoítos entran de esta manera al torrente sanguíneo y luego de 15 a 45

minutos alcanzan el hígado e invaden las células hepáticas.

Una vez dentro del hepatocito, los esporozoítos se transforman en criptozoítos

de forma redondeada donde comienza la fase hepática siendo muy difícil la detección

del parásito durante esta etapa. Luego los criptozoítos se dividen dando lugar a los

esquizontes hepáticos. Este proceso de división celular no sexual tiene una duración de

seis días.

Los esquizontes hepáticos causan la lisis del hepatocito y la consiguiente

liberación de merozoítos directamente en los vasos sanguíneos del hígado. Muchos de

los merozoítos liberados son fagocitados y destruidos por las células de Kupffer pero los

que sobreviven invaden los glóbulos rojos de la sangre dando comienzo al ciclo

intraeritrocítico.

Los merozoítos que invaden los glóbulos rojos comienzan su desarrollo pasando

por los diferentes estadios intraeritrocíticos: anillos o trofozoítos jóvenes, trofozoítos

maduros y esquizontes. Con la ruptura de los esquizontes se liberan nuevos merozoítos

al torrente sanguíneo que infectarán nuevos glóbulos rojos dando continuidad al ciclo.

Como existe una excelente sincronización en el desarrollo de los parásitos, la lisis de los

eritrocitos infectados con la consecuente liberación de los merozoítos al torrente

sanguíneo, ocurre simultáneamente, dando lugar a una alta concentración de parásitos

Introducción

16

Invasión de los hepatocitos por los esporozoítos

Crecimiento de los trofozoítos hepáticos

Multi plicación

Formación de los merozoítos

Liberación de los merozoítos

ESTADÍOS HEPÁTICOS

MacrogametaMicro gameta

Formación del zigoto El oocineto penetra

en la pared celular

Desarrollo del oocisto

Liberación de los esporozoítos

Los esporozoítos invaden las glándulas

salivales

Infección del hombre por los esporozoítos

MOSQUITO

ESTADÍOS SEXUALES

HO

MB

RE

Figura 1. Ciclo de vida de Plasmodium falciparum en el hospedador vertebrado (hombre) e invertebrado (mosquito). (Adaptado de Bannister and Mitchell, 2003).

Invasión

CICLO INTRA-ERITROCÍTICO

Anillo

Trofozoíto

Esquizonte

Merozoítos

Liberación de

merozoítos

Macrogametocito

Microgametocito

Flagelación

ESTADÍOS SEXUALES

Introducción

17

libres en la sangre que se manifiesta por un período de fiebre alta en el hospedador.

Estos ciclos son extremadamente regulares con una duración de 48 horas.

Después de un tiempo y por factores todavía desconocidos, la forma anillo

diferencia a gametocito (masculino o femenino). Los gametocitos no sufren ninguna

división posterior y se encuentran en la sangre periférica siendo su vida media de

aproximadamente 60 días.

-Ciclo en el hospedador invertebrado: mientras que el mosquito macho solo se

alimenta de néctar y savia vegetal, las hembras necesitan sangre en su alimentación para

la maduración de sus huevos.

Cuando una hembra del mosquito Anopheles ingiere sangre de una persona

infectada que contiene las formas sexuales del parásito, gametocitos femeninos y

masculinos, se inicia la fase sexual dentro del tracto digestivo del mosquito. Las

gametas femeninas y masculinas se diferencian en macrogameta y microgameta

respectivamente, y luego de la fecundación de la macrogameta por la microgameta

ocurre la formación del zigoto u oocineto, pocos minutos después de la ingesta de la

sangre. El zigoto es la única forma diploide del ciclo de vida del parásito. El zigoto

migra a la pared del estómago del mosquito donde se aloja entre las células y la

membrana basal del epitelio. El oocineto se transforma en oocisto que queda

encapsulado y se multiplica en forma asexual dando lugar a numerosos esporozoítos.

Finalmente, los esporozoítos se liberan y migran a las glándulas salivares del mosquito,

los cuales serán inoculados en el huésped vertebrado.

La existencia de la reproducción sexual del parásito posibilita la recombinación

génica y con ello el surgimiento de nuevas cepas resistentes a las diferentes drogas que

se utilizan para el tratamiento de la enfermedad.

1.3.2. Morfología y estructura de las formas intraeritrocíticas.

El ciclo intraeritrocítico de Plasmodium falciparum tiene una duración de 48 horas

y durante el mismo se produce la reproducción asexuada del parásito. Comienza con la

invasión de un glóbulo rojo por un merozoíto, el cual evoluciona a la forma anillo al

Introducción

18

cabo de 30 minutos. Luego de 26 horas de la invasión el parásito se transforma en

trofozoíto maduro y finalmente en esquizonte (38 horas). A las 48 horas se produce la

lisis del glóbulo rojo liberándose una gran cantidad de merozoítos al torrente sanguíneo

que infectarán nuevas células para dar continuidad al ciclo (Bannister el al, 2000).

Merozoíto (Fig. 2, A)

El merozoíto tiene una forma ovoide con una longitud de 1,6 mm. En su extremo

anterior se encuentra el complejo apical que esta formado por las roptrias, micronemas y

gránulos densos. Este complejo apical es el responsable del proceso de invasión.

Los merozoítos entran a los glóbulos rojos a través de un complejo mecanismo de

invasión, el cual puede dividirse en cuatro etapas: (a) reconocimiento inicial y

acoplamiento reversible del merozoíto a la superficie del glóbulo rojo (Butcher et al,

1979); (b) reorientación y acoplamiento irreversible entre el extremo apical del parásito

y el eritrocito, y la posterior secretación de sustancias por las roptrias y micronema que

llevan a la formación de la vacuola parasitófora (Murphy et al, 2007); (c) invaginación

de la membrana del eritrocito alrededor del merozoíto acompañado de la perdida de

cubierta del mismo; y (d) sellado de la vacuola parasitófora y de la membrana del

eritrocito luego de que se completo la invasión por el merozoíto (Ward et al, 1993;

Miller et al, 1994).

La superficie del merozoíto esta recubierta por un envoltorio formado

principalmente por glicoproteínas lo que lo hace altamente inmunogénico. Presenta una

membrana plasmática simple recubriendo otra doble membrana interna.

En el interior del merozoíto existen microtúbulos que van de un polo al otro de la

célula. En el citoplasma están presentes varios ribosomas, el núcleo, una mitocondria

grande y un plástido no fotosintético llamado apicoplasto. Esta organela se encuentra

íntimamente asociada con la mitocondria y en los estadios posteriores desempeña un

papel muy importante en la biología del parásito, dado que en la misma ocurren diversas

vías metabólicas como la biosíntesis de ácidos grasos, de isoprenoides y del hemo

(Stuart et al, 2004). La mitocondria presente en el parásito no es una mitocondria típica

y parece no estar involucrada en la síntesis de ATP. La principal fuente de energía del

parásito es la glicólisis y la vía de las pentosas.

Introducción

19

Anillo (Fig. 2, B)

Luego de la invasión, las organelas del complejo apical desaparecen al igual que

los microtúbulos. Se comienza a desarrollar el citostoma que será el responsable de la

fagocitosis en las etapas siguientes. Al mismo tiempo, cerca del núcleo se empieza a

formar el retículo endoplásmico liso y rugoso. También se detecta la formación de un

complejo de Golgi no tradicional que se denomina estructura tipo Golgi. La

mitocondria y el apicoplasto se encuentran siempre unidos entre si por sus extremos.

A medida que el parásito crece, la vacuola parasitófora se ve aumentada en

tamaño y comienzan a formarse unas proyecciones de la membrana de la vacuola que se

extienden hasta la membrana del eritrocito formándose una red tubovesicular de

membranas (Elmendorf and Haldar, 1994; Tamez et al, 2008).

La forma del parásito va cambiando haciéndose más redondeada e irregular.

Trofozoíto (Fig. 2, C)

La distinción morfológica entre los estadios anillo y trofozoíto se basa

principalmente en el tamaño y forma celular más que en diferencias internas

fundamentales.

El crecimiento de los trofozoítos va acompañado de un mayor metabolismo que

incluye: la glicólisis de una gran cantidad de glucosa importada, la ingestión del

citoplasma de la célula hospedera y la proteolisis de la hemoglobina en sus aminoácidos

esenciales. El parásito no es capaz de degradar el hemo producido, el cual es tóxico para

el parásito. De esta forma, durante la degradación de la hemoglobina, la mayoría del

hemo liberado es polimerizado formando la hemozoína (pigmento malárico), una

sustancia cristalina que es almacenada en la vacuola digestiva.

El número de ribosomas libres aumenta ampliamente y el retículo endoplásmico

se agranda, dos cambios que marcan el aumento en la síntesis de proteínas. Asimismo

se observa una más compleja estructura del complejo tipo-Golgi. La mitocondria y el

apicoplasto, que continúan unidos, muestran también un gran crecimiento. El

apicoplasto muestra una enrevesada estructura de membranas y se pone en contacto con

la vacuola digestiva y otras organelas. Esta aproximación indica posibles interacciones

metabólicas.

Introducción

2

0

Extensión superficial Plástido Vacuola pigmentada

Vacuolas digestivas

Citostomas

Invaginación superficial

Vesículas exocíticas RE rugoso Complejo de

Golgi Núcleo

Membrana plasmática

Mitocondria

Ribosomaslibres

C

Plástido Mitocondria

Microtúbulos

Gránulos densos

Micronema

Anillos polares

Prominencia apical

Roptria

Cisterna pelicular Ribosomas

Membrana plasmática

Núcleo

A RE rugoso Complejo de Golgi

Vesículas exocíticas

Plástido

Mitocondria

Ribosomas libres

Núcleo

Membrana plasmática

Citostoma

Vacuolas digestivas pequeñas

B

Membrana del GR Citostoma

Vacuola digestiva

RE rugoso

Hendiduras

Hendiduras

Buds de los merozoítos

Roptria Complejo de Golgi

Huso mitótico

Núcleo

Mitocondría

Plástido

Knobs

D

Figura 2. Estructuras tridimensionales esquemáticas de las formas de Plasmodium falciparum durante el ciclo intraeritrocítico. A, Merozoíto; B, Anillo; C, Trofozoíto; D, Esquizonte. (Modificado de Bannister et al, 2000).

Introducción

21

Durante este período, además de aumentar el tamaño del parásito, comienzan a

observarse modificaciones en la superficie del glóbulo rojo infectado. Nuevas moléculas

son exportadas al eritrocito, donde algunas se ensamblan formando sacos membranosos

generando estructuras conocidas como Maurer’s Clefts (Tilley and Hanssen, 2008).

Otras interactúan con la membrana y el citoesqueleto del eritrocito formando pequeñas

protuberancias en su superficie que se denominan Knobs (Atkinson and Aikawa, 1990),

y otras son insertadas en la membrana del glóbulo rojo y son las responsables de la

citoadherencia de los glóbulos rojos infectados al endotelio de los vasos sanguíneos. De

esta manera el parásito evita ser eliminado del torrente sanguíneo por las defensas del

cuerpo a través del bazo. Si los glóbulos rojos infectados se adhieren a las paredes de

los vasos sanguíneos del cerebro se produce la malaria cerebral, mientras que si ocurre

en la placenta se puede ver afectado el crecimiento fetal.

Esquizonte (Fig. 2, D)

El esquizonte es un parásito intraeritrocítico que esta sufriendo o ha sufrido

repetidas divisiones celulares. De todas formas, la síntesis de algunas de las moléculas

necesarias para la multiplicación del parásito, incluyendo el ADN, se sabe que

comienzan en el estadio trofozoíto (White and Kilbey, 1996; Arnot and Gull, 1998).

En este momento también se observan cambios en la apariencia de los eritrocitos

infectados que se vuelven más angulosos debido a la distorsión del citoesqueleto y la

membrana plasmática producida por las proteínas exportadas del parásito. Además

aumenta el número de Knobs en la superficie del glóbulo rojo (Nagao et al, 2000).

La división nuclear es acompañada por numerosos cambios citoplasmáticos que

implicarán la formación de los merozoítos. Existe una gran proliferación del retículo

endoplásmico rugoso y los ribosomas, se produce la multiplicación de la mitocondria y

del apicoplasto y se genera una acumulación de una o más vacuolas lipídicas. Esta fase

es seguida por la aparición de centros para la formación de los merozoítos, en los cuales

se ensamblan los diferentes elementos que formarán la nueva célula, comenzando con

las organelas del complejo apical (Jaikaria et al, 1993). Antes de la completa

separación, un núcleo, una mitocondria y un apicoplasto se mueven desde el centro del

esquizonte hacia cada merozoíto en formación. Finalmente se separan los merozoítos

del cuerpo residual del esquizonte que contiene la vacuola digestiva (Vickerman and

Cox, 1967). Las membranas de la vacuola parasitófora y del glóbulo rojo se rompen

Introducción

22

liberando los merozoítos a la sangre, que se encuentran listos para infectar nuevos

eritrocitos (Bannister et al, 1986). Esta liberación de los parásitos es la causa del

aumento de la temperatura del hospedador durante la progresión de la enfermedad. Este

ciclo intraeritrocítico es continuo y toma cerca de 48 horas en el caso de Plasmodium

falciparum. Existe gran sincronización entre los ciclos dentro de los diferentes glóbulos

rojos lo que hace que los merozoítos sean liberados aproximadamente a la misma hora

del día. El contenido de los glóbulos rojos infectados que se libera en el momento de su

lisis estimula la producción del factor de necrosis tumoral y otras citoquinas que son los

responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Tuteja, 2007).

1.4. La malaria en el mundo.

La malaria es la enfermedad parasitaria más importante en el mundo. Más del 40 %

de la población mundial vive en zonas donde la malaria es endémica. Los números

exactos no se conocen pero se estima que en el año 2006 se produjeron 250 millones de

casos produciéndose como resultado casi un millón de muertes. El 90% de las muertes

ocurren en África al sur del Sahara, y la mayoría corresponden a niños de menos de 5

años de edad (Guerra et al, 2006; Breman and Holloway, 2007).

La distribución geográfica de la malaria en el mundo depende principalmente de

factores climáticos como la temperatura, humedad y las precipitaciones que generan las

condiciones adecuadas para el desarrollo del mosquito vector (Fig. 3). De esta forma se

observa que la malaria ocurre generalmente en regiones tropicales y subtropicales donde

el mosquito Anopheles puede reproducirse y sobrevivir y de esta forma el parásito

puede completar su ciclo de vida. De las variables climáticas, la temperatura es

particularmente crítica ya que Plasmodium falciparum no puede completar su ciclo de

vida dentro del mosquito a temperaturas inferiores a 20ºC.

Sin embargo, la distribución de la malaria en el mundo no solo se debe a factores

climáticos sino que también se debe a causas socio-culturales, políticas y económicas

siendo los más afectados los países menos desarrollados que se encuentran en la zona

tropical. Más del 90% de los casos de malaria se reportan en África al sur del Sahara y

un 6% se encuentran en 6 países, India, Brasil, Sri Lanka, Vietnam, Colombia y las Islas

Solomon.

Introducción

23

La malaria afecta fundamentalmente regiones de extrema pobreza, donde la alta

morbilidad y mortalidad pueden atribuirse a la falta de tratamientos adecuados, el 60%

de las muertes ocurren dentro del 20% más pobre de la población mundial.

En la Argentina, la malaria no es generalmente grave o peligrosa para la vida del

paciente, pero es debilitante e incapacitante originando pérdidas de días de trabajo,

gastos médicos y pérdidas económicas que afectan a la familia. Los enfermos, además,

constituyen una fuente de infección para otros mosquitos manteniendose de esta manera

la transmisión de la enfermedad, con el consiguiente incremento en el número de

enfermos y familias que se ven afectadas.

Actualmente, los casos reportados en la Argentina son producidos por Plasmodium

vivax. Sin embargo, durante los años 1940 y 1945 se registraron también una gran

cantidad de infecciones por Plasmodium falciparum, las cuales fueron eliminadas en el

año 1960. En el país se han identificado 38 especies de Anophelinos potenciales

vectores de la enfermedad siendo los más importantes An. pseudopunctipennis y An.

darlingi.

El área de la Argentina afectada originalmente por la malaria comprendía regiones

de las provincias de Salta, Jujuy, Tucumán, Chaco y Formosa y en menor medida de

Figura 3. Distribución geográfica de la malaria en el mundo. (World Health Organization, 2007. Última información disponible).

Zonas de alta transmisión de malaria

Zonas de baja transmisión de malaria

Zonas de ausencia de la enfermedad

Introducción

24

Corrientes, Misiones, Catamarca, Santiago del Estero, San Juan, La Rioja, San Luis y

Córdoba (SENAPA-1959). Afortunadamente, se logró erradicar la enfermedad en el

96% de las zonas afectadas originariamente. La enfermedad en la actualidad es

endémica en las zonas tropicales de Salta y Jujuy y es epidémica en algunas zonas de las

provincias de Corrientes y Misiones (Min.de Salud de la Provincia de Jujuy ; Dantur

Juri et al, 2009).

La malaria sigue existiendo en la Argentina, es de interés nacional y de denuncia

obligatoria (Ley Nacional Nº22.585, Decreto 3550/40).

1.5. El problema de la malaria en la actualidad.

La malaria fue eliminada de los Estados Unidos y de la mayor parte de Europa

durante la primera mitad del siglo XX como resultado de cambios en el uso de la tierra,

las prácticas de agricultura, la construcción de casas y por medidas de control del

vector.

El desarrollo del insecticida DDT altamente efectivo para el control del mosquito,

inició un programa de erradicación global en los años 50 y 60 que fue efectivo

inicialmente en algunos países como Sri Lanka, India y algunos sectores de Asia. Sin

embargo este éxito no fue sostenido debido a los altos costos del programa, la

resistencia de diversas comunidades a rociar sus casas repetidamente con el insecticida

y a la aparición de la resistencia al DDT. Por otro lado, no se realizaron esfuerzos en

tratar de controlar la malaria en África.

La eliminación de la malaria de Europa y Estados Unidos y la falla en el programa

de erradicación mundial llevaron a una pérdida del interés en esta enfermedad por un

período de 25 años desde los comienzos de los años 1970 hasta finales de la década del

90. Solo 3 de las 1223 nuevas drogas desarrolladas entre los años 1975 – 1996, fueron

drogas antimaláricas (Greenwood and Mutabingwa, 2002; Rinaldi, 2004).

Las drogas que se utilizan actualmente en el tratamiento de la malaria son:

cloroquina, sulfadoxine-pyrimethamine (Fansidar®), mefloquina (Lariam®),

atovaquona-proguanil (Malarone®), quinina, doxiciclina, y derivados de la artemisina

(White, 2008; Peters, 1971). La quinina fue la primera droga utilizada. Su uso se

remonta al siglo XVII cuando llegó a Europa desde Perú. Se extrae de la corteza del

Introducción

25

árbol de la Cinchona. La quinina actúa sobre las formas sanguíneas maduras inhibiendo

la formación de la hemozoína. Sin embargo presenta efectos colaterales y está

contraindicada en pacientes con alteraciones cardíacas. La cloroquina es una droga

sintética, que se desarrolló durante la segunda guerra mundial en la búsqueda de un

mejor tratamiento contra la enfermedad. Su mecanismo de acción implica la

acumulación del hemo que es tóxico para el parásito. Esta droga tiene menos efectos

colaterales y fue muy ampliamente utilizada debido a su bajo costo, lo que generó la

aparición de resistencia en el párasito. Sin embargo, continua siendo la droga más usada

en la actualidad (Ridley, 2002).

Recientemente, la situación de la malaria ha empeorado y la mortalidad está

probablemente aumentando en África, especialmente en la zona al sur del Sahara. La

principal razón del recrudecimiento de la enfermedad es que Plasmodium falciparum ha

desarrollado resistencia a las drogas más baratas y más utilizadas como la cloroquina.

Otras causas que producen el recrudecimiento de la enfermedad son la resistencia del

mosquito vector a los insecticidas utilizados para su control y a los cambios sociales y

del medio ambiente.

De esta manera, es urgente la necesidad de encontrar una vacuna y nuevas drogas e

insecticidas (Holder, 1999; Carter et al, 2000). Los proyectos genoma del parásito, del

mosquito y del hombre están ayudando en la búsqueda de nuevas herramientas pero es

necesaria también la inversión económica y mecanismos de financiación para que estas

herramientas puedan desarrollarse en los países más pobres donde la malaria tiene las

peores consecuencias (Hoffman et al, 2002; Cooke and Coppel, 2004).

Introducción

26

2. Esfingolípidos.

2.1. Esfingolípidos en mamíferos

La denominación fue dada por J. L. W. Thudichum quien dedicaba su tiempo

libre al estudio de las esfinges de la mitología griega y nombró a los compuestos que

había aislado en 1884 como esfingolípidos debido a la naturaleza enigmática de sus

propiedades y funciones (Merril et al, 1997).

Los esfingolípidos continuaron siendo enigmáticos hasta hace relativamente

poco tiempo. Durante casi 100 años fueron considerados sólo como componentes

estructurales de membranas biológicas. Sin embargo, en los últimos 20 años, dos

descubrimientos fundamentales impulsaron las investigaciones sobre los mismos. El

primero fue la determinación de su capacidad para actuar como primeros y segundos

mensajeros en una gran variedad de mecanismos celulares de señalización y,

posteriormente se encontraron evidencias de que estos compuestos tienen roles

importantes dentro de los microdominios de membrana, denominados lipid rafts

(Futerman and Hannun, 2004).

Como la mayoría de los lípidos de membranas, los esfingolípidos son moléculas

anfipáticas que tienen propiedades hidrofílicas y también hidrofóbicas. Esta última

corresponde a una base esfingosínica unida por un enlace amida a un ácido graso de

cadena larga. El término base esfingosínica se refiere a las bases 2-amino-1,3-dihidroxi

alcano o alqueno. La más común de estas bases es la esfingosina (2-amino-1,3-

dihidroxi-4-octadeceno) (Fig. 4) (Merril, 2002). Las bases esfingosínicas presentan dos

centro asimétricos y por lo tanto existen cuatro estereoisómeros posibles, de los cuales

solo el isómero D-erythro (2S, 3R) es el que se encuentra en la naturaleza (Kok et al,

1997; Dragusin et al, 2003).

El esfingolípido más simple es la ceramida (Fig. 4) que contiene una región

hidrofílica pequeña que corresponde a los dos hidroxilos libres. Este compuesto tiene un

papel central en la señalización celular y es el precursor de una gran variedad de

esfingolípidos más complejos (Merril, 2002).

Los esfingolípidos complejos presentan regiones hidrofílicas de mayor tamaño

como por ejemplo, fosfato en el caso de la esfingosina-1-fosfato (S1P) y la ceramida-1-

fosfato, la fosfocolina en la esfingomielina (SM) y diferentes tipos de hidratos de

carbono en el caso de los glicoesfingolípidos (GSL) (Fig. 4). Los glicoesfingolípidos a

Introducción

27

su vez pueden ser clasificados en glicoesfingolípidos neutros (compuestos únicamente

por monosacáridos neutros) y glicoesfingolípidos ácidos, y estos últimos a su vez

pueden ser sialilados (conteniendo uno a más residuos de ácido siálico) o sulfatados. En

términos de complejidad, existen al menos 5 bases esfingosínicas diferentes en las

células de mamíferos, más de 20 especies de ácidos grasos (que varían en la longitud de

cadena, el grado de instauraciones y/o el grado de hidroxilación) que pueden unirse

Figura 4. Estrucuras de algunos de los esfingolípidos más comunes en células de mamíferos

Glucosilceramida (GlcCer) ((2S,3R)-1-O--glucosil-N-palmitoilesfingosina)

OH

NH

O

OHO

HOOH

OH

O

Esfingomielina (SM) ((2S,3R)-1-O-fosfocolina-N-palmitoilesfingosina)

P

O

O

O-

N+

O

OH

NH

O

Ceramida (Cer) (D-erythro-N-palmitoilesfingosina; (2S,3R)-2-amino-1,3-dihidroxi-N-hexadeciloctadec-4-eno)

OH

OH

NH

O

Esfingosina (So) (D-erythro-esfingosina; (2S,3R)-2-amino-1,3-dihidroxi-4-octadeceno)

OH

OH

NH2

Introducción

28

formando el enlace amida y cerca de 500 estructuras de hidratos de carbono descriptas

hasta el momento en los glicoesfingolípidos (Bell et al, 1993; Kolter et al, 2002).

Aunque generalmente existe una preferencia para la asociación de componentes en

esfingolípidos específicos (esto es, ciertos ácidos grasos se encuentran preferentemente

en ciertos glicoesfingolípidos) el número de potenciales combinaciones es

extremadamente amplio. Esta gran complejidad sería un indicio de que existe un

mecanismo de regulación altamente organizado y eficiente, el cual todavía no ha sido

completamente elucidado (Futerman and Hannun, 2004).

2.1.1. Metabolismo de los esfingolípidos.

En células de mamíferos, la biosíntesis de novo de los esfingolípidos (Fig. 5)

comienza con la condensación de palmitoil-CoA con serina por acción de la serin-

palmitoil transferasa (SPT) para dar lugar a la 3-cetoesfinganina (Hanada, 2003), sobre

la cual actúa la 3-cetoesfinganina reductasa (3KSR) obteniendose la esfinganina

(dihidroesfingosina). La esfinganina es posteriormente acilada con un acido graso

mediante la dihidroceramida sintasa (esfinganina N-acil transferasa, DHCerS)

formandose una amida: la dihidroceramida (Pewzner-Jung et al, 2006), en la cual

finalmente la dihidroceramida desaturasa/reductasa (DHCD) introduce un doble enlace

trans 4-5 para obtener la ceramida (Munoz-Olaya et al, 2008). Esta última actúa como

precursor de esfingolípidos más complejos y esta involucrada en importantes procesos

celulares. La ceramida es el centro del metabolismo de los esfingolípidos y es el primer

punto de acumulación significativa en la biosíntesis de novo de los esfingolípidos

(Merrill, 2002; Hannun and Obeid, 2002).

La ceramida puede ser fosforilada por una ceramida kinasa (CK) dando lugar a

la ceramida-1-fosfato (van Overloop et al, 2006), puede ser glicosilada para formar

glucosilceramida (Ichikawa et al, 1996 ; Paul et al, 1996) o galactosilceramida (Coetzee

et al, 1998; Sprong et al, 1998) o puede ser transformada en esfingomielina por la

acción de la esfingomielina sintasa que transfiere un grupo fosfocolina de la

fosfatidilcolina a la ceramida (Pagano, 1988) (Fig. 5).

La galactosilceramida, a su vez, es el precursor de los sulfátidos (GalCer-3-

sulfato), los cuales son los glicoesfingolípidos mayoritarios de cerebro en mamíferos,

Introducción

29

Figura 5. Biosíntesis de los esfingolípidos. Estructuras de los compuestos y enzimas involucradas en la ruta metábolica en células de mamíferos. SPT: serinapalmitoiltransferasa; 3KSR: 3-cetoesfinganina reductasa; DHCerS: dihidroceramida sintasa; CerS: ceramida sintasa; DHCD: dihidroceramida desaturasa; CK: ceramida kinasa; CPP: ceramida-1-fosfato fosfatasa; CDasa: ceramidasa; CGalT: galactosilceramida sintasa; GCS: glucosilceramida sintasa; SMS; esfingomielina sintasa; SMasa: esfingomielinasa; SK: esfingosina kinasa; SPP: esfingosina-1-fosfato fosfatasa.

SCoA

OHC

COO-

NH3+

CH2OH

+

Palmitoil-CoA L-serina

SPT

OH

O

NH23-Cetoesfinganina

3KSR

OH

OH

NH2Esfinganina

DHCerS

DHCS

OH

OH

NH

ODihidroceramida

OH

OH

NH

OCERAMIDA

CPP

R O

OH

NHR

O

P

O

OH

OH

CK Ceramida-1-fosfato

R O

OH

NHR

O

P

O

O

O-

N+

SMS

SMasa

Esfingomielina

CDasa

R OH

OH

NH2

R O

OH

NH2

P

O

OH

OH

CerS

SK SPP

Esfingosina

Esfingosina-1-fosfato

R

OH

NHR

O

O

HOOH

OHOH

O

CGalT

Galactosilceramida

Sulfátidos

R

O

OH

NHR

O

OHO

HOOH

OH

GCS

Glucosilceramida

Glicoesfingolípidos complejos

Introducción

30

donde presentan un rol importante tanto en la estructura como en las funciones de la

mielina, la cual es una estructura en forma de hoja que cubre los axones nerviosos.

Estos glicoesfingolípidos son los responsables de interacciones del tipo carbohidrato-

carbohidrato entre estas membranas, generando lo que se conoce como las glicosinapsis.

La cadena glicosídica de estos galactoesfingolípidos es raramente extendida.

La glucosilceramida, en cambio, es la base de los glicoesfingolípidos

complejos, los cuales son biosintetizados por adición sucesiva de diferentes residuos de

hidratos de carbono.

Los glicoesfingolípidos son degradados por la acción de hidrolasas específicas

que llevan a la formación de glucosilceramida nuevamente, la cual es sustrato de una -

glucosidasa específica que puede regenerar la ceramida. La esfingomielina también

puede ser hidrolizada para regenerar la ceramida por la acción de varias

esfingomielinasas (SMasa), de las cuales se conocen tres isoformas, la SMasa ácida, la

SMasa neutra y la SMasa alcalina, las cuales se encuentran distribuídas en diferentes

compartimientos celulares (Huitema et al, 2004; Tafesse et al, 2006) (Fig. 5).

Por otra parte, la ceramida puede ser degradada por la ceramidasa, lo que lleva a

la formación de la esfingosina la que tiene dos destinos posibles: la esfingosina puede

ser reciclada en la ruta metabólica de los esfingolípidos o puede ser fosforilada por la

esfingosina kinasa (SK). El producto esfingosina-1-fosfato puede ser desfosforilado

para regenerar la esfingosina por la acción de una fosfatasa específica (SPP).

Alternativamente, la esfingosina-1-fosfato es hidrolizada irreversiblemente por la

esfingosina-1-fosfato liasa dando como productos de degradación final

etanolaminafosfato y hexadecanal (Spiegel and Milstien, 2002).

En los últimos años, se han podido identificar molecularmente las principales

enzimas que actúan en el metabolismo de los esfingolípidos en levaduras primero

(Obeid et al, 2002) y luego en mamíferos. Se ha encontrado que varias de estas enzimas

presentan diferentes isoformas con localizaciones subcelulares específicas. Como se

podría esperar dada la naturaleza lipídica de los sustratos, las enzimas involucradas en la

biosíntesis de los esfingolípidos son proteínas integrales de membrana y se encuentran

localizadas principalmente en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi (Futerman

and Riezman, 2005 ; Delgado et al, 2006; Zheng et al, 2006; Lahiri and Futerman,

2007 ; Kitatani et al, 2008).

Los primeros pasos de la síntesis de novo de los esfingolipidos que llevan a la

formación de la ceramida ocurren en la superficie citosólica de la membrana del retículo

Introducción

31

endoplásmico (Michel and van Echten-Deckert, 1997). La ceramida así formada es

posteriormente sustrato de varias enzimas, las cuales tienen diferentes localizaciones

subcelulares. La ceramida es capaz de traslocar por difusión simple hacia la cara interna

del retículo endoplásmico (Ruggers et al, 2000 ; van Meer and Holthuis, 2000 ;

Montero et al, 2005) donde se encuentra el sitio activo de la galactosilceramida

transferasa que convierte a la ceramida en la correspondiente galactosilceramida. La

galactosilceramida puede posteriormente ser transportada por medio de un transporte

vesicular al complejo de Golgi, donde esta presente la sulfotransferasa responsable de la

transferencia de un grupo sulfato a la posición 3-OH de la galactosa (Honke et al, 1997;

Hirahara et al, 2000; Degroote et al, 2004; Yaghootfam et al, 2007).

Sin embargo, la síntesis de esfingomielina y glucosilceramida ocurre en el

aparato de Golgi, en el cual la esfingomielina es sintetizada en la superficie interna de la

membrana del trans-Golgi (Futerman et al, 1990; Jeckel et al, 1990) mientras que la

síntesis de la glucosilceramida ocurre en la cara citosólica de la región cis del aparato de

Golgi (Futerman and Pagano, 1991; Jeckel et al, 1992) (Fig. 6).

Debido a la estructura y a la alta hidrofobicidad de la ceramida, esta no es capaz

de traslocar entre diferentes membranas intracelulares (Simon et al, 1999) y por lo tanto

debe existir un mecanismo de transporte para que la ceramida alcance el Golgi para sus

posteriores modificaciones desde el retículo endoplásmico en donde es sintetizada.

Existen al menos dos mecanismos por los cuales la ceramida podría ser

transportada desde el retículo endoplásmico hacia el trans-Golgi para la síntesis de

esfingomielina: un mecanismo principal dependiente de energía y otro minoritario no

dependiente de energía que implicaría un transporte vesicular. En el año 2003, el grupo

de Hanada y colaboradores publicaron la identificación de una proteína citosólica

responsable del transporte de la ceramida (CERT) en forma dependiente de energía

exclusivamente para la posterior síntesis de esfingomielina (Hanada et al, 2003). Sin

embargo, la síntesis de glucosilceramida no esta relacionada con la ceramida

transportada por la proteína CERT lo que sugiere que la ceramida utilizada por la

glucosilceramida sintasa alcanza el Golgi por un mecanismo diferente que se ha

descripto como un mecanismo vesicular (Perry y Ridgway, 2005). La glucosilceramida

es sintetizada en la cara citosólica del aparato de Golgi por lo que posteriormente debe

translocar hacia la cara interna del trans-Golgi donde se encuentran las

glicosiltransferasas responsables de la síntesis de los glicoesfingolípidos complejos.

Introducción

3

2

Figura 6. Localización subcelular de los metabolitos y enzimas involucrados en la biosíntesis de los esfingolípidos. GSL, glicoesfingolípidos; SM, esfingomielina; GlcCer, glucosilceramida; DHCer, dihidroceramida; Sa, esfinganina; 3KSa, 3-cetoesfinganina; Ser, serina; So, esfingosina; S1P, esfingosina-1-fosfato.

Introducción

33

Hannun y colaboradores describieron en el 2007 la existencia de la proteína FAPP2 que

estaría involucrada en el transporte específico de la glucosilceramida sintetizada hacia el

sitio de acción de las sucesivas glicosiltransferasas (D’Angelo et al, 2007). La

translocación a través de la membrana para alcanzar la cara interna del trans-Golgi está

a cargo de otra proteína ubicada en dicha membrana que actúa como

transportador específico no dependiente de energía (Buton et al, 2002). Finalmente,

tanto la esfingomielina como los glicoesfingolípidos complejos son transportados desde

el trans-Golgi hacia la membrana plasmática por un mecanismo vesicular similar al

descripto para el tráfico de proteínas (Futerman, 2006).

La esfingomielina presente en la membrana plasmática puede ser hidrolizada por

las esfingomielinasas ácida y neutra que se encuentran como proteínas integrales de la

membrana para dar ceramida nuevamente, la cual es sustrato de la ceramidasa neutra

generándose esfingosina. Esta puede ser reciclada para obtener ceramida que entra

nuevamente en el metabolismo de los esfingolípidos o puede ser fosforilada por la

esfingosina kinasa citosólica para dar esfingosina-1-fosfato (Hannun and Obeid, 2002;

Kolenisk, 2002).

Por otra parte, los glicoesfingolípidos complejos y la esfingomielina de la

membrana plasmática son transportados hacia lisosomas ácidos por un mecanismo de

endocitosis (Riboni et al, 1997; Sharma et al, 2003). La degradación de los

glicoesfingolípidos ocurre en forma secuencial donde se van liberando una a una las

unidades de monosacáridos desde el extremo no reductor por acción de diferentes

exohidrolasas (Kolter and Sandhoff, 2005) obteniéndose como resultado ceramida. La

esfingomielina también es hidrolizada en el lisosoma por acción de una

esfingomielinasa ácida para generar ceramida. La ceramida, proveniente de ambas

degradaciones, es posteriormente desacilada por una ceramidasa específica para dar

lugar a la esfingosina, la cual puede atravesar la membrana del lisosoma y actuar como

sustrato de diferentes enzimas, tanto para ser reacilada generando una nueva ceramida o

para ser fosforilada.

El único punto de salida de los esfingolípidos del pool celular general es a través

de la degradación de la esfingosina-1-fosfato mediada por la enzima esfingosina-1-

fosfato liasa que da como productos el aldehído de cadena larga correspondiente y

fosfoetanolamina. Por lo tanto, la actividad de la esfingosina kinasa, enzima responsable

de la fosforilación de esfingosina, inicia la única vía bioquímica degradativa para la

eliminación de la ceramida de la célula.

Introducción

34

La localización subcelular de las enzimas del metabolismo de los esfingolípidos,

así como también los mecanismos de transporte específicos que actúan en la misma ruta

metabólica son determinantes para comprender la acción de los esfingolípidos

biológicamente activos ya que de acuerdo con su estructura estos lípidos se encuentran

principalmente formando parte de membranas y muestran poco movimiento entre

diferentes compartimientos intracelulares. Además, es interesante notar que los niveles

intracelulares de los diferentes esfingolípidos bioactivos son considerablemente

diferentes. Las concentraciones intracelulares de ceramida, esfingosina y esfingosina-1-

fosfato difieren en más de un orden de magnitud, donde la ceramida presenta la mayor

concentración y la esfingosina-1-fosfato el menor nivel. Por lo tanto, la hidrólisis de una

pequeña cantidad de la ceramida sintetizada de novo podría implicar un incremento

importante en los niveles de esfingosina. De la misma forma, la fosforilación de un 1-

3% de la esfingosina generaría un aumento al doble en la concentración de la

esfingosina-1-fosfato (Bartke y Hannun, 2008; Hannun y Obeid, 2008).

Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores se puede suponer que existe

una importante regulación de toda la vía metabólica para controlar las concentraciones

individuales de cada esfingolípidos y también de su interconversión metabólica,

considerando además que existen varias enzimas que pueden operar simultáneamente

sobre el mismo sustrato.

2.1.2. Esfingolípidos biológicamente activos

Los “lípidos bioactivos” son aquellos que producen consecuencias funcionales

en la célula debido a cambios en sus niveles intracelulares. En las últimas décadas se ha

demostrado que los esfingolípidos no son solamente compuestos estructurales de

membranas biológicas sino que además son lípidos bioactivos involucrados en la

regulación del citoesqueleto, de la endocitosis, del ciclo celular y de la apoptosis (Smith

et al, 2000). Los esfingolípidos más estudiados hasta el momento han sido la ceramida y

la esfingosina-1-fosfato que tienen roles importantes en diversos eventos celulares como

la proliferación (Adam et al, 2002), crecimiento y diferenciación celular (Okazaki et al,

1989) y apoptosis (Obeid et al, 1993; Venkatamaran and Futerman, 2000; Ogretmen

and Hannun, 2001). La ceramida está involucrada en la respuesta celular al estrés

Introducción

35

Respuesta biológica

Inductores

síntesis de novo

Esfingomielina (30000)

Ceramida (3000)

Esfingosina (100)

Esfingosina-1-fosfato (1)

SMasa CDasa SK

Senescencia Diferenciación Apoptosis Detención del ciclo celular

Apoptosis Detención del ciclo celular

Proliferación Mitogénesis Inflamación Migración Angiogénesis Protección de la apoptosis

Radiación UV Quimioterapia

Estrés Radiación UV Quimioterapia

Factores de crecimiento Citoquinas Hipoxia

Figura 7. Resumen de las funciones de los principales esfingolípidos bioactivos. Los esfingolípidos están metabolicamente conectados entre sí y en consecuencia debe existir un mecanismo de regulación específico. Estos lípidos bioactivos interaccionan con proteínas específicas como fosfatasas, kinasas y receptores acoplados a proteína G que son los efectores de las distintas respuestas celulares. Entre paréntesis se muestran las concentraciones celulares relativas de cada uno de los esfingolípidos (Modificado de Hannun and Obeid, 2008).

desencadenando la apoptosis y la senescencia celular (Venable et al, 1995), mientras

que la esfingosina-1-fosfato actúa sobre la supervivencia celular, migración e

inflamación (Hla, 2004). La ceramida y la esfingosina-1-fosfato tienen, entonces, roles

opuestos en los mecanismos de supervivencia y muerte celular de manera que el

destino de la célula está determinado por la relación de los niveles de estos dos

esfingolípidos bioactivos que están conectados metabólicamente (Maceyka et al, 2002 ;

Lahiri and Futerman, 2007) (Fig. 7).

Actualmente también están siendo objeto de estudio otros esfingolípidos como la

ceramida-1-fosfato que estaría involucrada en procesos de inflamación y el tránsito

vesicular (Chalfaut and Spiegel, 2005; Mitsutake et al, 2004; Hinkovska-Galcheva et al,

2005) y la glucosilceramida que actuaría en los mecanismos de transporte post-Golgi y

Introducción

36

en la resistencia a drogas (Radin et al, 1993; Gonaze-Andersson and Cabot, 2006).

Además existen evidencias de que los glicoesfingolípidos más complejos están

involucrados en la fisiología celular al actuar como antígenos (De libero et al, 2002),

mediadores de la adhesión celular y como moduladores de la transducción de señales

(Hakomori, 2002).

Por otra parte, los esfingolípidos tienen una gran importancia en la formación y

estabilidad de los microdominios de membrana (lipid rafts) (Futerman and Hannun,

2004), los cuales tienen una composición rica en esfingolípidos y colesterol (Munro,

2003). Estudios recientes mostraron que los diferentes microdominios contienen

diferentes proteínas y distintas especies de esfingolípidos que difieren en la longitud de

cadena y en los grupos polares (Brugger et al, 2004). Cada vez está más aceptada la

hipótesis de que los lipid rafts de la membrana plasmática estarían funcionando como

plataformas de señalización donde estarían localizados receptores y kinasas. Existen

evidencias significativas que muestran que algunos de los roles de la ceramida en la

señalización celular estarían relacionados con su presencia en estos microdominios

(Gulbins and Kolesnik, 2003) y que la generación de ceramida a través de la acción de

la esfingomielinasa ácida de la membrana estaría favoreciendo la formación de estos

lipid rafts (Cremesti et al, 2002; Saito and Yokasuka, 2006).

Los esfingolípidos son hoy considerados como importantes efectores de una

gran variedad de procesos celulares. La complejidad del metabolismo de los mismos y

la interconversión de los esfingolípidos bioactivos proveen a la célula con un amplio

repertorio de moléculas, no sólo para generar múltiples señales, sino también para

regular en forma precisa diversas respuestas específicas.

Introducción

37

2.2. Esfingolípidos en parásitos

2.2.1. Plasmodium falciparum

El estudio del metabolismo de lípidos en Plasmodium falciparum está limitado a

los estadios intraeritrocíticos del mismo. Luego de la invasión del glóbulo rojo, el

parásito se desarrolla dentro de la vacuola parasitófora (Murphy et al, 2007; Ward et al,

1993; Miller et al, 1994) y genera una red tubovesicular de membranas modificando el

citoplasma del glóbulo rojo infectado (Eldorf and Ferguson, 1993; Elemendorf and

Haldar, 1994; Haldar, 1998). A través de esta red de membranas el parásito exporta

proteínas hacia la membrana del glóbulo rojo e importa diferentes nutrientes desde la

célula hospedadora (Gero and Kirk, 1994; Haldar, 1994; Deitsch and Wellems, 1996).

Además de los cambios que ocurren dentro del citoplasma de los eritrocitos, la

composición lipídica de la membrana plasmática de los glóbulos rojos infectados se ve

modificada por la presencia del parásito. El análisis del contenido lipídico de los

eritrocitos infectados muestra un importante incremento de fosfatidiletanolamina y

fosfatidilcolina principalmente y una disminución significativa de esfingomielina

(aproximadamente 47%) (Holz, 1977; Maguire and Sherman, 1990; Hsiao et al, 1991).

Se sabe que los eritrocitos maduros que son infectados carecen de núcleo, organelas

intracelulares y estructuras con membrana y, además, son incapaces de la síntesis de

novo de proteínas y lípidos (Chasis et al, 1989). De todas maneras, en estas células se

generan nuevas membranas y hay modificaciones de los componentes lipídicos luego de

la infección por Plasmodium falciparum lo que sugiere que su formación es regulada

por el parásito aunque los mecanismos bioquímicos y moleculares todavía son, en su

mayoría, desconocidos.

A pesar de que el metabolismo y la actividad de los esfingolípidos están

ampliamente estudiados en mamíferos, muy poco es lo que se sabe sobre los mismos en

Plasmodium falciparum.

Los primeros trabajos publicados donde fueron realizados experimentos de

marcaciones metabólicas en Plasmodium falciparum utilizando serina y acido palmítico

marcados radioactivamente no mostraron cantidades detectables de esfingolípidos

marcados sugiriendo, en un principio, que el parásito era incapaz de sintetizar

esfingolípidos de novo (Vial et al, 1982; Ansorge et al, 1995; Elabbodi et al, 1997). Sin

embargo, experimentos utilizando análogos fluorescentes o ceramidas radioactivas de

Introducción

38

cadena corta evidenciaron la capacidad del parásito de sintetizar esfingomielina como

único producto, sugiriendo la existencia de una esfingomielina sintasa en Plasmodium

falciparum (Haldar, 1991; Ansorge et al, 1995; Lauer et al, 1995). La ausencia de

cantidades detectables de glicoesfingolípidos luego de las incorporaciones metabólicas,

especialmente de glucosilceramida, en los eritrocitos infectados llevó a la conclusión de

que la enzima responsable del primer paso de glicosilación estaba ausente en

Plasmodium falciparum o a una falta de reconocimiento del sustrato por la enzima del

parásito (Haldar, 1991).

En los últimos años, en el genoma de P. falciparum, se han encontrado dos

genes continuos que codifican para dos esfingomielina sintasas putativas (PFF1210w y

PFF1215w) (Welti et al, 2007). Simultaneamente, los estudios de caracterización

bioquímica de la esfingomielina sintasa de P. falciparum reveló que existen dos

isoformas de la misma con diferente sensibilidad al inhibidor PPMP (DL-threo-1-fenil-

2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol) el cual es un conocido inhibidor de la

esfingomielina sintasa de mamíferos (Vunnam and Radin, 1980; Inokuchi and Radin,

1987; Abe et al, 1992 ; Rosenwald et al, 1992). Las dos isoformas de la enzima del

parásito presentan, además de una diferente sensibilidad al inhibidor, una localización

intracelular específica. La esfingomielina sintasa sensible (SSS) (inhibida a bajas

concentraciones de PPMP) se encuentra en la red tubovesicular de membranas mientras

que la esfingomielina insensible (SSI) (inhibida a concentraciones mayores a 25 M de

PPMP) se localiza en la zona perinuclear dentro del parásito (Elmendorf and Haldar,

1994; Ansorge et al, 1995; Lauer et al, 1995; Haldar, 1996; Haldar, 1998). La

inhibición de la enzima sensible bloquea la correcta formación de la red tubovesicular

de membranas en el estadio anillo, haciendo que el parásito no pueda importar los

nutrientes necesarios y, en consecuencia, no pueda desarrollarse (Lauer et al, 1995 y

1997).

Las evidencias existentes indican la presencia de la enzima esfingomielina

sintasa en Plasmodium falciparum, pero todavía queda por determinar las fuentes de la

ceramida que utiliza dicha enzima para la síntesis de la esfingomielina propia del

parásito. Se ha propuesto que la ceramida podría provenir de la hidrólisis enzimática de

la esfingomielina de la célula hospedadora y/o de la hidrólisis de glicoesfingolípidos

complejos que son internalizados desde la membrana de la célula hospedadora (Hsiao et

al, 1991; Maguire et al, 1991; Lauer et al, 2000). Sin embargo, fue recién a principios

de esta década que dos grupos de investigadores independientes describieron la

Introducción

39

existencia de una actividad enzimática de Plasmodium falciparum correspondiente a

una esfingomielinasa dependiente de Mg2+ que se encuentra asociada a membrana

(Hanada et al, 2000; Lauer et al, 2001). Aunque la localización subcelular de esta

enzima continua siendo controversial, ensayos realizados por el grupo de Haldar y

colaboradores estarían indicando que la esfingomielinasa de Plasmodium falciparum se

encuentra en la membrana plasmática del parásito y por lo tanto la esfingomielina

proveniente de la célula hospedadora debe ser internalizada por medio de la red

tubovesicular de membranas (Lauer et al, 2001). Esta enzima, entonces, podría estar

generando la fuente de la ceramida necesaria para que el parásito re-sintetice su propia

esfingomielina en la red tubovesicular de membranas por acción de la esfingomielina

sintasa propia.

Sin embargo, a pesar de que en los comienzos no fue posible detectar la síntesis

de novo de glicoesfingolípidos en Plasmodium falciparum utilizando diferentes

precursores marcados, en el año 2001, Gerold y Schwarz presentaron las primeras

evidencias de que esta biosíntesis si ocurría en el parásito (Gerold and Schwarz, 2001).

Estos autores fueron capaces de identificar ceramida y glicoesfingolípidos como

productos de marcaciones metabólicas con serina y glucosamina marcadas. La síntesis

de novo en Plasmodium falciparum resultó ser también sensible frente a conocidos

inhibidores de la síntesis de ceramida y glucosilceramida en mamíferos (Platt and

Butters, 1995). De todas formas, la inhibición de la síntesis de los esfingolípidos resultó

no ser completa, indicando que los inhibidores utilizados, o bien no llegan

eficientemente al parásito que se encuentra dentro de la célula hospedadora, o que las

enzimas son menos sensibles a los inhibidores utilizados implicando cierto grado de

diferencia entre las enzimas del parásito y las de mamíferos de esta ruta metabólica.

La presencia de Fumonisina B1, un inhibidor de la dihidroceramida sintasa

(Vesper et al, 1999), inhibe eficientemente la síntesis de novo de glicoesfingolípidos

marcados a partir de serina mientras que la formación de esfingomielina se ve menos

afectada. Frente a estos resultados, los autores especularon que las diferencias en el

grado de inhibición de la síntesis específica del parásito de esfingomielina y otros

esfingolípidos se debe a que la esfingomielina, como ya ha sido demostrado, es esencial

para el desarrollo intraeritrocítico del parásito y por lo tanto la síntesis de novo no debe

ser la única fuente de ceramida para la enzima esfingomielina sintasa (Lauer et al,

1995).

Introducción

40

Fue interesante que el tratamiento con mioricina y cicloserina, inhibidores de la

serina palmitoiltransferasa, la primera enzima involucrada en la síntesis de novo, dieron

como resultado una disminución en la incorporación de glucosamina marcada,

implicando que los glicoesfingolípidos provienen de la síntesis de novo.

Simultaneamente a los efectos sobre la síntesis de los esfingolípidos, se

determinó que los inhibidores ensayados, mioricina y Fumonisina B1, producen, a altas

concentraciones, una inhibición de la multiplicación del parásito (39% mioricina y 18%

Fumonisina B1) indicando que la síntesis de novo de los esfingolípidos estaría

afectando a la multiplicación y viabilidad de P. falciparum en cultivos aunque todavía

no se conoce el mecanismo involucrado (Gerold and Schwartz, 2001).

Sin embargo, pese a la existencia de la síntesis de novo de esfingolípidos, la

inhibición de dicha vía no evita el crecimiento del parásito dentro de la célula

hospedadora, lo que estaría sugiriendo que la ceramida proveniente de la síntesis de

novo no sería la principal fuente de sustrato para la esfingomielina sintasa, cuyo

producto es esencial para la correcta formación de la red tubovesicular de membranas y

el desarrollo del parásito. Este hecho, en conjunto con las evidencias existentes de la

presencia de una actividad enzimática de esfingomielinasa propia del parásito, sugieren

que esta última es la fuente principal de ceramida en el parásito para la síntesis de

esfingomielina (Lauer et al, 2001).

Finalmente, el gran número de evidencias que involucran a la ceramida en una

gran variedad de procesos biológicos en células de mamíferos llevó al estudio de los

posibles roles de la ceramida en Plasmodium falciparum. Diferentes estudios realizados

demostraron que la ceramida tiene un efecto antimalárico (Pankova-Kholmansky et al,

2003; Pankova-Kholmansky and Flescher, 2006). Las evidencias encontradas sugieren

que el mecanismo de acción de la ceramida en la inhibición del crecimiento del parásito

sería una consecuencia de la disminución en el nivel de glutatión de la célula. Debido a

la digestión de la hemoglobina metabolizada, el parásito genera una gran cantidad de

ferriprotoporfirina tóxica. Cerca del 30% de la misma es convertida por polimerización

en hemozoína que no es tóxica para el parásito (Slater et al, 2001). El resto de la toxina

que queda libre debe ser degradada para poder garantizar la supervivencia del parásito,

para lo cual la ferroprotoporfirina debe salir de la vacuola digestiva para ser degradada

por el glutatión presente en el citoplasma (Atamna and Ginsburg, 1995; Famin et al,

1999), en consecuencia una disminución en el nivel de glutatión produce una

acumulación de la toxina y la consecuente muerte del parásito. De esta manera, la

Introducción

41

ceramida produce la muerte de Plasmodium falciparum al eliminar un mecanismo de

defensa fisiológico del parásito contra la ferroprotoporfirina.

2.2.2. Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado perteneciente al Phylum

Apicomplexa que puede invadir todas las células nucleadas del hospedador, incluyendo

al hombre. El parásito tiene dos estadios en su ciclo de vida: el tachizoíto que es la

forma replicativa y que se encuentra durante la infección aguda, y el bradizoíto que se

encuentran formando los quistes intracelulares latentes. Las infecciones con

Toxoplasma spp. son generalmente asintomáticas pero pueden causar lesiones severas

en personas inmunosuprimidas, especialmente en pacientes con el síndrome de

inmunodeficiencia adquirida (SIDA) debido a la reactivación de la toxoplasmosis

crónica por ruptura de los quistes intracelulares (Kim and Weiss 2004; Montoya and

Liesenfeld, 2004).

El parásito se multiplica y desarrolla dentro de la vacuola parasitófora en el

citoplasma de la célula hospedadora (Mordue et al, 1999). La membrana de esta vacuola

se forma durante la invasión con componentes provenientes tanto del parásito como de

la célula hospedadora (Sibley et al, 1986; De Carvalho and De Souza, 1989; De

Carvalho and De Souza, 1990; Pfefferkorn, 1990). Durante el crecimiento del parásito,

la vacuola también aumenta su tamaño para lo cual es necesaria la síntesis y/u obtención

de los componentes para la formación de la misma.

Actualmente, el conocimiento acerca de los esfingolípidos en Toxoplasma

gondii es muy escaso. Los primeros estudios realizados acerca del metabolismo de los

esfingolípidos en estos parásitos se llevaron a cabo utilizando análogos fluorescentes de

ceramidas. Estos estudios mostraron evidencias de que los tachizoítos de T. gondii son

capaces de incorporar ceramidas desde la célula hospedadora, las cuales son

posteriormente metabolizadas y distribuidas en la membrana de la vacuola parasitófora

(de Melo and de Souza, 1996).

La primera evidencia de la síntesis de novo de esfingolípidos en el parásito fue

descripta en el año 2002, donde se encontró la presencia de ceramida, ceramidas

glicosiladas y esfingomielina marcados en los estadios replicativos utilizando como

Introducción

42

precursores serina y galactosa tritiadas (Azzouz et al, 2002). El análisis de los

esfingolípidos marcados mostró que los glicoesfingolípidos mayoritarios contienen dos

y tres unidades de monosacáridos y que la galactosa es transformada en N-acetil-

galactosamina antes de ser incorporada en los glicoesfingolípidos (Azzouz et al, 2002).

Por otra parte, el mismo trabajo mostró que la síntesis de novo de esfingolípidos

en T. gondii es sensible al inhibidor L-cicloserina, el cual bloquea la acción de la

primera enzima de la biosíntesis, y también al inhibidor PPMP, que actúa al nivel de las

enzimas responsables de modificar la ceramida para dar la esfingomielina y la

glucosilceramida, indicando que las enzimas del parásito deben presentar ciertas

similitudes con aquellas enzimas presentes en el hospedador mamífero. De todas

maneras, es necesaria una caracterización más detallada de las enzimas involucradas en

esta ruta metabólica para determinar el grado de similitud y diferencia entre las enzimas

del parásito y el hospedador a fin de de establecer si las mismas podrían ser utilizadas

como blancos de nuevas drogas antiparasitarias.

Estudios más recientes confirmaron nuevamente la existencia en Toxoplasma

spp. de diferentes ceramidas glicosiladas mediante el estudio de los productos obtenidos

a partir de las incorporaciones metabólicas de UDP-glucosa (Marechal et al, 2002) y

acetato (Bisanz et al, 2006) marcados radioactivamente. Otro trabajo mostró que T.

gondii presenta además fosfoesfingolípidos de los cuales se identificó el que se

encuentra en mayor proporción como ceramida-1-fosfoetanolamina (Welti et al, 2007),

el cual solo se presenta en muy pequeñas cantidades en células de mamíferos (Maurice

and Malgat, 1990). También se determinó que la cantidad de esfingomielina en las

células infectadas por el parásito es significativamente inferior que en las células no

infectadas, lo que estaría indicando la posible hidrólisis de la esfingomielina del

hospedador. El análisis del genoma de T. gondii mostró la presencia de un gen

(50.m03113) que codificaría para una esfingomielina sintasa putativa del parásito

aunque todavía no se tienen evidencias bioquímicas de esta actividad enzimática (Welti

et al, 2007).

Introducción

43

2.2.3. Leishmania spp.

Leishmania spp. es un parásito protozoario del Orden Kinetoplastida, familia

Trypanosomatidae, que causa una gran variedad de enfermedades en el hombre y otros

animales, conocidas conjuntamente como Leishmaniasis.

El ciclo de vida del parásito tiene tres estadios diferentes en dos hospedadores:

los promastigotes procíclicos y metacíclicos flagelados en el tracto digestivo del vector

y los amastigotes no flagelados que son intracelulares y residen en el compartimiento

fagolisosomal ácido de los macrófagos de mamíferos (Chang, 1983; Molyneux and

Killick-Kendric, 1987; Socks, 1989). Todos los estadios están adaptados para

desarrollarse en ambientes hidrolíticos y hostiles, y se cree que las moléculas

específicas expresadas en la superficie de la membrana del parásito tienen una función

protectora fundamental (Chaudhuri et al, 1989; Turco, 1990). En Leishmania spp. están

presentes una amplia variedad de glicoconjugados con diferentes y complejas

estructuras. Todos estos compuestos presentan diferentes funciones en la progresión de

la enfermedad en los hospedadores vertebrados o directamente en el ciclo de vida del

parásito. Entre los gliconjugados de membrana más importantes se encuentran los

lipofosfoglicanos, glicoinositolfosfolípidos, proteofosfoglicanos y glicoesfingolípidos

(Descoteaux and Turco, 1999). Muchos de estos compuestos se encuentran dentro de

los microdominios de membrana resistentes a detergentes (lipid rafts) (Denny et al,

2001; Ralton et al, 2002) los cuales están enriquecidos principalmente en esfingolípidos

y esteroles (Denny et al, 2001).

Los principales esfingolípidos complejos en las diferentes especies de

Leishmania son la inositolfosfoceramida (IPC) y sus derivados glicosilados, en forma

similar a lo que ocurre en hongos y plantas (Lester and Dickson, 1993; Sperling and

Heinz, 2003) que representan un 5 a 10% de los lípidos totales de la célula (Kaneshiro

et al, 1998). La inositolfosfoceramida es sintetizada por la transferencia del grupo

fosforilinositol desde el fosfatidilinositol a la ceramida, proceso catalizado por la

enzima inositolfosfoceramida sintasa, la cual ha sido clonada y caracterizada

bioquímicamente en Leishmania major (Denny et al, 2006). Debido a que la

inositolfosfoceramida no se encuentra en las células de mamíferos ha sido considerada

como un posible blanco de nuevas drogas antiparasitarias y en consecuencia su

biosíntesis y características han sido ampliamente estudiadas y no abarcaremos el tema

en este trabajo.

Introducción

44

Dentro de los esfingolípidos presentes en Leishmania spp. se ha determinado

también la existencia de relativamente grandes cantidades de glicoesfingolípidos en las

formas amastigote mientras que en las formas promastigote, estos compuestos están

prácticamente ausentes (Straus et al, 1993). Este hecho estaría implicando un cambio

importante en la composición de la membrana plasmática del parásito que se encontraría

asociado al proceso de diferenciación. La modulación en la biosíntesis de los

glicoesfingolípidos y su expresión en amastigotes podrían estar relacionadas con la

supervivencia y proliferación del parásito dentro de los macrófagos del hospedador.

Estudios realizados para determinar las funciones de estos compuestos mostraron que

los mismos son importantes en el reconocimiento y adhesión entre el parásito y el

macrófago, ya que anticuerpos generados contra los glicoesfingolípidos de Leishmania

inhiben fuertemente la invasión (Straus et al, 1993).

Los primeros estudios sobre la biosíntesis de novo de esfingolípidos en

Leishmania spp. recién fueron publicados en la última década. Dentro de los mismos se

encuentran las publicaciones de dos grupos independientes que determinaron la

existencia en Leishmania spp. de la primera enzima del metabolismo de la ceramida, la

serin-palmitoiltransferasa (Zhang et al, 2003; Denny et al, 2004). Esta enzima se

expresa abundantemente en las formas replicativas promastigotes procíclicos mientras

que no es detectable en el estadio amastigote (Denny et al, 2004). Estudios de

silenciamiento e inhibición farmacológica de esta enzima mostraron que la síntesis de

novo de esfingolípidos no es necesaria para la supervivencia del parásito pero si para la

diferenciación de las formas procíclica a metacíclica y el correcto desarrollo del ciclo de

vida del paráasito (Zhang et al, 2003).

A pesar de la ausencia de la enzima serin-palmitoiltransferasa en las formas

amastigote, se conoce que el parásito, en este estadio, presenta cantidades considerables

de esfingolípidos, lo que sugiere la existencia de un mecanismo alternativo para

compensar la falta de síntesis de novo de estos esfingolípidos. Una teoría indica que

Leishmania spp. sería capaz de internalizar glicoesfingolípidos de la célula hospedadora

para suplir sus propias necesidades (Winter et al, 1994). Las evidencias indican que

Leishmania spp. internaliza esfingolípidos del hospedador que son hidrolizados y

posteriormente reciclados en especies propias del parásito, lo que estaría indicando que

los esfingolípidos contribuyen a la supervivencia del parásito (Zhang et al, 2005).

Alternativamente, en ausencia de la enzima, es posible que las formas amastigote

sinteticen esfingolípidos complejos utilizando precursores de fuentes alternativas, por

Introducción

45

ejemplo, Leishmania donovani estimula la producción de ceramida en el hospedador, la

cual es internalizada por el parásito para posteriores modificaciones (Ghosh et al, 2002).

Ambos mecanismos permitirían mantener la estructura de la membrana del parásito

pero no permitiría, en principio, regular la síntesis de los diferentes esfingolípidos que

cumplen roles importantes como mensajeros secundarios en diferentes células y por lo

tanto todavía falta mucho para comprender el metabolismo de los esfingolípidos en

Leishmania spp.

2.2.4. Trypanosoma brucei

Trypanosoma brucei es un parásito protozoario perteneciente al Phylum

Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae. Trypanosoma brucei es el agente etiológico

de la enfermedad del sueño africana que afecta a una gran variedad de animales y

también al hombre. Esta enfermedad causa un debilitamiento físico severo y anemia,

pudiendo causar la muerte si no es tratada correctamente y en forma rápida (Tomlinson

and Raper, 1998).

El ciclo de vida de este parásito incluye diferentes estadios dentro del

hospedador vertebrado como en el tracto digestivo del vector pero, a diferencia de lo

que ocurre en los otros parásitos de la familia Kinetoplastidae, todos los estadios de T.

brucei son extracelulares (www.cdc.gov).

Dentro de los Trypanosomátidos, tanto Trypanosoma cruzi como Leishmania

spp. sintetizan inositolfosfoceramida como principal esfingolípido complejo (Kaneshiro

et al, 1986) y se ha asumido en forma general que esto ocurre en todos los parásitos de

esta familia (Denny and Smith, 2004; Denny et al, 2006; Heung et al, 2006; Sonda and

Hehl, 2006). Sin embargo, los estadios procíclicos de T. brucei contienen

inositolfosfoceramida (Guther et al, 2006; Fridberg et al, 2008), pero también

cantidades significativas de esfingomielina tanto en las formas procíclicas como en las

formas sanguíneas del parásito (Patnaik et al, 1993). Estudios posteriores demostraron

que la inositolfosfoceramida es sintetizada por Trypanosoma brucei únicamente en el

estadio procíclico mientras que la esfingomielina es sintetizada en ambos estadios del

ciclo de vida del parásito. Además, se demostró la presencia de ceramida-1-

fosfoetanolamina en las formas sanguíneas de este parásito (Sutterwala et al, 2008).

Introducción

46

El estudio de las bases esfingosínicas presentes en los esfingolípidos de T. brucei

mostró que se encuentran presentes la esfingosina y la esfinganina. Las cantidades

relativas de los esfingolípidos conteniendo estas bases varían en función del estadio del

parásito. La ceramida y los esfingolípidos complejos derivados de la misma son

predominantes en las formas sanguíneas de T. brucei, mientras que la dihidroceramida

es más abundante en las formas procíclicas, lo que estaría indicando la existencia de una

regulación o expresión diferencial estadio-dependiente de la enzima dihidroceramida

desaturasa que es la responsable de convertir la dihidroceramida en ceramida mediante

la incorporación del doble enlace trans 4-5 (Sutterwala et al, 2008).

Por otra parte, el estudio de los glicoesfingolípidos en T. brucei llevó a la

determinación de la presencia de glucosilceramida y lactosilceramida como principales

componentes de la fracción de glicoesfingolípidos neutros. El análisis estructural de la

porción hidrofóbica de los mismos reveló la presencia ácidos grasos hidroxilados y no

hidroxilados. Estos glicoconjugados se encuentran principalmente en la membrana del

parásito (Uemura et al, 2006).

Se sabe que los glicoesfingolípidos en las superficies celulares actúan como

determinantes antigénicos y como mediadores de la respuesta inmune (Thompson and

Tillack, 1985; Hakomori, 1991). Se ha demostrado que durante infecciones parasitarias

se producen anticuerpos específicos contra los glicolípidos del parásito (Sjoberg at al,

1991; Orinda et al, 1993) y en el caso de los esfingolípidos los anticuerpos específicos

reconocen únicamente las especies que contienen ácidos grasos hidroxilados en su

estructura (Nakamura et al, 1989). De esta manera, los glicoesfingolípidos de T. brucei

son de gran interés ya que podrían actuar como potenciales antígenos de reconocimiento

del parásito y en consecuencia es necesaria una mejor caracterización de estos

compuestos y su metabolismo.

Finalmente, los estudios de inhibición de los primeros pasos en la biosíntesis de

los esfingolípidos indicaron que los mismos son esenciales para la viabilidad de T.

brucei, a diferencia de lo que ocurre con Leishmania spp. Sin embargo, todavía queda

pendiente determinar cuales son las especies de esfingolípidos que cumplen un rol

fundamental para el correcto desarrollo del parásito (Sutterwala et al, 2007).

Introducción

47

2.2.5. Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario perteneciente al Orden

Kinetoplástida, familia Trypanosomatidae. Trypanosoma cruzi es el agente causante de

la enfermedad de Chagas que afecta a millones de personas en América central y en

América del sur. En la Argentina es una enfermedad endémica y se extiende en una

amplia zona de nuestro territorio.

El ciclo de vida de T. cruzi se completa en dos hospedadores, el hombre y el

insecto vector. Dentro del tracto digestivo del insecto, el parásito se diferencia desde las

formas epimastigote replicativas y no infectivas a las formas trypomastigote

metacíclicos que son las responsables de la infección de las células del hospedador

vertebrado. Cuando el hombre es infectado, el parásito invade las células de diferentes

tejidos donde se diferencia a amastigotes y se multiplica. Finalmente, se produce una

diferenciación y se liberan a la sangre nuevos trypomastigotes que pueden infectar otras

células o ser ingeridos por el insecto vector para completar su ciclo de vida en el

hospedador invertebrado (Hutchinson and Fujii, 1995).

Al igual de lo que ocurre en Leishmania spp, los principales esfingolípidos de T.

cruzi son la inositolfosfoceramida y sus derivados glicosilados. La enzima responsable

de la síntesis de inositolfosfoceramida ha sido caracterizada bioquímicamente en T.

cruzi (Figueiredo et al, 2005) y se ha encontrado una secuencia génica que codifica para

una inositolfosfoceramida sintasa putativa por homología con la enzima de hongos

(Denny et al, 2006). En estos parásitos la inositolfosfoceramida es uno de lo principales

componentes de las anclas de membranas de diferentes proteínas. Se ha comprobado

que la acción de fosfolipasas liberan ceramida-1-fosfato a partir de la

inositolfosfoceramida de la membrana de las formas metacíclicas de T. cruzi. La

ceramida-1-fosfato puede ser hidrolizada para dar ceramida y/o esfingosina y ser

reciclada en el metabolismo de los esfingolípidos (de Lederkremer et al, 1996).

Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en Leishmania spp., en T. cruzi se ha

descripto la presencia de esfingomielina en las formas epimastigotes (Quinones et al,

2004).

Por otra parte, los glicoesfingolípidos neutros de T. cruzi han sido más

ampliamente estudiados. Los principales glicoesfingolípidos presentes son las

hexosilceramidas conteniendo tanto glucosa como galactosa y la lactosilceramida. El

análisis estructural de estos compuestos aislados de diferentes cepas de T. cruzi mostró

Introducción

48

que los glicoesfingolípidos presentan diferentes ácidos grasos saturados,

monoinsaturados y -hidroxiácidos (Barreto-Bergter et al, 1992 y 1985.).

Existen anticuerpos monoclonales que reconocen las monohexosilceramidas que

reaccionan específicamente con galactosilceramidas que contienen ácidos grasos

hidroxilados pero no con aquellas que estan compuestas por ácidos grasos no

hidroxilados. Estas observaciones indicarían que el epitope inmunólogico requiere tanto

la estructura glicosídica como la presencia de los ácidos hidroxilados en la porción no

hidrofílica de estos glicoesfingolípidos (Nakakuma et al, 1989). Además esto sugiere

que los glicoesfingolípidos que contienen los ácidos grasos hidroxilados podrían tener

mayor inmunogenicidad in vivo que aquellos que contienen ácidos grasos no

hidroxilados (Villas-Boas, 2005).

Por otra parte, se sabe que los pacientes que padecen la infección crónica de T.

cruzi pueden desarrollar una cardiomiopatía inflamatoria. Un mecanismo posible del

desarrollo de la misma es la inducción de una respuesta autoinmune específica del

corazón (Tibetts et al, 1994). Una posible explicación de esta autoinmunidad generada

por esta enfermedad es la reactividad cruzada de los anticuerpos generados frente a

ciertos antígenos del parásito. Esta hipótesis sugiere que T. cruzi y la célula

hospedadora comparten antígenos comunes y que los anticuerpos producidos en

respuesta a la infección reconocen también los antígenos propios. Estudios realizados

mostraron que existen glicoesfingolipidos comunes en T. cruzi y en las células de

corazón de ratón. Ambos presentan la misma porción glicosídica y varían solamente en

la estructura de los ácidos grasos presentes en la ceramida. Los ácidos grasos

predominantes en las monohexosilceramidas de las células de corazón y de T. cruzi son

C18:0 hidroxilado y C24:0 hidroxilado, respectivamente. Estos descubrimientos

sugieren que los glicoesfingolípidos de las células de corazón podrían constituir una

clase de antígenos con reactividad cruzada (Vermelho et al, 1997). Debido a que el

corazón es el órgano más afectado en la enfermedad de Chagas, estos

glicoesfingolípidos comunes podrían ser los responsables, solos o en conjunto con otras

moléculas, de la autoinmunidad descripta en la patogenicidad de esta enfermedad.

También ha sido descripta la presencia de sulfogalactocerebrósidos en las

formas epimastigote de T. cruzi (de Lederkremer et al, 1985, Petry et al, 1988). Estos

compuestos son abundantes en los nervios periférios del hospedador (Roberts, 1991). Se

han encontrado anticuerpos contra estos glicoesfingolípidos sulfatados en pacientes con

la enfermedad crónica los cuales también podrían estar involucrados en las reacciones

Introducción

49

de autoinmunidad generadas por la infección de T. cruzi (Avila et al, 1993; Feldman et

al, 1999).

Por otro lado, en las formas trypomastigote de Trypanosoma cruzi se han

realizado diferentes incorporaciones con precursores marcados radioactivamente que

llevaron a la descripción de la presencia de fosfolípidos (Uhrig et al, 1997; Agusti et al,

2000), inositolfosfolípidos (Uhrig et al, 1996), sulfoglicolípidos (Couto et al, 1991;

Uhrig et al, 1992) y sialoglicolípidos (Couto et al, 1985).

Sin embargo, todavía no hay estudios realizados sobre las enzimas involucradas

en los diferentes pasos de la biosíntesis de novo de esfingolípidos en Trypanosoma

cruzi.

Introducción

50

3. Herramientas para el estudio de los esfingolípidos.

3.1. Análogos de esfingolípidos.

En los últimos años, el interés en el metabolismo de diferentes clases de lípidos

ha aumentado considerablemente y junto con ello se han desarrollado diferentes

técnicas y herramientas para su estudio.

En el caso de los esfingolípidos, una de las herramientas más ampliamente

utilizadas son los llamados análogos moleculares. Estos análogos son compuestos que

presentan pequeñas diferencias frente a los compuestos naturales de interés pero donde

las propiedades físico-químicas más importantes permanecen virtualmente idénticas

aunque pueden presentar un comportamiento levemente diferente en ciertos aspectos.

Las modificaciones que presentan los compuestos análogos introducen, dentro de la

estructura molecular, algún grupo que sea fácilmente detectable por alguna técnica

conocida (Ghidoni et al, 1999).

Existen diferentes clases de análogos que pueden diferenciarse en dos grandes

grupos, los análogos estructurales y los análogos funcionales. Los primeros mantienen

una estrecha relación estructural con los compuestos naturales y presentan propiedades

físico-químicas similares, mientras que los segundos, son moléculas poco relacionadas a

nivel estructural pero que presentan el mismo comportamiento dentro de los sistemas en

estudio.

El uso de los análogos de esfingolípidos ha aumentado considerablemente en la

última década ya que los mismos presentan un amplio espectro de posibles usos tanto en

bioquímica como en biología celular. Estos análogos son utilizados principalmente en el

estudio de las propiedades biológicas, el metabolismo, el tráfico intracelular y las

posibles funciones biológicas de los esfingolípidos naturales. Para el esclarecimiento del

posible mecanismo durante el tráfico intracelular de los esfingolípidos se han utilizado

en algunos casos análogos no metabolizables para evitar de esta manera el catabolismo

de los mismos y tener así la seguridad de estar observando la localización de los

esfingolípidos de interés y no la de los posibles metabolitos derivados del mismo.

También son ampliamente utilizados los análogos de esfingolípidos que contienen

ciertas modificaciones químicas específicas (en los dobles enlaces, en la estereoquímica

y/o en el grado de hidroxilación) que constituyen una herramienta útil para comprender

las especificidades moleculares de las enzimas relacionadas con el metabolismo de los

Introducción

51

mismos o los requerimientos estructurales necesarios para cumplir una función

específica.

Entre los análogos de esfingolípidos más conocidos hasta el momento, se

encuentran los análogos de cadena corta y los análogos fluorescentes que son los más

utilizados. En todos ellos hay que tener en cuenta que las modificaciones estructurales

respecto de los compuestos naturales, pueden generar diferencias en los

comportamientos biológicos de los mismos (Fig. 8).

3.2. Análogos fluorescentes

Treinta años atrás, Simoni y colaboradores demostraban que el ácido parinárico,

una familia de ácidos grasos fluorescentes naturales de 18 átomos de carbono con 4

dobles enlaces cis y/o trans conjugados (Fig. 9), podía ser utilizado para el estudio de

las propiedades físicas de de los ácidos grasos y fosfolípidos tanto in vitro como in vivo

(Sklar et al, 1975, Rintoul and Simoni, 1977). Desde entonces se han utilizado

OR

OH

NH

OCambios en las cadenas

Modificaciones de la configuración

Acortamiento de cadenas laterales

Empaquetamiento lateral Metabolismo Transporte intracelular

Transporte intracelular Capacidad para atravesar la membrana

Reconocimiento enzimático Eventos de señalización

Figura 8. Posibles modificaciones de esfingolípidos para el diseño de diferentes clases de análogos. En cada caso se indican los posibles cambios en el comportamiento de los esfingolípidos debido a las modificaciones estructurales del compuesto original. (Modificado de Ghidoni et al, 1999)

Introducción

52

diferentes compuestos fluorescentes lipofílicos con longitudes de onda de excitación y

emisión dentro del espectro visible a diferencia de lo que ocurre con los ácidos

parináricos, simplificando las técnicas de detección necesarias. El principal uso de todos

estos análogos desarrollados es el estudio de las propiedades físicas de las membranas

celulares y la elucidación de los mecanismos de transporte de los lípidos celulares.

Un gran avance en el campo de los análogos fluorescentes fue la introducción de

los NBD-esfingolípidos por el grupo de Pagano y colaboradores a partir del año 1981.

El grupo fluorescente NBD (nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) (Fig. 9) es pequeño y

relativamente polar lo que hace que los NBD-esfingolípidos sean más solubles en

medios acuosos que los respectivos compuestos naturales haciendo más fácil su

utilización en incorporaciones metabólicas en diferentes tipos celulares. El hecho

fundamental que promovió la utilización de esta familia de análogos fue que la NBD-

ceramida actúa como un marcador específico del aparato de Golgi en células vivas

(Pagano et al, 1981; Lipsky and Pagano, 1985). Luego de la publicación de estos

resultados, estos análogos han sido ampliamente utilizados por diferentes grupos de

trabajo generando una importante fuente de datos topológicos (Pagano and Sleight,

1985). Incluso el uso de los NBD-esfingolípidos generó las bases para la hipótesis de

los “lipid rafts” (van Meer et al, 1987). Por otra parte, estos lípidos fluorescentes se

asemejan estructuralmente lo suficiente a los esfingolípidos naturales de mamíferos, y

se ha establecido que los mismos son reconocidos por las enzimas involucradas en las

vías metabólicas celulares de esfingolípidos.

A pesar de la existencia de numerosos trabajos publicados, en el año 1995, la

función de la NBD-ceramida como marcador específico del aparato de Golgi fue

cuestionada (Putz and Schwarzmann, 1995). Fue demostrado que la marcación de la

membrana del Golgi luego de la incorporación metabólica de NBD-ceramida se debe

principalmente a la formación de dos metabolitos fluorescentes de la misma, la NBD-

esfingomielina y la NBD-glucosilceramida. Si no se produce la síntesis de estos dos

compuestos, es fundamentalmente la membrana citoplasmática la que adquiere la marca

fluorescente.

Otros estudios están focalizados en el metabolismo, transporte y distribución

intracelular de los lípidos en una amplia variedad de cultivos celulares utilizando

diferentes NBD-esfingolípidos. Todos estos estudios se basan en el hecho de que estos

análogos son transferidos espontáneamente desde fuentes externas hacia las membranas

biológicas (Pagano and Sleight, 1985), y que los mismos presentan un comportamiento,

Introducción

53

dentro de la célula, que es igual al comportamiento de los compuestos naturales

(Rosenwald et al, 1992). A pesar de que esto es verdad en la mayoría de las situaciones,

hay que tener presente que la porción hidrofóbica de los análogos está modificada

estructuralmente lo que genera la existencia de algunas diferencias entre los

esfingolípidos naturales y los NBD-esfingolípidos. La principal y más crítica de estas

OH

O

Ácido parinárico (Ácido (9E, 11E, 13E, 15E)-octadeca-9,11,13,15-tetraenoico) ex= 325 nm; em= 420 nm.

N

O

N

NO2

NH2

NBD (nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) ex= 470 nm; em= 530 nm.

N+

B-N

F F

BODIPY (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diazo-s-indaceno) ex= 503 nm; em= 512 nm.

Pireno ex= 340 nm; em= 376 nm.

Figura 9. Estructuras químicas de los grupos fluorescentes más utilizados.

Introducción

54

diferencias es el hecho de que los esfingolípidos naturales no se transfieren

espontáneamente entre membranas intracelulares.

Los espectros de absorción y emisión de fluorescencia, los rendimientos

cuánticos y los coeficientes de extinción de los diferentes conjugados con el grupo NBD

dependen fuertemente del solvente utilizado y, de hecho, muchos de los conjugados no

son fluorescentes en medios acuosos. Los máximos de excitación y emisión son 470 y

530 nm respectivamente. Una de las principales desventajas de este cromóforo es que a

altas concentraciones se produce la auto-extinción y por lo tanto se pierde eficiencia en

la emisión de fluorescencia (Nichols and Pagano, 1981; Barak and Webb, 1982). Los

esfingolípidos marcados con el grupo NBD tienden a interaccionar en la interfase lípido

– agua de las membranas. Estudios biofísicos mostraron que, en membranas artificiales,

las cadenas laterales que contienen al grupo NBD en los esfingolípidos fluorescentes no

quedan completamente incorporadas en la bicapa lipídica sino que este grupo queda

hacia fuera en la interfase con el agua debido a sus características relativamente polares

(Fig. 10) (Chattopadhyay and London, 1988; Chattopadhyay, 1990; Wolf et al, 1992).

Posteriormente y debido a que los NBD-esfingolípidos no se asemejan

completamente a los esfingolípidos naturales, se introdujo un nuevo grupo fluorescente

para generar una nueva familia de esfingolípidos marcados, el 4,4-difluoro-4-bora-

3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY) (Fig. 9), el cual es un muy buen cromóforo,

relativamente no polar que permite una mejor incorporación dentro de la bicapa lipídica

Figura 10. Estructura tridimensional de A, esfingolípidos naturales; B, NBD-esfingolípidos; C, esfingolípidos conteniendo el grupo pireno, y D, esfingolípidos conteniendo el ácido graso pentainsaturado derivado del ácido parinárico (Modificado de van Meer and Liskamp, 2005)

A B C D

Introducción

55

de las membranas (Chen et al, 1997). Este compuesto tiene un coeficiente de extinción

mayor que el NBD ( > 80000 cm-1 M-1), un rendimiento cuántico de fluorescencia más

elevado, un ancho de banda de emisión más estrecho y un tiempo de vida del estado

excitado relativamente largo (típicamente 4 ns o mayor) (Johnson et al, 1991). Los

máximos de excitación y emisión para el grupo BODIPY son 503 y 512 nm

respectivamente. Adicionalmente, cuando estos análogos se encuentran en altas

concentraciones en las membranas, el grupo fluorescente muestra un corrimiento del

máximo de emisión hacia el rojo debido a la formación de exímeros (dímeros en el

estado excitado). El hecho de que la fluorescencia es dependiente de la concentración

(Pagano et al, 1991) fue utilizado para obtener información de la concentración de los

glicolípidos en los microdominios involucrados en los mecanismos de endocitosis

(Sharma et al, 2003). Sin embargo, las propiedades físico – químicas de los BODIPY-

esfingolípidos son también diferentes a aquellas de los esfingolípidos naturales (Wang

and Silvius, 2000) y por lo tanto permanece la incertidumbre sobre si su localización

intracelular es la misma que la de los compuestos naturales.

Otros análogos fluorescentes que se han utilizado a lo largo de los últimos años

son los que contienen la estructura del pireno (Fig. 9). El pireno tiene un rendimiento

cuántico y un tiempo de vida medio del estado excitado elevados (0,65 y 410 ns

respectivamente a 293 K en etanol como solvente) y posee la ventaja de ser un grupo no

polar. Los máximos de excitación y emisión son de 340 y 376 nm respectivamente. A

bajas concentraciones, el pireno emite fluorescencia en la longitud de onda cercana al

violeta como monómero pero a altas concentraciones, que son fácilmente alcanzadas en

las membranas se forman exímeros que emiten luz en el rango de longitudes de onda

correspondientes al verde. Los derivados del pireno son, en algunos casos sensibles a la

luz y por lo tanto deben ser muy bien protegidos de la luz solar. Los ácidos grasos

conjugados con el pireno resultan estables y mantienen propiedades similares a las de

los compuestos naturales (Somerharju, 2002). La principal desventaja que presentan los

esfingolípidos marcados con el pireno para el estudio del metabolismo es la

internalización de los mismos en la célula ya que no pueden atravesar la membrana

libremente (Agmon et al, 1991).

Finalmente, en los últimos años los ácidos parináricos han vuelto ha ganar

importancia debido al descubrimiento de que la incorporación de un quinto doble enlace

conjugado desplaza los máximos de excitación y emisión hacia la región de la luz

visible del espectro. Estos ácidos grasos fluorescentes fueron los primeros en ser

Introducción

56

incorporados eficientemente en los esfingolípidos celulares demostrando su semejanza

con los compuestos naturales y generando una nueva herramienta para el estudio de la

localización y comportamiento intracelular de los esfingolípidos naturales (Knerschner

et al, 2005).

Resultados y Discusión

Resultados y Discusión

57

1. Biosíntesis de esfingolípidos en Plasmodium falciparum.

Objetivos:

Elucidación y caracterización de la ruta biosintética de esfingolípidos neutros y

ácidos en Plasmodium falciparum.

Estudio de los efectos de inhibidores en la biosíntesis de esfingolípidos en los

diferentes estadios intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum.

Determinación estructural de glicoesfingolípidos de Plasmodium falciparum.

Resultados y Discusión

58

1. Biosíntesis de esfingolípidos en Plasmodium falciparum.

1.1. Glicoesfingolípidos neutros.

En las células de mamíferos, la biosíntesis de los glicoesfingolípidos complejos

involucra la acción secuencial de glicosiltransferasas, comenzando con la formación de

la glucosilceramida a partir de la ceramida. En consecuencia esta primera reacción de

glicosilación de la ceramida, catalizada por la glucosilceramida sintasa, tiene un papel

de gran importancia dentro del metabolismo de los glicoesfingolípidos.

La síntesis de esta clase de glicolípidos parece ser una característica de todas las

células eucariotas. Sin embargo, el conocimiento acerca de la biosíntesis, estructura y

posibles funciones de los esfingolípidos y de los glicoesfingolípidos en los parásitos

protozoarios es muy limitado.

Los primeros estudios llevados a cabo en Plasmodium falciparum utilizando

como precursores metabólicos serina y ácidos grasos radioactivos no mostraron la

presencia de esfingolípidos complejos (Vial et al, 1990). Sin embargo, la posterior

utilización de diferentes ceramidas radioactivas o análogos fluorescentes de las mismas,

permitieron la determinación de la presencia de esfingomielina marcada en el parásito

(Haldar et al, 1991; Ansorge et al, 1995). Estos trabajos fueron los primeros en

demostrar la existencia de una enzima esfingomielina sintasa específica del parásito

presente en las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum (Lauer et al, 1995).

El estudio más detallado de esta enzima mostró la existencia de dos enzimas

responsables de la actividad enzimática de esfingomilina sintasa que presentan una

localización subcelular diferente y una sensibilidad diferenciada a inhibidores: una

enzima sensible que es inhibida en presencia de pequeñas concentraciones del inhibidor

(5mM) y otra menos sensible, cuya actividad es inhibida utilizando concentraciones del

inhibidor del orden de 25 mM. Mientras que esta última enzima es similar a la que se

encuentra en las células de mamíferos, la primera es característica del parásito.

La ceramida que es utilizada como sustrato por la esfingomielina sintasa es

también, en las células de mamíferos, el precursor inmediato de la biosíntesis de la

glucosilceramida. Sin embargo, en Plasmodium falciparum, durante años no fue posible

determinar la presencia de glucosilceramida ni de glicoesfingolípidos más complejos.

Este hecho llevó a la conclusión de que la enzima no estaba presente en las formas

Resultados y Discusión

59

Figura 11. Esquema de la biosíntesis de esfingolípidos en células de mamíferos donde se muestran los sitios de acción de diferentes inhibidores (Modificado de Gerold ans Schwarz, 2001).

intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum o que la enzima del parásito no estaba

reconociendo el sustrato (Haldar et al, 1991).

Fue recién en el año 2001 que Gerold y Schwarz mostraron que Plasmodium

falciparum era capaz de biosintetizar glicoesfingolípidos neutros de novo a partir de

diferentes precursores marcados.

Estos autores mostraron la presencia de diferentes glicoesfingolípidos marcados

luego de realizar incorporaciones metabólicas con serina y glucosamina tritiadas. El uso

de precursores específicos junto con el protocolo de extracción de los lípidos y la

estabilidad frente a la hidrólisis alcalina permitió a los autores caracterizar a los

glicolípidos marcados como glicoesfingolípidos.

La identificación fue confirmada mediante ensayos de sensibilidad a diferentes

inhibidores conocidos del metabolismo de los esfingolípidos en células de mamíferos

(Fig.11). Sin embargo, la inhibición de la biosíntesis de esfingolípidos, en el parásito,

no resultó completa. Este hecho estaría indicando que los inhibidores utilizados no

llegan eficientemente al interior del parásito que se encuentra dentro de la célula

hospedadora o que las enzimas de Plasmodium falciparum son menos sensibles a estos

inhibidores. La presencia de Fumonisina B1, que en mamíferos inhibe eficazmente la

síntesis de la dihidroceramida, en Plasmodium falciparum, inhibe la síntesis de

glicoesfingolípidos pero no la de esfingomielina. Por otro lado, el DL-threo-1-fenil-2-

palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (DL-threo-PPMP) utilizado en bajas

concentraciones es capaz de inhibir la formación de glicoesfingolípidos complejos en el

Palmitoil-CoA + Serina

3-cetoesfinganina

Esfinganina

Dihidroceramida

Ceramida

Glucosilceramida Esfingomielina

Mioricina Ciclo-serina

Fumonisinas

DL-t-PPMP (5M)

DL-t-PPMP (25M)

Resultados y Discusión

60

parásito, mientras que en las células de mamíferos se necesitan concentraciones

mayores para inhibir la biosíntesis de la glucosilceramida (Gerold and Schwarz, 2001).

Por otra parte, nuestro laboratorio determinó recientemente la presencia de una

glucosilcermida sintasa activa en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium

falciparum que presenta una especificidad de sustrato diferente a la enzima de

mamíferos. En el caso del parásito, la enzima actúa preferentemente sobre la

dihidroceramida y no sobre el compuesto insaturado que es lo que ocurre con la enzima

de mamíferos. En el mismo trabajo, se realizaron marcaciones metabólicas con ácido

[14C]-palmítico y [14C]-glucosa y el posterior análisis de los glicoesfingolípidos neutros

obtenidos mostró que la base de cadena larga mayoritaria de estos compuestos es la

esfinganina en contraste con la esfingosina que es la base que se encuentra en los

esfingolípidos de los eritrocítos. Esto evidencia una actividad específica de la enzima de

Plasmodium falciparum. El estudio del efecto del DL-threo-PPMP, descripto

previamente como un inhibidor involucrado en el metabolismo de los esfingolípidos,

mostró una inhibición de la actividad in vitro de la enzima glucosilceramida sintasa del

parásito. El efecto de este inhibidor agregado a los cultivos detiene el desarrollo de los

parásitos con una consecuente desaparición de los glicoesfingolípidos neutros (Couto et

al, 2004).

Teniendo en cuenta estos antecedentes en este trabajo se realizaron

incorporaciones metabólicas utilizando como precursores marcados análogos

fluorescentes de ceramida (NBD-Cer) y dihidroceramida (NBD-DHCer). En ambos

casos los sustratos se agregaron al medio de cultivo de los parásitos acoplados a BSA,

para aumentar su solubilidad, en una concentración final de 5 M. Los parásitos fueron

incubados bajo estas condiciones durante 24 horas y luego se purificaron los diferentes

estadíos intraeritrocíticos. Los lípidos fueron extraídos con cloroformo: metanol y

fueron purificados por una columna de intercambio aniónico DEAE-Sephadex (forma

acetato), recuperándose la fracción que no interacciona con la resina correspondiente a

los lípidos neutros y zwiteriónicos. Esta fracción fue posteriormente analizada por

cromatografía en capa delgada utilizando el sistema A como solvente de desarrollo (Fig.

12).

El análisis de los lípidos provenientes de igual número de parásitos de cada

estadío mostró que todas las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum son

capaces de utilizar ambos precursores en la biosíntesis de esfingolípidos más complejos,

siendo el estadío esquizonte el que presentó una mayor incorporación de los precursores

Resultados y Discusión

61

fluorescentes en los diferentes compuestos. En la figura 12 se observa que la

incorporación con NBD-dihidroceramida da como resultado la aparición de una banda

de movilidad equivalente a la del estándar de NBD-glucosildihidroceramida mientras

que los parásitos incubados en presencia de NBD-ceramida como precursor metabólico

biosintetizan como producto principal la NBD-esfingomielina. También es interesante

notar, teniendo en cuenta que ambos compuestos fluorescentes son internalizados por

las células de una manera equivalente (Martin et al, 1993; Kok et al, 1997; Tomás et al,

2004), que mientras la NBD-dihidroceramida incorporada por los parásitos no es

completamente metabolizada, no se observa NBD-ceramida remanente, siendo ésta

última completamente utilizada por los parásitos en la biosíntesis de diferentes

productos, especialmente esfingomielina, marcando una diferencia importante entre

ambos sustratos.

Estos resultados indicarían la existencia en Plasmodium falciparum de dos rutas

metabólicas no interconectadas entre si. Por una parte, la biosíntesis de novo de

Figura 12. Análisis por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema A de solventes de los lípidos neutros del estadio esquizonte de Plasmodium falciparum. Linea 1: Incorporación con NBD-DHCer; Linea 2: Incorporación con NBD-Cer. En ambos casos se analizaron los lípidos provenientes de 8x107 parásitos.

NBD-DHGlcCer/ NBD-GlcCer

NBD-Cer NBD-DHCer

NBD-LacCer

NBD-SM

1 2

NBD-ácido

Resultados y Discusión

62

glicoesfingolípidos conteniendo como esqueleto la dihidroceramida y, en forma

paralela, el parásito tendría la capacidad de sintetizar esfingomielina a partir de

ceramida.

Para confirmar la independencia de las estas dos vías metabólicas paralelas se

realizó una incorporación con NBD-esfingomielina. Los lípidos de los parásitos fueron

extraídos y purificados como se describió anteriormente. El análisis por cromatografía

en capa delgada de la fracción correspondiente a los esfingolípidos neutros provenientes

de esta incorporación metabólica mostró que el parásito no es capaz de sintetizar NBD-

glucosilceramida a partir de la ceramida obtenida por la hidrólisis de la esfingomielina

incorporada al cultivo del parásito (Fig. 13A). Para confirmar este hecho se realizó un

segundo análisis de los lípidos utilizando el sistema B como solvente de desarrollo

donde se confirma la ausencia de NBD-glucosilceramida (Fig. 13B).

Figura 13. Análisis de los lípidos neutros purificados de los diferentes estadios de Plasmodium falciparum incorporados metabólicamente con NBD-esfingomielina. A, Cromatografía en placa delgada utilizando el sistema A como solvente de desarrollo, Linea 1: eritrocítos no infectados; Linea 2: Anillos; Linea 3: Trofozoítos; Linea 4: Esquizontes, en todos los casos se analizaron los lípidos provenientes de 1,8x108 parásitos. B, Cromatografía en placa delgada utilizando el sistema D como solvente de desarrollo de los lípidos provenientes de 3x107 parásitos del estadio trofozoíto.

NBD-Cer

NBD-GlcCer

NBD-SM

B A

1 2 3 4

NBD-Cer

NBD-GlcCer

NBD-SM

Resultados y Discusión

63

La incorporación de la NBD-esfingomielina mostró la ausencia de NBD-

Glucosilceramida así como también la ausencia de NBD-ceramida, lo cual estaría de

acuerdo con trabajos previos en los cuales se encontró un efecto antimalárico de la

ceramida. Ha sido demostrado que el agregado de ceramida exógena o de la enzima

esfingomielinasa bacteriana, que aumenta el nivel de ceramida por hidrólisis de la

esfingomielina, producen una inhibición del crecimiento de Plasmodium falciparum de

una manera dependiente del tiempo y la dosis (Pankova-Kholmansky et al, 2003). Ha

sido sugerido que el efecto antimalárico de la ceramida es a causa de que la misma

produce una disminución en los niveles de glutatión en la célula. El glutatión es el

responsable de la degradación de la ferriprotoporfirina IX que es un compuesto tóxico

generado por el parásito durante la digestión de la hemoglobina (Pankova-Kholmansky

and Flescher, 2006). En base a estos hechos, el parásito sólo generaría ceramida por

hidrólisis de la esfingomielina por acción de la SMasa propia del parásito en cantidades

necesarias para su reutilización evitando la acumulación de la misma que tendría un

efecto negativo para la supervivencia del mismo.

La confirmación de la identidad de los productos obtenidos a partir de los

diferentes precursores utilizados fue realizada por espectrometría de masa UV-MALDI-

TOF. Las muestras de lípidos neutros se analizaron utilizando como matrices ácido -

cianohidroxicinámico y ácido 2,4-dihidroxibenzoíco. Los espectros fueron obtenidos en

modo reflectrón positivo en todos los casos (Fig. 14). Los lípidos obtenidos a partir de

los parásitos incorporados con NBD-dihidroceramida como precursor muestra una señal

a m/z 739,9 que se corresponde con una estructura de NBD-hexosildihidroceramida

(m/z calculado 740,4) mientras que en el caso del espectro obtenido de la fracción

lipídica neutra purificada luego de la incorporación con NBD-ceramida se observa una

señal a m/z 743,7 correspondiente a una estructura de NBD-esfingomielina (m/z

calculado 742,5). En este último caso no es posible observar la señal correspondiente a

la NBD-hexosilceramida (m/z calculado 738,4) (Tabla I).

Considerando la ruta metabólica de los esfingolípidos en las células de

mamíferos, la dihidroceramida es convertida en ceramida por acción de la enzima

dihidroceramida desaturasa, responsable de la formación del doble enlace en la posición

4 (Futerman and Riezman, 2005). Sin embargo, los resultados obtenidos hasta el

momento en Plasmodium falciparum indicarían que este paso de la biosíntesis de los

esfingolípidos más complejos no ocurre en el parásito. Para determinar la presencia o

Resultados y Discusión

64

m/z obs m/z calc Posible estructura

NBD-DHCer

739,9 740,4 [NBD·DHGlcCer+H]+

763,3 762,4 [NBD·DHGlcCer+Na]+

778,9 778,4 [NBD·DHGlcCer+K]+

781,8 780,4 [NBD·DHGlcCer+Na+H2O]+

926,1 925,2 [NBD·DHLacCer+Na]+

NBD-Cer 743,7 742,5 [NBD·SM+H]+

786,6 786,4 [NBD·SM+2Na]+

Tabla I. Posibles estructuras correspondientes a las señales obtenidas por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF en modo reflectrón positivo.

Figura 14. Análisis por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF en modo positivo de los lípidos neutros. A, Incorporación de NBD-DHCer; B, Incorporación de NBD-Cer

668.

5

RP G14 Lip Neutros DHCer\0_G14\1\1SRef Raw

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns.

[a.u

.]

RP E18 Lip Neutros Cer\0_E18\1\1SRef Raw

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns.

[a.u

.]

50 700 750 800 850 900

m/z

652.

9

695.

8

711.

4

739.

8

754.

5 76

3.3

778.

9 781.

8

797.

4

824.

7

840.

3

867.

6

883.

2

910.

5

926.

1

668.

4

727.

0

743.

7

771.

0

786.

6

A

B

Resultados y Discusión

65

ausencia de ceramida en las incorporaciones realizadas con NBD-dihidroceramida

como sustrato se realizó el análisis de la fracción de esfingolípidos neutros por

cromatografía en capa delgada en fase reversa (Fig. 15). El análisis de estos lípidos

mostró que la NBD-dihidroceramida no es biotransformada a NBD-ceramida. De la

misma forma, se observa que la incorporación metabólica de NBD-esfingomielina no

produce cantidades detectables de ceramida. Estos resultados confirmaron que

Plasmodium falciparum no es capaz de transformar la dihidroceramida en ceramida en

contraposición a lo que ocurre en células de mamíferos.

Finalmente, los datos obtenidos indican la existencia, en Plasmodium

falciparum, de dos vías metabólicas paralelas a diferencia de lo que ocurre en

mamíferos (Fig. 16). Por una parte, Plasmodium falciparum es capaz de biosintetizar

glicoesfingolípdos de novo a partir de serina y palmitoil-CoA. Sin embargo, la

estructura de estos glicoesfingolípidos sería diferente a la de los glicoesfingolípidos de

mamíferos ya que la base de cadena larga predominante en el parásito es la esfinganina

a diferencia de la esfingosina presente en los esfingolípidos de eucariotas superiores.

Paralelamente, el parásito sintetizaría su propia esfingomielina por medio de la

esfingomielina sintasa propia (Lauer et al, 2005; Haldar, 2001) utilizando como

precursor ceramida proveniente de la célula hospedadora. Esta ceramida, sería obtenida

a partir de la hidrólisis de la esfingomielina de la célula hospedadora por medio de la

NBD-CerNBD-DHCer

NBD-SM

1 2 3

Figura 15. Análisis de los esfingolípidos fluorescentes por cromatografía en capa delgada en fase reversa utilizando el sistema de solventes E. Linea 1, Incorporación de NBD-DHCer; Linea 2, Incorporación de NBD-Cer; Linea 3, Incorporación de NBD-SM.

Resultados y Discusión

66

esfingomielinasa propia del parásito que ya ha sido descripta (Hanada et al, 2000; Lauer

et al, 2001). Estas dos vías metabólicas son paralelas e independientes entre si debido a

la incapacidad del parásito de transformar la dihidroceramida sintetizada de novo en

ceramida. Este hecho estaría indicando la ausencia de la enzima responsable de este

paso de la biosíntesis. En efecto, es de destacar que esta enzima no se encuentra anotada

en la base de datos del genoma de Plasmodium falciparum (Plasmodb.org).

SCoA

OHC

COO-

NH3+

CH2OH+

Palmitoil-CoA L-serina

SPT

OH

O

NH23-Cetoesfinganina

3KS

OH

OH

NH2Esfinganina

DHCerS

OH

OH

NH

ODIHIDROCERAMIDA

GCS

R

O

OH

NHR

O

OHO

HOOH

OH

GLUCOSILDIHIDROCERAMIDA

Glicoesfingolípidos complejos.

SMasaPf

OH

OH

NH

O

R O

OH

NHR

O

P

O

O

O-

N+

Esfingomielina (Célula hospedadora)

CERAMIDA

R O

OH

NHR

O

P

O

O

O-

N+

Esfingomielina

Figura 16. Esquema de la biosíntesis de esfingolípidos propuesta para Plasmodium falciparum donde se muestran las dos rutas metabólicas paralelas que son independientes entre si.

Resultados y Discusión

67

1.1.1. Efecto del tamoxifeno en la biosíntesis de glicoesfingolípidos neutros.

El tamoxifeno, un derivado sintético del trifenileteno (Fig. 17), es un compuesto

no esteroide utilizado en el tratamiento del cáncer de mama debido a su capacidad de

actuar como antagonista del estrógeno al unirse competitivamente al receptor del mismo

(Coezy et al, 1982; Katzenellenbogen et al, 1983).

Sin embargo, ha sido demostrado que el tamoxifeno presenta una gran variedad

de actividades biológicas que aparentemente, no estarían relacionadas con el mecanismo

de acción como antagonista del estrógeno (Kellen, 1996). Algunas de estas actividades

son la protección contra la peroxidación de lípidos (Wiseman and Halliwell, 1994), la

inducción del factor de crecimiento (Knabbe et al, 1987), la modificación de la

actividad de proteína-kinasa C (O’Brien et al, 1985; Gundimenda et al, 1996; Lavie et

al, 1996), la activación de la señalización por lípidos como mensajeros secundarios

(Cabot et al, 1995) y la acción como antagonista de calmodulina (Rowlands et al,

1990).

A pesar de que ha sido demostrado que el tamoxifeno está involucrado en

diferentes aspectos del metabolismo de lípidos en diferentes células y tejidos, no se ha

encontrado todavía una clara evidencia de que esta droga este actuando sobre alguna

enzima en particular dentro de la ruta metabólica de lípidos. En 1996, Cabot y

colaboradores determinaron, en una línea celular de melanoma, que el tamoxifeno

inhibe la síntesis de glucosilceramida indicando que este compuesto tendría una acción

regulatoria sobre la biosíntesis de glicoesfingolípidos (Cabot et al, 1996).

O

N(CH3)2

Figura 17. Estructura química del tamoxifeno (2-[4-[(Z)-1,2-difenilbut-1-enil]fenoxi]-N,N-dimetiletanamina).

Resultados y Discusión

68

La existencia de otros mecanismos de acción del tamoxifeno independientes del

antagonismo con el estrógeno llevaron a un aumento en el interés sobre esta droga, ya

que la misma se encuentra en uso actualmente y por lo tanto están bien establecidos los

perfiles farmacológicos y farmacocinéticos de la misma.

Dentro de las enfermedades parasitarias, el tamoxifeno ha sido ensayado en el

caso de Leishmaniasis cutáneas, donde esta droga tiene un efecto anti-parasitario in

vitro (Miguel et al, 2007) e in vivo en ratones infectados (Miguel et al, 2008; Miguel et

al, 2009). En estos casos la acción del tamoxifeno es independiente de los receptores de

estrógeno pero todavía no se conoce cual sería el mecanismo efectivo de acción del

mismo.

En Plasmodium falciparum ha sido previamente estudiado el efecto que produce

el tamoxifeno sobre la internalización de diferentes metabolitos iónicos desde el exterior

de la célula hacia el parásito. Se sabe que los glóbulos rojos infectados aumentan la

permeabilidad de su membrana para una variedad de pequeños solutos polares que

incluyen aniones, cationes, aminoácidos, polioles y nucleósidos. Esto ocurre como

consecuencia de un nuevo mecanismo de transporte inducido por el parásito. Existen

evidencias que indicarían que este mecanismo es esencial para la adquisición de

nutrientes y el desecho de desperdicios producidos por el parásito por lo que la

inhibición de dicho transporte tendría importantes consecuencias en la supervivencia del

parásito (Kirk, 2001). Este transporte de nutrientes tiene características similares a las

de los canales iónicos clásicos (Kirk et al, 1994). Estos hechos llevaron a estudiar los

efectos de inhibidores de los canales iónicos sobre el transporte de nutrientes y la

inhibición del crecimiento del parásito entre los que se encuentran la mefloquina y el

tamoxifeno. Los resultados de estos estudios mostraron que estas drogas no tienen

implicaciones en el proceso de transporte de solutos como la colina y el lactato. Sin

embargo, la mefloquina presenta un efecto inhibitorio del crecimiento de Plasmodium

falciparum en cultivos mientras que el tamoxifeno no lo presenta en las concentraciones

ensayadas (Staines et al, 2004).

Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, se decidió probar el efecto

del tamoxifeno en el metabolismo de los glicoesfingolípidos de Plasmodium

falciparum. Para ello, se realizaron incorporaciones metabólicas con NBD-DHCer y

NBD-Cer como precursores de esfingolípidos más complejos, en presencia y ausencia

de tamoxifeno en el cultivo celular. Los lípidos fueron luego purificados a partir de cada

estadío intraeritrocítico como se describió anteriormente.

Resultados y Discusión

69

1 2 3 4

NBD-DHCer NBD-Cer

NBD-GlcCer

NBD-LacCer

NBD-SM

Figura 18. Análisis de los lípidos neutros de Plasmodium falciparum, formas esquizontes en presencia y ausencia de tamoxifeno. La cromatografía en capa delgada se desarrolló utilizando el sistema A de solventes. Línea 1, Incorporación de NBD-DHCer en ausencia de tamoxifeno; Línea 2, Incorporación de NBD-DHCer en presencia de tamoxifeno; Línea 3, Incorporación de NBD-Cer en ausencia de tamoxifeno; Línea 4, Incorporación de NBD-Cer en presencia de tamoxifeno. En todos los casos se analizaron los lípidos provenientes de 8x107 parásitos.

El análisis de los lípidos neutros fluorescentes provenientes del mismo número

de parásitos tratados y no tratados (Fig. 18) mostró que los esfingolípidos

biosintetizados aumentan en el caso de los parásitos tratados con tamoxifeno cuando se

utiliza como precursor la NBD-dihidroceramida, mientras que en el caso de incorporar

NBD-ceramida como sustrato, los lípidos fluorescentes resultantes se ven disminuidos

en una cantidad significativa. El perfil de esfingolípidos fluorescentes sintetizados a

partir de los dos precursores mostrado anteriormente se mantiene inalterado en

presencia de la droga, es decir, los principales esfingolípidos obtenidos a partir de la

NBD-dihidroceramida son los glicoesfingolípidos mientras que al utilizar la NBD-

ceramida como sustrato, no se observa NBD-glucosilceramida pero si una importante

cantidad de NBD-esfingomielina.

A pesar de que la cantidad de lípidos obtenidos a partir de la NBD-ceramida en

los parásitos tratados con la droga es considerablemente menor, es interesante observar

que todo el sustrato fluorescente incorporado es completamente metabolizado dado que

no se visualiza NBD-ceramida remanente. Considerando que el tamoxifeno no afecta la

Resultados y Discusión

70

incorporación de los precursores metabólicos fluorescentes, este hecho podría estar

indicando que la NBD-ceramida no es utilizada para la biosíntesis de esfingolípidos más

complejos, sino que la misma esta siendo convertida en esfingosina, la cual podría

entrar en la ruta de degradación completa. Es importante notar que la hidrólisis de la

NBD-ceramida para dar esfingosina implica la pérdida del grupo fluorescente utilizado

y, por lo tanto, no es posible, en estos experimentos, detectar el producto de esta

transformación.

Por otra parte, también se observó que la NBD-dihidroceramida utilizada como

precursor de la biosíntesis de esfingolípidos se mantuvo en exceso a pesar de que el

metabolismo de lípidos se vió aumentado en el caso del tratamiento con tamoxifeno.

Finalmente, a partir de los experimentos realizados con este inhibidor, se

observó que el tamoxifeno tiene una acción diferencial sobre cada una de las rutas

biosintéticas. Este hecho estaría corroborando la existencia de dos vías metabólicas

independientes, una que involucra a la dihidroceramida y los glicoesfingolípidos y la

otra que esta relacionada con la hidrólisis y biosíntesis de la esfingomielina (Fig. 16).

Paralelamente se realizaron ensayos del efecto de este inhibidor sobre el

crecimiento de los parásitos observandose que el tamoxifeno inhibe el crecimiento de

los parásitos en forma dependiente de la concentración. La concentración de tamoxifeno

que produjo el 50% de la inhibición en el crecimiento (IC50) fue de 1,7 mM a las 48 hs

de tratamiento.

1.2. Glicoesfingolípidos ácidos.

La presencia de glicoesfingolípidos ácidos ha sido determinada en una gran

variedad de células y tejidos. Dentro de los esfingolípidos ácidos, se encuentran

principalmente los ganglíosidos que contienen diferentes cantidades de ácido siálico en

su estructura y los sulfoglicoesfingolípidos que presentan monoésteres de sulfato. Estos

compuestos están presentes en la superficie de diferentes tipos celulares y ha sido

determinado que son participantes activos en procesos de adhesión celular en varios

sistemas. Existen evidencias que indican que estos esfingolípidos ácidos estarían

involucrados en la regulación de la proliferación celular, diferenciación y otros eventos

del desarrollo celular. Los glicoesfingolípidos sulfatados se encuentran como

componentes de la membrana plasmática de una gran variedad de células dentro de las

Resultados y Discusión

71

que se incluyen a los oligodendrocitos, las células renales tubulares y algunas células

tumorales. Estos glicoesfingolípidos parecen estar involucrados en la conducción

nerviosa y la adhesión celular aunque sus funciones fisiológicas específicas todavía

permanecen desconocidas (Pesheva et al, 1997; Kurosawa et al, 2000; Merten and

Thiagarajan, 2001; Merten et al, 2005; Shimazawa et al, 2005).

Existe una gran variedad de especies moleculares de sulfátidos en función de los

azúcares que contienen y de la estructura de la base esfingosínica que los compone, así

como también de los ácidos grasos que los conforman. La existencia de estas diferentes

especies parece estar relacionada con las funciones que los sulfátidos cumplen en

relación con la adhesón celular y su presencia en los microdominios de membrana

(Kobayashi et al, 1994).

Mientras que la biosíntesis y funciones de estos compuestos ha sido

ampliamente estudiada en células de mamíferos, los conocimientos acerca de los

mismos en parásitos protozoarios como Plasmodium falciparum son todavía muy

limitados.

Los antecedentes existentes en Plasmodium falciparum, indican que este

parásito no es capaz de biosintetizar ácido siálico (Schauer et al, 1984), lo cual

implicaría que este parásito no es capaz de biosintetizar gangliosidos propios.

En este trabajo se estudió la capacidad de sintetizar glicoesfingolípidos ácidos de

las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum, para lo cual los parásitos fueron

incorporados metabolicamente con ácido [14C]-palmítico, luego se extrajeron los lípidos

con cloroformo: metanol y los extractos obtenidos fueron fraccionados por

cromatografía de intercambio aniónico. La fracción correspondiente a los lípidos ácidos

fue eluída utilizando como solvente cloroformo: metanol: acetato de sodio 0,8M y

posteriormente hidrolizados en medio alcalino para eliminar los glicerolípidos

presentes. Las muestras provenientes de los tres estadios intraeritrocíticos se analizaron

por cromatografía en capa delgada mostrando en todos los casos la presencia de

compuestos marcados, además de las bandas de mayor Rf correspondientes a los ácidos

grasos marcados liberados durante la saponificación (Fig. 19). Cuando se analizaron los

lípidos provenientes de igual número de parásitos de cada uno de los estadios se

observó que se incorporó una mayor cantidad del precursor radioactivo en el estadio

esquizonte, en forma similar a lo que ocurre en los glicoesfingolípidos neutros (Couto et

al, 2004).

Resultados y Discusión

72

Paralelamente, se analizaron los glicoesfingolípidos ácidos provenientes de los

parásitos incorporados con [14C]-glucosa como precursor metabólico (Fig. 20A). En

este caso también se observaron compuestos marcados en los tres estadios

intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum, sin embargo, la mayor incorporación de la

glucosa marcada fue observada en el estadio trofozoíto.

En ambas incorporaciones se determinó la presencia de dos compuestos

mayoritarios, SPf1 y SPf2, con una movilidad menor que el estándar de

sulfogalactosilceramida (GalCer-SO4) que resultaron de interés.

En otro experimento paralelo, se realizó la incorporación metabólica de un

análogo fluorescente de la ceramida como precursor (NBD-Cer). Los lípidos fueron

tratados de forma similar a la descripta anteriormente y la fracción correspondiente a los

lípidos ácidos fue analizada por cromatografía en capa delgada (Fig. 20B). Además de

los ácidos fluorescentes libres provenientes de hidrólisis parciales de los esfingolípidos,

fue posible determinar también la presencia de los compuestos SPf1 y SPf2, indicando

Figura 19. Análisis por cromatografía en capa delgada utilizando el sistema B de solventesde los lípidos ácidos de los diferentes estadios intraeritrocíticos obtenidos luego de la incorporación metabólica de ácido [14C]-palmítico. Linea 1, glóbulos rojos no infectados; Linea 2, Anillos; Linea 3, Trofozoítos; Linea 4, Esquizontes.

1 2 3 4

GalCer-SO4

SPf1

SPf2

Resultados y Discusión

73

que los mismos serían derivados de la ceramidas y confirmando, entonces, que

Plasmodium falciparum es capaz de sintetizar esfingolípidos ácidos.

Teniendo en cuenta los trabajos previos realizados en Plasmodium falciparum

que indican que el parásito no es capaz de sintetizar ácido siálico (Schauer et al, 1984) y

considerando que los inositolfosfolípidos fueron eliminados durante la saponificación a

la cual se sometieron las muestras, los compuestos obtenidos en las marcaciones

metabólicas realizadas podrían estar indicando la presencia de sulfoglicolípidos en

Plasmodium falciparum. Para determinar si estos compuestos presentan una naturaleza

de sulfoglicolípidos, se decidió realizar una incorporación metabólica con Na235SO4.

Los lípidos provenientes de los tres estadios intraeritrocíticos fueron extraídos y

purificados como se describió anteriormente. El análisis de los esfingolípidos ácidos

mostró compuestos marcados en todos los estadios (Fig. 21). En este caso, al igual que

en el caso de la incorporación de [14C]-glucosa, el Na235SO4 se incorporó en mayor

proporción en el estadio trofozoíto.

A

Figura 20. Análisis por cromatografía en capa delgada de los lípidos ácidos purificados a partir de las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum. A, Lípidos provenientes de la incorporación de [14C]-glucosa. La placa fue desarrollada en el sistema de solventes B. Línea 1, glóbulos rojos no infectados; Línea 2, Anillos; Línea 3, Trofozoítos; Línea 4, Esquizontes. B, Lípidos provenientes de la incorporación de NBD-Ceramida, formas trofozoítos. La placa fue desarrollada utilizando el sistema de solventes C.

1 2 3 4

SPf1

SPf2

GalCer-SO4

B

NBD-ácido

SPf1

SPf2

Resultados y Discusión

74

Cuando los lípidos fueron analizados por cromatografía en capa delgada (Fig.

21) se detectaron los dos mismos compuestos mayoritarios que en las dos

incorporaciones anteriores, SPf1 y SPf2. El hecho de que estos dos compuestos estén

presentes también en los lípidos obtenidos luego de la incorporación con sulfato

marcado hace suponer que los mismos serían sulfoglicolípidos.

En todos los casos, se realizaron incorporaciones de los mismos precursores

metabólicos marcados en eritrocitos no infectados y se analizaron los lípidos

provenientes de los mismos tratados de igual forma, observándose en todos los casos la

ausencia de compuestos marcados en cantidades significativas. Estos resultados

implican la existencia en Plasmodium falciparum de la maquinaria necesaria para la

biosíntesis de sulfoglicolípidos.

Para confirmar la naturaleza sulfolipídica del compuesto denominado SPf1, se

procedió a la desulfatación química del mismo. Para ello, se recuperó de la placa de

silicagel parte de este compuesto obtenido luego de la incorporación metabólica de los

parásitos con ácido [14C] palmítico, y se trató con 9mM H2SO4 en DMSO:Metanol

durante 3 horas a 80ºC. Luego de la correspondiente neutralización se analizaron los

productos obtenidos por cromatografía en capa delgada utilizando el sistema C como

Figura 21. Incorporación de Na235SO4 en los lípidos ácidos de los

estadios intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum. A, Comparación de la radioactividad recuperada en la fracción de lípidos ácidos de cada uno de los estadios intraeritrocíticos; C, control de glóbulos rojos no infectados; A, Anillos; T, Trofozoítos; E, Esquizontes. B, Análisis de los lípidos ácidos marcados de los diferentes estadios por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema de solventes B; Línea 1, Anillos; Línea 2, Trofozoítos; Línea 3, Esquizontes.

CP

M x

106 /

célu

la

0

1

2

3

4

5

6

7

C A T E

A

SPf2

SPf1

1 2 3

B

GalCer-SO4

Resultados y Discusión

75

solvente de desarrollo (Fig. 22). El análisis de los productos luego de la solvólisis

mostró la presencia de un nuevo compuesto de mayor movilidad que el compuesto

original SPf1 como consecuencia de la hidrólisis del grupo sulfato, confirmando la

naturaleza sulfolipídica de este compuesto,.

Continuando con la elucidación estructural de los dos compuestos, SPf1 y SPf2,

se llevó a cabo una metanólisis ácida para determinar los ácidos grasos componentes de

los mismos. Una vez realizada la hidrólisis y simultánea metilación de los ácidos grasos,

los mismos fueron extraídos y analizados por cromatografía en placa delgada de fase

reversa (Fig. 23). El análisis reveló la presencia de los ácidos grasos C16:0 y C18:0 en

SPf1 y C14:0 y C18:0 en SPf2, mayoritariamente.

Figura 22. Análisis de los productos luego de la solvólisis de SPf1. La placa se desarrollo utilizando el sistema C de solventes. Línea 1, SPf1 sin tratamiento; Línea 2, SPf1 luego de la hidrólisis.

SPf1

GalCer-SO4

1 2

C 14:0

C 16:0

C 18:0

C 20:0

1 2

Figura 23. Análisis por cromatografía en capa delgada en fase reversa desarrollada en el sistema de solventes F de los ácidos grasos metilados. Linea 1, ácidos grasos provenientes de SPf1; Línea 2, ácidos grasos provenientes de SPf2.

Resultados y Discusión

76

Con intención de realizar una mejor caracterización estructural de estos dos

compuestos biosintetizados por el parásito, se decidió realizar un análisis por

espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. Para ello se realizó una extracción de los

lípidos provenientes de una muestra fría de Plasmodium falciparum de manera similar a

lo descripto previamente. Estos lípidos fueron purificados como se describió

anteriormente y la fracción correspondiente a los lípidos ácidos fue sometida a una

saponificación y analizada por cromatografía en capa delgada junto con una muestra de

lípidos proveniente de una incorporación metabólica con ácido [14C]-palmítico

procesada en forma idéntica a la anterior. Una vez revelada la placa, se extrajeron las

manchas correspondientes a SPf1 y SPf2 de la misma para ser analizadas por

espectrometria de masa UV-MALDI-TOF.

La muestra correspondiente al compuesto denominado SPf1 fue analizada en

modo lineal positivo utilizando como matriz ácido 2,4-dihidroxibenzoíco (Fig. 24). El

espectro mostró una señal a m/z 859,0 compatible con una estructura de

monohexosilceramida monosulfatada conformada por una base esfingosínica

monoinsaturada de 20 átomos de carbono (d20:1) acilada con un ácido graso saturado

de 18 átomos de carbono (C18:0) (m/z calculado 858,6; correspondiente al ión

molecular más sodio, [M+Na]+).

En contraste a estos resultados, el análisis por UV-MALDI-TOF de la muestra

correspondiente a SPf2 no mostró señales al realizar dicho análisis en el modo positivo.

Figura 24. Espectro de masa UV-MALDI-TOF en modo lineal positivo de SPf1 utilizando DHB como matriz.

[M+Na] +

masa/carga

Resultados y Discusión

77

Sin embargo, al realizar el análisis en modo negativo utilizando como matriz nor-

Harmano, tanto en modo lineal como en modo reflectrón (Fig. 25A y B), se obtuvieron

señales intensas que pudieron ser utilizadas para determinar la posible estructura del

compuesto. El espectro obtenido en modo lineal negativo muestra una señal a m/z 913.5

consistente con una monohexosilceramida disulfatada compuesta por una base

esfingosínica monoinsaturada d20:1 acilada en la posición 2 con el ácido graso C18:0

(m/z calculado, [M-H]- 914,5). El espectro realizado en modo reflectrón negativo

permitió obtener una mayor información acerca de la estructura de este compuesto al

mostrar algunas fragmentaciones inducidas por el láser dentro de la fuente

(fragmentaciones “in source”). La perdida del grupo sulfato genera una señal a m/z

817,7 (m/z calculado 817,6) correspondiente al ión [M-H-HOSO3]-. La pérdida

consecutiva de otro grupo sulfato da una señal a m/z 720,5 (m/z calculado 720,6) que

confirma la existencia de los dos grupos sulfato en el ión molecular. También se

observa la perdida de una molécula de agua a partir del ión molecular generando la

señal a m/z 895,7 (m/z calculado 896,5). Otras señales significativas son las que se

Figura 25. Espectro de masa UV-MALDI-TOF de SPf2 utilizando nor-Harmano como matriz. A, Modo lineal negativo; B, Modo lineal reflectrón.

B A

masa/carga

masa/carga

Resultados y Discusión

78

observan a m/z 647,5 correspondiente a la pérdida a partir del ión molecular del ácido

graso C18:0 (m/z calculado 648,3) y a m/z 629,7 que se genera del anterior por pérdida

de agua (m/z calculado 630,3). Estas últimas señales indican que el compuesto de

interés se encuentra acilado con el ácido graso C18:0 mayoritariamente y esta

información se encuentra en concordancia con la obtenida a partir de los ensayos de

incorporación metabólica con ácido [14C]-palmítico, que se mostraron anteriormente.

Finalmente, el ión más abundante que se observa a m/z 645,6 también corresponde al

fragmento obtenido por la ruptura de la base esfingosínica entre los carbonos C2 y C3.

El ión generado por esta ruptura corresponde a la hexosa disulfatada más el fragmento

C1 a C2 de la base esfingosínica incluyendo el ácido graso en la posición 2 (m/z

calculado 645,3) (Esquema I).

Finalmente, los estudios estructurales realizados permitieron identificar dos

sulfoglicolípidos biosintetizados por Plasmodium falciparum. Los mismos fueron

identificados como una monohexosilceramida monosulfatada y como una

monohexosilceramida disulfatada. En ambos casos la base esfingosínica presente

resultó ser la esfingosina, de manera similar a lo que ocurre en las células de mamíferos.

O

HN

OH

O

H(SO3)O

H(SO3)O

hex

m/z 645.3

m/z 817.6

m/z 720.6

m/z 648.3

- H2O

m/z 730.3

Esquema I

[M-H ]- = 914,5

Resultados y Discusión

79

1.2.1. Efecto del DL-t-PPMP en la biosíntesis de glicoesfingolípidos ácidos.

Teniendo en consideración los resultados anteriores, se decidió profundizar en el

estudio sobre los glicolípidos ácidos de Plasmodium falciparum y su ruta metabólica.

Para ello se decidió evaluar cuales son los efectos del inhibidor DL-threo-1-fenil-2-

palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (DL-t-PPMP) (Fig. 26) en la biosíntesis de los

sulfoglicolípidos.

En Plasmodium falciparum, el DL-t-PPMP ha sido descripto como un potente

inhibidor del desarrollo intraeritrocítico. Los anillos formados en presencia de la droga

no contienen las estructuras tubulares que conforman la red de membranas tubulares, la

cual es indispensable para la continuidad del ciclo intraeritrocítico. Por el contrario, los

estadíos trofozoíto y esquizonte, que ya contienen esta red de membranas perfectamente

desarrollada, no se ven afectados por la presencia de la droga (Lauer et al, 1995 y 1997;

Gerold and Schwarz, 2001).

Por otra parte, trabajos previos de nuestro laboratorio mostraron que el

tratamiento con DL-t-PPMP inhibe eficientemente la la síntesis in vitro de

glicoesfingolípidos neutros (Couto et al, 2004).

Para determinar los efectos de este inhibidor en la síntesis de sulfoglicolípidos,

se realizaron ensayos de incorporaciones metabólicas en presencia de la droga. Se

OH

NH

N

O

(CH2)14-CH3

O

Figura 26. Estructura química del DL-threo-1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (DL-t-PPMP).

Resultados y Discusión

80

SPf1

SPf2

1 2 3 4 5 6 7

Figura 27. Análisis de la fracción correspondiente a los lípidos ácidos purificados marcados con ácido [14C]-palmítico obtenidos a partir de los parásitos cultivados en presencia y ausencia de PPMP. Líneas 1, 3 y 5, lípidos correspondientes a los parásitos no tratados colectados en los estadíos anillo, trofozoíto y esquizonte respectivamente; Líneas 2, 4 y 6, lípidos correspondientes a los parásitos tratados con PPMP en los estadíos anillo, trofozoíto y esquizonte respectivamente; Línea 7, control de glóbulos rojos no infectados. La placa de silica gel fue desarrollada en el sistema de solventes B.

realizaron marcaciones utilizando [14C]-glucosa y ácido [14C]-palmítico en cultivos

tratados con DL-t-PPMP previamente durante 24 horas. Simultáneamente se realizaron

ensayos en ausencia de la droga como controles de las incorporaciones metabólicas. Los

lípidos fueron extraídos a partir de las diferentes formas intraeritrocíticas aisladas y

posteriormente purificados como se describió anteriormente para obtener la fracción de

los lípidos ácidos.

Como era esperado, se observaron alteraciones en el crecimiento en los parásitos

tratados con DL-t-PPMP. Como había sido demostrado previamente (Couto et al, 2004),

en este caso se observó que el tratamiento de los cultivos de parásitos con este inhibidor

detiene el desarrollo del parásito. De esta manera, los parásitos colectados en el estadío

anillo que fueron aquellos que recibieron la droga en el estadío trofozoíto

Resultados y Discusión

81

(aproximadamente 40 horas antes) se vieron muy poco afectados. Sin embargo, se

obtuvo una menor cantidad de parásitos en el estadío esquizonte ya que los mismos

recibieron el inhibidor en el estadío anillo y en consecuencia no fueron capaces de

desarrollar la red de membranas tubulares necesaria para su supervivencia. A pesar de

obtener una cantidad considerablemente menor de parásitos en el estadio esquizonte, el

hecho de que el ácido [14C]-palmítico es activamente incorporado en todos los estadios,

permitió realizar el análisis de los esfingolípidos ácidos provenientes del mismo número

de parásitos de los tres estadíos intraeritrocíticos por cromatografía en capa delgada

(Fig. 27). El análisis mostró un efecto importante en la biosíntesis de los

sulfoglicolípidos principalmente en los estadíos anillo y esquizonte donde se observa

una clara disminución en la biosíntesis de los diferentes esfingolípidos ácidos.

Por otro lado, la cantidad de [14C]-glucosa incorporada en los estadíos más

tempranos del ciclo intraeritrocítico tratados con DL-t-PPMP, no fue suficiente para

poder realizar una comparación de la biosíntesis de los glicolípidos ácidos en los

diferentes estadíos. De todas maneras, se pudo observar la presencia de los compuestos

Figura 28. Análisis por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema de solventes C de la fracción correspondiente a los lípidos ácidos purificados marcados con [14C]-glucosa obtenidos a partir de los parásitos cultivados en presencia y ausencia de DL-t-PPMP. Línea 1, Lípidos provenientes de esquizontes no tratados; Línea 2, Lípidos provenientes de esquizontes tratados con PPMP.

SPf2

SPf1

1 2

Resultados y Discusión

82

SPf1 y SPf2 en la fracción de esfingolípidos ácidos proveniente de los esquizontes no

tratados, mientras que la fracción análoga proveniente de los esquizontes tratados con el

inhibidor mostró una clara disminución en los niveles de los esfingolípidos marcados

sintetizados (Fig. 28).

Para evaluar los efectos producidos por el DL-t-PPMP en los primeros pasos de

la biosíntesis de los glicoesfingolípidos ácidos, se realizó una incorporación metabólica

utilizando como precursor biosintético la NBD-dihidroceramida. El ensayo se realizó en

las mismas condiciones detalladas anteriormente y se obtuvieron los lípidos ácidos

correspondientes que se analizaron por cromatografía en capa delgada.

La incorporación del análogo de la dihidroceramida fue eficiente aunque no fue

posible obtener cantidades de parásitos viables suficientes para realizar el análisis en los

tres estadíos intraeritrocíticos debido al efecto del DL-t-PPMP. En consecuencia,

solamente se analizaron los lípidos ácidos en el estadío esquizonte, observándose una

disminución de los esfingolípidos biosintetizados por el parásito (Fig. 29).

Para profundizar el estudio de los efectos de inhibidores en la ruta metabólica de

los esfingolípidos ácidos del parasito, se realizó una incorporación metabólica de NBD-

Figura 29. Análisis de la fracción de lípidos ácidos provenientes de la incorporación de NBD-dihidroceramida en las formas esquizonte de Plasmodium falciparum. Línea 1, Parásitos control, Línea 2, Parásitos tratados con Tamoxifeno; Línea 3, Parásitos tratados con PPMP.

SPf1

SPf2

1 2 3

Resultados y Discusión

83

dihidroceramida en presencia de otro probable inhibidor, el tamoxifeno, que se había

utilizado previamente para el estudio de la biosíntesis de los esfingolípidos neutros. Los

parásitos fueron tratados con el tamoxifeno durante 24 horas y luego se agregó el

precursor marcado con el grupo fluorescente. Los lípidos se purificaron y se analizó la

fracción correspondiente a los esfingolípidos ácidos. Al igual que en el caso del DL-t-

PPMP, se determinó que el tamoxifeno produce una disminución considerable de la

biosíntesis de los esfingolípidos ácidos propios del parásito (Fig. 29).

Los resultados obtenidos permitieron determinar la estructura de dos

sulfoglícolípidos propios del parásito. Los mismos se encuentran presentes en los tres

estadíos intraeritrocíticos, y aunque son compuestos presentes en una pequeña

proporción podrían presentar un papel importante en la estabilización estructural y física

de la membrana o bien podrían estar involucrados en el fenómeno de adhesión que

presentan los glóbulos rojos infectados (Silamut et al, 1999). Finalmente, en este trabajo

se determinó que la biosíntesis de los sulfoglicolípidos tiene un comportamiento

diferencial en los tres estadíos intraeritrocíticos del parásito. Este hecho sugiere la

existencia de una regulación de los niveles de sulfátidos a lo largo del ciclo de vida del

parásito. Sin embargo, todavía se requieren más estudios para clarificar los posibles

roles biológicos de los sulfátidos en el desarrollo de Plasmodium falciparum y/o en la

patogénesis de la enfermedad.

Resultados y Discusión

84

2. Biosíntesis de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi.

Objetivos:

Caracterización de la ruta biosíntetica de esfingolípidos en las formas

epimastigote de Trypanosoma cruzi.

Estudio de los efectos de diferentes inhibidores en la biosíntesis de

esfingolípidos en Trypanosoma cruzi.

Resultados y Discusión

85

2. Biosíntesis de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi.

2.1. Biosíntesis de glicoesfingolípidos neutros. Efecto de diferentes inhibidores.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en Plasmodium falciparum, se

decidió estudiar la biosíntesis en otros parásitos protozoarios para poder determinar si

esta diferencia en las rutas metabólicas de los esfingolípidos es una característica

exclusiva de Plasmodium falciparum, o si es compartida por otros hemoparásitos. Se

decidió entonces realizar el estudio de la biosíntesis de esfingolípidos en formas

epimastigote de Trypanosoma cruzi, debido a la experiencia del laboratorio en el

estudio del mismo.

La biosíntesis de los esfingolípidos ha sido estudiada como posible blanco de

drogas antiparasitarias en algunas especies de Leishmania y Trypanosomas. El potencial

de esta ruta metabólica como blanco de drogas antiparasitarias en estas dos especies está

relacionado con la importancia que tienen estos compuestos en procesos celulares

claves como la diferenciación celular y la invasión de la célula hospedadora sumado al

hecho de que la vía biosintética de estos organismos es diferente de la que existe en

mamíferos (Salto et al, 2003; Zhang et al, 2003; Denny et al, 2004) (Fig. 30).

Sin embargo, se ha encontrado que Trypanosoma cruzi, además de biosintetizar

inositolfosfoceramida, es capaz de producir esfingomielina (Quinones et al, 2004) y

diferentes glicoesfingolípidos como galactosilceramida, glucosilceramida,

lactosilceramida y sulfogalactosilceramida. Estos últimos han sido extensamente

estudiados llevando a una identificación estructural detallada de los mismos que mostró

que dichos esfingolípidos están compuestos por una esfingosina de 18 átomos de

carbono y una amplia variedad de ácidos grasos (Barreto-Bergter et al, 1985; Petry et al,

1988; Barreto-Bergter et al, 1992). Sin embargo, todavía no se conocen las enzimas

involucradas en la biosíntesis de los mismos.

Teniendo en cuenta los antecedentes existentes sobre los glicoesfingolípidos de

T.cruzi, se infiere que en estos parásitos la biosíntesis de los esfingolípidos neutros es

similar a la de mamíferos y no a la de Plasmodium falciparum, ya que los

glicoesfingolípidos estudiados hasta el presente contienen como base de cadena larga la

esfingosina al igual de lo que ocurre en las células de mamíferos.

A partir de estos conocimientos se decidió profundizar en el estudio de la

biosíntesis de los esfingolípidos en formas epimastigote de Trypanosoma cruzi,

Resultados y Discusión

86

realizando incorporaciones metabólicas utilizando como precursor un análogo

fluorescente de ceramida (NBD-ceramida). Los parásitos fueron incubados en presencia

de este precursor por 24 horas y luego fueron cosechados por centrifugación. Los

lípidos fueron extraídos utilizando cloroformo: metanol y posteriormente purificados

por intercambio iónico en una columna de DEAE-Sephadex (forma acetato) para

obtener los esfingolípidos neutros en la primera fracción. El análisis por cromatografía

en capa delgada de los lípidos fluorescentes obtenidos a partir de este precursor mostró

la presencia de cantidades significativas de esfingolípidos fluorescentes entre los que se

encuentran glucosilceramida y esfingomielina (Fig. 31) confirmando la existencia de

una única vía metabólica a diferencia de lo que ocurre en Plasmodium falciparum.

Para obtener mayor información acerca de esta ruta metabólica en Trypanosoma

cruzi, se decidió ensayar el efecto de diferentes inhibidores del primer paso de

Figura 30. Rutas metabólicas alternativas de la biosíntesis de esfingolípidos en los diferentes organismos. PC: fosfatidilcolina; PI: fosfatidilinositol; DAG: diacilglicerol.

Mamíferos Kinetoplástidos, hongos y plantas

Serina + Palmitoil-CoA

Ceramida

Esfingomielina (SM)

Inositolfosfoceramida (IPC)

PC PI

DAG DAG

Glucosilceramida (GlcCer)

3-cetoesfinganina

Esfinganina

Dihidroceramida

Aureobasidina A

Resultados y Discusión

87

glicosilación en la biosíntesis de los glicoesfingolípidos. Los inhibidores elegidos

fueron DL-t-PPMP y tamoxifeno, ambos inhibidores de la glucosilceramida sintasa en

células de mamíferos (Radin et al, 1993). El DL-t-PPMP (Fig. 26) actúa como análogo

de la ceramida y produce la desaparición de los glicoesfingolípidos en las células de

mamíferos, al tiempo que produce un aumento importante en el nivel de ceramida que

se cree es el responsable de la citotoxicidad de este compuesto (Tifft and Proia, 2000).

Como consecuencia de la acción de este inhibidor se observa una inhibición del

crecimiento celular in vitro (Abe et al, 1995; Abe and Shayman, 1998; Lee et al, 1999).

Por otra parte, este inhibidor ha sido ensayado en Plasmodium falciparum donde se ha

visto que actúa sobre la biosíntesis de glicoesfingolípidos y también sobre la enzima

esfingomielina sintasa, produciendo una inhibición en el crecimiento del parásito (Lauer

et al, 1995 y 1997; Gerold and Schawrz, 2001; Couto et al, 2004).

El tamoxifeno, como se menciono anteriormente, ha sido propuesto en algunos

tipos de células de mamíferos como un inhibidor de la glucosilceramida en células de

mamíferos y además ha sido ensayado en Leishmania como inhibidor del crecimiento

del parárito (Miguel et al, 2007).

Para determinar los efectos de estos inhibidores en la biosíntesis de

esfingolípidos en Trypanosoma cruzi, se realizaron incorporaciones metabólicas con

NBD-ceramida en presencia de estos compuestos en una concentración de 10 M. Los

parásitos fueron cosechados y los lípidos fueron purificados como se describió

previamente y se analizaron los lípidos provenientes de igual número de parásitos por

cromatografía en capa delgada (Fig. 31). Los resultados mostraron que el perfil de

lípidos fluorescentes sintetizados a partir del precursor incorporado se mantiene igual en

ausencia o presencia de los inhibidores. Sin embargo, se observa un cambio en las

cantidades totales de los esfingolípidos sintetizados. El tratamiento con DL-t-PPMP

produce una pequeña disminución en la cantidad de esfingolípidos neutros sintetizados

por el parásito. Por el contrario, el tamoxifeno produce un aumento de la biosíntesis.

Debido a la magnitud de estas diferencias, las mismas son difíciles de determinar por

cromatografía en placa delgada por lo que se realizó el estudio de estas mismas

muestras por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). De esta manera, se

analizaron los esfingolípidos fluorescentes obtenidos a partir de igual número de

parásitos, utilizando un HPLC equipado con un detector de fluorescencia (Fig. 32). En

este caso se cuantificó la NBD-glucosilceramida biosintetizada en las diferentes

condiciones a partir de las áreas de los picos correspondientes. Los resultados

Resultados y Discusión

88

mostraron una clara inhibición de la biosíntesis de glucosilceramida en el caso del

tratamiento con DL-t-PPMP y un aumento de la síntesis de este compuesto en presencia

de tamoxifeno en el medio de cultivo (Fig. 33).

Paralelamente, durante las incorporaciones metabólicas y tratamientos con

inhibidores descriptas anteriormente, se monitoreó el crecimiento de los parásitos por

microscopía para determinar el efecto de estos compuestos en el crecimiento celular de

Trypanosoma cruzi. Luego de 48 horas de tratamiento se observó una disminución en el

crecimiento de los parásitos en presencia de los dos inhibidores aunque el efecto del DL-

t-PPMP sobre el crecimiento es significativamente mayor que el del tamoxifeno en las

Figura 31. Análisis por cromatografía en capa delgada en el sistema de solventes A de los lípidos neutros obtenidos a partir de la incorporación metabólica de NBD-ceramida en T. cruzi, formas epimastigote. Línea 1, Incorporación de NBD-Ceramida control; Línea 2, Incorporación de NBD-Ceramida en presencia de 10 M de t-PPMP; Línea 3, Incorporación de NBD-Ceramida en presencia de 10 M Tamoxifeno.

NBD-GlcCer

NBD-Cer

NBD-LacCer

NBD-SM

1 2 3

Resultados y Discusión

89

NB

D-G

lcC

er

NB

D-C

er

NB

D li

bre

NB

D-L

acC

er

A

B

C

tr (minutos)

Flu

ores

cenc

ia

Figura 32. Análisis de los lípidos neutros por HPLC. A, Incorporación con NBD-ceramida; B, Incorporación con NBD-ceramida en presencia de 10 M DL-t-PPMP; C, Incorporación con NBD-ceramida en presencia de 10 M Tamoxifeno.

Resultados y Discusión

90

concentraciones ensayadas (Fig. 34). Las concentraciones utilizadas fueron aquellas que

están descriptas que no producen un efecto citotóxico visible en las células de

mamíferos (Radin et al, 1993).

Finalmente, se realizó un ensayo sobre los efectos de estos inhibidores en las

formas trypomastigote de ratones infectados (Tabla II). En este caso se encontró que las

concentraciones de estos compuestos utilizadas producen una lisis muy significativa de

las formas sanguíneas de este parásito.

Por consiguiente, los resultados obtenidos muestran que el DL-t-PPMP produce

una importante inhibición del crecimiento del parásito y además tiene un efecto

específico sobre la síntesis de glucosilceramida haciendo disminuir su concentración en

Tabla II. Efecto de los inhibidores DL-t-PPMP y tamoxifeno en trypomastigotes sanguineos de ratones infectados.

PPMP

Tamoxifeno

Inhibidor Concentración

(M)

10 - 50

10

Lisis de los parásitos (%)

79 – 95,5

90 0 %

2 0 %

4 0 %

6 0 %

8 0 %

1 0 0 %

1 2 0 %

Cont r ol PPM P T amoxi f enoControl +PPMP (10 M)

+Tamox. (10 M)

Cre

cim

ietn

o ce

lula

r (%

) 100%

62%

78%

Figura 34. Efecto sobre el crecimiento in vitro de los inhibidores DL-t-PPMP y tamoxifeno en las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi.

Figura 33. Cuantificación a partir de las áreas correspondientes obtenidas durante el análisis por HPLC del efecto de los inhibidores sobre la biosíntesis de NBD-Glucosilceramida en Trypanosoma cruzi, formas epimastigote.

% a

ctiv

idad

0

20

40

60

80

100

120

140

Control PPMP Tamoxifeno

Resultados y Discusión

91

la célula. Esto podría estar indicando una estrecha relación entre la síntesis de

glicoesfingolípidos y la supervivencia del parásito, indicando que estos compuestos

serían indispensables para el parásito.

Finalmente, el tamoxifeno, presenta una muy alta eficiencia en la lisis de las

formas trypomastigote de Trypanosoma cruzi, al tiempo que genera un aumento de la

biosíntesis de glicoesfingolípidos. Esto estaría indicando que el tamoxifeno actua sobre

la biosíntesis de glicoesfingolípidos aunque probablemente este compuesto también este

afectando alguna otra ruta metabólica del parásito que resulte indispensable para su

supervivencia.

Resultados y Discusión

92

3. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Plasmodium

falciparum.

Objetivos:

Purificación de la enzima GlucosilCeramida Sintasa presente en los estadios

intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum.

Caracterización y determinación de la posible localización subcelular de la

GlucosilCeramida Sintasa.

Resultados y Discusión

93

3. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Plasmodium

falciparum.

En la biosíntesis de los glicoesfingolípidos la primera enzima que actúa es la

glucosilceramida sintasa (UDP-Glucosa:Ceramida glucosiltransferasa, GCS), la cual es

responsable del primer paso de glicosilación de la ceramida y/o dihidroceramida. Esta

enzima cataliza la transferencia de glucosa desde UDP-glucosa hacia la ceramida

generando como resultado la glucosilceramida, el glicoesfingolípido más simple.

3.1. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum.

La glucosilceramida sintasa fue originalmente descripta por Basu y

colaboradores en el año 1968 en el cerebro de embriones de pollo (Basu et al, 1968).

Sin embargo, el estudio de esta enzima no fue una tarea sencilla debido a la dificultad

de solubilizar y purificar la misma. Algunos años después diferentes estudios sobre la

GCS determinaron la presencia de esta enzima en ratas (Durieux et al, 1990), la

existencia de dos isoformas de la enzima, una presente en cerebro y la otra en hígado

que presentan diferentes propiedades (Vunnam and Radin, 1979) y la existencia de un

compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática específica (Inokuchi and Radin,

1987).

Actualmente se sabe que la glucosilceramida se encuentra esencialmente en

todos los animales y en una gran variedad de plantas (Nakayama et al, 1995; Lynch et

al, 1997). Por su parte, hasta la actualidad la glucosilceramida sintasa ha sido

identificada y clonada en varios organismos como humanos (Ichikawa et al, 1996),

ratón (Ichikawa et al, 1998), C. elegans, C. albicans, P. pastoris, M. grisea, G.

arboreum (Leipelt et al, 2001) y Drosophila melanogaster (Kohyama-Koganeya et al,

2004). Las enzimas descriptas hasta el momento no muestran similitud con ninguna otra

glicosiltransferasa descripta anteriormente. Adicionalmente, las secuencias de

aminoácidos de las diferentes glucosilceramidas sintasa presentan una muy baja

homología de secuencia entre sí.

Resultados y Discusión

94

En base a los antecedentes existentes y teniendo en cuenta los resultados previos

del laboratorio, que confirman la existencia de una glucosilceramida sintasa activa en

las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum, se decidió proceder a la

purificación de la enzima para poder realizar una caracterización más completa de la

misma. Previamente, nuestro laboratorio había determinado la presencia de una enzima

activa en el parásito con una especificidad de sustrato diferente a la enzima de

mamíferos, la cual actúa específicamente sobre ceramida presentando además una alta

estereoespecificidad. La GCS caracterizada en higado de rata es activa sobre el isómero

natural erythro- pero no sobre el isómero threo- de la ceramida (Paul et al, 1996). La

enzima de Plasmodium falciparum, en cambio, actúa, in vitro, específicamente sobre la

dihidroceramida y no sobre el sustrato insaturado (Couto et al, 2004). Estos resultados

fueron también corroborados mediante incorporaciones metabólicas in vivo que se

describieron anteriormente.

Se decidió realizar la purificación de la posible GCS del parásito utilizando dos

procedimientos en paralelo, mediante una inmunopurificación y una cromatografía de

afinidad a colorantes.

3.1.1. Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum.

Se decidió comenzar el estudio de la enzima realizando la purificación de la

enzima del parásito por inmunoafinidad utilizando anticuerpos policlonales anti-GCS

humana, gentilmente cedidos por los Drs. Marks y Pagano. Estos anticuerpos fueron

desarrollados en conejo utilizando como antígenos polipéptidos sintéticos, construidos

en base a regiones hidrofílicas de la secuencia deducida de aminoácidos de la GCS

humana (Ichikawa et al, 1996; Marks et al, 1999).

La inmunopurificación se llevó a cabo a partir de formas esquizonte de

Plasmodium falciparum ya que es el estadío intraeritrocítico que muestra una mayor

actividad de síntesis de glucosilceramida (Couto et al, 2004). Los parásitos purificados

por centrifugación en gradiente de Percoll se lisaron mediante 3 ciclos de sonicado a

0ºC en buffer estabilizante (Buffer Hepes 50mM, 100 mM KCl, 20% glicerol

conteniendo inhibidores de proteasas) y se centrifugaron a 4ºC para eliminar células

Resultados y Discusión

95

enteras remanentes. La muestra sin ningún otro tratamiento se aplicó en una columna de

inmunoafinidad específica equilibrada previamente en buffer Hepes 50mM pH 7,4

conteniendo 0,5M NaCl.

Esta columna de inmunoafinidad fue preparada a partir de los anticuerpos

policlonales 1.2 (correspondientes a una zona cercana al extremo N-terminal de la GCS

humana) (Fig. 39) purificados por precipitación con sulfato de amonio al 33% y

posterior afinidad a proteína A-Sepharosa. Los anticuerpos fueron luego acoplados a la

matriz de Sepharosa activada con bromocianógeno. Luego de la realización de la

reacción de acoplamiento, se lavó la columna recuperando los anticuerpos excedentes.

La cuantificación de los anticuerpos antes y después de la reacción de acople se utilizó

para determinar el porcentaje de ligando acoplado a la matriz de Sepharosa y poder de

esta manera estimar la capacidad de la columna (Tabla III).

.

La muestra de parásitos aplicada en la columna de inmunoafinidad se dejó

interactuar durante toda la noche a 4ºC, posteriormente se eluyó con el mismo buffer

equilibrante para eliminar la fracción que no interactuó con los ligandos y luego se

realizó la elución de la fracción específica con buffer Hepes 50mM pH 7,4 con el

agregado de 2M MgCl2, colectandose fracciones consecutivas de 2 ml cada una (Marks

et al, 1999).

La purificación fue monitoreada por determinación de la actividad enzimática

específica (Fig. 35) y las fracciones que presentaban dicha actividad fueron analizadas

por SDS-PAGE y Western-blot (Fig. 36).

Tabla III. Cuantificacióna de las IgGs 1.2 anti-GCS humana y cálculo de la eficiencia del acople a la matriz de Sepharosa.

IgG 1.2

Antes Después Acopladas % acople

11,85 mg 2,43 mg 9,42 mg 79,5

Capacidadb

2,8 mg

a La cuantificación de las IgGs fue realizada por el método de Bradfrord. b La capacidad fue calculada en base al peso molecular teórico de la GCS humana.

Resultados y Discusión

96

La inmunopurificación realizada utilizando los anticuerpos anti-GCS humana

dió como resultado la obtención de una fracción que presenta la actividad específica de

glucosilceramida sintasa utilizando como sustrato la dihidroceramida. La misma

fracción mostró una única banda al ser analizada por SDS-PAGE seguida de una tinción

tradicional de plata. La misma banda fue reconocida por el anticuerpo correspondiente

al analizar la fracción por SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido por un

Western-blot (Fig. 36). Estos hechos indican la existencia de una única proteína de peso

molecular aparente de aproximadamente 70000 Da responsable de la actividad

específica de glucosilceramida sintasa en las formas esquizonte de Plasmodium

falciparum. Este resultado establece otra diferencia entre la enzima del parásito y la de

mamíferos ya que se observó una gran diferencia entre los pesos moleculares de las

mismas. La enzima reconocida por este mismo anticuerpo a partir de un homogenato de

células de hígado de rata presenta un peso molecular aparente de 38 kDa (Marks et al,

1999) y el peso molecular teórico calculado a partir de la secuencia es de 44,8 kDa

Figura 35. Ensayo de actividad específica de GCS utilizando como sustrato NBD-DHCer. Los productos de la reacción se analizaron por cromatografía delgada en el sistema A de solventes. Línea 1, Lisado de formas esquizonte; Línea 2, Fracción correspondiente a la elución con 2M MgCl2.

NBD-DHGlcCer

NBD-DHCer

1 2

Resultados y Discusión

97

(Ichikawa et al, 1996). Esta pequeña discrepancia existente entre el peso molecular

experimental y el teórico es justificada por el grupo de Pagano como una consecuencia

de que la proteína migra en forma anómala en los geles de poliacrilamida debido a su

carácter fuertemente hidrofóbico (Marks et al, 1999).

Como ya ha sido determinado, la enzima del parásito presenta una especificidad

de sustrato diferente a la de mamíferos, indicando una importante diferencia entre estas

dos enzimas. Sin embargo, el anticuerpo realizado contra la GCS de mamíferos es capaz

de reconocer la enzima de Plasmodium falciparum indicando cierto grado de similitud.

La existencia de esta similitud entre las proteínas, de todas formas, no indica ni implica

una conservación de la secuencia de aminoácidos. Para que se produzca el

reconocimiento de la proteína por el anticuerpo empleado solamente es necesaria la

presencia de una región que mantenga una estructura tridimensional similar al epitope

utilizado en la preparación del anticuerpo. El hecho significativo de que la enzima de

Plasmodium falciparum no sea reconocida bajo condiciones no reductoras sería un

indicio de que el epitope reconocido por el anticuerpo utilizado se encuentra, en el caso

de la GCS del parásito, protegido por la estructura secundaria y/o terciaria de la proteína

o debido a la formación de oligómeros de la proteína como esta descripto en mamíferos

(Marks et al, 1999), impidiendo la correcta interacción entre el anticuerpo y la proteína,

durante el ensayo de Western-blot.

94 kDa 109 kDa

51,7 kDa

35,9 kDa

29,5 kDa

1 2

97,4 kDa

66,2 kDa

45,0 kDa

31,0 kDa

A B

Figura 36. A, Análisis por Western-blot de la fracción eluída con 2M MgCl2

utilizando para el revelado el anticuerpo 1.2 anti-GCS humana, Línea 1, Muestra sin reducir; Línea 2, Muestra reducida por tratamiento de -mercaptoetanol a 100ºC por 3 minutos; B, La misma fracción analizada por SDS-PAGE seguida de tinción de plata tradicional.

Resultados y Discusión

98

3.1.2. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a colorantes.

Paralelamente a la inmunopurificación de la GCS, se decidió realizar una

purificación alternativa de esta enzima por afinidad a colorantes utilizando una resina de

Green-dye agarosa. Ha sido descripto que algunos colorantes textiles se unen a

diferentes proteínas, especialmente aquellas que presentan sitios activos de unión para

nucleótidos (Haeckel et al, 1968; Kopperschlager, 1968). La afinidad de estos

colorantes por el sitio de unión a un nucleótido específico no puede ser predicha. Las

interacciones que existen entre las proteínas y los colorantes pueden deberse tanto a las

similitudes estructurales entre los sustratos/cofactores y los colorantes, como también a

propiedades hidrofóbicas o de intercambio iónico y por lo tanto no es posible

predecirlas. Esta descripto en la bibliografía que ciertas proteínas requieren el agregado

de cationes divalentes para que la unión con el colorante sea efectiva (Hughes et al,

1982). Por otra parte, los detergentes no iónicos son incompatibles con estas resinas ya

que encapsulan en micelas a los colorantes que se encuentran inmovilizados evitando

que las proteínas puedan quedar retenidas. En cambio, bajas concentraciones de

detergentes aniónicos son repelidos por las cargas negativas que presentan la mayoría de

estos colorantes y, por lo tanto, no interfieren con la afinidad de las proteínas

(Stellwagen, 1990). En función de estas consideraciones, el método más efectivo para la

determinación de la capacidad de unión de una determinada proteína consiste en realizar

un ensayo en pequeña escala con los diferentes colorantes disponibles (Scopes, 1986).

En nuestro caso, se decidió la utilización del colorante verde (Reactive Green) en base a

datos de literatura (Paul et al, 1996).

Esta purificación fue llevada a cabo a partir de formas esquizonte de

Plasmodium falciparum. Los parásitos fueron tratados en forma similar a lo descripto

anteriormente. La muestra fue aplicada en una columna conteniendo el colorante

inmovilizado y previamente equilibrada en buffer Hepes 50mM pH 7,4, a una velocidad

de 20 ml/hora para que las interacciones fueran efectivas. La columna fue luego eluída

secuencialmente con buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 0,15M KCl; buffer Hepes

50mM pH 7,4 suplementado con 20mM UDP-Glucosa y 20mM -NAD y por último

buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 1M KCl. La elución con UDP-Glucosa es un

paso de elución específica basado en la competencia del sitio de unión de la proteína por

el sustrato original y el colorante.

Resultados y Discusión

99

Las diferentes fracciones obtenidas durante la elución fueron analizadas por

SDS-PAGE seguido de una tinción de plata tradicional y un Western-blot empleando el

anticuerpo anti-GCS humana 1.2 para el revelado. Paralelamente, se realizó el ensayo

de la actividad específica de la enzima para determinar la presencia de la misma en las

fracciones obtenidas (Fig. 37).

Los resultados obtenidos mostraron la presencia de una proteína de peso

molecular aparente de 65500 Da, fácilmente visualizable por tinción de plata tradicional

en la fracción eluída de la columna de Green-dye agarosa en forma específica con UDP-

Glucosa. La misma banda fue reconocida por el anticuerpo anti-GCS humana solamente

en condiciones reductoras como fue observado anteriormente para la proteína purificada

Figura 37. A, Análisis por SDS-PAGE seguido por tinción de plata tradicional de las diferentes fracciones eluídas de la columna de Green-dye agarosa. Línea 1, Elución con 0,15M KCl; Línea 2, Elución con 20mM UDP-Glc + 20mM -NAD; Línea 3, Elución con 1M KCl. B, Análisis por Western-blot de la fracción eluída con UDP-Glucosa utilizando para el revelado el anticuerpo 1.2 anti-GCS humana, Línea 1, Muestra reducida por tratamiento de -mercaptoetanol a 100ºC por 3 minutos; Línea 2, Muestra sin reducir. C, Ensayo de actividad de GCS utilizando como sustrato NBD-DHCer de las mismas fracciones obtenidas luego de realizar la columna de afinidad a colorantes. Los productos de reacción fueron analizados por cromatografía en capa delgada con el sistema de solventes A. Línea 1, Elución con 0,15M KCl; Línea 2, Elución con 20mM UDP-Glc + 20mM -NAD; Línea 3, Elución con 1M KCl. Se indican los pesos moleculares de los estándares expresados en kDa.

31,0

66,2

45,0

97,4

1 2 3 A

1 2 3

NBD-DHCer

NBD-DHGlcCer

NBD-SM

C

35,9

94

51,7

109

B 1 2

Resultados y Discusión

100

por inmunoafinidad. La misma fracción también mostró actividad de GCS en las

condiciones ensayadas sugiriendo la identidad de la proteína como la posible

glucosilceramida sintasa de Plasmodium falciparum. Sin embargo, se observó una

pequeña diferencia en la migración de las proteínas purificadas por los diferentes

métodos durante el análisis por SDS-PAGE, posiblemente debido a las diferentes

condiciones de preparación de las muestras.

Con el objeto de realizar una mejor caracterización de la proteína responsable de

esta actividad enzimática, se decidió someter a la proteína purificada a diferentes

tratamientos. La proteína purificada por afinidad al colorante fue tratada en condiciones

desnaturalizantes (-mercaptoetanol y ditiotreitol, 3 minutos, 100ºC) y en paralelo se

realizó el tratamiento de la misma con una N-glicanasa (PNGasa F) para determinar la

presencia de glicosilación como una posible modificación post-traduccional de la

misma. Luego de los diferentes tratamientos se analizaron los resultados por SDS-

PAGE y las bandas fueron visualizadas por tinción de plata tradicional (Fig. 38).

Los resultados mostraron que tanto el tratamiento desnaturalizante por

calentamiento como por agregado de DTT, no afectan en forma significativa la proteína

estudiada. Sin embargo, el tratamiento con -mercaptoetanol muestra un corrimiento de

la banda correspondiente a la proteína hacia pesos moleculares más altos, lo que podría

estar implicando un cambio de conformación que hace que la proteína migre en forma

anómala. Finalmente, el tratamiento con la enzima N-glicanasa no mostró un

corrimiento apreciable de la banda de la proteína. Sin embargo, la apariencia de la

banda de la proteína se vio modificada observandose, en este último caso, una banda

Figura 38. Analisis por SDS-PAGE y visualización por tinción de plata de los diferentes tratamientos aplicados sobre la proteína purificada. Línea 1, Proteína sin tratamiento; Línea 2, Tratamiento en baño a 100ºC durante 3 minutos; Línea 3, Tratamiento con DTT en baño a 100ºC durante 3 minutos; Línea 4, Tratamiento con -mercaptoetanol en baño a 100ºC durante 3 minutos; Línea 5, Tratamiento con -mercaptoetanol en baño a 100ºC durante 3 minutos seguido de tratamiento con la enzima PNGasa durante 18 horas a 37ºC. Los pesos moleculares de los estándares utilizados están expresados en kDa.

1 2 3 4 5

97,4 66,2

45,0

31,0

PNGasa F

Resultados y Discusión

101

REGIÓN TRANSMEMBRANA

COOH NH2

5 6 2 1

11 32 33 52 57 78 257 280 372 394

H169

H193

H26

Figura 39. Esquema de la secuencia de la enzima GCS de mamíferos donde se muestran las secuencias correspondientes a los epitopes utilizados por el grupo del Dr. Pagano para obtener los anticuerpos policlonales anti-GCS. Los anticuerpos fueron denominados GCS-1; GCS-2; GCS-5 y GCS-6 y se muestran marcados en verde en la figura. (Modificado de Marks et al, 1999).

más definida. Este resultado, entonces, no sería concluyente para determinar la

presencia de N-glicosilación en esta proteína. Si la proteína presentara una baja

glicosilación, la eliminación de estas cadenas no produciría un cambio observable en el

peso molecular aparente determinado a partir de un análisis por SDS-PAGE pero si

podría observarse una banda más definida debido a la eliminación de la

microheterogeneidad que le confiere a la proteína las cadenas glicosídicas.

3.2. Localización subcelular de la GCS de Plasmodium falciparum.

Paralelamente a la caracterización de la actividad enzimática de la GCS de

mamíferos, ha sido determinado que la síntesis de la glucosilceramida ocurre en la

superficie citosólica del aparato de Golgi mientras que las posteriores reacciones de

glicosilación necesarias para la biosíntesis de los glicoesfingolípidos complejos tienen

lugar en la cara lumenal de la misma organela (Brandli et al, 1988; Futerman and

Pagano, 1991; Trinchera et al, 1991; Jeckel et al, 1992; Lannert et al, 1994). En base a

estos resultados, la glucosilceramida debería ser transportada hacia el interior del Golgi

para poder ser utilizada como precursor de los glicoesfingolípidos más complejos. Este

hecho ha generado un gran interés en el estudio de la topología de la GCS debido a que

la misma podría estar actuando como una flipasa al mismo tiempo de actuar como

glucosiltranferasa.

Resultados y Discusión

102

La utilización de programas para la predicción de la estructura de la proteína a

partir de la secuencia primaria de aminoácidos muestra que la misma tendría una

estructura tipo de clase III. Estas proteínas presentan un segmento N-terminal corto en

la región lumenal, un único segmento transmembrana y una larga porción ubicada en la

región citosólica (Spiess, 1995). Estos resultados serían consistentes con la orientación

citosólica de la enzima que ha sido propuesta en base a los resultados de estudios

realizados con proteasas y los anticuerpos policlonales dirigidos contra diferentes

epitopes (Marks et al, 1999) (Fig. 39). Estos resultados sugieren que el extremo N-

terminal de la GCS de mamíferos (epitope GCS-1) y un loop que contiene el epitope

GCS-6, ubicado inmediatamente después de la región transmembrana putativa, se

encuentran inmersos en un ambiente acuoso en la cara citosólica de la membrana del

aparato de Golgi ya que ambos epitopes son fácilmente asequibles por los anticuerpos y

son fácilmente degradados por la tripsina. En contraste, el epitope GCS-5 esta protegido

del ambiente acuoso por otras porciones de la proteína o por posibles interacciones con

la membrana (Marks et al, 1999).

Para obtener una primera aproximación sobre la localización subcelular de la

enzima GCS de Plasmodium falciparum se realizó un análisis por inmunofluorescencia

indirecta. Para ello se prepararon láminas finas de eritrocitos infectados sobre

portaobjetos que fueron fijadas en metanol frío. Luego de ser bloqueadas, las muestras

fueron incubadas con una dilución del anticuerpo de conejo anti-GCS humana y

posteriormente con el segundo anticuerpo anti-conejo conjugado con rodamina. En este

caso, se utilizaron dos anticuerpos correspondientes a dos fragmentos de la enzima

humana, el anticuerpo 1.2 que reconoce un segmento cercano al extremo C-terminal y el

anticuerpo 5.1 que reconoce una zona adyacente al extremo N-terminal.

Las mismas muestras fueron tratadas con marcadores fluorescentes de diferentes

estructuras intracelulares, Tracker Blue White como marcador de la estructura de tipo-

Golgi del parásito e ioduro de propidio como marcador del núcleo. Las muestras fueron

analizadas en un microscopio confocal de fluorescencia. Las células fueron iluminadas

con las longitudes de onda específicas de cada marcador fluorescente utilizado y

posteriormente las imágenes fueron superpuestas para determinar la localización de la

enzima GCS en Plasmodium falciparum. Paralelamente las células fueron visualizadas

por contraste de fases.

Los resultados obtenidos a partir de la superposición de las imágenes

correspondientes a los anticuerpos 1.2 y a los marcadores de las estructuras subcelulares

Resultados y Discusión

103

Figura 40. Localización subcelular de GCS de Plasmodium falciparum. Reconocimiento de trofozoitos y esquizontes tempranos por el suero de conejo policlonal anti-GCS humana y co-localización con el marcador de estructuras tipo Golgi. Reconocimiento de los estadios intraeritrocíticos por I -Anti GCS humana-Rodamina, II -marcador de estructuras tipo Golgi, III - imagen de contraste de fase, IV -superposición de las imágenes I y II.

I II

IV III

permitieron determinar la presencia de la enzima GCS en la estructura de tipo Golgi que

se encuentra presente en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum (Fig.

40). Como era de esperar, fue posible determinar la completa ausencia de la enzima en

el núcleo del parásito ya que no se observó co-localización al realizar la superposición

de las imágenes correspondientes (Fig. 41). Resultados similares se obtuvieron para el

anticuerpo 5.1.

Estos datos confirman, entonces, la presencia de la enzima en el parásito y

presentan evidencias de que la misma se encuentra localizada exclusivamente en la

Resultados y Discusión

104

Figura 41. Localización subcelular de GCS de Plasmodium falciparum. Reconocimiento de trofozoitos y esquizontes tempranos por el suero de conejo policlonal anti-GCS humana. Se observa la no co-localización con el marcador de núcleo. Reconocimiento de los estadios intraeritrocíticos por I -Anti GCS humana-Rodamina, II -marcador de núcleo, III - imagen de contraste de fase, IV -superposición de las imágenes I y II.

I II

III IV

estructura de tipo Golgi. Sin embargo, todavía son necesarios estudios complementarios

para determinar la topología de la GCS de Plasmodium falciparum y de esta manera

contar con mayor cantidad de información para realizar una completa comparación con

lo que ocurre con la enzima presente en las células de mamíferos.

Recientemente también ha sido clonada la enzima UDP-Galactosa:Ceramida

galactosiltransferasa de mamíferos, cuya secuencia muestra homología con las

glucuronosiltransferasas involucradas en el metabolismo de drogas (Schulte and Stoffel,

1993). Es interesante notar el hecho de que, aunque las enzimas glucosilceramida

sintasa y galactosilceramida transferasa catalizan reacciones muy similares, la

Resultados y Discusión

105

comparación de las dos secuencias correspondientes ha mostrado una extremadamente

baja homología (Schulte and Stoffel, 1993; Ichikawa et al, 1996). Se ha encontrado

además que la galactosilceramida transferasa tiene una importante homología con las

glucuroniltransferasas involucradas en el metabolismo de algunas drogas. Por otra parte,

la galactosilceramida transferasa se encontraría localizada en la cara interna del retículo

endoplásmico (Drake et al, 1992) a diferencia de lo que ocurre con la glucosilceramida

sintasa que se encuentra localizada en la membrana del aparato de Golgi. Estas dos

observaciones, la falta de homología de las secuencias y la diferente localización

subcelular, sugieren fuertemente que estas dos enzimas tienen distintos orígenes

evolutivos y, en consecuencia, funciones biológicas diferentes.

Resultados y Discusión

106

4. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Trypanosoma cruzi.

Objetivos:

Estudio de la GlucosilCeramida Sintasa en Trypanosoma cruzi.

Caracterización y determinación de la localización subcelular de la enzima

GlucosilCeramida sintasa del párasito.

Resultados y Discusión

107

4. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Trypanosoma cruzi.

4.1. Determinación de la presencia de una GCS activa en Trypanosoma cruzi.

Paralelamente al estudio realizado de la enzima GCS de Plasmodium

falciparum, se decidió ampliar el estudio de esta enzima en otros parásitos protozoarios,

comenzando por las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi, debido a la experiencia

del laboratorio en el estudio del mismo.

Existen numerosas evidencias de la existencia de glicolípidos en formas

epimastigote (de Lederkremer et al, 1985) y trypomastigote (Couto et al, 1985; Couto et

al, 1991; Uhrig et al, 1992; Uhrig et al, 1996; Uhrig et al, 1997; Agusti et al, 2000) de

Trypanosoma cruzi. Los glicoesfingolípidos han sido estudiados estructuralmente en

Trypanosoma mega (Vermelho et al, 1986) y en Trypanosoma cruzi (cepa Y)

encontrándose en éste último la presencia de una gran cantidad de ácidos grasos 2-

hidroxilados (Barreto-Bergter et al, 1985). Dentro de los glicoesfingolípidos más

simples, ha sido descripta la presencia de galactosil- y glucosilceramida conteniendo

ácidos grasos hidroxilados y no hidroxilados. (Barreto-Bergter et al, 1992 y 1996).

También han sido descriptos en la cepa CL-Brener la existencia de

sulfogalactosilceramidas (Petry et al, 1988). Finalmente, se ha propuesto que podría

existir una estrecha relación entre los glicoesfingolípidos de T. cruzi y la autoinmunidad

generada durante la enfermedad de Chagas (Vermelho et al, 1997), sin embargo, el

mecanismo y las enzimas involucradas en la biosíntesis de los mismos no ha sido

todavía elucidado. Teniendo en cuenta que la glucosilceramida sintasa es la primera

enzima involucrada en la síntesis de una gran variedad de glicoesfingolípidos más

complejos en diferentes especies celulares, resulta de gran interés poder realizar una

caracterización de esta enzima en T. cruzi.

Como primer paso se determinó la presencia de una actividad de

glucosilceramida sintasa en las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi de las cepas

Tulahuen 2 y CL-Brener. El ensayo de actividad fue llevado a cabo in vitro utilizando

como sustratos fluorescentes NBD-ceramida y NBD-dihidroceramida, y UDP-Glucosa

como donor de glucosa, analizándose luego la presencia de NBD-

glucosilceramida/NBD-dihidroglucosilceramida por cromatografía en placa delgada

(Fig. 42). La enzima de Trypanosoma cruzi mostró actividad con ambos sustratos

Resultados y Discusión

108

fluorescentes aunque se observó mayor actividad para el caso del sustrato insaturado, en

forma análoga a lo que ocurre con la enzima de mamíferos y en contraposición a lo que

se observó en Plasmodium falciparum.

Una vez determinada la presencia de esta actividad enzimática en el

homogenato total del parásito, se ensayaron diferentes condiciones de reacción,

variando la concentración de sustrato, proteína total, temperatura, presencia de

diferentes cationes y detergentes con el objeto de determinar las condiciones óptimas de

reacción para la enzima de Trypanosoma cruzi (Fig. 43). En todos los casos el ensayo

de actividad se realizó como se describió previamente y, en los casos en que fue posible,

se cuantificó la fluorescencia correspondiente al producto fluorescente de interés. De los

resultados obtenidos se desprende que la ceramida es mejor sustrato para la enzima que

el compuesto equivalente saturado ya que se obtiene una mayor cantidad de producto en

la reacción in vitro. La temperatura óptima para la reacción fue de 37ºC. La variación de

la actividad en función de la concentración del sustrato fluorescente muestra que la

NBD-GlcCer

NBD-DHCer NBD-Cer

1 2

Figura 42. Ensayo de actividad in vitro de Trypanosoma cruzi, formas epimastigote. Los productos de la reacción fueron analizados por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema de solventes A. Línea 1, utilizando como sustrato fluorescente NBD-dihidroceramida; Línea 2, utilizando como sustrato fluorescente NBD-ceramida

Resultados y Discusión

109

Figura 43. Ensayo de actividad de GlucosilCeramida Sintasa bajo diferentes condiciones. A, Curva de actividad a diferentes temperaturas; B, Curva de actividad con diferentes cantidades de sustrato fluorescente; C, Curva de actividad utilizando diferentes cantidades de proteína total en el ensayo. Utilizando NBD-Ceramida como sustrato, Utilizando NBD-DHCer como sustrato fluorescente. D, Análisis por cromatografía en capa delgada (sistema de solventes A) de los productos obtenidos en el ensayo de actividad utilizando NBD-Cer como sustrato en presencia de diferentes detergentes. Línea 1, Homogenato total de Trypanosoma cruzi; Línea 2, Homogenato total con el agregado de 0,1% CHAPS; Línea 3, Homogenato total con el agregado de 0,1% Tween 20. E, Análisis por cromatografía en capa delgada, sistema de solventes A, de los productos de la reacción in vitro en presencia de diferentes cationes, Línea 1, MgCl2; Línea 2, ZnCl2; Línea 3, CuCl2; Línea 4, FeCl2.

0

5000

10000

15000

20000

25000

20 25 30 35 40 45

Temperatura (ºC)

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 50 100 150

Sustrato (nmol)

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Proteina (mg)

NBD-Cer

NBD-GlcCer

1 2 3

D

NBD-Cer

NBD-GlcCer

1 2 3 4

E

C

B

A

Resultados y Discusión

110

enzima alcanzó un máximo de actividad para luego comenzar con una

disminución de la actividad al continuar con el incremento de la cantidad de sustrato.

Finalmente se observó que la actividad de la enzima de interés mantiene un

comportamiento aproximadamente lineal dentro del rango de proteína utilizado.

Por otra parte, el uso de bajas concentraciones de detergentes mostró una

pequeña inhibición de la actividad enzimática como esta descripto en el caso de la

enzima de mamíferos donde se ha determinado que la presencia de detergentes es

necesaria para la solubilización de la enzima pero deben mantenerse las concentraciones

debajo de ciertos valores para evitar la inhibición de la actividad enzimática (Paul et al,

1996; Marks et al, 1999).

Finalmente el estudio del efecto de los diferentes cationes en la actividad mostró

un máximo en presencia de MgCl2, al igual de lo que se ha encontrado para la enzima

de mamíferos sobre la cual los cationes divalentes como el Mg2+, Mn2+ y Ca2+, tienen un

efecto estimulador de la actividad, siendo el Mg2+ el que produce el mayor efecto a una

concentración de 10 mM (Abe and Shayman, 1999).

Teniendo en cuenta datos de literatura se ensayó el efecto de la presencia de

agentes reductores en el medio de reacción (Fig. 44). En este caso fue posible

determinar un pequeño aumento en la actividad en presencia de 1% -mercaptoetanol

en el ensayo de actividad. Este hecho implicaría que el sitio activo de la enzima no se

Figura 44. Ensayo de actividad en condiciones no reductoras y reductoras. Los productos de la reacción in vitro se analizaron por cromatografía en capa delgada utilizando el sistema de solventes A. Línea 1, Reacción en ausencia de -mercaptoetanol; Línea 2, Reacción en presencia de 1% de -mercaptoetanol

NBD-Cer

NBD-GlcCer

1 2

Resultados y Discusión

111

encuentra expuesto en su totalidad para el acercamiento de uno o los dos sustratos

necesarios para que ocurra la reacción. En presencia de un agente reductor, este sitio

activo sería expuesto en mayor grado, ya sea por ruptura de enlaces disulfuro o por una

modificación en la estructura terciaria de la proteína (Marks et al, 1999 y 2001).

Finalmente se evaluó el efecto de diferentes inhibidores, PPMP y Tamoxifeno,

sobre la actividad enzimática in vitro. El porcentaje de glicosilación de la NBD-

ceramida en presencia del PPMP fue de solo el 40%, en forma similar a lo que ha sido

descripto para la enzima de mamíferos (Chujor et al, 1998). El tamoxifeno, por otra

parte, parece estar involucrado en diferentes aspectos del metabolismo de lípidos y ha

sido descripto como un inhibidor de la glucosilceramida sintasa en células de mamíferos

y diferentes tejidos (Cabot et al, 1996). En Trypanosoma cruzi, sin embargo, se observó

que el tamoxifeno produce un drástico aumento de la síntesis in vitro de la

glucosilceramida (Fig. 45). Este hecho se encuentra en concordancia con el resultado

obtenido anteriormente que mostró un aumento de la biosíntesis de los esfingolípidos

neutros en ensayos de incorporaciones metabólicas in vivo en presencia de la misma

droga.

Figura 45. Efecto sobre la actividad enzimática in vitro de los diferentes inhibidores ensayados. A, Análisis de los productos de la reacción enzimática por cromatografía en capa delgada, en el sistema de solventes A. Línea 1, Control en ausencia de inhibidores; Línea 2, Tamoxifeno (20 M); Línea 3, DL-t-PPMP (20 M). B, Porcentajes de inhibición de los diferentes compuestos en relación al control en ausencia de inhibidores, 1, Control; 2, Tamoxifeno; 3, DL-t-PPMP.

A

NBD-Cer

NBD-GlcCer

1 2 3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 2 3

100%

160%

44%

B

Resultados y Discusión

112

4.2. Caracterización de otros productos de la reacción in vitro.

A partir del análisis por cromatografía en capa delgada de los productos de la

reacción in vitro, realizada a partir de diferentes partidas de parásitos, fue posible

determinar la presencia de otros productos de reacción, además de la NBD-

glucosilceramida y la NBD-esfingomielina. Frente a la ausencia de estándares

comerciales correspondientes a los diferentes compuestos obtenidos en el ensayo se

decidió analizar los productos mayoritarios por espectrometría de masa UV-MALDI-

TOF para realizar su identificación. Las bandas de interés fueron recuperadas a partir de

la placa de silica gel por extracción con Cloroformo: Metanol: Agua. El solvente fue

posteriormente evaporado y las muestras fueron sembradas en el portamuestras del

equipo utilizando como matrices nor-harmano y ácido 2,4-dihidroxibenzoíco. Los

espectros obtenidos en modo positivo permitieron realizar la identificación de los dos

productos fluorescentes mayoritarios (Fig. 46).

La banda de mayor movilidad en cromatografía en capa delgada fue asignada a

una mezcla de NBD-glucosilceramidas aciladas con diferentes ácidos grasos (Tabla IV).

Las posiciones de los ácidos grasos presentes en el compuesto no fue determinado ya

que la información brindada por los espectros no fue la suficiente.

R1 R2 m/z calc. m/z obs.

H H 737,4 736,5

C20:2 h H 1043,6 1042,9

C22:1 H 1057,7 1057,1

C22:2 h H 1071,7 1072,1

C24:1 H 1085,8 1086,0

C24:2 h H 1099,7 1100,3

C20:2 h C24:1 1392,0 1392,3

C22:2 h C22:1

C22:2 h C24:1 1420,1 1420,7

C24:1 C24:1 1434,1 1434,9

Tabla IV. Probables estructuras para las NBD-glucosilceramidas aciladas.

Resultados y Discusión

113

Figura 46. Determinación estructural de diferentes productos obtenidos en el ensayo in vitro de Trypanosoma cruzi, formas epimastigote. A, Análisis por cromatografía en capa delgada, sistema de solventes A, de los productos de reacción; B, Espectro obtenido en modo positivo por UV-MALDI-TOF de la banda de mayor movilidad eluída de la placa (matriz: nor-harmano); C, Espectro obtenido en modo positivo por UV-MALDI-TOF de la banda de menor movilidad que la NBD-glucosilceramida eluída de la placa de silica gel (matriz: ácido gentísico).

O

O

O

(CH2)14CH3

O

NH

N

N

O

NO2

OP

O

OH

OOH

OH

OH OH

O

O

OH OH C

NH

OR1*

HN

O

N

N

O

NO2

OHO

HO OOH

OR2*

B

NBD-Cer

NBD-libre

NBD-GlcCer

A

Resultados y Discusión

114

La banda de menor movilidad que la NBD-glucosilceramida fue asignada como

NBD-fosfatidilinositol acilado (Esquema II), producto de una posible transacilación

que estaría transfiriendo el grupo fluorescente desde la ceramida hacia un

fosfatidilinositol.

OH

OH

OP

O

OH

OOH

OH

OH OH

OH

m/z (obs) 334.7 m/z (calc) 335.0

O

O

O

(CH2)14CH3

O

NH

N

N

O

NO2

OP

O

OH

OOH

OH

OH OH

O

O

OH OH

m/z (obs) 1024.3 m/z (calc) 1024.7

m/z (obs) 846.7 m/z (calc) 847.4

m/z (obs) 667.9 m/z (calc) 668.4

m/z (obs) 1202.8 m/z (calc) 1203.7

Esquema II

[M+H ]+

Resultados y Discusión

115

4.3. Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi.

Una vez realizada la purificación parcial de la glucosilceramida sintasa de

Plasmodium falciparum, se decidió realizar la purificación de la misma enzima a partir

de las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi utilizando una metodología similar a

la descripta anteriormente. En este caso, fue necesario desarrollar una estrategia de

purificación más compleja debido a las características propias de la enzima y del

parásito.

La purificación fue realizada en base a la experiencia previa adquirida durante la

purificación de la enzima de Plasmodium falciparum y en base a datos presentes en la

literatura (Paul et al, 1996). En este caso, los parásitos fueron lisados por 3 ciclos de

congelado-descongelado y resuspendidos en una solución de sacarosa para luego ser

sometidos a una centrifugación para obtener un extracto enriquecido en los

componentes de membrana del parásito debido a que esta descripto que la

glucosilceramida sintasa de varios organismos es una proteína integral de membrana

(Paul et al, 1996). A continuación se realizó una precipitación con solución saturada de

sulfato de amonio hasta alcanzar una concentración final de 50%. El precipitado

obtenido fue resuspendido en un buffer conteniendo CHAPS y UDP-Glucosa para

ayudar a la correcta solubilización y estabilidad de la enzima. En esta etapa fue

importante mantener la concentración de proteína en la solución en un valor aproximado

de 1 mg/ml, obteniéndose en este paso un alto grado de purificación de la enzima (Tabla

V). Posteriormente, se realizó una ultracentrifugación a 100000g para eliminar el

material no soluble. La fracción que permaneció solubilizada fue aplicada en una

columna de afinidad a Green Dye agarosa previamente equilibrada en un buffer

conteniendo el detergente y UDP-Glucosa. En estas condiciones se esperaba que la

enzima de interés no interaccione con la matriz de la columna ya que la misma se

encontraría formando el complejo con el sustrato UDP-Glucosa y por lo tanto no tendría

disponible el sitio activo para interaccionar con el colorante. De esta manera se eliminan

las proteínas que interaccionan inespecíficamente con este colorante. Para continuar con

el proceso de purificación fue necesario eliminar de esta fracción la UDP-Glucosa. Para

ello se aplicó la muestra en una columna de BioGel P2, obteniéndose en el volumen

muerto las proteínas de la muestra. Finalmente se realizó un paso de purificación

específico utilizando una columna de Green Dye agarosa en ausencia de UDP-Glucosa.

En este caso, la enzima interactúa específicamente con la matriz y es eluída en forma

Resultados y Discusión

116

específica de la misma. La elución, en este caso, se realizó secuencialmente con: 1-

0,15M KCl en el buffer equilibrante conteniendo 0,1mM fosfatidilcolina; 2- 20 mM

UDP-Glucosa en el mismo buffer y 3- 1M KCl, también en el mismo buffer. La elución

de la columna fue seguida por cuantificación de proteína realizada por el método de

Bradford (Fig. 47). Todo el proceso de purificación fue realizado a 4ºC y monitoreado a

través del ensayo de actividad específico para la GCS (Fig. 48).

Es interesante notar que la actividad enzimática se mantiene a lo largo de todo el

proceso de purificación. En el último paso de purificación, se aumenta

considerablemente la actividad específica de la enzima ya que la cantidad de proteína

recuperada en el paso de elución de la columna de Green-dye agarosa con UDP-Glucosa

se encuentra cercana al límite de detección del método.

El análisis de las diferentes fracciones por SDS-PAGE seguido de tinción de

plata tradicional (Fig. 49) mostró la presencia de una triple banda de peso molecular

aparente de aproximadamente 65000 Da, la cual sería responsable de la actividad de

glucosilceramida sintasa. Para poder observar esta triple banda fue necesario concentrar

la fracción eluída específicamente con UDP-Glucosa debido a la baja concentración de

proteína obtenida en dicha fracción.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 10 20 30 40 50 60Volumen eluído (ml)

Pro

teín

a to

tal (

g)

0,15M KCl 20mM UDP-Glc 1M KCl

Figura 47. Perfil de elución de proteínas de la segunda columna de Green Dye agarosa. La elución fue realizada secuencialmente con 0,15M KCL, 20mM UDP-Glc y 1M KCl en buffer estabilizante conteniendo 0,1 mM fosfatidilcolina. El eluído fue recuperado en fracciones de 2 ml cada una.

Resultados y Discusión

117

El proceso de purificación de la enzima de GCS de Trypanosoma cruzi es

sensiblemente más complejo que en el caso de Plasmodium falciparum, y esto puede ser

debido a las diferentes estructuras que presentan estos dos parásitos.

En este caso se encontró que el agregado de UDP-Glucosa en los primeros pasos

de la purificación, desde la preparación del homogenato hasta la primera columna de

afinidad a colorantes, y de fosfatidilcolina durante la elución de la segunda columna de

green dye-agarosa ayudan a la conservación de la actividad enzimática, como esta

descripto en la bibliografía para el caso de otras glucosiltransferasas (Matern et al,

1990).

Figura 48. Control de la actividad de GlucosilCeramida sintasa durante las diferentes etapas de la purificación. Los productos de la reacción in vitro se analizaron por cromatografía en placa delgada utilizando el sistema de solventes A. Línea 1, Fracción enriquecida en membrana (50 mg de proteína); Línea 2, Precipitado con sulfato de amonio (50 mg de proteína); Línea 3, Sobrenadante de la ultracentrifugación (50 mg de proteína); Línea 4, Fracción no unida a la primera columna de Green Dye agarosa (50 mg de proteína); Línea 5, Volumen muerto de la columna de BioGel P2 (50 mg de proteína); Línea 6, Fracción eluída de la segunda columna de Green Dye agarosa con 0,15M KCl (3,45 mg de proteína); Línea 7, Fracción eluída de la misma columna específicamente con 20 mM UDP-Glucosa (0,15 mg de proteína); Línea 8, Fracción eluída de la misma columna con 1M KCl(3,45 mg de proteína).

NBD-Cer

NBD-GlcCer

6 7 8

NBD-ácido

1 2 3 4 5

NBD-Cer

NBD-GlcCer

NBD-ácido

Resultados y Discusión

118

En la tabla V se muestran los valores de recuperación y purificación para los

distintos pasos del proceso de purificación, donde se observó que la fracción eluída con

UDP-glucosa presentó el mayor grado de enriquecimiento.

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 PM 9

97400 Da

66200 Da

45000 Da

31000 Da

97400 Da

66200 Da

45000 Da

21500 Da

31000 Da

Figura 49. Análisis por SDS-PAGE y tinción de plata tradicional de las diferentes etapas del proceso de purificación de la GCS. Línea 1, Precipitado con sulfato de amonio 50% (0,73g de proteína); Línea 2, Sobrenadante de la ultracentrifugación (0,99g de proteína); Línea 3, Fracción no unida a la primera columna de Green-Dye agarosa (0,71g de proteína); Línea 4, Volumen muerto de la columna de BioGel P2 (1,30g de proteína); Línea 5, Fracción no unida de la segunda columna de Green-Dye agarosa (1,8g de proteína); Línea 6, Elución con 0,15M KCl (0,74g de proteína); Línea 7, Elución con UDP-Glucosa (0,02g de proteína); Línea 8, Elución con 1M KCl (0,66g de proteína); Línea 9, Eluído con UDP-Glucosa concentrado (0,16g de proteína). PM: Estándares de pesos moleculares.

a La cuantificación de la proteína total presente en cada fracción fue determinada por el método de Lowry. b La actividad específica de cada fracción fue calculada como la fluorescencia correspondiente a la NBD-glucosilceramida producida en el ensayo en unidades arbitrarias de fluorescencia por unidad de proteína calculada en miligramos.

Proteína totala

Recuperación Actividad Específicab

Enriquecimiento

mg % unidades/mg veces

Homogenato 728 100 22,24 1

Fracción rica en mb. 402 55 24,56 1,1

Ppdo (NH4)2SO4 50% 7,3 1,8 731 29

Sn 100000g 4,9 67 583 0,8

Dye-agarosa 1 1,46 9,4 618 1,1

BioGel P2 1,45 99 569 0,92

Dye-agarosa 2 0,43 30 1867 3,3

0,15M KCl 0,27 18 3254 5,7

UDP-Glc 0,013 0,93 111333 195

1M KCl 0,19 13 2652 4,6

Tabla V. Purificación de la GCS de formas epimastigotes de Trypanosoma cruzi.

Resultados y Discusión

119

4.4. Localización subcelular de la GCS de Trypanosoma cruzi.

Para determinar la localización subcelular de la enzima GCS presente en la

formas epimastigote de Trypanosoma cruzi, se realizó una primera aproximación a

partir de un fraccionamiento subcelular realizado con carburo de silicio y posteriores

centrifugaciones diferenciales (Duschak and Cazzulo, 1991). Las diferentes fracciones

corresponden a la fracción nuclear, las fracciones de gránulos grandes y pequeños

conformadas por vesículas mitocondriales, lisosomas y glicosomas en diferente

proporción, la fracción microsomal conteniendo esencialmente el retículo endoplásmico

y fragmentos de la membrana plasmática y finalmente la fracción soluble compuesta por

el citosol y el contenido soluble de las organelas rotas como la mitocondria (Bontempi

et al, 1989). Las diferentes fracciones subcelulares obtenidas fueron analizadas por

SDS-PAGE seguido de un análisis por Western-blot utilizando como anticuerpo

primario el anticuerpo 1.2 anti-GCS humana (Fig. 50).

El análisis mostró la presencia de dos bandas mayoritarias en la fracción

microsomal sugiriendo que la enzima de Trypanosoma cruzi sería una proteína de

membrana en forma similar a lo que ocurre en las células de mamíferos. La existencia

de dos bandas podría estar implicando la existencia de complejos de proteínas junto con

la GCS o la formación de oligómeros como se ha descripto para la enzima de mamíferos

(Marks et al, 1999).

En orden de obtener mayor información acerca de la localización subcelular de

la GCS del parásito se realizó una inmunomicroscopía electrónica. A partir de los

parásitos cosechados se realizó una fijación para poder obtener luego una serie de

203 kDa

123 kDa

80 kDa

48 kDa

1 2 3 4 5

Figura 50. Análisis por SDS-PAGE y Western-blot de las diferentes fracciones subcelulares obtenidas por tratamiento con carburo de silicio y posteriores centrifugaciones secuenciales. Línea 1, Fracción nuclear; Línea 2, Fracción de gránulos grandes; Línea 3, Fracción de gránulos pequeños; Línea 4, Fracción microsomal; Línea 5, Fracción soluble.

Resultados y Discusión

120

láminas finas que fueron incubadas con el anticuerpo anti-GCS humana y un segundo

anticuerpo conjugado con pequeñas partículas de oro (Fig. 51). Paralelamente se realizó

un tratamiento con OsO4 como control para observar las estructuras subcelulares del

parásito.

La microscopía electrónica confirmó la presencia de la enzima en Trypanosoma

cruzi asociada a membrana como se esperaba. La señal correspondiente se observó

principalmente en el complejo de Golgi del parásito así como también en la membrana

plasmática del mismo, incluyendo la membrana del flagelo. La señal observada en la

membrana se encontró, en algunos casos, concentrada en ciertas regiones que formaban

pequeñas protuberancias de la membrana, las cuales podrían ser estructuras de tipo

“lipid rafts”.

Figura 51. Microscopía electrónica de Trypanosoma cruzi, formas epimastigote. K, Kinetoplástido; G, Complejo de Golgi; FP, Bolsillo flagelar; F, Flagelo.

G 0,15 m

F

F FP

0,2 m

0,1 m

G

K G

0,1m

Resultados y Discusión

121

5. Actividad de Glucosilceramida Sintasa en otros parásitos.

Objetivos:

Determinación de la presencia de la enzima GlucosilCeramida Sintasa en

Leishmania amazoniensis y Toxoplasma gondii.

Resultados y Discusión

122

5. Actividad de Glucosilceramida Sintasa en otros parásitos.

A partir de la determinación de la actividad de GCS en Plasmodium falciparum

y Trypanosoma cruzi, se decidió extender el estudio a otros parásitos protozoarios. Se

realizó el ensayo in vitro utilizando homogenatos completos para determinar la

presencia de esta actividad en Leishmania amazoniensis y Toxoplasma gondii (Fig 52).

Como era de esperar, en base a los resultados obtenidos anteriormente, se observó la

biosíntesis de glucosilceramida en ambos parásitos a partir de los sustratos fluorescentes

utilizados. Cabe destacar, que en los casos de Leishmania y Toxoplasma, se observó

actividad tanto con el sustrato saturado como con el sustrato insaturado, al igual de lo

que había sido encontrado en el caso de Trypanosoma cruzi.

Figura 52. Ensayo de actividad in vitro de Glucosilceramida Sintasa con diferentes sustratos fluorescentes en diferentes parásitos. Los productos de la reacción in vitro se analizaron por cromatografia en capa delgada en el sistema A de solventes. Línea 1, Leishmania amazoniesis utilizando NBD-ceramida como sustrato; Línea 2, Leishmania amazoniesis utilizando NBD-dihidroceramida como sustrato en el ensayo de actividad; Línea 3, Toxoplasma gondii con NBD-ceramida como sustrato; Línea 4, Toxoplasma gondii con NBD-Dihidroceramida como sustrato para la enzima. En todos los casos se utilizaron 2,4x107 parásitos para realizar el ensayo.

NBD-Cer/NBD-DHCer

NBD-GlcCer/NBD-DHGlcCer

1 2 3 4

Resultados y Discusión

123

Es interesante notar que se obtuvo una mayor actividad enzimática en el caso de

Toxoplasma gondii y que este parásito estaría utilizando preferentemente el sustrato

insaturado al igual que Trypanosoma cruzi y a diferencia de lo que ocurre en

Plasmodium falciparum. Por otra parte, Leishmania amazoniesis mostró una pequeña

cantidad de producto fluorescente y no se observaron diferencias significativas entre los

dos sustratos ensayados.

Resultados y Discusión

124

6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.

Objetivos:

Determinacón de las condiciones óptimas para el análisis de glicoesfingolípidos

por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.

Estudio de la capacidad de la NBD-Ceramida como matriz para el análisis de

diferentes analitos por espectrometria de masa UV-MALDI-TOF.

Resultados y Discusión

125

6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.

En la actualidad, la espectrometría de masa (EM) UV-MALDI-TOF es,

probablemente, la técnica analítica más utilizada en el análisis de glicoconjugados como

las glicoproteínas y los glicolípidos (Zhigilei et al, 1997 y 1998). Sin embargo, esta

técnica presenta una importante limitación experimental que esta dada por la

preparación de la muestra, la cual es fundamental para obtener un resultado exitoso. Las

muestras se aplican en forma de finas láminas sobre un portamuestras adecuado donde

son irradiadas por un láser de pulsos para producir la vaporización e ionización del

analito (Horneffer et al, 1999; Dreisewerd, 2003). Este proceso ocurre mediante la

absorción de energía por parte de la matriz utilizada, la cual transfiere parte de esa

energía a las moléculas de analito que se encuentran en sus proximidades. Por lo tanto,

no es sorprendente, que una de las características fundamentales de los compuestos que

actúan como matrices en esta técnica, es que deben absorber a la longitud de onda

emitida por el láser utilizado (Patricelli et al, 2003; Berkers et al, 2005). Sin embargo,

todavía no han sido perfectamente esclarecidos los procesos por los cuales ocurre la

volatilización/ionización de la muestra. De esta manera la elección de la matriz es un

procedimiento completamente experimental, ya que no se ha encontrado hasta el

momento cual es la relación entre la estructura química de la matriz y su efectividad en

la obtención de buenos resultados por espectrmetría de masa UV-MALDI.

Durante la realización de este trabajo, se realizaron múltiples aproximaciones

para el análisis de esfingolípidos por EM-UV-MALDI. En algunos casos, se realizó el

análisis de esfingolípidos provenientes de incorporaciones metabólicas con análogos

fluorescentes, NBD-ceramida y NBD-dihidroceramida. Para ello fue necesaria la

búsqueda de las condiciones óptimas para la preparación de las muestras, y en ese

contexto se investigó si ciertos NBD-esfingolípidos podían ser analizados sin el

agregado de una matriz externa, ya que el mismo compuesto podría ser capaz de

absorber la energia a las longitudes de onda del láser utilizado y actuar

desorbiendo/ionizando los compuestos.

Inicialmente, para el análisis de los esfingolípidos, se probaron diferentes

matrices descriptas en la bibliografía, ácido -ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), ácido

2,4-dihidroxibenzoíco (DHB) y nor-harmano (nHo), tanto en modo positivo como en

modo negativo. Sin embargo, en la mayoría de los casos, solo se obtuvieron señales

correspondientes a las matrices y no a los analitos de interés. Considerando estos

Resultados y Discusión

126

primeros resultados negativos y considerando la presencia del grupo fluorescente en los

NBD-esfingolípidos cuya estructura de anillos aromáticos le confiere una alta eficiencia

de absorción de energía de la longitud de onda del láser del equipo de UV-MALDI

utilizado, se decidió realizar una determinación en ausencia de una matriz externa.

Cuando se analizó una muestra de NBD-ceramida patrón se obtuvieron espectros

de gran calidad, tanto en modo positivo (Fig. 53) como en modo negativo (Fig. 54). Fue

interesante observar que el espectro realizado en modo positivo mostró una señal

intensa a m/z 552,0 correspondiente a la estructura [M+Na-NO2]+ pero no fue posible

determinar la presencia del ión molecular. Por otra parte, el análisis en modo negativo

mostró una señal de gran intensidad a m/z 574,3 correspondiente al ión molecular

[(NBD-Cer)-H]-. En este caso también se observaron otras señales de menor intensidad

correspondientes a la pérdida sucesiva de protón y un radical hidroxilo ([(NBD·Cer)-H-

HO]-., m/z 558,3) y a productos de descomposición del grupo fluorescente de la

molécula.

0 0

0.5

1.0

1.5

4x10

Inte

ns. [

a.u

.]

00 450 500 550 600 650

m/z

495.

080

523.

150

552.

0

[(NBD·Cer)+Na-NO2]+·

Figura 53. Espectro UV-MALDI-TOF de la NBD-Ceramida en modo positivo sin el agregado de una matriz externa. [(NBD·Cer)+Na-NO2]

+· , m/z calculado 551.218.

Resultados y Discusión

127

El análisis de NBD-dihidroceramida, por su parte, dio señales de la misma

naturaleza, obteniéndose la señal de mayor intensidad para el ión molecular con un

valor de m/z 576,3 y la correspondiente señal a m/z 560,3 compatible con la pérdida

sucesiva de protón y radical hidroxilo. Adicionalmente, el análisis de una muestra de

NBD-Ceramida acetilada en condiciones de peracetilación dió una señal de gran calidad

a m/z 657,6 correspondiente al la NBD-Ceramida-1,3-diacetilada (Fig. 55).

Considerando los buenos resultados obtenidos se decidió extender el análisis a otros

esfingolípidos. Se analizaron en modo reflectrón negativo la NBD-glucosilceramida, la

NBD-glucosildihidroceramida y la NBD-esfingomielina obteniendose señales a m/z

736.4 y 738.5 correspondientes a [(NBD-hexosilceramida)-H]- y a [(NBD-

hexosildihidroceramida)-H]-, respectivamente (Fig. 55), y, en el caso de la

esfingomielina se detectó una buena señal a m/z 740.0 correspondiente al ión molecular

[(NBD-SM)-H]- (Fig. 56).

Figura 54. Espectro UV-MALDI-TOF de la NBD-Ceramida en modo negativo sin el agregado de una matriz externa. [(NBD-Cer)-H] -, m/z calculado 574,2; [(NBD·Cer)-H-HO]-., m/z calculado 557,4.

0

500

1000

1500

2000

Inte

ns.

[a.u

.]

00 520 540 560 580 600 620 640

m/z

[(NBD·Cer)-H] -

574.

3

558.

3

Resultados y Discusión

128

Figura 55. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo sin el agregado de matriz externa. A, NBD-1,3-diacetilceramida; B, NBD-glucosilceramida; C, NBD-glucosildihidroceramida.

0

50

100

150

200

250

Inte

ns.

[a.u

.]

00 550 600 650 700 750

m/z

[(NBD·GlcCer)-H] -

736.

4

720.

3

574.

2

0

100

200

300

400

500

600

Inte

ns.

[a.u

.]

00 550 600 650 700 750

m/z

[(NBD·DHGlcCer)-H] -

722.

4

576.

3

738.

4

0

100

200

300

400

500

600

Inte

ns.

[a.u

.]

00 520 540 560 580 600 620 640 660 680

m/z

[(NBD-1,3-diacetilCer)-H]-

641.

6

657.

6 A

B

C

Resultados y Discusión

129

Teniendo en cuenta los espectros de alta calidad obtenidos para los diferentes

esfingolípidos fluorescentes analizados, se decidió realizar el estudio de una muestra de

origen biológico para determinar si esta metodología resultaba de utilidad. Se procedió

al análisis por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF sin el agregado de una matriz

externa de una muestra de lípidos purificada proveniente de una incorporación

metabólica de NBD-ceramida en un cultivo de formas epimastigote de Trypanosoma

cruzi (Fig. 57). El espectro realizado en modo reflectron negativo mostró señales a m/z

636.7 y 647.7 correspondientes a [(NBD-Cer-1-PO4)-H2O-H]- y [(NBD-

fosfatidilinositol-K)-H]-, respectivamente. También se observaron dos señales

superpuestas a m/z 737.6 and 739.6 correspondientes a NBD-glucosilceramida y NBD-

esfingomielina. Todos los compuestos detectados en la muestra son componentes

mayoritarios de Trypanosoma cruzi de acuerdo con lo descripto en la bibliografía

(Barreto-Bertger et al, 1992; Figueiredo et al, 2005), indicando que el análisis es de

gran utilidad para el análisis directo de muestras complejas.

De esta manera, los compuestos fluorescentes utilizados presentaron una gran

versatilidad ya que los mismos pueden actuar como marcadores metabólicos en

diferentes ensayos y actuar posteriormente como fotosensibilizadores para el análisis de

estos compuestos por espectrometría de masa UV-MALDI. En este caso, al no ser

agregada una matriz externa, el proceso de volatilización/ionización es producido

Figura 56. Espectro UV-MALDI-TOF en modo reflectron negativo de la NBD-esfingomielina.

20

40

60

80Inte

ns. [a

.u.]

00 550 600 650 700 750

m/z

740.

0

[(NBD·SM)-H] -

Resultados y Discusión

130

directamente por el láser (UV-LDI). Sin embargo, a pesar de que dicha técnica es un

método ionizante fuerte, en este caso, se han obtenido espectros muy limpios. Esta

aplicación es, por lo tanto, de gran interés ya que es posible localizar y caracterizar

diferentes metabolitos en un solo experimento disminuyendo considerablemente el

tiempo de análisis requerido y aumentando la sensibilidad y versatilidad con una

mínima preparación de la muestra.

Considerando otro aspecto de la utilidad del grupo fluorescente utilizado, se

decidió comprobar si la NBD-ceramida podía ser utilizada como una matriz externa en

el análisis de diferentes analitos. Para evaluar su capacidad de acción como una matriz

útil para espectrometría de masa UV-MALDI, se realizó el análisis de diferentes

ceramidas y glicoesfingolípidos no fluorescentes. Los espectros de diferentes ceramidas

d18:1 aciladas con una variedad de ácidos grasos mostraron señales de alta calidad tanto

en modo positivo como en modo negativo al utilizar la NBD-ceramida como matriz

(Fig. 58). También se evaluó el rendimiento de la NBD-ceramida como matriz en el

caso de diferentes glicoesfingolípidos. En esto casos se obtuvieron espectros con una

excelente relación señal/ruido en el modo positivo (Fig. 59).

Figura 57. Espectro obtenido por UV-MALDI-TOF en modo negativo de los lípidos neutros obtenidos luego de incorporación metabólica con NBD-ceramida en las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi.

Inte

ns. [

a.u

.]

10

20

00 620 640 660 680 700 720 740 760 780

m/z

647.

7

636.

7

[(NBD-Cer-1-PO4)-H2O-H] -

[(NBD-hexosilCer)-H]-

737.

9 73

9.6

[(NBD-SM)-H] -

[(NBD-fosfatidilinositol-K)-H] -

Resultados y Discusión

131

Figura 58. Espectros obtenidos por EM-UV-MALDI-TOF para diferentes esfingolípidos utilizando como matriz NBD-ceramida. A, Ceramida d18:1, C18:0, en modo positivo; B, Ceramida d18:1, C16:0, en modo positivo; C, Ceramida d18:1, C18:0, en modo negativo; D, Ceramida d18:1, C16:0, en modo negativo.

0

1000

2000

3000

Inte

ns.

[a.u

.]

460 480 500 520 540 560 580 600 620 640

m/z

588.

3

[(Cer d18:1 C18:0)+Na]+

A

0

500

1000

1500

Inte

ns. [

a.u

.]

460 480 500 520 540 560 580 600 620 640

m/z

560.

3

[(Cer d18:1 C16:0)+Na]+

B

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [

a.u.

]

460 480 500 520 540 560 580 600 620 640

m/z

564.

4 57

4.4

[(Cer d18:1 C18:0)-H]-

C

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns.

[a.u

.]

460 480 500 520 540 560 580 600 620 640

m/z

536.

4

574.

2

510.

5

488.

3

[(Cer d18:1 C16:0)-H]-

D

Resultados y Discusión

132

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns.

[a.u

.]

50 875 900 925 950 975 1000 1025 1050 1075

m/z

912.

6

928.

6 94

0.6

[(LacCer d18:1 C18:0)+Na]+

[(LacCer d18:1 C18:0)+K]+

[(LacCer d18:1 C20:0)+Na]+

0

100

200

300

400

500

Inte

ns.

[a.u

.]

00 900 1000 1100 1200 1300 1400

m/z

1277

.7

[(Gg4Cer d18:1 C18:0)+Na]+

20

40

60

Inte

ns.

[a.u

.]

00 800 1000 1200 1400 1600

m/z

1360

.0

[GbO4 d18:1 C24:1)+Na]+

A

B

C

Figura 59. Espectros obtenidos por EM-UV-MALDI-TOF en modo positivo para diferentes glicoesfingolípidos utilizando como matriz NBD-ceramida. A, Lactosilceramida; B, Asialo GM1; C, Globotetraósido.

Resultados y Discusión

133

Teniendo en cuenta todos estos resultados en conjunto, fue posible determinar

que el grupo fluorescente de la NBD-ceramida utilizada actúa como matriz produciendo

la desorción/ionización de los mismos compuestos conteniendo el grupo fluorescente

unido covalentemente y de diferentes glicolípidos. Tratandose en el primer caso de un

análisis de muestras sin el agregado de una matriz externa mientras que en el segundo

caso la NBD-ceramida estaría actuando como matriz para el análisis de analitos de

estructura química similar. Sin embargo, fue posible determinar que la eficiencia de

desorción/ionización decrece al aumentar la polaridad de los analitos o el número de

unidades de monosacáridos presentes aunque se observó que no hay relación con el tipo

de azúcar presente en la molécula.

Resultados y Discusión

134

7. Sintesis de conjugados proteína – hidratos de carbono.

Objetivos:

Preparación simple de conjugados proteína – hidratos de carbono.

Caracterización de los compuestos obtenidos por espectrometría de masa UV-

MALDI-TOF.

Obtención y caracterización de pequeños oligosacáridos a partir de la heparina.

Resultados y Discusión

135

7. Síntesis de conjugados proteína – hidratos de carbono.

Teniendo en consideración que en este trabajo se han estudiado diferentes

glicoconjugados presentes en Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi y que los

hidratos de carbono presentan generalmente una fuerte antigenicidad, se decidió intentar

desarrollar una técnica que permitiese determinar la participación de las cadenas

glicosídicas en la antigenicidad. Esta participación se estudia generalmente con ensayos

de ELISA y/o de Dot-blot, para lo cual el resto oligosacarídico debe ser unido a una

membrana de nitrocelulosa para ser presentados a los diferentes anticuerpos. Es

conocido que los hidratos de carbono no se unen eficientemente a estas membranas por

lo cual los resultados suelen no ser reproducibles. Para ello se decidió realizar un acople

de oligosacáridos de diferentes estructuras a proteínas comerciales seguido de su

caracterización estructural. Adicionalmente, se realizó la caracterización de

oligosacáridos provenientes de una degradación de heparina como fuente de cadenas

oligosacarídicas sulfatadas para incorporar al estudio.

7.1. Preparación de conjugados proteína – hidratos de carbono.

Debido a la naturaleza hapténica de los hidratos de carbono, fue necesario

desarrollar y optimizar una síntesis simple y rápida para preparar conjugados de estos

compuestos con proteínas no inmunogénicas para obtener conjugados que puedan

desencadenar una respuesta inmune en un organismo. Para ello, se decidió comenzar

utilizando hidratos de carbono y proteínas comerciales simples.

La reacción de unión entre los hidratos de carbono y las proteínas se llevó a cabo

mediante una condensación de glutaraldehído con dos grupos amino, uno perteneciente

al azúcar y el otro a alguna cadena lateral básica de los aminoácidos de las proteínas. De

esta manera, fue necesario en primer lugar realizar la modificación de algunos hidratos

de carbono de manera de introducir un grupo amino en el carbono anomérico (Esquema

III).

La síntesis de las glicosaminas fue realizada en un solo paso utilizando

carbamato de amonio en metanol (Hackenberger et al, 2005) modificando el método

tradicional que utiliza bicarbonato de amonio en agua (Takeda et al, 1990). Las

glicosilaminas son inestables y tienden a formar dímeros, hidrolizarse e isomerizarse.

Resultados y Discusión

136

Estas reacciones secundarias de las glicosilaminas hacen que su purificación sea dificil

y, en consecuencia, se utilizan para reacciones posteriores sin previa purificación

(Manger et al, 1992; Vetter and Gallop, 1995; Bejugam and Flitsch, 2004).

La reacción de aminación selectiva sobre azúcares no protegidos utilizando

como reactivo el carbamato de amonio en metanol ha sido recientemente descripta

(Hackenberger et al, 2005) donde se mostró la aplicabilidad de esta reacción para

diferentes mono- y disacáridos. La mayor ventaja de este procedimiento es la fácil

purificación del producto de reacción. La glicosilamina formada por la reacción con el

amoníaco generado por la disociación del carbamato, precipita como la sal del ácido

carbámico en las condiciones de reacción utilizadas (Esquema IV). La formación de

esta sal previene la hidrólisis y la formación de dímeros. Finalmente, la amina libre es

obtenida por tratamiento con bases o en condiciones de alto vacío.

NH4CO2NH2 (4equiv.)

MeOHO

HO

HO

OHOH

OH

OHO

HO

OHNH2

OH

NH2N

H2N NH2

N N

OHO

HOOH

N

OH

OHO

HOOH

N

OH

OHO

HOOH

N

OH

BSA

NH2H2N

H2N NH2

H2N NH2

BSA

Buffer Fosfato 50 mM pH= 7,4

Glutaraldehído

NH4CO2NH2 (4equiv.)

MeOHO

HO

HO

OHOH

OH

OHO

HO

OHNH2

OH

NH2N

H2N NH2

N N

OHO

HOOH

N

OH

OHO

HOOH

N

OH

OHO

HOOH

N

OH

BSA

NH2H2N

H2N NH2

H2N NH2

BSA

Buffer Fosfato 50 mM pH= 7,4

Glutaraldehído

Esquema III

Precipita en metanol

O HR

H O

R

H ON H 2

N H 4 C O O N H 2

-C O 2

N H 3 N H 4C O O N H 2

-N H 3

R

H ON H 2 ·H O O C N H 2

R

H ON H 2

Esquema IV

Vacío o Bases

Resultados y Discusión

137

La unión de las glicosilaminas a las proteínas comerciales fue realizada en un

solo paso utilizando las glicosilaminas, cuando fue necesario, sin purificación previa

(Esquema III).

Las proteínas que se utilizaron fueron seroalbúmina bovina (BSA), Ubiquitina y

Citocromo C que presentan diferentes pesos moleculares y contienen una gran cantidad

de residuos básicos (Tabla VI).

Las proteínas modificadas por la incorporación de los diferentes hidratos de

carbono modificados apropiadamente fueron analizadas por EM-UV-MALDI-TOF para

determinar el número de residuos de azúcares que se unieron covalentemente. Las

muestras fueron sembradas en el portamuestras mediante el método mezcla utilizando

ácido sinapínico como matriz. Los espectros fueron obtenidos en modo lineal positivo y

la cantidad de residuos incorporados fue calculada como la diferencia de los pesos

moleculares de la proteína tratada y sin tratar dividido la masa del residuo del azúcar

utilizado (incluyendo el glutaraldehído que actúa como separador) (Salih and Zenobi,

1998; Lu and Zenobi, 2000).

La reacción fue realizada en diferentes condiciones con el objetivo de obtener

las condiciones óptimas de reacción. La reacción se llevó a cabo en buffer fosfato 0,1 M

pH 7,4 (Dhénin et al, 2007) y en consecuencia fue necesario realizar la diálisis de todas

las muestras para eliminar las sales de fosfato que interfieren en el proceso de

ionización/volatilización por UV-MALDI de las muestras (Papac et al., 1998).

Inicialmente se probaron diferentes relaciones molares de los reactivos utilizando como

proteína la seroalbúmina bovina y como azúcar la -1-O-metil-6-glucosamina (Fig. 60).

Tabla VI. Peso molecular y número de residuos básicos de las proteínas comerciales utilizadas.

Número de residuos básicos.

Arginina Lisina Histidina

Número de residuos básicos toalesa.

Peso molecular.

Ubiquitina 4 7 1 13 8564

BSA 20 55 17 93 66300

Citocromo C 2 18 3 24 12230

a Incluye el amino terminal.

Resultados y Discusión

138

La reacción se llevó a cabo durante 24 horas a temperatura ambiente con agitación

magnética constante.

A partir de los espectros obtenidos y del cálculo del número de residuos

incorporados, se corroboró que no todos los grupos básicos de la BSA están disponibles

para reaccionar con el glutaraldehído para dar lugar a la imina. Se observó que el

número de residuos incorporados está en relación con la cantidad de azúcar que se

agrega al medio de reacción, siendo menor al trabajar en presencia de cantidades más

pequeñas del azúcar como era esperable. La cantidad de glutaraldehído utilizada no

parece afectar considerablemente la tasa de reacción de los grupos básicos, ya que en

69

26

4.0

30

34

61

0.6

11

0 0

0.5

1.0

1.5

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

72

31

8.6

20

36

16

3.5

03

0 0

0.5

1.0

1.5

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

73

50

3.7

09

36

76

9.4

95

0 00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

66

43

3.7

77

33

20

7.8

12

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

BSA

BSA/Glutaraldehído/-O-metil-6-glucosaminopiranósido, 1: 10: 100 (relación molar) 27

BSA/Glutaraldehído/-O-metil-6-glucosaminopiranósido, 1: 50: 100 (relación molar) 24

BSA/Glutaraldehído/-O-metil-6-glucosaminopiranósido, 1: 50: 50 (relación molar) 11

Nro de residuos incorporados

Figura 60. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo para la seroalbúmina bovina comercial y las proteínas modificadas obtenidas luego de la reacción con-1-O-metil-6-glucosamina en diferentes relaciones molares.

Resultados y Discusión

139

Figura 61. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo de A, BSA; B, BSA + glutaraldehído + GlcNH2, 24 hs.; C, BSA + glutaraldehído + GlcNH2, 48 hs.; D, BSA + glutaraldehído + GlcNH2, 72 hs.

66

596

.52

0

333

01

.40

3

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000Inte

ns.

[a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

70

787

.92

5

354

30

.88

9

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns.

[a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

704

62

.70

1

352

01

.75

6

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [

a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

70

16

3.6

24

35

04

4.4

71

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [

a.u

.]

30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

[M+2H] ++

(m/z 33310)

[M+H] +

(m/z 66596) [M+H] +

(m/z 70787)

[M+2H] ++

(m/z 35502) [M+2H] ++

(m/z 35417)

[M+H] +

(m/z 71049) [M+H] +

(m/z 70939)

[M+2H] ++

(m/z 35430)

ningún caso se observó la completa desaparición del glutaraldehído agregado en el

medio de reacción.

A continuación se decidió determinar el tiempo de reacción óptimo para la

obtención de los conjugados de una manera reproducible. Se dejó la mezcla de reacción

manteniendo la relación molar de los reactivos en 1: 50: 50, BSA: glutaraldehído:

glucosamina, durante 24, 48 y 72 horas (Fig. 61) para determinar si la cantidad de

residuos incorporada alcanzaba un equilibrio. Los residuos incorporados en cada caso

fueron de 17, 14 y 10 respectivamente, indicando que existe un equilibrio para la

reacción y que un mayor tiempo de reacción no aumenta el número de grupos básicos

de la proteína disponibles para la condensación.

Resultados y Discusión

140

Figura 62. Espectros UV-MALDI-TOF en modo lineal positivo de los productos luego de 24 horas de reacción de acople de A, BSA + glutaraldehído + 2-GlcNH2; B, BSA + glutaraldehído + -1-O-metil-6-glucosamina; y C, BSA + glutaraldehído + 1-aminomaltosa; D, BSA + ácido 1-aminogalacturónico.

71

04

9.8

12

35

50

2.0

55

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

Inte

ns.

[a.u

.]

3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0

m /z

70

78

7.9

25

35

43

0.8

89

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

Inte

ns.

[a.u

.]

3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0

m /z

70

93

9.6

86

35

41

7.8

20

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

Inte

ns.

[a.u

.]

3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0

m /z

70787

70163

70462

0

20

40

60

80

100

Inte

ns.

[a.u

.]

000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

m/z

75008

A

B

C

D

Resultados y Discusión

141

Habiendo establecidos las mejores condiciones para llevar a cabo la reacción con

BSA como proteína, se decidió evaluar los resultados obtenidos en dichas condiciones

con diferentes ligandos. Se realizó la reacción utilizando 2-glucosamina, -1-O-metil-6-

glucosamina, 1-aminomaltosa y ácido 1-aminogalacturónico. El análisis de los

productos de reacción por EM-UV-MALDI-TOF (Fig. 62) mostró que en las mismas

condiciones de reacción se incorporaron 17, 14, 10 y 35 residuos respectivamente. Estos

resultados mostraron que la reactividad de los azúcares neutros es similar mientras que

los residuos ácidos son incorporados en mayor grado. Es interesante notar que existe

una pequeña disminución en el número de residuos del disacárido indicando la

existencia de un mayor impedimento estérico para que ocurra la reacción de

condensación.

Finalmente, se decidió ensayar la misma reacción con otras proteínas

comerciales de menor peso molecular y con un menor número de grupos básicos en las

cadenas laterales de los aminoácidos potencialmente disponibles para reaccionar. Las

proteínas ensayadas fueron ubiquitina y citocromo C. En este último caso, la relación

molar y el tiempo de reacción se mantuvieron constantes y se calcularon los residuos

incorporados para dos ligandos diferentes, -1-O-metil-6-glucosamina y 1-

aminomaltosa (Fig. 63). A partir de las señales obtenidas en modo lineal positivo para el

citocromo C y para los productos de reacción se calcularon el número de residuos

incorporados, siendo de 5 en ambos casos.

0

1000

2000

3000

Inte

ns. [

a.u.

]

000 11000 12000 13000 14000

12406.8

200

300

400

500

600

Inte

ns. [

a.u.

]

000 13000 14000 15000 16000 17000

m/z

14508.9

400

600

800

1000

1200

Inte

ns. [

a.u.

]

000 11000 12000 13000 14000 15000

m/z

13590.4

Figura 63. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo de A, Citocromo C; B, producto de reacción del acople de Citocromo C con -1-O-metil-6-glucosamina; y C, producto de reacción del acople de Citocromo C con 1-aminomaltosa.

A B C

Resultados y Discusión

142

En el caso de la Ubiquitina se decidió estudiar la reacción utilizando un azúcar

sulfatado cargado como la glucosamina-6-sulfato y se decidió realizar la reacción a

tiempos más cortos debido al menor número de grupos amino disponibles para

reaccionar que contiene la proteína. La reacción se llevo a cabo manteniendo las

relaciones molares en 1: 50: 50 y se tomaron alícuotas a 0, 5, 15 y 50 minutos. Luego de

dializar las muestras se analizaron por EM-UV-MALDI-TOF (Fig. 64) y se determinó

el número de residuos incorporados que fue de 0, 5, 5 y 6 respectivamente. Estos

resultados mostraron que en aproximadamente 1 hora la reacción alcanza el equilibrio y

que no todos los grupos básicos de la proteína se encuentran disponibles para

reaccionar. En este caso, fue posible observar la señal correspondiente a la ubiquitina

sin reaccionar en todos los casos. Es interesante notar que la intensidad relativa de la

señal de la proteína tal cual va disminuyendo con el tiempo de reacción.

En resumen, fue posible determinar las condiciones óptimas para la reacción de

acople de las proteínas con los diferentes hidratos de carbono. De todas las condiciones

ensayadas se determinó que las relaciones molares óptimas fueron 1: 50: 50, proteína:

glutaraldehído: azúcar. Los resultados de la reacción que se observaron a las 24 horas se

mantuvieron aproximadamente constantes para reacciones realizadas durante períodos

de tiempos mayores, indicando que la misma alcanza una situación de equilibrio que no

se ve modificada por el paso del tiempo. Además, se determinó que en el caso de

proteínas con pocos grupos básicos disponibles para reaccionar en su estructura, el

tiempo necesario para alcanzar la situación de equilibrio es considerablemente menor,

siendo de aproximadamente una hora.

De esta manera, fue posible poner a punto un método sencillo y la

caracterización de los productos por EM-UV-MALDI-TOF para obtener

glicoconjugados con diferentes cantidades de hidratos de carbono como herramientas

para el estudio de los diferentes mecanismos en que están involucrados los hidratos de

carbono.

Resultados y Discusión

143

250

500

750

1000

1250

1500

Inte

ns. [

a.u.

]

00 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500

m/z

10097.9

8567.6

500

1000

1500

2000

2500Inte

ns. [

a.u.

]

00 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500

m/z

10344.6

8567.6

200

400

600

800

1000

1200Inte

ns. [

a.u.

]

00 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500

m/z

10109.3

8567.6 85

67.6

02

428

2.60

3

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

00 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

8567.6

Figura 64. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo de los productos de la reacción de condensación entre la ubiquitina y la glucosamina-6-sulfato a distintos tiempos. A, 0 minutos; B, 5 minutos; C, 15 minutos; y D, 50 minutos.

A

B

C

D

Resultados y Discusión

144

7.2. Caracterización de oligosacáridos provenientes de la degradación de

heparina.

Con el objetivo de obtener pequeños oligosacáridos con diferentes

estructuras para posteriormente realizar la reacción de unión a proteínas, se decidió

realizar una degradación química de la heparina comercial. La degradación de la

heparina se llevó a cabo con ácido nitroso por exactamente 5 minutos para obtener

oligosacáridos medianos. El método arrojó resultados totalmente reproducibles que

fueron controlados por análisis de los fragmentos resultantes por cromatografía de

intercambio iónico de alta resolución (HPAEC). El perfil de elución de las muestras se

mantuvo constante en experimentos sucesivos, lo que permitió purificar una pequeña

cantidad de los diferentes fragmentos (Fig. 65).

0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0 16,3 17,5 18,8 20,0 21,3 22,5 23,8 25,0 26,3 2-1

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

min

1 - 20,384

2 - 21,067

3 - 21,417

4 - 22,184

5 - 22,584

23,717

7 - 24,417

8 - 24,9509 - 25,317

26,300

1

23

45

x

x

x x

6

16,3 17,5 18,8 20,0 21,3 22,5 23,8 25,0 26,3

1 - 20,384

2 - 21,067

3 - 21,417

4 - 22,184

5 - 22,584

23,717

7 - 24,417

8 - 24,9509 - 25,317

26,300

1

23

45

x

x

x x

6 A B

t (min)

nC

Figura 65. A, Perfil de elución por HPAEC-PAD de los fragmentos de la degradación de la heparina; B, Ampliación de la zona de interés. Se analizaron las fracciones numeradas de 1 a 6. (X = fracciones no analizadas en detalle).

Resultados y Discusión

145

Las fracciones purificadas fueron posteriormente analizadas por EM-UV-

MALDI-TOF en modo negativo en diferentes condiciones de preparación de las

muestras. Se ensayaron tres matrices y las muestras fueron, en algunos casos, sembradas

en el portamuestras con al agregado de 5 mM de formiato de butilamonio, debido a que

esta descripto que el agregado de sales de amonio favorece y mejora la

desorción/ionización de las muestras (Antonopoulos et al, 2005). Debido a la naturaleza

polianiónica de los glicosamaminoglicanos la obtención de buenos espectros resulta

dificultoso. La necesidad de utilizar un método de volatilización/ionización lo

suficientemente suave para que los grupos sulfato lábiles queden retenidos en la

molécula dando lugar a buenas señales correspondientes a los iones moleculares, pero

que al mismo tiempo produzca fragmentaciones dentro de los anillos para poder

determinar la posición de los grupos sulfato es el mayor problema que hace que la

determinación estructural de este tipo de compuestos no sea, hasta el momento, un

análisis de rutina. El desarrollo de nuevas matrices en los últimos años ha convertido a

la espectrometría de masa UV-MALDI en una herramienta muy útil para su análisis

(Nonami et al., 1998; Wheeler y Harvey, 2001; Fukuyama et al., 2002). Entre las

matrices alternativas desarrolladas se encuentra el compuesto 7-amino-4-metil-

coumarín para el análisis de disacáridos monosulfato, y la combinación con 6-azo-2-

tiotimina permitió el análisis de trisacáridos y tetrasacáridos sulfatados, así como de

oligosacáridos sialilados (Dai et al., 1997). Otros autores demostraron que la utilización

de -carbolinas como matrices en modo negativo resulta muy efectiva en la detección

de especies sulfatadas. En particular las -carbolinas harmano y nor-harmano son

capaces de producir aniones a partir de polisacáridos altamente sulfatados purificados

de algas (-carragenenos), y de oligosacáridos comerciales derivados de los mismos

(Nonami, et al., 1997 y 1998; Erra-Balsells and Nonami, 2002; Fukuyama et al., 2002).

A partir de los espectros obtenidos fue posible realizar la determinación

estructural de los compuestos mayoritarios presentes en las fracciones numeradas de 1 a

6 (Fig. 65). Las fracciones marcadas con X en la figura 65 corresponden a mezclas de

compuestos no resueltas por la cromatografía de intercambio iónico. Esto se determinó

durante el análisis de dichas fracciones por EM-UV-MALDI-TOF por la presencia de

múltiples señales en la región del ión molecular del espectro.

Resultados y Discusión

146

Compuesto 1 (Esquema V)

Se determinó la estructura de este compuesto como un tetrasacárido

tetrasulfatado conteniendo un grupo N-acetilo a partir de las señales observadas

correspondientes a la sal del ión molecular conteniendo cuatro sodios y un potasio, m/z

1165.7; la sal trisódica, m/z 1104.9 y la sal monosódica, m/z 1082.9. En el esquema V

se muestran las principales fragmentaciones para el compuesto 1. En todos los casos se

utilizó la nomenclatura propuesta por Domon y Costello que se muestra en la Fig. 66

(Domon and Costello, 1988). Los fragmentos B2 y Z2 (m/z 539.9 y m/z 504.4,

respectivamente) (Fig. 67b) indican la presencia de dos grupos sulfato en cada

disacárido resultante. 0,3A3 (m/z 642.7) y 2,5A3 (m/z 656.8) (Fig. 67b) son consistentes

con la presencia de un grupo sulfato en la posición 2 de la unidad de ácido urónico

(tercer residuo desde el extremo no reductor) y en consecuencia el segundo grupo

sulfato debería estar sobre la unidad de AnhManOH, donde sería más probable que se

encuentre en la posición 6 que en la 3. La posición de los dos grupos sulfato

correspondientes al disacárido del extremo no reductor no queda inequívocamente

establecida a partir de las señales obtenidas, siendo probable que se encuentren en las

posiciones señaladas en el esquema V.

Otras señales presentes son: m/z 1040.6 (pérdida de CH2CO desde m/z 1082.9,

Fig. 67b); m/z 1003.6 (pérdida de 2SO3 desde m/z 1165.7, Fig. 67a); m/z 608.3 (3,5A3-

H2O).

OO H

O H

O H

C H 2 O H

O

O H

O H

C H 2 O H

O

O H

O H

C H 2 O H

O O

O R

Z0 Z1 Z2

C3 C2 C1

Y2 Y1 Y0

B1 B2 B3

2,5A32,4A2

0,2A1

1,5X1

Figura 66. Nomenclatura de los iones generados por la fragmentación de ologosacáridos (Domon and Costello, 1988).

Resultados y Discusión

147

Compuesto 4 (Esquema V)

Las señales a m/z 1187.8 (M-H, sal pentasódica) y m/z 1165.7 (M-H, sal

tetrasódica) pueden ser asignadas a un tetrasacárido pentasulfatado (Fig. 68a). El tiempo

de retención observado en la purificación por cromatografía de intercambio iónico es

consistente con esta estructura propuesta, al compararlo con el compuesto 1. Los

fragmentos 0,2X3 (m/z 941.7)(Fig. 68b), 2,5A3 (m/z 781.7) y 0,2A3 (m/z 731.8)(Fig. 68a)

indican que ambos residuos de ácido urónico contienen dos grupos sulfatos. La señal a

665.5

33

695.4

45

1003

.635

1165.7

76

841.3

23

1067

.624

1055

.586

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

00 600 700 800 900 1000 1100 1200

m/z

*

*

*

*

1003.6

1165.7

A

501.7

24

656.8

52

539.9

11

642.7

50

719.4

42

1040.6

10

0

1000

2000

3000

4000

5000Inte

ns. [a

.u.]

500 600 700 800 900 1000 1100 1200

m/z

*

504.4

539.9

642.7

1040.6

*

*

B

Figura 67. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 1 utilizando A, DHB como matriz; y B, DHB como matriz y con el agregado de formiato de butilamonio. Las señales marcadas con * corresponden a diferentes aductos de matriz.

Resultados y Discusión

148

Figura 68. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 4 utilizando A, DHB como matriz y B, nor-harmano como matriz. Las señales marcadas con * corresponden a diferentes aductos de las matrices.

1056

.203

731

.893

781

.764

894.

109

1005

.096

850.

924

842

.186

118

7.815

116

5.7

33

1026.

210

1012

.821

1232

.454

125

5.2

82

0

500

1000

1500

Inte

ns.

[a.u

.]

00 800 900 1000 1100 1200

m/z

* *

*

731.8

892.7 1165.7

1187.8

1056.2

781.7

A

548.4

61

733.9

26

570.6

12

756.0

95

592.7

99

778.2

94

576.6

97

800.5

32

941.6

56

965.7

626

14.

985

1008.0

07

986.3

89

0

200

400

600

800

1000

Inte

ns.

[a.u

.]

00 600 700 800 900 1000

m/z

*

548.4

733.8

941.7

592.8 576.7

965.7

986.3 1008.0

614.9

756.1

B

m/z 892.7 (Fig. 68a) correspondiente a la fragmentación 1,3A4 sugiere la presencia de un

grupo sulfato en la unidad de AnhManOH, siendo necesario que la posición 3 no se

encuentre sustituída.

Los fragmentos C2 (m/z 592.8) y B2 (m/z 576.7) (Fig. 68b) confirman la

presencia de tres grupos sulfato en el disacárido del extremo no reductor. Sin embargo,

Resultados y Discusión

149

la señal correspondiente a m/z 548.4 (Fig. 68b) puede ser asignada al fragmento Z2

conteniendo tres iones sodio, en forma análoga a lo que ocurre con el fragmento Z2 del

compuesto 1 (m/z 504.4).

Otras señales: m/z 1056.2 (M - SO3 - CO)(Fig. 68a), m/z 965.7, 986.3,

1008.0(0,2X3 - Na, - 2Na, - 3Na, respectivamente), 756.1 (1,4X2 - Na), 614.9 (C2 -

Na)(Fig. 68b).

Esquema V

HOO

COOH

HO O

OO

HO NH

OO

COOH

HO O

O

O

OH

Ac

OO

OH

SO3HSO3H

SO3H SO3H

0,3A3642

539B2

Z2 (+Na) 504

Che

2,5A3656

Compuesto 1

Fórmula química C21H41NO34S4

Peso molecular exacto = 1039.0

M + 4Na + K = 1164.9 M + 3Na = 1105.0 M + 2Na = 1083.0

HOO

COOH

HO O

OO

HO NH

OO

COOH

HO O

O

O

OH

SO3H

OO

OH

SO3HSO3H

SO3H SO3H

0,2A3 (+Na) 732

1,5A2548

0,2X3 942

C2593

1,3A48922,5A3

(+4Na) 782

1,4X2 (+K+2Na) 733

Z2 (+3Na)

548

Ch

B2577

Compuesto 4

Fórmula química C24H39NO36S5

Peso molecular exacto = 1077.0

M + 5Na = 1186.9 M + 4Na = 1164.9

Resultados y Discusión

150

Compuesto 2 (Esquema VI)

Las señales a m/z 1218.0 (M-H-H2O, sal monosódica) y m/z 1195.7 (M-H-

CH2CO, sal monosódica) sugirieron la presencia de un hexasacárido disulfatado mono-

N-acetilado. El fragmento C5-H2O (m/z 1050.3) indica que la unidad de anhidromanitol

no se encuentra sulfatada. El ión C4 (m/z 893.1) es consistente con la presencia de una

unidad de ácido urónico no sulfatado, unido directamente a la unidad de AnhManOH

Resultados y Discusión

151

Figura 69. Espectro UV-MALDI-TOF en modo lineal negativo del compuesto 2 utilizando, A, DHB como matriz, y B, nor-harmano como matriz. Las señales marcadas con * corresponden a diferentes aductos de las matrices.

0 00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

500 600 700 800 900 1000 1100 1200

m/z

491.0

519.1

729.7

751.7

773.8

790.7934.8

956.71118.8

B

68

5.9

95

66

3.8

646

53.2

85

84

2.5

97

10

50

.33

7

89

3.5

62

71

4.7

15

10

19

.20

91

04

0.2

76

10

79

.31

2

12

18

.06

4

11

95

.74

51

17

4.4

49

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [

a.u

.]

00 600 700 800 900 1000 1100 1200

m/z

* *

663.8 685.9

842.5

893.1

1018.1

1040.2

1050.3

1195.7

1218.0

A

Esquema VI

Compuesto 2

OO

COOH

HO OH

OO

HO NH

OO

COOH

HO OH

O

O

OH

SO3H

OHO

OH

HOO

COOH

HO OH

OO

HO NH

Ac

OH

SO3H

Z4841

Z3(+Na)

665

C4892

2,5X4(+2Na+K)

1017

C5(-H2O)1050

Chemical FormuExact Ma

2,5A3 (+Na) 519

2,5X5 (+Na) 1119

M + Na – CH2CO = 1195.2 M + Na – H – H2O = 1219.1

Fórmula química: C38H60N2O38S2 Peso molecular exacto: 1216.2

M + 4Na = 1506.1 M + 5Na = 1527.0

OO

COOH

HO O

OO

HO NH

OO

COOH

HO O

O

O

OH

Ac

OO

OH

HOO

COOH

HO OH

OO

HO NH

Ac

OH

SO3H

SO3H

SO3H

SO3H

2,5X5(+2Na)

1343

Y5(+4Na)1328

0,2X4(+2Na)

1165

2,5X3(+Na)

942

1,4A3548

1,4X2(+K+2Na)

733

2,5X4(+3Na)

1203

Z2(+3Na)

548

Chemical Formula:Exact Mass

Compuesto 3

Fórmula química: C40H62N2O45S4 Peso molecular exacto: 1418.2

Resultados y Discusión

152

(Fig. 69a). Por otra parte, los fragmentos 2,5X5, 2,5X4, y Z4 (m/z 1118.8, Fig. 69b, m/z

1017.1 y 841.5, Fig. 69a, respectivamente) junto con la señal a m/z 663.8 (Y3-Na-H2O,

Fig. 69a) apoyan la presencia de un grupo acetilo en la primera unidad de glucosamina

(desde el extremo no reductor) en lugar de un grupo sulfato. Por lo tanto, teniendo en

cuenta esta última señal, los dos grupos sulfatos deben estar en la otra unidad de

glucosamina. Las fragmentaciones dentro de esta GlcN (0,3A4, 3,5A4 y 1,4X2 a m/z 790.7,

729.7 y 491.0 respectivamente) apoyan la hipótesis de que los grupos sulfatos se

encuentran en el N y en la posición 6 (Fig. 69b).

Otras señales: m/z 1040.2 (m/z 1081.1 - Na, Fig. 69a); m/z 956.7 (2,5X4 - Na);

m/z 934.8 (2,5X4); 773.7 (3,5A4 - 3Na); 751.7 (3,5A4 - 2Na) (Fig. 69b); m/z 685.9 (m/z

663.8 - Na) (Fig. 69a), m/z 544.8 (3,5X2 - K); m/z 566.7 (m/z 544.8 - Na) (Fig. 69b).

Compuesto 3 (Esquema VI)

El ión molecular observado (m/z 1505.8) podría corresponder a la sal tetrasódica

de un hexasacárido tetrasulfatado, di-N-acetilado y la señal a m/z 1526.8 correspondería

al ión conteniendo cinco sodios. El fragmento 2,5X5 (m/z 1342.9) apoya esta hipótesis.

El ión Y5 (m/z 1329.0) sugiere que el estremo no reductor no se ecuentra sulfatado y el

fragmento 0,2X4 (m/z 1165.5 y m/z 1188.2 [m/z 1165.5 - Na]) indica que el grupo

sulfato no podría estar ubicado sobre el disacárido del extremo no redutor, de manera

que los cuatro grupos sulfato debería estar ubicados sobre las unidades 4-6 (Fig. 70a y

b). De manera similar, los iones m/z 1180.5 y 1204.2 corresponderían al fragmento 2,5X4

sin y con sodio. Finalmente, la señal a m/z 942.7 correspondiente al ión 2,5X3 apoya esta

asignación (Fig. 70c).

Las señales a m/z 548.1 o 548.4 (Fig. 70a y c, respectivamente) correspondientes

a la fragmentación 1,4A3, permite localizar un grupo sulfato en la posición 2 del segundo

residuo de ácido urónico (unidad 3). Este fragmento también se correlaciona con el

fragmento Z2 como se describió para el compuesto 4, compartiendo el mismo disacárido

conteniendo una unidad de anhidromanitol. El fragmento 1,4X2 (m/z 733.9, Fig. 70c) es

consistente con la presencia de un grupo sulfato en la posición 6 de la segunda unidad

GlcNAc y no en la posición 3. De esta manera, los dos grupos sulfatos restantes deben

estar ubicados sobre el disacárido reductor. La ubicación de los mismos sería en la

posición O-2 del ácido urónico y otro en la posición O-6 (o O-3) del anhidromanitol, o

los dos grupos sulfato podrían estar sustituyendo ambas posiciones del anhidromanitol

Resultados y Discusión

153

548.4

43

57

0.5

97

73

3.9

44

75

6.1

25

592.7

58

778.2

58

942

.710

0

250

500

750

1000

1250

1500

Inte

ns.

[a.u

.]

00 550 600 650 700 750 800 850 900 950

m/z

548.4

570.5

592.7

733.9

756.1

942.7

*

Figura 70. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 3 utilizando A, DHB como matriz; B, ampliación del espectro A desde m/z 1100 a 1600; y C, nor-harmano como matriz. Las señales marcadas con * corresponden a aductos de las moléculas de matriz en todos los casos.

10

04

.04

8

84

1.8

21

98

9.0

03

11

66

.50

7

13

29

.07

31

34

2.9

66

54

8.1

75

15

05

.85

9

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

Inte

ns.

[a.u

00 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500

m

*

* *

548.1 1004.0

1165.5

1329.0

1342.9

1505.8

*

A

11

66

.50

7

13

29

.07

3

11

80

.55

3

13

42

.96

6

15

05

.85

9

12

44

.33

9

14

07

.53

2

15

26

.83

4

0 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500

m

B

1180.5

1165.5

1329.0

1342.9

1407.5

1505.8 1188.2

1204.2

1526.8

1244.3

C

Resultados y Discusión

154

(en este último caso la degradación con ácido nitroso debería haber hidrolizado el sitio

de unión de la heparina conteniendo una unidad de glucosamina N,3,6-trisulfatada). No

fue posible obtener señales adicionales que permitieran la diferenciación entre estas dos

posibilidades.

Otras señales: m/z 1244.3 (m/z 1342.9 - SO3 - H2O, Fig. 70b); m/z 1407.5 (M -

SO3 - H2O, Fig. 70b); m/z 1004.0 (m/z 1165.5 - 2SO3, Fig. 70a); m/z 756.1 (m/z 733.9 -

Na); m/z 570.5 (m/z 548.4 - Na); m/z 592.7 (m/z 570.5 - Na, Fig. 70c).

Compuesto 5 (Esquema VII)

Se observó el ión molecular a m/z 1536.9 como sal disódica correspondiente a

un hexasacárido hexasulfatado y a m/z 1513.8 como la sal monosódica. A partir de los

calculos de masas realizados se determinó que no están presentes grupos acetilos pero si

se pudo determinar que ambas glucosaminas contienen grupos sulfato como N-sulfatos.

La señal a m/z 1351.2 (C5+Na-H2O) (Fig. 71a) indica que la unidad de AnhManOH

terminal no se encuentra sulfatada como ocurre en el compuesto 2. El fragmento Y3

(m/z 837.8, Fig. 71c) se corresponde con un trisacárido incluyendo al anhidromanitol

conteniendo tres grupos sulfatos. Los fragmentos C2 y 1,5A2 (m/z 593.0 y 548.0,

respectivamente, Fig. 71b) sugieren la presencia de dos grupos sulfatos adicionales

sobre el disacárido del extremo no reductor. La presencia de los grupos sulfato en la

posición 2 del ácido urónico y en la posición 6 de la N-sulfoglucosamina conforman el

disacárido más abundante dentro de los oligosacáridos de la heparina. El fragmento 3,5X2-H2O a m/z 568.1 (Fig.71b) concuerda con la presencia de un grupo sulfato en la

posición 6 de la unidad GlcNS. El grupo sulfato faltante podría estar localizado en la

posición 2 del residuo de ácido urónico o, menos probablemente, en la posición 3 de la

glucosamina. Adicionalmente, los fragmentos 0,2A3 (m/z 732.4, 754.5 y 776.7, Fig. 71b)

son similares a los obtenidos para el Compuesto 4.

Otras señales son: m/z 1337.6 (M - H - 2SO3 - H2O, sal monosódica), m/z

1196.6 (M - H - 4SO3, sal monosódica), m/z 1173.7 (M - H - 4SO3, ácido libre), m/z

1011.8 (M - H - 6SO3) (Fig. 71a), m/z 902.3 (1,4X3 - 2K - 2H), m/z 886.4 (1,4X3) (Fig.

71c), m/z 615.4 (C2 - Na) (Fig. 71b).

Resultados y Discusión

155

Figura 71. Espectro UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 5 utilizando, A, DHB como matriz, B, nor-hamano como matriz, y C, expansión del espectro mostrado en B desde m/z 800 a 940. Las señales marcadas con * corresponden a aductos moleculares de las matrices.

83

4.2

05

99

7.34

7

133

7.6

65

117

3.7

39

101

1.8

82

84

8.15

1

119

6.6

34

135

1.2

27

15

13.8

44

153

6.9

62

0

100

200

300

400

Inte

ns.

[a.u

.]

00 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500

m/z

*

*

1011.8

1173.7

1196.6

1337.6

1351.2 1513.8

1536.9

A

57

0.7

21

59

3.0

40

61

5.4

96

54

8.0

92

75

6.5

39

77

9.7

51

73

4.4

46

0

500

1000

1500

2000Inte

ns.

[a.

00 550 600 650 700 750 800

m

886

.434

902

.32

0

837

.81

5

820 840 860 880 900 920 940

837.8

886.4

902.3

548.0

568.1

593.0

615.4

732.4

754.5

776.7

B C

Resultados y Discusión

156

Compuesto 6 (Esquema VII)

En este caso no fue posible observar la señal correspondiente al ión molecular y,

en consecuencia, las asignaciones realizadas no han podido ser confirmadas. La

estructura propuesta ha sido teniendo en cuenta el orden de elución de este compuesto

Y4(+2Na) 1039

OO

COOH

HO O

OO

HO NH

OO

COOH

HO OH

O

O

OH

SO3H

OO

OH

HOO

COOH

HO O

OO

HO NH

SO3H

O

SO3HSO3H

SO3H SO3H Chemical Formula: C36H58N2O52S7Exact Mass: 1574.0

1,5X4 (+2Na) 1068

0,2X3 (+2Na) 906

0,2A3 (+2K) 786

1,5X2 (+Na) 469

2,5X2 (+Na) 578

Y3 (+Na+2K) 837

2,5A3694

SO3H

Y0243

2,5A2 (+3Na) 505

Compuesto 6

Fórmula química : C36H58N2O52S7

Peso molecular exacto : 1574.0

OO

COOH

HO OH

OO

HO NH

OO

COOH

HO O

O

O

OH

SO3H

OHO

OH

HOO

COOH

HO O

OO

HO NH

SO3H

O

SO3H

SO3H

SO3H

B5 (+Na) 1352

C2 593

SO3H

1,5A2 548

Y3 (+2K+Na) 837

3,5X2(-H2O) 568

2,5X3 (+4Na)

886

Chemical Formula: C36H58N2O49S6Exact Mass: 1494.0

Fórmula química : C36H58N2O49S6

Peso molecular exacto : 1494.0

M + 2Na – H = 1537.0 M + Na – H = 1515.0

Compuesto 5

Esquema VII

C5

(+Na-H2O) 1351

Resultados y Discusión

157

en el perfil de elución en HPAEC. Al eluir a un mayor tiempo de retención que el

Compuesto 5, el Compuesto 6 debe contener al menos siete grupos sulfatos en su

estructura. La presencia de señales correspondientes a diferentes fragmentos están de

acuerdo con la estructura del hexasacárido heptasulfatado que se muestra en el esquema.

El ión 2,5A2 (m/z 505.2, Fig. 72c) indica un ácido urónico terminal unido a una unidad

de glucosamina N,6-disulfatada. También se observaron las señales correspondientes a

los fragmentos 1,5X4 (m/z 1068.0, Fig. 72a) y Y4 (m/z 1039.6, Fig. 72b) que apoyan la

asignación realizada anteriormente. Asimismo, fue posible observar la misma

fragmentación pero con la carga negativa retenida en el otro residuo dando lugar al

fragmento B2 (m/z 599.7, Fig. 72c, m/z 665.2 sal trisódica, Fig. 70b).

Las señales correspondientes a los fragmentos 2,5X2 sal monosódica, 2,5X2 y 1,2X2

(m/z 578.4; 557.5, Fig. 72c; y 469.6, Fig. 72b, respectivamente) indican la presencia de

un grupo sulfato adicional en el disacárido del extremo reductor, teniendo en cuenta que

la glucosamina se encontraría N-sulfatada. También se observó la señal correspondiente

al fragmento Y1 (m/z 243.5) que indicaría la presencia de un residuo de anhidromanitol

sulfatado en la posición O-3 ó O-6. Por otra parte, el ión Y3 (837.3, Fig. 72c) permitió

localizar el grupo sulfato en la posición 6 de la unidad central de N-sulfoglucosamina.

Además, los dos iones provenientes de la ruptura del mismo enlace pero dejando la

carga en cada uno de los fragmentos, 0,2X3 (m/z 906.4, Fig. 72a) y 0,2A3 (m/z 786.2, Fig.

72a), permitieron establecer que la unidad central de ácido urónico se encuentra

sulfatada en la posición 2. Esta estructura se ve confirmada por la presencia de la señal a

m/z 694.3 correspondiente al fragmento 2,5A3 (Fig. 72c).

Otras señales son: m/z 707.8 (3,5A3 - Na), m/z 730.7 (3,5A3 - 2Na), m/z 808.0

(m/z 786.2 - Na) (Fig. 72a), m/z 890.6 ( m/z 1068.0 - 2SO3 - H2O), m/z 868.5 ( m/z

890.6 - Na), m/z 687.3 (m/z 868.5 - 2SO3 - Na), m/z 487.8 (m/z 665.2 - 2SO3 - H2O)

(Fig. 72b).

La optimización de la degradación con ácido nitroso, seguida de una separación

por HPAEC-PAD permitió obtener diferentes oligosacárido sulfatados a partir de la

heparina comercial de un modo rápido y sencillo. Debido a la simplicidad y bajo costo,

esta reacción podría ser una buena alternativa a las degradaciones enzimáticas para

obtener este tipo de oligosacáridos.

Resultados y Discusión

158

707.870

730.700

808.016

786.290

906.466

1068.033

0

1000

2000

3000

4000

Intens. [a

.u.]

00 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

*

*

*

*

*

786.2

707.8

730.7

808.0 905.4 1068.0

A

487.867

469.676 68

7.38

8

578.48

0

103

9.683

665

.231

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Intens. [a

.u.]

00 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

868.5

890.6

469.6 487.8

578.4

665.2

687.3

1039.6

B

*

567.5 599.7

694.3

505.2

837.3

C

0

200

400

600

Intens

. [a.u.]

00 550 600 650 700 750 800 850 900 950

m/z

Figura 72. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo correspondientes al compuesto 6 utilizando, A, DHB como matriz, B, DHB como matriz con el agregado de formiato de butilamonio, y C, nor-harmano como matriz con el agregado de formiato de butilamonio. Las señales marcadas con * corresponden a aductos de las matrices.

Resultados y Discusión

159

En este caso fue posible determinar las estructuras de seis oligosacáridos,

purificados por HPAEC-PAD, a partir del análisis por EM-UV-MALDI-TOF en modo

negativo utilizando tres matrices diferentes. La columna ProPac PA1 utilizada permite

la separación de los diferentes fragmentos en función de la cantidad de grupos

sulfato presentes en el oligosdacárido, lo que a su vez depende del tamaño del mismo.

Las fracciones analizadas en este caso consisten en tetra- y hexasacáridos, donde para

cada serie las estructuras deducidas a partir del análisis de los espectros de EM-UV-

MALDI-TOF corresponden con el orden de elución esperado, donde las especies más

sulfatadas son eluídas a mayores concentraciones de sales. Esta correlación sugiere que

los fragmentos diagnósticos no sufren una extensa desulfatación y en consecuencia fue

posible determinar el número total de grupos sulfato presentes en cada oligosacárido.

La ausencia de desulfatación se debe probablemente al alto contenido de iones sodio

presentes en la muestras adquiridos durante la etapa de purificación por HPAEC-PAD,

los cuales estabilizan los grupos sulfato previniendo la eliminación de los mismos

durante el proceso de volatilización/ionización (Tissot et al, 2007).

Se observó que el agregado de formiato de butilamonio permitió una mejor

desorción de la muestra, que se debe probablemente a una modificación en la co-

cristalización de la muestracon la matriz en el portamuestras. Al realizar los espectros

en diferentes condiciones y con el uso de distintas matrices no fue necesario un análisis

del tipo EM/EM para determinar las estructuras. Solamente en algunos casos no fue

posible determinar inequivocamente la posición de algunos grupos sulfato.

La técnica utilizada para el análisis de los oligosacáridos involucró la utilización

de varias matrices para la preparación de las muestras, sin embargo, solo fueron

necesarios los espectros obtenidos con dos matrices (DHB y nHo) para realizar la

asignación estructural de los mismos. El uso de DHB como matriz permitió la

visualización de la señal correspondiente al ión molecular en casi todos los casos. Esta

información resultó de gran utilidad para determinar el número total de grupos sulfato

presentes en cada oligosacárido. Adicionalmemente, con esta matriz fue posible

identificar l señales correspondientes a algunos iones desulfatados.

Por otra parte, el uso de nor-harmano como matriz dió como resultado la

obtención de fragmentos, que en su gran mayoría conservaron el grupo sulfato haciendo

que estos iones sean de gran importancia para la determinación de las posiciones de los

estos grupos sulfatos. En algunos casos, los espectros obtenidos utilizando nor-harmano

como matriz no resultaron de utilidad por la ausencia de las señales correspondientes a

Resultados y Discusión

160

este tipo de iones (Compuesto 1), en este caso se utilizó el agregado de formiato de

butilamonio y DHB como matriz para generar este tipo de fragmentos de interés.

Finalmente, es interesante destacar que mientras en el análisis de oligosacáridos

neutros, los iones más abundantes corresponden a las fragmentaciones de las uniones

glicosídicas (B, C, Y y Z), mientras que en el caso de los oligosacáridos sulfatados

analizados en este caso, las señales mayoritarias correspondieron a fragmentaciones

dentro de los anillos (A y X). Estas fragmentaciones claves para la asignación

estructural se vieron favorecidas con el aumento del número de grupos sulfato presentes

en la molécula. Las unidades internas de ácido urónico sulfatado en la posición 2 mostró

múltiples fragmentaciones del anillo, fundamentalmente involucrando la unión C2 – C3

(2,5X, 2,5A, 0,2A), mientras que la unidad de ácido urónico del extremo no reductor casi

no mostró fragmentaciones. Adicionalmente, las unidades de GlcNAc y GlcNS,

mostraron principalmente fragmentaciones C5 – O (2,5X, 2,5A, 1,5X, 1,5A). La

fragmentación de la unidad de anhidromanitol solo se detectó en el caso del Compuesto

4 (1,3A4).

Aunque todavía son necesarios nuevos estudios para que el análisis glicólico de

este tipo de compuestos sea un análisis de rutina, este trabajo presenta una forma simple

de obtención y análisis de oligosacáridos estructuralmente definidos. Esta metodología

podría resultar de interés para el estudio de otras glicoproteínas de origen natural.

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

161

Reactivos y equipamiento utilizado

En todos los casos se utilizaron solventes de grado analítico o similar. Se utilizó

agua deionizada grado MilliQ (resistividad 18,2MTodos los reactivos fueron de grado de pureza analítica.

Los anticuerpos anti-GCS humana fueron gentilmente cedidos por los Drs.

Marks y Pagano de la Mayo Clinic and Foundation, U.S.A. Los anticuerpos fueron

obtenidos a partir de la inmunización de conejos con péptidos sintéticos basados en la

secuencia de aminoácidos predicha para la enzima humana. Para este trabajo se

emplearon dos anticuerpos que reconocen diferentes regiones de la proteína. El

anticuerpo 1.2 reconoce una zona cercana al extremo C-terminal, mientras que el

anticuerpo 5.1 reconoce una región del extremo N-terminal de la proteína.

Materiales y Métodos

162

Cultivo de Plasmodium falciparum

Las formas intraeritrocíticas del clon 3D7 de Plasmodium falciparum se

cultivaron en botellas de cultivo (75 cm2) conteniendo medio RPMI 1640 suplementado

con 25 mM Hepes, 21 mM bicarbonato de sodio, 370 M hipoxantina, 11 mM glucosa,

40 g/ml gentamicina y 10% (v/v) de suero humano, donde se agregaron glóbulos rojos

humanos de tipo O+ lavados hasta una concentración del 5%. Los cultivos se incubaron

a 37ºC bajo una atmósfera controlada conteniendo 5,05% CO2, 4,93% O2 y 90,2 N2 con

cambios diarios del medio de cultivo (Trager and Jensen, 1976; Kimura et al., 1996). El

crecimiento y multiplicación de los parásitos fue monitoreado por observación al

microscopio de muestras teñidas con Giemsa. Estos cultivos fueron realizados en la

Universidad de San Pablo, Brasil.

Purificación de los diferentes estadios intraeritrocíticos

Los parásitos fueron cosechados y los diferentes estadios intraeritrocíticos

fueron purificados por centrifugación a 15000 g en un gradiente discontinuo 40/70/80 %

de Percoll durante 30 minutos a 25ºC. Luego de la centrifugación se separaron las

diferentes fracciones, la banda superior (40%) que contiene los esquizontes, una banda

intermedia (interfase 70-80%) que contiene los trofozoítos y el precipitado que contiene

los estadios anillos (Braun-Breton et al., 1986).

Preparación de los complejos NBD-dihidroceramida, NBD-ceramida y NBD-

esfingomielina con seroalbúmina bovina

Cada uno de los esfingolípidos comerciales marcados con el grupo fluorescente

nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD) se disolvieron en cloroformo: metanol, 1:2, v/v,

hasta una concentración final de 1g/l. Se tomaron 50 l de dicha solución y se

secaron bajo corriente de N2, seguido de 30 minutos en desecador con vacío. Luego se

redisolvieron en 20 l de etanol y esta solución se agregó muy lentamente y con

agitación continua a 166 l de una solución 0,5 mM de seroalbúmina bovina (BSA)

Materiales y Métodos

163

delipidizada en buffer Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 obteniendose una solución de NBD-

esfingolípido/BSA de concentración 0,5 mM (Marks et al., 2000)

Incorporaciones metabólicas en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium

falciparum

Incorporación de sustratos fluorescentes

Se realizaron incorporaciones metabólicas de NBD-dihidroceramida, NBD-

ceramida y NBD-esfingomielina. Los diferentes NBD-esfingolípidos, previamente

acoplados a seroalbúmina bovina, fueron agregados a los cultivos de los parásitos en

una concentración de 5 M en medio RPMI 1640. Los parásitos fueron marcados por 24

horas y luego se cosecharon. Posteriormente se purificaron los diferentes estadios

intraeritrocíticos, como se detalló anteriormente y se analizaron los esfingolípidos.

Paralelamente se realizaron, como controles, las mismas incorporaciones en un número

equivalente de glóbulos rojos no infectados que fueron procesados de igual manera.

Incorporaciones de precursores radioactivos

Se realizaron incorporaciones de [U-14C]-ácido palmítico, D-[U-14C]-glucosa y

Na235SO4.

El [U-14C]-ácido palmítico (Amersham, 822 mCi·mmol-1, 2.91 mCi·mg-1),

originalmente disuelto en tolueno se llevó a seco con N2, se redisolvió en etanol y se

acopló con seroalbúmina bovina delipidizada en una relación molar 1:1, como se

describió anteriormente. Los parásitos (5.7% anillos, 5.7% trofozoitos, 4% esquizontes)

fueron incubados durante 18 horas en medio de cultivo RPMI 1640 conteniendo 6.25

Ci/ml del precursor radioactivo, 0,5% Albumax y 0,05% seroalbúmina bovina.

La D-[U-14C]-glucosa (Amersham, 291 mCi·mmol-1, 1,54 mCi·mg-1) fue

incorporada en una concentración de 6,25 mCi/ml en medio RPMI 1640 sin el agregado

de glucosa (Uhrig et al, 1996). Los parásitos (5.9% anillos, 5.4% trofozoítos, 3.7%

esquizontes) fueron incubados en estas condiciones por 18 horas.

Materiales y Métodos

164

El Na235SO4 (Amersham, 1 mCi·mmol-1, 2.2 mCi·ml-1) fue incorporado en una

concentración final de 12,5 mCi/ml en medio RPMI 1640. Los parásitos (6.3% anillos,

7.3% trofozoítos, 4.6% esquizontes) fueron incubados durante 18 horas.

En todos los experimentos, la viabilidad de los parásitos fue verificada por

evaluación en el microscopio de muestras teñidas con Giemsa. Luego de las

incorporaciones, los diferentes estadios intraeritrocíticos fueron purificados como se

describió previamente.

En todos los casos, se realizaron incorporaciones metabólicas de los diferentes

precursores radioactivos de muestras de igual número de glóbulos rojos no infectados

como control.

Ensayos con inhibidores en cultivos de Plasmodium falciparum

Se realizaron ensayos de incorporaciones metabólicas en presencia y ausencia de

dos inhibidores conocidos del metabolismo de esfingolípidos en mamíferos,

DL-threo-1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (PPMP) (Matreya) y 2-[4-

[(Z)-1,2-difenilbut-1-enil]fenoxi]etil-dimetilazanio (Tamoxifeno) (Gador). En este caso

se realizaron los tratamientos con los inhibidores previamente a la incorporación de los

precursores marcados. Los inhibidores fueron agregados a los cultivos de los parásitos

en una concentración final de 10M en medio RPMI. Luego de 24 horas de incubación

se agregaron al medio de los cultivos los diferentes precursores marcados y se

incubaron durante 24 horas más antes de la cosecha y purificación de los diferentes

estadios.

Determinación de la IC50 del tamoxifeno en cultivos de Plasmodium falciparum

Se utilizaron diluciones de tamoxifeno a partir de una solución madre en etanol

(10 mM). Los ensayos fueron llevados a cabo en microplacas de cultivos de fondo plano

según el método propuesto por Desjardins et al. para determinar la concentración que

produce el 50% de inhibición en el creciemiento. Los valores de IC50 fueron calculados

por análisis probit (Minitab Statistical Software 13.30 TM; Minitab Inc.).

Materiales y Métodos

165

Cultivo de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, cepas Tulahuen 2 y CL Brener

Las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi fueron cultivadas durante 10

días a 28ºC en un medio bifásico axénico en erlenmeyers de 250 ml. El medio bifásico

consta de una fase sólida constituída por 3% de agar nutritivo (Difco), esterilizado por

autoclave durante 20 min a 1 atmósfera de presión, y 2% de sangre desfibrinada de

conejo y una fase líquida constituída por 3,7% de infusión cerebro-corazón (Difco)

(Cazzulo et al., 1985).

Los parásitos se cosecharon por centrifugación a 7000 rpm y se lavaron 2 veces

con buffer fosfato salino.

Estos cultivos fueron realizados en el Instituto Nacional de Parasitología Mario

Fatala-Chaben, ANLIS-Malbran, Min. de Salud, Buenos Aires, Argentina.

Incorporaciones metabólicas en epimastigotes de Trypanosoma cruzi

En el día 6, los cultivos de epimastigotes de Trypanosoma cruzi se traspasaron a

medio líquido suplementado con 10% de suero fetal bovino y se agregó la NBD-

ceramida o la NBD-dihidroceramida previamente acopladas a BSA en una

concentración final de 5 M. Posteriormente los parásitos se cosecharon como se

describió anteriormente.

Ensayos con inhibidores en cultivos de Trypanosoma cruzi

Se realizaron ensayos de incorporaciones metabólicas en presencia y ausencia de

dos inhibidores conocidos del metabolismo de esfingolípidos en mamíferos, DL-threo-1-

fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (PPMP) (Matreya) y 2-[4-[(Z)-1,2-

difenilbut-1-enil]fenoxi]etil-dimetilazanio (Tamoxifeno) (Gador). En este caso, los

parásitos fueron traspasados a medio líquido suplementado con 10% de suero fetal

bovino el día 5, donde se agregaron los inhibidores en una concentración final de 10M.

Materiales y Métodos

166

Luego de 24 horas se agregaron los esfingolípidos fluorescentes y los parásitos se

cosecharon el día 7 como se describió anteriormente.

Extracción y purificación de los esfingolípidos marcados

Extracción de los lípidos

Luego de las incorporaciones metabólicas, los parásitos fueron liofilizados. Los

lípidos fueron extraídos con cloroformo: metanol, 2:1, v/v (2 veces), y posteriormente

con cloroformo: metanol, 1: 2, v/v (2 veces). Los extractos se juntaron y se secaron bajo

corriente de N2.

Cromatografía de intercambio aniónico

Las muestras conteniendo los lípidos fluorescentes fueron disueltas en una

mínima cantidad de cloroformo: metanol: agua (30:60:8, v/v/v) y se fraccionaron por

intercambio aniónico utilizando una columna de DEAE-Sephadex A-25 (forma acetato)

(1,3 x 5 cm), previamente equilibrada en el mismo solvente. Los lípidos neutros y

zwiteriónicos fueron recuperados en la primera fracción utilizando como solvente

cloroformo: metanol: agua (30:60:8, v/v/v). Los lípidos ácidos fueron eluídos con

cloroformo: metanol: 0,8M acetato de sodio, (30: 60: 8, v/v/v). Ambas fracciones

fueron llevadas a seco por evaporación a presión reducida.

La fracción de los lípidos ácidos fue posteriormente desalada utilizando una

columna pre-armada de fase reversa RP-18 (Supelco). Para ello, la muestra fue disuelta

en agua y aplicada sobre la columna previamente equilibrada en agua. La columna se

eluyó con 5 volúmenes de agua para eliminar las sales y luego se recuperaron los lípidos

con 5 volúmenes de metanol seguidos de 5 volúmenes de metanol: cloroformo, 1:1, v/v.

Las fracciones conteniendo los lípidos se juntaron y se evaporó el solvente a presión

reducida.

Materiales y Métodos

167

Saponificación

Las muestras de lípidos provenientes de las incorporaciones con los precursores

radioactivos fueron tratadas con 0,1M NaOH en metanol (500l) durante 3 horas a

37ºC. Las mezclas fueron neutralizadas con HCl 1M en presencia de 50 l de buffer

fosfato 50 mM pH 7 para evitar la sobreacidificación. Luego de la evaporación del

solvente por destilación a presión reducida, se eliminaron las sales por cromatografía en

fase reversa utilizando columnas pre-armadas (Supelco) como se describió

anteriormente.

Ensayo de actividad de la glucosilceramida sintasa (GCS)

La reacción de actividad de la enzima GCS fue realizada en buffer Tris-HCl 50

mM, pH 7,4, conteniendo 25 mM KCl, 5 mM MnCl2, 0,1% Chaps, 2 mM -NAD, 2,5

mM UDP-Glucosa y 5 nmoles de NBD-ceramida o NBD-dihidroeramida (Sigma)

conjugada con seroalbumina bovina como sustrato en un volumen final de reacción de

200 l. Luego de 60 minutos de incubación a 37ºC la reacción se detuvo por

enfriamiento y se extrajeron los lípidos por agregado de 1,2 ml de cloroformo: metanol,

1:1, v/v y 0,52 ml de solución ácida salina (0,9% NaCl y 15mM HCl). La fase orgánica

se separó y se eliminó el solvente bajo corriente de N2 (Futerman and Pagano, 1991;

Paul et al., 1996). Los lípidos se resuspendieron en 30 l de cloroformo: metanol, 1:1,

v/v y se analizaron por cromatografía en capa delgada.

Cromatografía en capa delgada

Para el análisis de los esfingolípidos se utilizaron placas de silica gel- 60 sin

indicador (Merk). Como solventes de desarrollo se utilizaron: Sistema A: cloroformo:

metanol: agua, (40:10:1, v/v/v); Sistema B: cloroformo: metanol: agua, (65:25:4, v/v/v);

Materiales y Métodos

168

Sistema C: propanol: amoníaco: agua, (75:5:5, v/v/v); Sistema D: cloroformo: hexano:

tetrahidrofurano: isopropanol: metanol: agua, (35:35:0,35:40:5:4, v/v/v/v/v/v).

Los esfingolípidos fluorescentes fueron visualizadas utilizando un analizador de

imágenes FujiFilm Las1000 equipado con una Intelligent Dark Box II y un software

FujiFilm Las1000pro.

En el caso de las muestras conteniendo esfingolípidos marcados

radioactivamente, las mismas fueron reveladas por fluorografía a -70ºC utilizando

EN3HANCE (NEN) y radiografías Kodak X-OMAT AR.

Cromatografía en capa delgada en fase reversa

Para el análisis de los esfingolípidos en fase reversa se utilizaron placas de silica

gel 60 RP-18 (Merk). Como solventes de desarrollo se utilizaron metanol: agua (90:10,

v/v) (Sistema E) y acetonitrilo: ácido acético (1:1, v/v) (Sistema F).

Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

Las muestras de esfingolípidos provenientes de las incorporaciones metabólicas

se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución utilizando un equipo Waters

600 equipado con un detector de fluorescencia Waters 2475, Multi Fluorescence

Detector.

Para el análisis se utilizó una columna de fase reversa RP-18 (Supelco, 5m) y

como fase móvil se empleó metanol: agua, 9:1, v/v, con un flujo de 0,5 ml/min. La

longitud de onda de excitación del detector fue fijada en 465 nm y la de emisión en 530

nm. El volumen de inyección de cada muestra fue de 20 l. Se utilizaron patrones de

NBD-ceramida, NBD-dihidroceramida, NBD-glucosilceramida, NBD-lactosilceramida

y NBD-esfingomielina.

Materiales y Métodos

169

Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-galactosil (NBD-DHGalCer)

y N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-glucosil (NBD-DHGlcCer)

La -D-galactosilesfingosina o la -D-glucosilesfingosina fueron hidrogenadas

en metanol bajo atmósfera de hidrógeno (30 psi) a temperatura ambiente en presencia

de 10% de catalizador de Pd/C en un hidrogenador Parr. La reacción fue monitoreada

por cromatografía en placa delgada. La reacción fue completa luego de 2 horas. La -D-

hexosilesfinganina obtenida fue posteriormente N-acilada por reacción con el derivado

N-succinimidil del ácido C6-NBD (ácido (6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-

il)amino)hexanoico)) (Molecular Probes, Eugene, OR) en dimetilformamida y di-

isopropilamina. La reaccion de amidación fue llevada a cabo en la oscuridad a 30ºC

durante 48 horas (Schwarzmann et al, 1987). Los productos de reacción fueron

purificados por cromatografía en capa delgada preparativa utilizando como solvente de

desarrollo cloroformo: metanol: agua (40: 10: 1, v/v/v). Las NBD-

hexosildihidroceramidas fueron eluídas de la placa utilizando metanol que fue luego

eliminado por evaporación bajo corriente de N2.

Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfingosina--D-galactosil-3-sulfato (NBD-

Sulfátido)

A partir de una muestra comercial de sulfátidos (Sigma) se realizó la de N-

deacilación de los mismos por tratamiento con KOH 1M en metanol bajo atmósfera de

nitrógeno durante 18 horas. La mezcla de reacción se neutralizó con ácido acético 2N y

se secó bajo corriente de N2. El curso de la reacción se siguió por CCD utilizando como

solvente n-propanol: amoníaco: agua (75: 5: 5, v/v/v). Las placas se revelaron con

H2SO4 10% en etanol y con ninhidrina 2% en acetona (Neuenhofer et al, 1985).

El liso-sulfátido obtenido fue posteriormente N-acilado utilizando el derivado N-

succinimidil del ácido C6-NBD (ácido (6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-

il)amino)hexanoico)) (Molecular Probes, Eugene, OR) como se describió anteriormente.

Materiales y Métodos

170

Inmunofluorescencia indirecta

Para los estudios de inmunofluorescencia indirecta se prepararon láminas finas

sobre portaobjetos de vidrio de eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum que se

fijaron con metanol durante 1 minuto a -20ºC. Las muestras fueron luego bloqueadas

con TBS conteniendo 3% de BSA durante 30 minutos e incubadas con el anticuerpo de

conejo anti–GCS humana en una dilución 1:50. Posteriormente, la muestra se incubó

con el segundo anticuerpo, anti–conejo conjugado con rodamina en una dilución 1:200.

Para la marcación de las diferentes estructuras intracelulares se utilizaron

marcadores comerciales: Tracker Blue White (THG, Molecular Probes) como marcador

de la estructura del tipo Golgi y retículo endoplásmico ya que reconoce a la ATPasa del

parásito e ioduro de propidio (DAPI, 4',6-diamidino-2-fenilindol) como marcador del

núcleo debido a su capacidad de unión con el ADN.

Las células fueron iluminadas con un láser de argón de 488 nm para la

excitación de la rodamina y un láser de helio-neón de 543 nm para la excitación de los

marcadores utilizados. La emisión de fluorescencia fue colectada con filtros de 560 nm

para rodamina y 505 – 530 nm para THG y DAPI.

Las imágenes fueron realizadas con un objetivo 40x con un microscopio

confocal de fluorescencia LSM 510 Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss, Germany)

equipado con el software LSM 510 versión 2.5.

Microscopia electrónica

La localización intracelular de la enzima GCS en Trypanosoma cruzi, formas

epimastigote, se determinó por inmunomicroscopía electrónica. En este caso, se

cosecharon los parásitos por centrifugación y se lavaron con buffer fosfato salino. Los

parásitos fueron fijados por inmersion en paraformaldehido 4%, glutaraldehido 0,25%

en buffer fosfato 0.1M, pH 7,5, durante 24hs.

Los bloques fueron lavados con sacarosa al 10% en el mismo buffer y

deshidratados por inmersión en soluciones de alcohol etílico 50 % y 70%

sucesivamente. Se realizaron 3 cambios de 20 minutos cada uno a 4º C y luego se

sumergieron en resina pura LR White resin monomer (48hs a 50ºC).

Materiales y Métodos

171

Posteriormente se realizaron cortes para obtener secciones ultrafinas que fueron

levantadas en grillas de niquel de 300 mesh e incubadas en una solución bloqueante de

suero normal de cabra 3% en buffer Tris-HCl salino 0,05M, pH 7,8, conteniendo 1%

seroalbúmina bovina y 0,05% Tween 20 durante una hora. Luego se incubaron en

paralelo diferentes secciones con los anticuerpo anti-GCS humana 1.2 y 5.1 en una

dilución 1: 500 en el buffer bloqueante durante 24 hs a 4ºC. Las secciones fueron

lavadas con el mismo buffer realizando 6 cambios de 2 minutos cada uno y

posteriormente incubadas con el anticuerpo secundario, anti-conejo acoplado a

partículas de oro de 10 nm o 5 nm, en una dilución 1:50 durante 1 hora a temperatura

ambiente. Finalmente, las secciones fueron lavadas y contrastadas en acetato de uranilo

al 0,5% y solución de Reynolds.

Las imágenes fueron obtenidas utilizando un microscopio electrónico Siemens

Zeiss C10 (Siemens, Germany) y las fotografías fueron tomadas utilizando una película

Kodak electron imaging film (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).

Fraccionamiento subcelular de Trypanosoma cruzi

Los parásitos se cosecharon y se lavaron con TBS y se resuspendieron en

solución de sacarosa 0,25M, KCl 1mM y EDTA 1mM. La suspensión se homogeneizó

en un mortero con carburo de silicio y luego se centrifugó a 500 rpm a 4ºC durante 10

minutos para eliminar las células enteras y el carburo de silicio. Las fracciones

subcelulares se obtuvieron luego por centrifugación diferencial: fracción nuclear

(sedimentada a 1000 g durante 10 minutos), gránulos grandes (5000 g, 10 minutos),

gránulos pequeños (14500 g, 10 minutos), fracción microsomal (100000 g, 60 minutos)

y fracción soluble (sobrenadante final) (Duschak and Cazzulo, 1991).

Materiales y Métodos

172

Purificación de inmunoglobulinas G presentes en un suero de conejo anti-GCS-

humana

Las inmunoglobulinas G (IgG) anti-GCS humana 1.2 fueron purificadas a partir

de un suero anti-GCS humana desarrollado en conejo. Para ello se realizó primero una

precipitación con sulfato de amonio al 33% a temperatura ambiente y luego se

centrifugó por 15 minutos a 15000 rpm a 25ºC. El precipitado obtenido se redisolvió en

buffer fosfato 0,1M, pH 8 y se dializó contra buffer fosfato 0,1M, pH 8 durante toda la

noche a 4ºC.

Posteriormente las IgGs fueron purificadas a través de una columna de Proteína

A-Sepharosa 4B Fast Flow (Sigma) previamente estabilizada en el mismo buffer

fosfato. La muestra se sembró a 20 ml/hora, se lavó con buffer fosfato 0,1M, pH 8 y

luego se eluyeron las IgGs con buffer citrato 0,1M pH 3,5. Se recolectaron fracciones de

1 ml sobre 0,4 ml de buffer Tris-HCl 0,5M, pH 8,5. Se leyó la absorbancia a 280 nm y

se juntaron las fracciones de absorbancia mayor de 0,2 (Lindmark, 1983).

Acoplamiento de las inmunoglobulinas G purificadas a Sepharosa 4B activada

con bromocianógeno

Las IgGs previamente purificadas se disolvieron en NaHCO3 0,1M, pH 8,3 con

0,5M de NaCl (Buffer de acople) y se mezclaron con la Sepharosa 4B previamente

lavada con HCl 0,1M y estabilizada en el mismo buffer de acople. Se utilizaron

aproximadamente 5-10 mg de ligando por ml de matriz y se agitó cabeza-cola durante

60 minutos a temperatura ambiente.

Una vez realizado el acople se recuperó el sobrenadante y se lavó la matriz

acoplada con buffer Tris-HCl 0,1M pH 8 y tres ciclos consecutivos de pH alternado

(Buffer acetato 0,1M pH 4 con 0,5M NaCl y Buffer Tris-HCl 0,1M con 0,5M NaCl)

(Richard et al, 2004).

Materiales y Métodos

173

Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum

Las formas esquizonte purificadas por gradiente de Percoll, como se describió

anteriormente, se resuspendieron en buffer estabilizante con inhibidores de proteasas

(Buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 100mM KCl, 20% glicerol, 10 g/ml

Aprotinina, 10g/ml Leupeptina, 10 g/ml TAME, 1g/ml Antipaína, 1g/ml

Pepstatina y 25 M APMSF). Los parásitos se lisaron por 3 ciclos de sonicación en

baño de hielo por 2 minutos y luego se centrifugó la muestra 2 minutos a 7000 g para

eliminar los restos de células enteras. El sobrenadante obtenido se aplicó en una

columna conteniendo 1ml de Sepharosa acoplada con las IgGs anti-GCS humana

previamente equilibrada con buffer Hepes 50mM pH 7,4 con 0,5M NaCl. La muestra se

dejó interactuar con la fase de la columna durante toda la noche a 4ºC. Luego se lavó la

columna con el mismo buffer. Como buffer de elución se utilizó buffer Hepes 50mM

pH 7,4 conteniendo 2M de MgCl2. Se recolectaron fracciones de 2 ml que fueron luego

dializadas contra buffer Hepes 5 mM pH 7,4 y posteriormente concentradas por

liofilización (Marks et al., 1999).

Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a colorantes

Las formas esquizonte purificadas por gradiente de Percoll, como se describió

anteriormente, se resuspendieron en buffer estabilizante con inhibidores de proteasas

(Buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 100 mM KCl, 20% glicerol, 10 g/ml

Aprotinina, 10 g/ml Leupeptina, 10 g/ml TAME, 1g/ml Antipaína, 1g/ml

Pepstatina y 25 M APMSF). Los parásitos se lisaron por 3 ciclos de sonicación en

baño de hielo por 2 minutos y luego se centrifugó la muestra 2 minutos a 7000 g para

eliminar los restos de células enteras. La muestra se aplicó con un flujo de 20 ml/hora

en una columna de Green Dye-Agarosa (Sigma) de 2 ml equilibrada con buffer Hepes

50mM pH 7,4. El procedimiento se repitió 3 veces con el material que no interaccionó

con la fase y luego se lavó con 5 volúmenes de buffer Hepes 50mM pH 7,4.

Posteriormente se realizó una elución secuencial con buffer Hepes 50mM pH 7,4

conteniendo 0,15M KCl (10 volúmenes), buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo

Materiales y Métodos

174

20mM UDP-Glucosa y 20mM -NAD (5 volúmenes) y buffer Hepes 50mM pH 7,4

conteniendo 1M KCl (5 volúmenes). Las distintas fracciones se dializaron contra buffer

Hepes 5 mM pH 7,4 y se concentraron por liofilización (Paul et al., 1996).

Materiales y Métodos

175

Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi

Obtención de una fracción enriquecida en membranas

La ruptura de los parásitos se realizó por 3 ciclos de congelado a -20ºC –

descongelado a temperatura ambiente, siendo el último paso de congelado de más de 12

horas luego del cual los parásito se descongelaron y resuspendieron en una solución de

Sacarosa 0,25M, KCl 5 mM en una concentración aproximada de 10 g de parásitos por

cada 25 ml de solución. El homogenato resultante se centrifugó a 7000 rpm durante 10

min a 4ºC. El sobrenadante se separó y el precipitado se solubilizó con otro volumen de

la solución de sacarosa y se volvió a centrifugar a 12000 rpm durante 10 min a 4ºC. El

precipitado obtenido constituye la fracción enriquecida en membrana (Cazzulo et al.,

1985).

Precipitación con sulfato de amonio

La fracción enriquecida en membrana se resuspendió en buffer Tris-HCl 50 mM,

pH 7,4, conteniendo 100 mM KCl, 10 g/ml Aprotinina, 10 g/ml Leupeptina, 10

g/ml TAME, 1 g/ml Antipaína, 1 g/ml Pepstatina y 25 M APMSF, se sonicó

durante dos 2 min en baño de hielo y se centrifugó a 10000 rpm durante 15 min a 4ºC.

Se separó el sobrenadante y se repitió el procedimiento dos veces más juntando los tres

sobrenadantes obtenidos. Esta fracción se precipitó con una solución saturada de sulfato

de amonio pH 7 que se agregó gota a gota, con agitación en baño de hielo hasta alcanzar

un 50% de saturación. La suspensión se centrifugó a 15000 rpm, 15 min a 4ºC y el

precipitado obtenido se disolvió en buffer Tris-HCl 50mM pH 7,4 y se dializó contra el

mismo buffer, realizando varios cambios durante toda la noche. (Cazzulo et al., 1989)

Ultracentrifugación

El extracto obtenido se llevó a una concentración final de proteínas de

aproximadamente 1g/l por agregado de buffer Tris-HCl 50mM pH 7,4 conteniendo

Materiales y Métodos

176

20% glicerol, 0,02% azida sódica, 1% Chaps, y 1mM DTT (Buffer B) con el agregado

de 1mM UDP-Glucosa, para solubilizar las enzimas de membranas. Luego de agitar

durante una hora a 4ºC se realizó una ultracentrifugación a 100000g a la misma

temperatura durante 60 minutos utilizando una Ultracentrifuga Beckman XL-90, con un

rotor SWSS Ti, reservándose el sobrenadante obtenido para continuar con la

purificación (Paul et al., 1996).

Cromatografía de afinidad a colorantes

Se realizaron dos cromatografías secuenciales de afinidad a colorantes. En un

primer paso la muestra se aplicó en una columna de Green Dye-Agarosa (Sigma) de

1x15 cm previamente equilibrada con Buffer B suplementado con 1mM UDP-Glucosa.

Se recolectó la fracción de la muestra que no interaccionó con el colorante.

Para poder continuar con la purificación fue necesario separar la UDP-Glucosa

de la muestra por cromatografía de exclusión de tamaño en un BioGel P2 (BioRad)

equilibrado en el buffer B. La separación se realizó utilizando una columna de 1x4 cm

empacada por centrifugación a 500 rpm durante 2 minutos. La muestra fue aplicada y se

recuperaron las fracciones realizando centrifugaciones de 1 minuto a 300 rpm. Las

fracciones correspondientes al V0 se juntaron y se dializaron contra el mismo buffer

diluido 5 veces y luego se concentraron por liofilización.

Para la segunda columna de afinidad se utilizó una columna de 1,4 x 4 cm

conteniendo 5 ml de Green Dye-Agarosa equilibrada en buffer B. Luego de aplicar la

muestra, la columna se lavó con 5 volúmenes de buffer B y posteriormente se eluyó

secuencialmente con 10 volúmenes de buffer B conteniendo 0,15M KCl, 7 volúmenes

de buffer B conteniendo 20mM UDP-Glucosa y 20mM -NAD y finalmente con 7

volúmenes de buffer B conteniendo 1M KCl (Paul et al., 1996).

Las diferentes fracciones obtenidas se lavaron y concentraron por ultrafiltración

utilizando filtros de tamaño de corte de 50kDa (Centriprep, Millipore).

Materiales y Métodos

177

Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida

discontinuos de 7,5; 10 o 12 % (de acuerdo al rango de resolución deseado) en

condiciones desnaturalizantes (Laemli et al., 1969).

Las muestras se disolvieron en buffer de siembra, se hirvieron a 100 °C durante

3 min y se sembraron. Los geles se corrieron a un voltaje constante de 110 volts. La

estimación de los pesos moleculares se realizó haciendo referencia a los patrones de

peso molecular comerciales (Bio-Rad) corridos en paralelo.

Revelado con Nitrato de Plata

Luego de la separación, los geles se fijaron con una solución de metanol: ácido

acético: agua (25:5:20, v/v/v) durante 10 min, se pasó a una solución de metanol: ácido

acético: agua (3,5:2,5:44) durante 10 min y se lavó luego con abundante agua

deionizada durante 10 min. A continuación se incubó con una solución de

Glutaraldehído 10% durante 15 min. Se descartó la solución y se lavó con abundante

agua deionizada durante 40 min, haciendo varios cambios. Se agregó el reactivo de

plata, recién preparado, se incubó 10 min, se descartó y nuevamente se lavó con agua

deionizada durante 5 min. Se incubó con la solución reveladora hasta la aparición de

manchas de la intensidad deseada y el revelado se detuvo por agregado de una solución

de ácido acético 10%.

- Reactivo de Plata: 1 ml de NH3 se mezcló con 1 ml de NaOH 1M, se llevó a 10 ml con

agua deionizada y se tituló, gota a gota y con agitación magnética, con 2 ml de solución

acuosa de nitrato de plata 20 % recién preparada. Se llevó a 50 ml finales con agua

deionizada.

- Revelador: 25 μl de formaldehído 37 % se mezclaron con 50 μl de ácido cítrico (50

mg/ml) y se llevaron a 50 ml con agua deionizada.

Materiales y Métodos

178

Ensayos de transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y reacción

con antisueros (Western Blot)

Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron electrotransferidas a membranas

de nitrocelulosa (Amersham Biosciences) durante 45 min a 300 mA en buffer Tris-

Glicina, metanol 20 %.

Para el revelado, las membranas se bloquearon durante 30 min con TBS-leche

descremada 3 % y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente con los

anticuerpos específicos, anti-GCS humana, en una dilución 1:500. Luego se lavaron con

TBS, 2 veces por 10 minutos y una vez con TBS con 0,05% NP-40. Posteriormente las

membranas fueron incubadas con anticuerpos anti-conejo acoplados a peroxidasa en una

dilución de 1:50000 por 60 minutos a temperatura ambiente. El revelado se realizó

utilizando el reactivo ECL (Amersham Biosciences) en un analizador de imágenes

FujiFilm Las1000.

Materiales y Métodos

179

Cuantificación de proteínas

Método de Bradford

Se utilizó la técnica en microescala, para la cuantificación de proteínas en

solución. Las muestras se llevaron a 500 μl con agua, se agregaron 500 μl del reactivo

comercial Bradford (BioRad), se agitó y determinó la absorbancia a 595 nm. Para la

curva de calibración se utilizaron diluciones de una solución madre de BSA 1 mg/ml

(Bradford, 1976).

Método de Lowry

Cada muestra se llevó a 200 μl con agua, se le agregó 1ml de la solución de

trabajo, se agitó y dejó reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se

agregaron 100 μl del reactivo de Folin 1N (Sigma), se agitó e incubó en oscuridad

durante 40 min. La absorbancia se determinó a 750 nm. La curva de calibración fue

realizada utilizando diluciones de una solución patrón de BSA 1mg/ml (Lowry et al.,

1951).

-Solución de trabajo: esta solución se realiza en el momento de usar mezclando 20 ml

de solución A (Carbonato de sodio 2 % en NaOH 0,1 N) con 0,4 ml de solución B

(sulfato de cobre 0,5 % en tartrato de sodio y potasio 1 %).

Materiales y Métodos

180

Degradación con ácido nítrico.

La heparina porcina comercial (Synthex SA) se disolvió en una solución de

nitrito de sodio 50 mM para obtener una concentración final de 100 mg/ml. La solución

fue acidificada hasta pH 1,5 por agregado de HCl 6N y se mantuvo a dicho pH durante

exactamente 5 minutos a temperatura ambiente. Los oligosacáridos obtenidos fueron

reducidos en condiciones alcalinas con borohidruro de sodio.

Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detector de pulso

amperométrico (HPAEC-PAD, sistema DIONEX) (Hardy y Townsend, 1994)

El análisis de los oligosacáridos se realizó en un sistema Dionex ICS-3000

equipado con un detector electroquímico ED50 utilizado en el modo de pulso

amperométrico para la detección de azúcares (PAD) usando un electrodo de referencia

de AgCl y un electrodo de trabajo de Au. Los parámetros del detector se fijaron en:

+0.05 V (desde t = 0 a t = 0.40 s, la detección comenzó a t = 0.20 s, y finalizó a t = 0.40

s), + 0.75 V (potencial de oxidación para limpiar el electrodo, desde t = 0.41 a t = 0.60

s), y -0.15 V (desde t = 0.61 a t = 1.00 s).

El análisis de los oligosacáridos se realizó utilizando una columna

semipreparativa Prozac PA1 (9 x 250 mm) con un flujo de 4,7 ml/min. El volumen de

inyección para cada análisis fue de 100 l. El gradiente de elución utilizado fue: 0 a 7

minutos: NaOH 80 mM, 7 a 15 minutos: gradiente desde 80 a 100 mM de NaOH, 15 a

60 minutos: 100 mM NaOH más un gradiente de 0 a 500 mM de Acetato de sodio.

Síntesis de 1-aminomaltosa

La reacción se llevó a cabo en un balón cerrado conteniendo 1 equivalente de

maltosa y 4 equivalentes de carbamato de amonio disueltos en 500 l de metanol. La

solución se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción fue monitoreada

por CCD utilizando como solvente acetato de etilo: metanol, 1: 1, v/v. Las placas fueron

reveladas utilizando H2SO4 10% en etanol y ninhidrina 2% en acetona, Rf (maltosa) =

Materiales y Métodos

181

0,7 y Rf (1-aminomaltosa) = 0,3. El producto obtenido fue utilizado para la reacción de

acople a proteínas sin posteriores purificaciones.

Reacción de acople de hidratos de carbono a proteínas

La reacción se realizó en un solo paso. Se partió de una solución de

concentración 4mg/ml de proteína preparada en buffer fosfato pH 7,4, 0,2 M a la cuál se

le incorporó el azúcar de interés disuelto en una mezcla metanol: agua, 1: 1, v/v, y

finalmente se agregó el glutaradehído. La solución resultante se llevó a volumen para

obtener una concentración final de la proteína en solución de 2mg/ml y una

concentración salina final de 0,1 M. La mezcla se agitó magnéticamente por diferentes

períodos de tiempo y posteriormente se dializó contra agua durante 24 horas con

sucesivos cambios y finalmente se concentró por liofilización.

Matriales y Métodos

182

Espectrometría de masa UV-MALDI

Equipo utilizado

Los análisis fueron realizados utilizando un espectrómetro de masa Ultraflex II

TOF/TOF equipado con un láser de estado sólido de alto rendimiento ( = 355 nm) y un

reflector. El sistema fue operado a través del software Flexcontrol 3.0 (Bruker Daltonics

GmbsH, Bremen, Germany).

Para el análisis de los glicoesfingolípidos ácidos de Plasmodium falciparum se

utilizó un espectrometro de masa Kompact MALDI 4 TOF (Shimadzu, Kyoto, Japón)

equipado con un láser pulsado de nitrógeno ( = 337 nm).

Las muestras fueron irradiadas con una potencia de láser de entre 50 y 60% y los

espectros fueron adquiridos tanto en modo lineal como en modo reflectron en los modos

positivo y negativo. Los espectros obtenidos fueron la suma de 100 a 500 disparos

simples del láser, dependiendo de las condiciones de las muestras.

Calibración

En todos los experimentos se utilizaron calibrantes externos, presentes en el

mismo electrodo donde se depositó la muestra a analizar. En este caso, se usaron las

proteínas comerciales bradikinina 1-7, PM 757.399; angiotensina I, PM 1296.685; e

insulina, cadena , PM 3494.6506 con CHCA como matriz en los modos positivo y

negativo.

Cuando fue necesario, se realizaron espectros de las diferentes matrices

utilizadas para poder conocer las señales propias de las mismas.

Matrices utilizadas

Como matrices se usaron ácido -ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), ácido 2,5-

dihidroxibenzoico (DHB, o ácido gentísico, GA), nor-harmano (nHo), 2, 4, 6-

trihidroxiacetofenona (THAP) y ácido sinapínico en diferentes concentraciones.

Matriales y Métodos

183

Para el análisis de los esfingolípidos fluorescentes se prepararon las siguientes

soluciones: 77 mg/mL DHB, 0.1% TFA (ácido trifluoroacético) en acetato de etilo; 20

mg/mL DHB en etanol 50%; 10 mg/mL DHB en etanol: agua 1:9, v/v; 2 mg/mL nHo en

metanol: agua 1:1, v/v; solución saturada de CHCA en acetonitrilo: 0,1% TFA, 2:1, v/v;

y solución saturada de THAP en acetonitrilo: 0,1% TFA, 2:1, v/v.

El análisis de los esfingolípidos ácidos se llevó a cabo utilizando soluciones de

DHB y nHo preparadas disolviendo 1 mg de matriz en 0,5 ml de agua: metanol, 1: 1,

v/v.

Para el análisis de los oligosacáridos provenientes de la degradación de la

heparina comercial se utilizaron las siguientes soluciones de matrices: 1 mg de DHB,

nHo, o CHCA in 100 l de acetonitrilo: agua, 3: 2, v/v.

Para el análisis de las muestras de proteínas conjugadas con los diferentes

hidratos de carbono se utilizó una solución de ácido sinapínico 200 mM en acetonitrilo:

TFA 0,1%, 33: 66, v/v.

Preparación de la muestra

Para el análisis de los esfingolípidos fluorescentes se prepararon soluciones

frescas de las diferentes muestras en una concentración aproximada de 10g/ml en

metanol o en metanol: agua, 1:1, v/v.

Las muestras fueron sembradas en un portamuestras de acero inoxidable sin

pulir (MTP 384 ground steel; Bruker Daltonics GmbsH) utilizando el método mezcla.

Se mezclaron volúmenes iguales de solución de matriz y analito y luego se colocó una

alícuota de 1 l en la superficie del electrodo portamuestas. La mezcla se dejó secar a

temperatura ambiente en desecador.

En algunos casos, para el análisis de los NBD-esfingolípidos, las muestras

fueron sembradas en el electrodo portamuestras sin el agregado de una matriz externa.

Para ello se sembró una alícuota de la soluciones patrones de los analitos preparadas en

metanol, se dejó secar la muestra a temperatura ambiente al aire y se repitió el

procedimiento.

Matriales y Métodos

184

Por otro lado, los esfingolípidos ácidos fueron disueltos en una mezcla de

cloroformo: metanol, 1: 1, v/v, en una concentración de aproximadamente 0,05

mg/0,025 l. En este caso las muestras fueron aplicadas en el portamuestras según el

método sándwich. Se aplicó, en primer lugar, 0,5 l de la solución de matriz y se dejó

secar a temperatura ambiente al resguardo de la luz. Luego se aplicó sobre la matriz una

alícuota de 0,5 l de la solución de análito, se dejó evaporar el solvente y se aplicaron

posteriormente dos capas más de solución de matriz, dejando evaporar el solvente entre

las mismas, siempre a temperatura ambiente y en oscuridad.

Para las determinaciones realizadas sobre los oligosacáridos de la heparina, las

muestras fueron sembradas en el portamuestras mediante el método mezcla con una

pequeña variación. Una vez sembrada la mezcla análito/matriz, se dejaron secar las

muestras y se agregó una alícuota más de solución de matriz, haciendo que la muestra

ya sembrada se redisuelva parcialmente y se dejó secar nuevamente.

Las muestras de proteínas comerciales modificadas con hidratos de carbono se

sembraron mediante el método mezcla. Se mezclaron volúmenes iguales de la solución

de analito preparada en agua y de la solución de matriz correspondiente y se aplicó 1 l

de la mezcla generada sobre el electrodo portamuestras. La muestra se dejó secar a

temperatura ambiente en un desecador al reparo de la luz.

Conclusiones

Conclusiones

185

CONCLUSIONES:

Resultados prévios de nuestro laboratorio indicaban que Plasmodium falciparum

biosintetiza glicoesfingolípidos y que presenta, en los estadíos intraeritrocíticos, una

glucosilceramida sintasa activa con una especificidad de sustrato diferente a la enzima

de mamíferos. En el presente trabajo se realizaron incorporaciones metabólicas de

NBD-ceramida, NBD-dihidroceramida y NBD-esfingomielina. En base a los resultados

obtenidos se determinó que Plasmodium falciparum presenta dos rutas metabólicas: la

biosíntesis de novo a partir de ácido palmítico y serina que formarán diferentes

intermediarios hasta llegar a dihidroceramida, la cual es directamente glicosilada para

dar glucosildihidroceramida y glicoesfingolípidos más complejos. Por otra parte, el

parásito hidroliza la esfingomielina del eritrocito a fin de obtener ceramida que luego

utilizará para biosintetizar su propia esfingomielina. El tratamiento de los parásitos con

tamoxifeno permitió establecer la independencia de estas dos vías metabólicas.

Paralelamente se estudiaron los glicoesfingolípidos ácidos. Se determinó por

primera vez la presencia de sulfoglicoesfingolípidos en los tres estadíos

intraeritrocíticos y se realizó la caracterización estructural por EM UV-MALDI-TOF.

Teniendo en cuenta que los sulfoglicolipidos están involucrados en procesos de

adhesión, los resultados obtenidos permitirán estudiar su participación en los fenómenos

de agregación descriptos en malaria severa.

A partir de los resultados obtenidos en el estudio biosintético, la

glucosilceramida sintasa con su particular especificidad de sustrato, surge como un

posible blanco para el desarrollo de nuevas drogas antimaláricas. Por lo tanto se

procedió a la extracción, purificación y caracterización de la enzima. En este trabajo se

desarrollaron dos protocolos de purificación de la GCS: utilizando cromatografia de

afinidad a colorantes y por immunoafinidad. Se realizó la localización subcelular y la

caracterización de la actividad enzimática.

Teniendo en cuenta las características particulares de la GCS de Plasmodium

falciparum se decidió estudiar la presencia de la enzima en otros parásitos. Así fue

posible determinar por primera vez la presencia de una GCS activa en Trypanosoma

cruzi, Leishmania amazoniesis y Toxoplasma gondii. Fue interesante determinar que a

diferencia de la enzima de Plasmodium falciparum, los tres parásitos analizados

presentaron actividad con los dos sustratos, ceramida y dihidroceramida, siendo mayor

Conclusiones

186

la actividad con el sustrato insaturado en forma similar a lo que ocurre con la enzima de

mamíferos.

Resultó interesante entonces caracterizar una GCS con una actividad de sustrato

diferente a la de P. falciparum, y para ello se eligió Trypanosoma cruzi dada la

experiencia del laboratorio con el estudio de dicho parásito. Durante este trabajo se

extrajo, purificó y caracterizó la GCS de formas epimastigote de Trypanosoma cruzi. Se

realizaron estudios de localización subcelular de la enzima y se caracterizaron por EM

UV-MALDI-TOF otros productos obtenidos en el ensayo de la actividad in vitro.

Debe aclararse que a pesar de los esfuerzos realizados hasta el momento, no fue

posible llegar a la determinación de la secuencia peptídica de la GCS purificada de

ninguno de los dos parásitos. Es conocido que la GCS presenta una muy baja homología

de secuencia en los diferentes sistemas. Este hecho impide la identificación de la

proteína por huella peptídica y debe realizarse la secuenciación de novo, para lo cual es

necesario contar con una mayor cantidad de la proteína purificada. El estudio

proteómico de la enzima no constituyó un objetivo de esta tesis.

Por otra parte, el presente trabajo ha contribuido con el desarrollo de dos

metodologías de análisis por espectrometría de masa que trascienden el campo de la

química de parásitos:

1- Se ha utilizado un grupo fluorescente unido covalentemente a una

esfingosina, no solo como un marcador selectivo sino también como fotosensibilizador

(matriz) para el análisis por espectrometría de masa UV-MALDI. El hecho de no

agregar matriz externa indica que el proceso que tiene lugar es una desorción/ionización

por láser (UV-LDI). Fue interesante determinar que aunque el proceso LDI es un

método de ionización fuerte, se obtienen espectros muy limpios. Esta aplicación resulta

particularmente útil ya que permite la localización y caracterización de metabolitos en

un único experimento, disminuyendo los tiempos de análisis y aumentando la

sensibilidad y versatilidad con un mínimo de preparación de muestra. Además fue

determinado que la NBD-ceramida puede ser utilizada como matriz externa para el

análisis de otros lípidos no marcados. Fue posible demostrar que muestras biológicas

pueden ser primero analizadas por técnicas no destructivas basadas en fluorescencia y

luego las mismas muestras sin pasos adicionales y sin necesidad de búsqueda de una

matriz adecuada, analizados por UV-LDI. Sin embargo, fue determinado que la

Conclusiones

187

eficiencia de ionización disminuye con el aumento de la polaridad de la muestra aunque

no resultó dependiente del tipo de azúcar.

2- Siendo conocido que los hidratos de carbono pueden ser responsables de la

antigenicidad de un glicoconjugado, se llevó a cabo la síntesis de diferentes conjugados

carbohidrato-proteína y su caracterización por EM como herramienta para su

utilización en ensayos biológicos.

En un primer acercamiento se buscaron las condiciones óptimas de relación

molar carbohidrato: proteína, tiempo de reacción y tamaño de proteína para que el

conjugado obtenido presente una relación carbohidrato: proteína similar a la presente en

una glicoproteína natural. De esta forma fueron sintetizados conjugados de

seroalbúmina bovina unida a maltosa, glucosamina, -1-metil-6-glucosamina y ácido

galacturónico conteniendo 10, 17, 14 y 35 unidades de azúcar por mol de proteína

respectivamente. Por otra parte se sintetizaron conjugados de los mismos azúcares a

Citocromo C y Ubiquitina, ambas proteínas de bajo PM (12230 y 8564

respectivamente). Todos estos conjugados serán utilizados en ensayos de dot-blot y

Elisa con anticuerpos de interés.

Paralelamente se planteó la obtención de oligosacáridos sulfatados a partir de

heparina comercial para ser acoplados a proteínas. Con ese objetivo se optimizó una

degradación de heparina con ácido nitroso seguido de una separación por HPAEC como

método rápido de obtención de los oligosacáridos sulfatados. Debido a su simplicidad y

bajo costo la reacción provee una buena alternativa a las degradaciones enzimáticas que

han sido ampliamente utilizadas, produciendo oligosacáridos sulfatados modificados

con una unidad de anhidromanitol. El análisis por EM UV-MALDI-TOF en modo

negativo utilizando dos matrices diferentes permitió la determinación estructural

prácticamente completa de seis oligosacáridos. La separación por HPAEC fue útil no

sólo para la obtención de oligosacáridos puros sino también para estabilizar los

sustituyentes acídicos como sales de sodio permitiendo la detección de las especies

ionizadas de las moléculas intactas sin la pérdida de los grupos sulfato. Fue utilizado el

agregado de formiato de butilamonio que permitió en algunos casos una mejor

desorción de la muestra probablemente modificando la co-cristalización de los

oligosacáridos sulfatados con la matriz. El uso complementario de los datos obtenidos

con las diferentes matrices hizo innecesario el análisis por MS/MS. Sólo en algún caso

la posición de un grupo sulfato entre la posición O-3 y el oxígeno adyacente quedó sin

determinar requiriéndose experimentos adicionales para llegar a la completa asignación

Conclusiones

188

estructural. Fue interesante determinar que cuando se utilizó DHB como matriz, se

detectó en casi todos los casos el ión molecular. Esta información fue útil para

determinar el número total de sulfatos presente en cada oligosacárido. Adicionalmente

algunos iones correspondientes a pérdidas de sulfato fueron detectados. En contraste,

cuando se utilizó nor-harmano como matriz, se detectaron fragmentos que retenían los

grupos sulfato. Estos iones fueron esenciales para la asignación de la posición de los

grupo sulfato en cada residuo.

A pesar de que todavía debe ser más estudiado este campo para llegar a un

análisis glicómico rutinario de este tipo de compuestos, este trabajo presenta una forma

simple de obtención de oligosacáridos estructuralmente definidos y un análisis rápido.

Esta metodología podría ser de interés para el estudio de glicoproteínas de otras fuentes.

Trabajos publicados

189

UV–MALDI–TOF mass spectrometry analysis of heparin oligosaccharides obtained by nitrous acid controlled degradation and high performance anion exchange chromatography. L. Bultel, M. Landoni, E. Grand, A.S. Couto, J. Kovensky. J Am Soc Mass Spectrom. 2009. 21: 178-90.

UV-MALDI Mass Spectrometry Analysis of NBD-Glycosphingolipids without an

External Matrix. M. Landoni, V.G. Duschak, R. Erra-Balsells, A.S. Couto. J Am Soc Mass Spectrom. 2008; 19: 923-6.

Plasmodium falciparum biosynthesizes sulfoglycosphingolipids. M. Landoni, V. G.

Duschak, V. J. Peres, H. Nonami, R. Erra-Balsells, A. M. Katzin, A. S. Couto. Mol Biochem Parasitol. 2007;154: 22-9.

Referencias

Referencias

190

REFERENCIAS Abe, A., Inokuchi, J., Jimbo, M., Shimeno, H., Nagamatsu, A., Shayman, J.A., Shukla, G.S., Radin, N.S. Improved inhibitors of glucosylceramide synthase. J Biochem. 1992; 111: 191-6. Abe, A., Radin, N.S., Shayman, J.A. Induction of glucosylceramide synthase by synthase inhibitors and ceramide. Biochim Biophys Acta. 1996; 1299: 333-41. Abe, A., Radin, N.S., Shayman, J.A., Wotring, L.L., Zipkin, R.E., Sivakumar, R., Ruggieri, J.M., Carson, K.G., Ganem, B. Structural and stereochemical studies of potent inhibitors of glucosylceramide synthase and tumor cell growth. J Lipid Res. 1995; 36: 611-21. Abe, A., Shayman, J.A. Purification and characterization of 1-O-acylceramide synthase, a novel phospholipase A2 with transacylase activity. J Biol Chem. 1998; 273: 8467-74. Abe, A., Shayman, J.A., Radin, N.S. A novel enzyme that catalyzes the esterification of N-acetylsphingosine. Metabolism of C2-ceramides. J Biol Chem. 1996; 271: 14383-9. Abe, A., Shayman, J.A., Radin, N.S. Fluorescence assay of glucosylceramide glucosidase using NBD-cerebroside. Lipids. 1992; 27: 1052-4. Abe, A., Wu, D., Shayman, J.A., Radin, N.S. Metabolic effects of short-chain ceramide and glucosylceramide on sphingolipids and protein kinase C. Eur J Biochem. 1992; 210: 765-73. Adam, D., Heinrich, M., Kabelitz, D., Schütze, S. Ceramide: does it matter for T cells? Trends Immunol. 2002; 23: 1-4. Agmon, V., Dinur, T., Cherbu, S., Dagan, A., Gatt, S. Administration of pyrene lipids by receptor-mediated endocytosis and their degradation in skin fibroblasts. Exp Cell Res. 1991; 196: 151-7. Aguilar, R., Dong, Y., Warr, E., Dimopoulos, G. Anopheles infection responses; laboratory models versus field malaria transmission systems. Acta Trop. 2005; 95: 285-91. Agusti, R., Couto, A.S., Alves, M.J., Colli, W., de Lederkremer, R.M. Lipids shed into the culture medium by trypomastigotes of Trypanosoma cruzi. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2000; 95: 97-102. Ansorge, I., Jeckel, D., Wieland, F., Lingelbach, K. Plasmodium falciparum-infected erythrocytes utilize a synthetic truncated ceramide precursor for synthesis and secretion of truncated sphingomyelin. Biochem J. 1995; 308: 335-41. Antonopoulos, A., Favetta, P., Jacquinet, J.C., Lafosse, M. Tandem mass spectrometry for the characterisation of sulphated-phosphorylated analogues of the carbohydrate-protein linkage region of proteoglycans. J Mass Spectrom. 2005; 40: 1628-36. Arnot, D.E., Gull, K. The Plasmodium cell-cycle: facts and questions. Ann Trop Med Parasitol. 1998; 92: 361-5. Atamna, H., Ginsburg, H. Heme degradation in the presence of glutathione. A proposed mechanism to account for the high levels of non-heme iron found in the membranes of emoglobinopathic red blood cells. J Biol Chem. 1995; 270: 24876-83. Atkinson, C.T., Aikawa, M. Ultrastructure of malaria-infected erythrocytes. Blood Cells. 1990; 16: 351-68. Avila, J.L., Rojas, M., Carrasco, H. Elevated levels of antibodies against sulphatide are present in all chronic chagasic and dilated cardiomyopathy sera. Clin Exp Immunol. 1993; 92: 460-5. Azzouz, N., Rauscher, B., Gerold, P., Cesbron-Delauw, M.F., Dubremetz, J.F., Schwarz, R.T. Evidence for de novo sphingolipid biosynthesis in Toxoplasma gondii. Int J Parasitol. 2002; 32: 677-84. Bannister, L., Mitchell, G. The ins, outs and roundabouts of malaria. Trends Parasitol. 2003; 19: 209-13.

Referencias

191

Bannister, L.H., Hopkins, J.M., Fowler, R.E., Krishna, S., Mitchell, G.H. Ultrastructure of rhoptry development in Plasmodium falciparum erythrocytic schizonts. Parasitology. 2000; 121: 273-87. Bannister, L.H., Mitchell, G.H. Lipidic vacuoles in Plasmodium knowlesi erythrocytic schizonts. J Protozool. 1986; 33: 271-5. Bannister, L.H., Mitchell, G.H., Butcher, G.A., Dennis, E.D. Lamellar membranes associated with rhoptries in erythrocytic merozoites of Plasmodium knowlesi: a clue to the mechanism of invasion. Parasitology. 1986;92: 291-303. Bannister, L.H., Mitchell, G.H., Butcher, G.A., Dennis, E.D., Cohen, S. Structure and development of the surface coat of erythrocytic merozoites of Plasmodium knowlesi. Cell Tissue Res. 1986; 245: 281-90. Barak, L.S., Webb, W.W. Diffusion of low density lipoprotein-receptor complex on human fibroblasts. J Cell Biol. 1982; 95: 846-52. Barreto-Bergter, E., Branquinha, M.H., Pohlentz, G., Vermelho, A.B. Monohexosylceramides of Trypanosoma dionisii. J Eukaryot Microbiol. 1996; 43: 486-8. Barreto-Bergter, E., Vermelho, A.B., Hartmann, R., Pohlentz, G., Klein, R.A., Egge, H. Structural characterization of neutral glycosphingolipids from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 1992; 51: 263-70. Barreto-Bergter, E., Vermelho, A.B., Hogge, L., Gorin, P.A. Glycolipid components of epimastigote forms of Trypanosoma cruzi. Comp Biochem Physiol B. 1985; 80: 543-5. Bartke, N., Hannun, Y.A. Bioactive sphingolipids: metabolism and function. J Lipid Res. 2009;50 Suppl:S91-6. Basu, S., Kaufman, B., Roseman, S. Enzymatic synthesis of ceramide-glucose and ceramide-lactose by glycosyltransferases from embryonic chicken brain. J Biol Chem. 1968; 243: 5802-4. Beier, J.C. Malaria parasite development in mosquitoes. Annu Rev Entomol. 1998; 43: 519-43. Bejugam, M., Flitsch, S.L. An efficient synthetic route to glycoamino acid building blocks for glycopeptide synthesis. Org Lett. 2004; 6: 4001-4. Bell, J.E., Hume, R., Busuttil, A., Burchell, A. Immunocytochemical detection of the microsomal glucose-6-phosphatase in human brain astrocytes. Neuropathol Appl Neurobiol. 1993; 19: 429-35. Berkers, C.R., Verdoes, M., Lichtman, E., Fiebiger, E., Kessler, B.M., Anderson, K.C., Ploegh, H.L., Ovaa, H., Galardy, P.J. Activity probe for in vivo profiling of the specificity of proteasome inhibitor bortezomib. Nat Methods. 2005; 2: 357-62. Berkers, C.R., Verdoes, M., Lichtman, E., Fiebiger, E., Kessler, B.M., Anderson, K.C., Ploegh, H.L., Ovaa, H., Galardy, P.J. Activity probe for in vivo profiling of the specificity of proteasome inhibitor bortezomib. Nat Methods. 2005; 2: 357-62. Bisanz, C., Bastien, O., Grando, D., Jouhet, J., Maréchal, E., Cesbron-Delauw, M.F. Toxoplasma gondii acyl-lipid metabolism: de novo synthesis from apicoplast-generated fatty acids versus scavenging of host cell precursors. Biochem J. 2006; 394: 197-205. Boëte, C. Malaria parasites in mosquitoes: laboratory models, evolutionary temptation and the real world. Trends Parasitol. 2005; 21: 445-7. Boëte, C., Paul, R.E. Can mosquitoes help to unravel the community structure of Plasmodium species? Trends Parasitol. 2006; 22: 21-5. Bontempi, E., Martinez, J., Cazzulo, J.J. Subcellular localization of a cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 1989; 33: 43-7.

Referencias

192

Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248-54. Brändli, A.W., Hansson, G.C., Rodriguez-Boulan, E., Simons, K. A polarized epithelial cell mutant deficient in translocation of UDP-galactose into the Golgi complex. J Biol Chem. 1988; 263: 16283-90. Braun-Breton, C., Jendoubi, M., Brunet, E., Perrin, L., Scaife, J., Pereira da Silva, L. In vivo time course of synthesis and processing of major schizont membrane polypeptides in Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 1986; 20: 33-43. Breman, J.G., Holloway, C.N. Malaria surveillance counts. Am J Trop Med Hyg. 2007;77: 36-47. Brügger, B., Graham, C., Leibrecht, I., Mombelli, E., Jen, A., Wieland, F., Morris, R. The membrane domains occupied by glycosylphosphatidylinositol-anchored prion protein and Thy-1 differ in lipid composition. J Biol Chem. 2004; 279: 7530-6. Butcher, G.A. Factors affecting the in vitro culture of Plasmodium falciparum and Plasmodium knowlesi. Bull World Health Organ. 1979; 57: 17-26. Buton, X., Hervé, P., Kubelt, J., Tannert, A., Burger, K.N., Fellmann, P., Müller, P., Herrmann, A., Seigneuret, M., Devaux, P.F. Transbilayer movement of monohexosylsphingolipids in endoplasmic reticulum and Golgi membranes. Biochemistry. 2002; 41: 13106-15. Cabot, M.C., Giuliano, A.E., Volner, A., Han, T.Y. Tamoxifen retards glycosphingolipid metabolism in human cancer cells. FEBS Lett. 1996; 394: 129-31. Cabot, M.C., Zhang, Z.C., Giuliano, A.E. Tamoxifen elicits rapid transmembrane lipid signal responses in human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat. 1995; 36: 299-306. Carter, R., Mendis, K.N., Miller, L.H., Molineaux, L., Saul, A. Malaria transmission-blocking vaccines--how can their development be supported? Nat Med. 2000; 6: 241-4. Cazzulo, J.J., Franke de Cazzulo, B.M., Engel, J.C., Cannata, J.J. End products and enzyme levels of aerobic glucose fermentation in trypanosomatids. Mol Biochem Parasitol. 1985; 16: 329-43. Chalfant, C.E., Spiegel, S. Sphingosine 1-phosphate and ceramide 1-phosphate: expanding roles in cell signaling. J Cell Sci. 2005; 118: 4605-12. Chang, K.P. Cellular and molecular mechanisms of intracellular symbiosis in leishmaniasis. Int Rev Cytol Suppl. 1983; 14: 267-305. Chasis, J.A., Prenant, M., Leung, A., Mohandas, N. Membrane assembly and remodeling during reticulocyte maturation. Blood. 1989; 74: 1112-20. Chasis, J.A., Schrier, S.L. Membrane deformability and the capacity for shape change in the erythrocyte. Blood. 1989; 74: 2562-8. Chattopadhyay, A. Chemistry and biology of N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-labeled lipids: fluorescent probes of biological and model membranes. Chem Phys Lipids. 1990; 53: 1-15. Chattopadhyay A, London E. Spectroscopic and ionization properties of N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-labeled lipids in model membranes. Biochim Biophys Acta. 1988; 938: 24-34. Chaudhuri, G., Chaudhuri, M., Pan, A., Chang, K.P. Surface acid proteinase (gp63) of Leishmania mexicana. A metalloenzyme capable of protecting liposome-encapsulated proteins from phagolysosomal degradation by macrophages. J Biol Chem. 1989; 264: 7483-9. Chaudhuri, G., Mukhopadhyay, A., Basu, S.K. Selective delivery of drugs to macrophages through a highly specific receptor. An efficient chemotherapeutic approach against leishmaniasis. Biochem Pharmacol. 1989; 38: 2995-3002.

Referencias

193

Chen, C.S., Martin, O.C., Pagano, R.E. Changes in the spectral properties of a plasma membrane lipid analog during the first seconds of endocytosis in living cells. Biophys J. 1997; 72: 37-50. Chujor, C.S., Feingold, K.R., Elias, P.M., Holleran, W.M. Glucosylceramide synthase activity in murine epidermis: quantitation, localization, regulation, and requirement for barrier homeostasis. J Lipid Res. 1998; 39: 277-85. Coetzee, T., Suzuki, K., Popko, B. New perspectives on the function of myelin galactolipids. Trends Neurosci. 1998; 21: 126-30. Coezy, E., Borgna, J.L., Rochefort, H. Tamoxifen and metabolites in MCF7 cells: correlation between binding to estrogen receptor and inhibition of cell growth. Cancer Res. 1982; 42: 317-23. Cooke, B.M., Mohandas, N., Coppel, R.L. Malaria and the red blood cell membrane. Semin Hematol. 2004; 41: 173-88. Cooke, B.M., Coppel, R.L. Blue skies or stormy weather: what lies ahead for malaria research? Trends Parasitol. 2004; 20: 611-4. Cooke, B.M., Lingelbach, K., Bannister, L.H., Tilley, L. Protein trafficking in Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Trends Parasitol. 2004; 20: 581-9. Couto, A.S., Caffaro, C., Uhrig, M.L., Kimura, E., Peres, V.J., Merino, E.F., Katzin, A.M., Nishioka, M., Nonami, H., Erra-Balsells, R. Glycosphingolipids in Plasmodium falciparum. Presence of an active glucosylceramide synthase. Eur J Biochem. 2004; 271: 2204-14. Couto, A.S., Uhrig, M.L., Agustí, R., Befumo, M.F., Zingales, B., Colli, W., de Lederkremer, R.M. Trypanosoma cruzi: incorporation of [3H]-palmitic acid and [3H]-galactose into components shed by trypomastigotes. Biochem Int. 1991; 24: 991-1002. Couto, A.S., Zingales, B., de Lederkremer, R.M., Colli, W. Trypanosoma cruzi: metabolic labeling of trypomastigote sialoglycolipids. Experientia. 1985; 41: 736-8. Cox, F.E. History of human parasitology. Clin Microbiol Rev. 2002; 15: 595-612. Cremesti, A.E., Goni, F.M., Kolesnick, R. Role of sphingomyelinase and ceramide in modulating rafts: do biophysical properties determine biologic outcome? FEBS Lett. 2002; 531: 47-53. Dai, Y., Whittal, R.M., Bridges, C.A., Isogai, Y., Hindsgaul, O., and Li, L. Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry for the analysis of monosulfated oligosaccharides. Carbohydrate Research. 1997; 304, 1-9. D'Angelo, G., Polishchuk, E., Di Tullio, G., Santoro, M., Di Campli, A., Godi, A., West, G., Bielawski, J., Chuang, C.C., van der Spoel, A.C., Platt, F.M., Hannun, Y.A., Polishchuk, R., Mattjus, P., De Matteis, M.A. Glycosphingolipid synthesis requires FAPP2 transfer of glucosylceramide. Nature. 2007; 449: 62-7. Dantur Juri, M.J., Zaidenberg, M., Claps, G.L., Santana, M., Almirón, W.R. Malaria transmission in two localities in north-western Argentina. Malar J. 2009; 19: 8:18. de Carvalho, L., de Souza, W. Internalization of surface anionic sites and phagosome-lysosome fusion during interaction of Toxoplasma gondii with macrophages. Eur J Cell Biol. 1990; 51: 211-9. de Carvalho, T.U., de Souza, W. Study of mitochondrial organization in living resident and activated macrophages using the laser dye rhodamine 123. J Leukoc Biol. 1989; 45: 498-502. de Lederkremer, R.M., Lima, C., del C Vila, M. Ceramide 1-phosphate is released from a glycoinositolphosphoceramide of Trypanosoma cruzi by rat blood plasma. Mol Biochem Parasitol. 1996; 79: 219-23.

Referencias

194

de Lederkremer, R.M., Zingales, B., Confalonieri, A.N., Couto, A.S., Martin, N.F., Colli, W. In vivo incorporation of palmitic acid and galactose in glycolipids of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Biochem Int. 1985; 10: 79-88. de Libero, G., Donda, A., Gober, H.J., Manolova, V., Mazorra, Z., Shamshiev, A., Mori, L. A new aspect in glycolipid biology: glycosphingolipids as antigens recognized by T lymphocytes. Neurochem Res. 2002; 27: 675-85. de Melo, E.J., de Souza, W. Pathway of C6-NBD-Ceramide on the host cell infected with Toxoplasma gondii. Cell Struct Funct. 1996; 21: 47-52. Deitsch, K.W., Wellems, T.E. Membrane modifications in erythrocytes parasitized by Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 1996; 76: 1-10. Delgado, A., Casas, J., Llebaria, A., Abad, J.L., Fabrias, G. Inhibitors of sphingolipid metabolism enzymes. Biochim Biophys Acta. 2006; 1758: 1957-77. Denny, P.W., Field, M.C., Smith, D.F. GPI-anchored proteins and glycoconjugates segregate into lipid rafts in Kinetoplastida. FEBS Lett. 2001; 491: 148-53. Denny, P.W., Goulding, D., Ferguson, M.A., Smith, D.F. Sphingolipid-free Leishmania are defective in membrane trafficking, differentiation and infectivity. Mol Microbiol. 2004; 52: 313-27. Denny, P.W., Morgan, G.W., Field, M.C., Smith, D.F. Leishmania major: clathrin and adaptin complexes of an intra-cellular parasite. Exp Parasitol. 2005; 109: 33-7. Denny, P.W., Shams-Eldin, H., Price, H.P., Smith, D.F., Schwarz, R.T. The protozoan inositol phosphorylceramide synthase: a novel drug target that defines a new class of sphingolipid synthase. J Biol Chem. 2006; 281: 28200-9. Denny, P.W., Smith, D.F. Rafts and sphingolipid biosynthesis in the kinetoplastid parasitic protozoa. Mol Microbiol. 2004; 53: 725-33. Descoteaux, A., Turco, S.J. Glycoconjugates in Leishmania infectivity. Biochim Biophys Acta. 1999; 1455: 341-52. Dhénin, S.G., Moreau, V., Morel, N., Nevers, M.C., Volland, H., Créminon, C., Djedaïni-Pilard, F. Synthesis of an anthrose derivative and production of polyclonal antibodies for the detection of anthrax spores. Carbohydr Res. 2008; 343: 2101-10. Domon, B., Costello, C.E. Structure elucidation of glycosphingolipids and gangliosides using high-performance tandem mass spectrometry. Biochemistry. 1988; 27: 1534-43. Domon, B., and Costello, C.E. A systematic nomenclature for carbohydrates fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate J. 1988; 5, 397-409. Dragusin, M., Gurgui, C., Schwarzmann, G., Hoernschemeyer, J., van Echten-Deckert, G. Metabolism of the unnatural anticancer lipid safingol, L-threo-dihydrosphingosine, in cultured cells. J Lipid Res. 2003; 44: 1772-9. Drake, R.R., Igari, Y., Lester, R., Elbein, A.D., Radominska, A. Application of 5-azido-UDP-glucose and 5-azido-UDP-glucuronic acid photoaffinity probes for the determination of the active site orientation of microsomal UDP-glucosyltransferases and UDP-glucuronosyltransferases. J Biol Chem. 1992; 267: 11360-5. Dreisewerd, K. The desorption process in MALDI. Chem Rev. 2003; 103: 395-426. Durieux, I., Martel, M.B., Got, R. Solubilization of UDPglucose-ceramide glucosyltransferase from the Golgi apparatus. Biochim Biophys Acta. 1990; 1024: 263-6.

Referencias

195

Duschak, V.G., Cazzulo, J.J. Subcellular localization of glutamate dehydrogenases and alanine aminotransferase in epimastigotes of Trypanosoma cruzi. FEMS Microbiol Lett. 1991; 67: 131-5. Elford, B.C., Ferguson, D.J. Secretory processes in Plasmodium. Parasitol Today. 1993; 9: 80-1. Elmendorf, H.G., Haldar, K. Plasmodium falciparum exports the Golgi marker sphingomyelin synthase into a tubovesicular network in the cytoplasm of mature erythrocytes. J Cell Biol. 1994; 124: 449-62. Erra-Balsells, R., Nonami, H. Nor-Harmane (9H-Pyrido[3,4-b]indole) as Outstanding Matrix for UV-Matrix-assisted Laser Desorption /Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis of Synthetic and Bio-Polymers. Environ Control in Biol. 2002; 40, 55-73. Famin, O., Krugliak, M., Ginsburg, H. Kinetics of inhibition of glutathione-mediated degradation of ferriprotoporphyrin IX by antimalarial drugs. Biochem Pharmacol. 1999; 58: 59-68. Feldman, S., García, G., Svetaz, M.J., Avila, J.L., Revelli, S., Bottasso, O.A., Marcipar, A. Evidence that antisulfatide autoantibodies from rats experimentally infected with Trypanosoma cruzi bind to homologous neural tissue. Parasitol Res. 1999; 85: 446-51. Figueiredo, J.M., Dias, W.B., Mendonça-Previato, L., Previato, J.O., Heise, N. Characterization of the inositol phosphorylceramide synthase activity from Trypanosoma cruzi. Biochem J. 2005; 387: 519-29. Fridberg, A., Olson, C.L., Nakayasu, E.S., Tyler, K.M., Almeida, I.C., Engman, D.M. Sphingolipid synthesis is necessary for kinetoplast segregation and cytokinesis in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 2008; 121: 522-35. Fukuyama, Y., Ciancia, M., Nonami, H., Cerezo, A.S., Erra-Balsells, R., and Matulewicz, M.C. Matrix-assisted ultraviolet laser-desorption ionization and electrospray-ionization time-of-flight mass spectrometry of sulfated neocarrabiose oligosaccharides. Carbohydr Res. 2002; 337, 1553-1562. Futerman, A.H. Intracellular trafficking of sphingolipids: relationship to biosynthesis. Biochim Biophys Acta. 2006; 1758: 1885-92. Futerman, A.H., Hannun, Y.A. The complex life of simple sphingolipids. EMBO Rep. 2004; 5: 777-82. Futerman, A.H., Pagano, R.E. Determination of the intracellular sites and topology of glucosylceramide synthesis in rat liver. Biochem J. 1991; 280: 295-302. Futerman, A.H., Riezman, H. The ins and outs of sphingolipid synthesis. Trends Cell Biol. 2005; 15: 312-8. Futerman, A.H., Stieger, B., Hubbard, A.L., Pagano, R.E. Sphingomyelin synthesis in rat liver occurs predominantly at the cis and medial cisternae of the Golgi apparatus. J Biol Chem. 1990; 265: 8650-7. Gero, A.M., Kirk, K. Nutrient transport pathways in Plasmodium-infected erythrocytes: what and where are they? Parasitol Today. 1994; 10: 395-9. Gerold, P., Schwarz, R.T. Biosynthesis of glycosphingolipids de-novo by the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 2001; 112: 29-37. Ghidoni, R., Sala, G., Giuliani, A. Use of sphingolipid analogs: benefits and risks. Biochim Biophys Acta. 1999; 1439: 17-39. Ghosh, S., Bhattacharyya, S., Sirkar, M., Sa, G.S., Das, T., Majumdar, D., Roy, S., Majumdar, S. Leishmania donovani suppresses activated protein 1 and NF-kappaB activation in host macrophages via ceramide generation: involvement of extracellular signal-regulated kinase. Infect Immun. 2002; 70: 6828-38. Gouaze-Andersson, V., Cabot, M.C. Glycosphingolipids and drug resistance. Biochim Biophys Acta. 2006; 1758: 2096-103.

Referencias

196

Greenwood, B. The molecular epidemiology of malaria. Trop Med Int Health. 2002; 7: 1012-21. Greenwood, B., Alonso, P. Malaria vaccine trials. Chem Immunol. 2002; 80: 366-95. Greenwood, B., Mutabingwa, T. Malaria in 2002. Nature. 2002; 415: 670-2. Guerra, C.A., Snow, R.W., Hay, S.I. Mapping the global extent of malaria in 2005. Trends Parasitol. 2006; 22: 353-8. Gulbins, E., Kolesnick, R. Raft ceramide in molecular medicine. Oncogene. 2003; 22: 7070-7. Gundimeda, U., Chen, Z.H., Gopalakrishna, R. Tamoxifen modulates protein kinase C via oxidative stress in estrogen receptor-negative breast cancer cells. J Biol Chem. 1996; 271: 13504-14. Güther, M.L., Lee, S., Tetley, L., Acosta-Serrano, A., Ferguson, M.A. GPI-anchored proteins and free GPI glycolipids of procyclic form Trypanosoma brucei are nonessential for growth, are required for colonization of the tsetse fly, and are not the only components of the surface coat. Mol Biol Cell. 2006; 17: 5265-74. Hackenberger, C.P., O'Reilly, M.K., Imperiali, B. Improving glycopeptide synthesis: a convenient protocol for the preparation of beta-glycosylamines and the synthesis of glycopeptides. J Org Chem. 2005; 70: 3574-8. Haeckel, R., Hess, B., Lauterborn, W., Wüster, K.H. Purification and allosteric properties of yeast pyruvate kinase. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1968; 349: 699-714. Hakomori, S. Glycosylation defining cancer malignancy: new wine in an old bottle. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99: 10231-3. Hakomori, S. New directions in cancer therapy based on aberrant expression of glycosphingolipids: anti-adhesion and ortho-signaling therapy. Cancer Cells. 1991; 3: 461-70. Haldar, K. Ducts, channels and transporters in Plasmodium-infected erythrocytes. Parasitol Today. 1994; 10: 393-5. Haldar, K. Intracellular trafficking in Plasmodium-infected erythrocytes. Curr Opin Microbiol. 1998; 1: 466-71. Haldar, K. Sphingolipid synthesis and membrane formation by Plasmodium. Trends Cell Biol. 1996; 6: 398-405. Haldar, K., Samuel, B.U., Mohandas, N., Harrison, T., Hiller, N.L. Transport mechanisms in Plasmodium-infected erythrocytes: lipid rafts and a tubovesicular network. Int J Parasitol. 2001; 31: 1393-401. Haldar, K., Uyetake, L., Ghori, N., Elmendorf, H.G., Li, W.L. The accumulation and metabolism of a fluorescent ceramide derivative in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Mol Biochem Parasitol. 1991; 49: 143-56. Hanada, K. Serine palmitoyltransferase, a key enzyme of sphingolipid metabolism. Biochim Biophys Acta. 2003; 1632: 16-30. Hanada, K., Hara, T., Nishijima, M. D-Serine inhibits serine palmitoyltransferase, the enzyme catalyzing the initial step of sphingolipid biosynthesis. FEBS Lett. 2000; 474: 63-5. Hanada, K., Hara, T., Nishijima, M. Purification of the serine palmitoyltransferase complex responsible for sphingoid base synthesis by using affinity peptide chromatography techniques. J Biol Chem. 2000; 275: 8409-15.

Referencias

197

Hanada, K., Kumagai, K., Yasuda, S., Miura, Y., Kawano, M., Fukasawa, M., Nishijima, M. Molecular machinery for non-vesicular trafficking of ceramide. Nature. 2003; 426: 803-9. Hanada, K., Mitamura, T., Fukasawa, M., Magistrado, P.A., Horii, T., Nishijima, M. Neutral sphingomyelinase activity dependent on Mg2+ and anionic phospholipids in the intraerythrocytic malaria parasite Plasmodium falciparum. Biochem J. 2000; 346: 671-7. Hanada, K., Nishijima, M. Purification of mammalian serine palmitoyltransferase, a hetero-subunit enzyme for sphingolipid biosynthesis, by affinity-peptide chromatography. Methods Mol Biol. 2003; 228: 163-74. Hannun, Y.A., Obeid, L.M. Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008; 9: 139-50. Hannun, Y.A., Obeid, L.M. The Ceramide-centric universe of lipid-mediated cell regulation: stress encounters of the lipid kind. J Biol Chem. 2002; 277: 25847-50. Heung, L.J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 2006; 74: 28-39. Hinkovska-Galcheva, V., Boxer, L.A., Kindzelskii, A., Hiraoka, M., Abe, A., Goparju, S., Spiegel, S., Petty, H.R., Shayman, J.A. Ceramide 1-phosphate, a mediator of phagocytosis. J Biol Chem. 2005; 280: 26612-21. Hla, T. Physiological and pathological actions of sphingosine 1-phosphate. Semin Cell Dev Biol. 2004; 15: 513-20. Hoffman, S.L., Goh, L.M., Luke, T.C., Schneider, I., Le, T.P., Doolan, D.L., Sacci, J., de la Vega, P., Dowler, M., Paul, C., Gordon, D.M., Stoute, J.A., Church, L.W., Sedegah, M., Heppner, D.G., Ballou, W.R., Richie, T.L. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 2002; 185: 1155-64. Hoffman, S.L., Subramanian, G.M., Collins, F.H., Venter, J.C. Plasmodium, human and Anopheles genomics and malaria. Nature. 2002; 415: 702-9. Holder, A.A., Guevara Patiño, J.A., Uthaipibull, C., Syed, S.E., Ling, I.T., Scott-Finnigan, T., Blackman, M.J.. Merozoite surface protein 1, immune evasion, and vaccines against asexual blood stage malaria. Parassitologia. 1999; 41: 409-14. Holder, A.A.. Malaria vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 1167-9. Holz, G.G. Jr. Lipids and the malarial parasite. Bull World Health Organ. 1977; 55: 237-48. Honke, K., Tsuda, M., Hirahara, Y., Ishii, A., Makita, A., Wada, Y. Molecular cloning and expression of cDNA encoding human 3'-phosphoadenylylsulfate:galactosylceramide 3'-sulfotransferase. J Biol Chem. 1997; 272: 4864-8. Hsiao, L.L., Howard, R.J., Aikawa, M., Taraschi, T.F. Modification of host cell membrane lipid composition by the intra-erythrocytic human malaria parasite Plasmodium falciparum. Biochem J. 1991; 274: 121-32. Hughes, P., Lowe, C.R., Sherwood, R.F. Metal ion-promoted binding of proteins to immobilized triazine dye affinity adsorbents. Biochim Biophys Acta. 1982; 700: 90-100 Hughes, P., Sherwood, R.F., Lowe, C.R. Metal-ion-promoted binding of triazine dyes to proteins. The interaction of Cibacron Blue F3G-A with yeast hexokinase. Biochem J. 1982; 205: 453-6. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J.F., Holthuis, J.C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 2004; 23: 33-44.

Referencias

198

Ichikawa, S., Ozawa, K., Hirabayashi, Y. Molecular cloning and characterization of the mouse ceramide glucosyltransferase gene. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 253: 707-11. Ichikawa, S., Sakiyama, H., Suzuki, G., Hidari, K.I., Hirabayashi, Y. Expression cloning of a cDNA for human ceramide glucosyltransferase that catalyzes the first glycosylation step of glycosphingolipid synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93: 4638-43. Inokuchi, J., Mason, I., Radin, N.S. Antitumor activity via inhibition of glycosphingolipid biosynthesis. Cancer Lett. 1987; 38: 23-30. Inokuchi, J., Radin, N.S. Preparation of the active isomer of 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol, inhibitor of murine glucocerebroside synthetase. J Lipid Res. 1987; 28: 565-71. Jaikaria, N.S., Rozario, C., Ridley, R.G., Perkins, M.E. Biogenesis of rhoptry organelles in Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 1993; 57: 269-79. Jeckel, D., Karrenbauer, A., Birk, R., Schmidt, R.R., Wieland, F. Sphingomyelin is synthesized in the cis Golgi. FEBS Lett. 1990; 261: 155-7. Jeckel, D., Karrenbauer, A., Burger, K.N., van Meer, G., Wieland, F. Glucosylceramide is synthesized at the cytosolic surface of various Golgi subfractions. J Cell Biol. 1992; 117: 259-67. Johnson, I.D., Kang, H.C., Haugland, R.P. Fluorescent membrane probes incorporating dipyrrometheneboron difluoride fluorophores. Anal Biochem. 1991; 198: 228-37. Kaneshiro, E.S., Jayasimhulu, K., Lester, R.L. Characterization of inositol lipids from Leishmania donovani promastigotes: identification of an inositol sphingophospholipid. J Lipid Res. 1986; 27: 1294-303. Katzenellenbogen, J.A., Carlson, K.E., Heiman, D.F., Robertson, D.W., Wei, L.L., Katzenellenbogen, B.S. Efficient and highly selective covalent labeling of the estrogen receptor with [3H]tamoxifen aziridine. J Biol Chem. 1983; 258: 3487-95. Kellen, J.A. Genomic effects of tamoxifen. Anticancer Res. 1996; 16: 3537-41. Khan, S.M., Waters, A.P. Malaria parasite transmission stages: an update. Trends Parasitol. 2004; 20: 575-80. Kim, K., Weiss, L.M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int J Parasitol. 2004; 34: 423-32. Kimura, E.A., Couto, A.S., Peres, V.J., Casal, O.L., Katzin, A.M. N-linked glycoproteins are related to schizogony of the intraerythrocytic stage in Plasmodium falciparum. J Biol Chem. 1996; 271: 14452-61. Kirk, K. Membrane transport in the malaria-infected erythrocyte. Physiol Rev. 2001; 81: 495-537. Kirk, K., Horner, H.A., Elford, B.C., Ellory, J.C., Newbold, C.I. Transport of diverse substrates into malaria-infected erythrocytes via a pathway showing functional characteristics of a chloride channel. J Biol Chem. 1994; 269: 3339-47. Kitatani, K., Idkowiak-Baldys, J., Hannun, Y.A. The sphingolipid salvage pathway in ceramide metabolism and signaling. Cell Signal. 2008; 20: 1010-8. Knabbe, C., Lippman, M.E., Wakefield, L.M., Flanders, K.C., Kasid, A., Derynck, R., Dickson, R.B. Evidence that transforming growth factor-beta is a hormonally regulated negative growth factor in human breast cancer cells. Cell. 1987; 48: 417-28. Kobayashi, T., Honke, K., Miyazaki, T., Matsumoto, K., Nakamura, T., Ishizuka, I., Makita, A. Hepatocyte growth factor specifically binds to sulfoglycolipids. J Biol Chem. 1994; 269: 9817-21.

Referencias

199

Kohyama-Koganeya, A., Sasamura, T., Oshima, E., Suzuki, E., Nishihara, S., Ueda, R., Hirabayashi, Y. Drosophila glucosylceramide synthase: a negative regulator of cell death mediated by proapoptotic factors. J Biol Chem. 2004; 279: 35995-6002. Kok, J.W., Nikolova-Karakashian, M., Klappe, K., Alexander, C., Merrill, A.H. Jr. Dihydroceramide biology. Structure-specific metabolism and intracellular localization. J Biol Chem. 1997; 272: 21128-36. Kolter, T., Proia, R.L., Sandhoff, K. Combinatorial ganglioside biosynthesis. J Biol Chem. 2002; 277: 25859-62. Kolter, T., Sandhoff, K. Principles of lysosomal membrane digestion: stimulation of sphingolipid degradation by sphingolipid activator proteins and anionic lysosomal lipids. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005; 21: 81-103. Kolter, T., Winau, F., Schaible, U.E., Leippe, M., Sandhoff, K. Lipid-binding proteins in membrane digestion, antigen presentation, and antimicrobial defense. J Biol Chem. 2005; 280(50):41125-8. Kopperschläger, G., Freyer, R., Diezel, W., Hofmann, E. Some kinetic and molecular properties of yeast phosphofructokinase. FEBS Lett. 1968; 1: 137-141. Kurosawa, Y., Dorn, A., Kitsuji-Shirane, M., Shimada, H., Satoh, T., Matile, H., Hofheinz, W., Masciadri, R., Kansy, M., Ridley, R.G. Hematin polymerization assay as a high-throughput screen for identification of new antimalarial pharmacophores. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44: 2638-44. Lahiri, S., Futerman, A.H. The metabolism and function of sphingolipids and glycosphingolipids. Cell Mol Life Sci. 2007; 64: 2270-84. Lannert, H., Bünning, C., Jeckel, D., Wieland, F.T. Lactosylceramide is synthesized in the lumen of the Golgi apparatus. FEBS Lett. 1994; 342: 91-6. Lauer, S.A., Chatterjee, S., Haldar, K. Uptake and hydrolysis of sphingomyelin analogues in Plasmodium falciparum-infected red cells. Mol Biochem Parasitol. 2001; 115: 275-81. Lauer, S.A., Ghori, N., Haldar, K. Sphingolipid synthesis as a target for chemotherapy against malaria parasites. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92: 9181-5. Lauer, S.A., Rathod, P.K., Ghori, N., Haldar, K. A membrane network for nutrient import in red cells infected with the malaria parasite. Science. 1997; 276: 1122-5. Lavie, Y., Cao, H., Bursten, S.L., Giuliano, A.E., Cabot, M.C. Accumulation of glucosylceramides in multidrug-resistant cancer cells. J Biol Chem. 1996; 271: 19530-6. Lee, L., Abe, A., Shayman, J.A. Improved inhibitors of glucosylceramide synthase. J Biol Chem.1999; 274: 14662-9. Leipelt, M., Warnecke, D., Zähringer, U., Ott, C., Müller, F., Hube, B., Heinz, E. Glucosylceramide synthases, a gene family responsible for the biosynthesis of glucosphingolipids in animals, plants, and fungi. J Biol Chem. 2001; 276: 33621-9. Lester, R.L., Dickson, R.C. Sphingolipids with inositolphosphate-containing head groups. Adv Lipid Res. 1993; 26: 253-74. Lindmark, R., Thorén-Tolling, K., Sjöquist, J. Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera. J Immunol Methods. 1983; 62: 1-13. Lipsky, N.G., Pagano, R.E. Intracellular translocation of fluorescent sphingolipids in cultured fibroblasts: endogenously synthesized sphingomyelin and glucocerebroside analogues pass through the Golgi apparatus en route to the plasma membrane. J Cell Biol. 1985; 100: 27-34.

Referencias

200

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; 193: 265-75. Lu, J., Zenobi, R. In-situ monitoring of protein labeling reactions by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Fresenius J Anal Chem. 2000; 366: 3-9. Lynch, D.V., Criss, A.K., Lehoczky, J.L., Bui, V.T. Ceramide glucosylation in bean hypocotyl microsomes: evidence that steryl glucoside serves as glucose donor. Arch Biochem Biophys. 1997; 340: 311-6. Maceyka, M., Payne, S.G., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine kinase, sphingosine-1-phosphate, and apoptosis. Biochim Biophys Acta. 2002; 1585: 193-201. Maguire, P.A., Sherman, I.W. Phospholipid composition, cholesterol content and cholesterol exchange in Plasmodium falciparum-infected red cells. Mol Biochem Parasitol. 1990; 38: 105-12. Manger, I.D., Wong, S.Y., Rademacher, T.W., Dwek, R.A. Synthesis of 1-N-glycyl beta-oligosaccharide derivatives. Reactivity of Lens culinaris lectin with a fluorescent labeled streptavidin pseudoglycoprotein and immobilized neoglycolipid. Biochemistry. 1992; 31: 10733-40. Maréchal, E., Azzouz, N., de Macedo, C.S., Block, M.A., Feagin, J.E., Schwarz, R.T., Joyard, J. Synthesis of chloroplast galactolipids in apicomplexan parasites. Eukaryot Cell. 2002; 1: 653-6. Marks, D.L., Paul, P., Kamisaka, Y., Pagano, R.E. Methods for studying glucosilceramide synthase. Methods Enzymol. 2000; 311: 50-59. Marks, D.L., Wu, K., Paul, P., Kamisaka, Y., Watanabe, R., Pagano, R.E. Oligomerization and topology of the Golgi membrane protein glucosylceramide synthase. J Biol Chem. 1999; 274: 451-6. Martin, O.C., Comly, M.E., Blanchette-Mackie, E.J., Pentchev, P.G., Pagano, R.E. Cholesterol deprivation affects the fluorescence properties of a ceramide analog at the Golgi apparatus of living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90: 2661-5. Matern, H., Bolz, R., Matern, S. Isolation and characterization of UDP-glucose dolichyl-phosphate glucosyltransferase from human liver. Eur J Biochem. 1990; 190: 99-105. Maurice, A., Malgat, M. Evidence for the biosynthesis of ceramide-phosphoethanolamine in brain synaptic plasma membrane vesicles and in sciatic nerve microsomes from normal and Trembler mice. Neurosci Lett. 1990; 118: 177-80. Merrill, A.H. Jr., Schmelz, E.M., Wang, E., Dillehay, D.L., Rice, L.G., Meredith, F., Riley, R.T. Importance of sphingolipids and inhibitors of sphingolipid metabolism as components of animal diets. J Nutr. 1997; 127: 830S-833S. Merrill, H.A. Jr. De novo sphingolipid biosíntesis: A necesary, but dangerous, pathway. J Biol Chem. 2002; 277: 25843-6. Merten, M., Beythien, C., Gutensohn, K., Kühnl, P., Meinertz, T., Thiagarajan, P. Sulfatides activate platelets through P-selectin and enhance platelet and platelet-leukocyte aggregation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25: 258-63. Merten, M., Thiagarajan, P. Role for sulfatides in platelet aggregation. Circulation. 2001; 104: 2955-60. Michel, C., van Echten-Deckert, G. Conversion of dihydroceramide to ceramide occurs at the cytosolic face of the endoplasmic reticulum. FEBS Lett. 1997; 416: 153-5. Michel, C., van Echten-Deckert, G., Rother, J., Sandhoff, K., Wang, E., Merrill, A.H. Jr. Characterization of ceramide synthesis. A dihydroceramide desaturase introduces the 4,5-trans-double bond of sphingosine at the level of dihydroceramide. J Biol Chem. 1997; 272: 22432-7.

Referencias

201

Miguel, D.C., Yokoyama-Yasunaka, J.K., Andreoli, W.K., Mortara, R.A., Uliana, S.R. Tamoxifen is effective against Leishmania and induces a rapid alkalinization of parasitophorous vacuoles harbouring Leishmania (Leishmania) amazonensis amastigotes. J Antimicrob Chemother. 2007; 60: 526-34. Miguel, D.C., Yokoyama-Yasunaka, J.K., Uliana, S.R. Tamoxifen Is Effective in the Treatment of Leishmania amazonensis Infections in Mice. PLoS Negl Trop Dis. 2008; 2: e249. Miguel, D.C., Zauli-Nascimento, R.C., Yokoyama-Yasunaka, J.K., Katz, S., Barbiéri, C.L., Uliana, S.R. Tamoxifen as a potential antileishmanial agent: efficacy in the treatment of Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi infections. J Antimicrob Chemother. 2009; 63: 365-8. Miller, L.H., Good, M.F., Milon, G. Malaria pathogenesis. Science. 1994; 264: 1878-83. Miller, L.H., McAuliffe, F.M., Johnson, J.G. Invasion of erythrocytes by malaria merozoites. Prog Clin Biol Res. 1979; 30: 497-502. Mitsutake, S., Kim, T.J., Inagaki, Y., Kato, M., Yamashita, T., Igarashi, Y. Ceramide kinase is a mediator of calcium-dependent degranulation in mast cells. J Biol Chem. 2004; 279: 17570-7. Montoya, J.G., Liesenfeld, O. Toxoplasmosis. Lancet. 2004; 363: 1965-76. Mordue, D.G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L.D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 1999; 190: 1783-92. Mordue, D.G., Håkansson, S., Niesman, I., Sibley, L.D. Toxoplasma gondii resides in a vacuole that avoids fusion with host cell endocytic and exocytic vesicular trafficking pathways. Exp Parasitol. 1999; 92: 87-99. Müller, S., Kappes, B. Vitamin and cofactor biosynthesis pathways in Plasmodium and other apicomplexan parasites. Trends Parasitol. 2007; 23: 112-21. Munoz-Olaya, J.M., Matabosch, X., Bedia, C., Egido-Gabás, M., Casas, J., Llebaria, A., Delgado, A., Fabriàs, G. Synthesis and biological activity of a novel inhibitor of dihydroceramide desaturase. ChemMedChem. 2008; 3: 946-53. Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell. 2003; 115: 377-88. Murphy, S.C., Fernandez-Pol, S., Chung, P.H., Prasanna Murthy, S.N., Milne, S.B., Salomao, M., Brown, H.A., Lomasney, J.W., Mohandas, N., Haldar, K. Cytoplasmic remodeling of erythrocyte raft lipids during infection by the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Blood, 2007; 110: 2132-9. Nagao, E., Kaneko, O., Dvorak, J.A. Plasmodium falciparum-infected erythrocytes: qualitative and quantitative analyses of parasite-induced knobs by atomic force microscopy. J Struct Biol. 2000; 130: 34-44. Nakakuma, H., Arai, M., Kawaguchi, T., Horikawa, K., Hidaka, M., Sakamoto, K., Iwamori, M., Nagai, Y., Takatsuki, K. Monoclonal antibody to galactosylceramide: discrimination of structural difference in the ceramide moiety. FEBS Lett. 1989; 258: 230-2. Nakayama, M., Kojima, M., Ohnishi, M., Ito, S. Enzymatic formation of plant cerebroside: properties of UDP-glucose: ceramide glucosyltransferase in radish seedlings. Biosci Biotechnol Biochem. 1995; 59: 1882-6. Neuenhofer, S., Schwarzmann, G., Egge, H., Sandhoff, K. Synthesis of lysogangliosides. Biochemistry. 1985; 24: 525-32. Nichols, J.W., Pagano, R.E. Kinetics of soluble lipid monomer diffusion between vesicles. Biochemistry. 1981; 20: 2783-9.

Referencias

202

Nonami, H., Fukui, S. y Erra-Balsells, R. b-Carboline Alkaloids as Matrices for Matrix-assisted Ultraviolet Laser Desorption Time-of-flight Mass Spectrometry of Proteins and Sulfated Oligosaccharides: A Comparative Study Using Phenylcarbonyl Compounds, Carbazoles and Classical Matrices. J Mass Spectrom. 1997; 32, 287-296. Nonami, H., Tanaka, K., Fukuyama, Y., and Erra-Balsells, R. beta-Carboline alkaloids as matrices for UV-matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in positive and negative ion modes. Analysis of proteins of high molecular mass, and of cyclic and acyclic oligosaccharides. Rapid Commun Mass Spectrom 1998; 12, 285-296. Obeid, L.M., Linardic, C.M., Karolak, L.A., Hannun, Y.A. Programmed cell death induced by ceramide. Science. 1993; 259: 1769-71. Obeid, L.M., Okamoto, Y., Mao, C. Yeast sphingolipids: metabolism and biology. Biochim Biophys Acta. 2002 ;1585(2-3):163-71. O'Brien, A.A., O'Briain, D.S., Daly, P.A. Aggressive endometrial stromal sarcoma responding to medroxyprogesterone following failure of tamoxifen and combination chemotherapy. Case report.Br J Obstet Gynaecol. 1985; 92: 862-6. Ogretmen, B., Hannun, Y.A. Updates on functions of ceramide in chemotherapy-induced cell death and in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 2001; 4: 368-77. Okazaki, T., Bell, R.M., Hannun, Y.A. Sphingomyelin turnover induced by vitamin D3 in HL-60 cells. Role in cell differentiation. J Biol Chem. 1989; 264: 19076-80. Orinda, G.O., Waltisbuhl, D.J., Rode-Bramanis, K., Goodger, B.V. Isolation, initial characterization and serological studies of glycolipid antigens from Babesia bovis-infected erythrocytes. Int J Parasitol. 1993; 23: 1011-7. Pagano, R.E. What is the fate of diacylglycerol produced at the Golgi apparatus? Trends Biochem Sci. 1988; 13: 202-5. Pagano, R.E., Longmuir, K.J., Martin, O.C., Struck, D.K. Metabolism and intracellular localization of a fluorescently labeled intermediate in lipid biosynthesis within cultured fibroblasts. J Cell Biol. 1981; 91: 872-7. Pagano, R.E., Martin, O.C., Kang, H.C., Haugland, R.P. A novel fluorescent ceramide analogue for studying membrane traffic in animal cells: accumulation at the Golgi apparatus results in altered spectral properties of the sphingolipid precursor. J Cell Biol. 1991; 113: 1267-79. Pagano, R.E., Sleight, R.G. Defining lipid transport pathways in animal cells. Science. 1985; 229: 1051-7. Pankova-Kholmyansky, I., Dagan, A., Gold, D., Zaslavsky, Z., Skutelsky, E., Gatt, S., Flescher, E. Ceramide mediates growth inhibition of the Plasmodium falciparum parasite. Cell Mol Life Sci. 2003; 60: 577-87. Pankova-Kholmyansky, I., Flescher, E. Potential new antimalarial chemotherapeutics based on sphingolipid metabolism. Chemotherapy. 2006; 52: 205-9. Papac, D.I., Briggs, J.B., Chin, E.T., Jones, A.J. A high-throughput microscale method to release N-linked oligosaccharides from glycoproteins for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis. Glycobiology. 1998; 8: 445-54. Patnaik, P.K., Field, M.C., Menon, A.K., Cross, G.A., Yee, M.C., Bütikofer, P. Molecular species analysis of phospholipids from Trypanosoma brucei bloodstream and procyclic forms. Mol Biochem Parasitol. 1993; 58: 97-105. Paul, P., Kamisaka, Y., Marks, D.L., Pagano, R.E. Purification and characterization of UDP-glucose:ceramide glucosyltransferase from rat liver Golgi membranes. J Biol Chem. 1996; 271: 2287-93.

Referencias

203

Perry, R.J., Ridgway, N.D. Molecular mechanisms and regulation of ceramide transport. Biochim Biophys Acta. 2005; 1734: 220-34. Pesheva, P., Gloor, S., Schachner, M., Probstmeier, R. Tenascin-R is an intrinsic autocrine factor for oligodendrocyte differentiation and promotes cell adhesion by a sulfatide-mediated mechanism. J Neurosci. 1997; 17: 4642-51. Peters, W. Adaptation of the malaria parasite to its environment during the life cycle. J Parasitol. 1971; 57: 120-5. Peters, W. Malaria. Chemoprophylaxis and chemotherapy. Br Med J. 1971; 2:95-8. Peters, W. The mechanisms of drug resistance in malaria parasites. J Parasitol. 1971; 57: 103-7. Petry, K., Nudelman, E., Eisen, H., Hakomori, S. Sulfated lipids represent common antigens on the surface of Trypanosoma cruzi and mammalian tissues. Mol Biochem Parasitol. 1988; 30: 113-21. Petry, K., Nudelman, E., Eisen, H., Hakomori, S. Sulfated lipids represent common antigens on the surface of Trypanosoma cruzi and mammalian tissues. Mol Biochem Parasitol. 1988; 30: 113-21. Pewzner-Jung, Y., Ben-Dor, S., Futerman, A.H. When do Lasses (longevity assurance genes) become CerS (ceramide synthases)?: Insights into the regulation of ceramide synthesis. J Biol Chem. 2006; 281: 25001-5. Pütz, U., Schwarzmann, G. Golgi staining by two fluorescent ceramide analogues in cultured fibroblasts requires metabolism. Eur J Cell Biol. 1995; 68: 113-21. Quiñones, W., Urbina, J.A., Dubourdieu, M., Luis Concepción, J. The glycosome membrane of Trypanosoma cruzi epimastigotes: protein and lipid composition. Exp Parasitol. 2004; 106: 135-49. Radin, N.S., Shayman, J.A., Inokuchi, J. Metabolic effects of inhibiting glucosylceramide synthesis with PDMP and other substances. Adv Lipid Res. 1993; 26: 183-213. Ralton, J.E., Mullin, K.A., McConville, M.J. Intracellular trafficking of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins and free GPIs in Leishmania mexicana. Biochem J. 2002; 363: 365-75. Riboni, L., Viani, P., Bassi, R., Prinetti, A., Tettamanti, G. The role of sphingolipids in the process of signal transduction. Prog Lipid Res. 1997; 36: 153-95. Ridley RG. Medical need, scientific opportunity and the drive for antimalarial drugs. Nature. 2002; 415: 686-93. Ridley, R.G. Chemotherapeutic hope on the horizon for Plasmodium vivax malaria? Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99: 13362-4. Ridley, R.G. Introduction. Antimalarial drug resistance: ramifications, explanations and challenges. Microbes Infect. 2002; 4: 155-6. Rinaldi, A. Fighting malaria at the crossroads. EMBO Rep. 2004; 5: 847-51. Rintoul, D.A., Simoni, R.D. Incorporation of a naturally occurring fluorescent fatty acid into lipids of cultured mammalian cells. J Biol Chem. 1977; 252: 7916-8. Rosenwald, A.G., Machamer, C.E., Pagano, R.E. Effects of a sphingolipid synthesis inhibitor on membrane transport through the secretory pathway. Biochemistry. 1992; 31: 3581-90. Rowlands, M.G., Parr, I.B., McCague, R., Jarman, M., Goddard, P.M. Variation of the inhibition of calmodulin dependent cyclic AMP phosphodiesterase amongst analogues of tamoxifen; correlations with cytotoxicity. Biochem Pharmacol. 1990; 40: 283-9.

Referencias

204

Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 2006; 18: 305-13. Salih, B., Zenobi, R. MALDI mass spectrometry of dye-peptide and dye-protein complexes. Anal Chem. 1998; 70: 1536-43. Schauer, R., Wember, M., Howard, R.J. Malaria parasites do not contain or synthesize sialic acids. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1984; 365: 185-94. Schulte, S., Stoffel, W. Ceramide UDPgalactosyltransferase from myelinating rat brain: purification, cloning, and expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90: 10265-9. Schwarzmann, G., Sandhoff, K. Lysogangliosides: synthesis and use in preparing labeled gangliosides. Methods Enzymol. 1987; 138: 319-41. Scopes, R.K. Strategies for enzyme isolation using dye-ligand and related adsorbents. J Chromatogr. 1986; 376: 131-40. Sharma, D.K., Choudhury, A., Singh, R.D., Wheatley, C.L., Marks, D.L., Pagano, R.E. Glycosphingolipids internalized via caveolar-related endocytosis rapidly merge with the clathrin pathway in early endosomes and form microdomains for recycling. J Biol Chem. 2003; 278: 7564-72. Shayman, J.A., Abe, A. 1-O-Acilceramide synthase. Methods Enzymol. 2000; 311: 42-49. Shayman, J.A., Abe, A. Glucosylceramide synthase: Assay and Properties. Methods Enzymol. 2000; 311: 42-49. Shimazawa, M., Kondo, K., Hara, H., Nakashima, M., Umemura, K. Sulfatides, L- and P-selectin ligands, exacerbate the intimal hyperplasia occurring after endothelial injury. Eur J Pharmacol. 2005; 520: 118-26. Sibley, L.D., Krahenbuhl, J.L., Adams, G.M., Weidner, E. Toxoplasma modifies macrophage phagosomes by secretion of a vesicular network rich in surface proteins. J Cell Biol. 1986; 103: 867-74. Silamut, K., Phu, N.H., Whitty, C., Turner, G.D., Louwrier, K., Mai, N.T., Simpson, J.A., Hien, T.T., White, N.J. A quantitative analysis of the microvascular sequestration of malaria parasites in the human brain. Am J Pathol. 1999; 155: 395-410. Sjöberg, K., Hosein, Z., Wåhlin, B., Carlsson, J., Wahlgren, M., Troye-Blomberg, M., Berzins, K., Perlmann, P. Plasmodium falciparum: an invasion inhibitory human monoclonal antibody is directed against a malarial glycolipid antigen. Exp Parasitol. 1991; 73: 317-25. Sklar, L.A., Hudson, B.S., Simoni, R.D. Conjugated polyene fatty acids as membrane probes: preliminary characterization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975; 72: 1649-53. Smith, E.R., Merrill, A.H., Obeid, L.M., Hannun, Y.A. Effects of sphingosine and other sphingolipids on protein kinase C. Methods Enzymol. 2000; 312: 361-73. Somerharju, P. Pyrene-labeled lipids as tools in membrane biophysics and cell biology. Chem Phys Lipids. 2002; 116: 57-74. Sonda, S., Hehl, A.B. Lipid biology of Apicomplexa: perspectives for new drug targets, particularly for Toxoplasma gondii. Trends Parasitol. 2006; 22: 41-7. Sperling, P., Heinz, E. Plant sphingolipids: structural diversity, biosynthesis, first genes and functions. Biochim Biophys Acta. 2003; 1632: 1-15. Spiegel, S., Kolesnick, R. Sphingosine 1-phosphate as a therapeutic agent. Leukemia. 2002; 16: 1596-602.

Referencias

205

Spiegel, S., Milstien, S. Sphingosine 1-phosphate, a key cell signaling molecule. J Biol Chem. 2002; 277: 25851-4. Spiess, M. Heads or tails--what determines the orientation of proteins in the membrane. FEBS Lett. 1995; 369: 76-9 Sprong, H., Kruithof, B., Leijendekker, R., Slot, J.W., van Meer, G., van der Sluijs, P. UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase is a class I integral membrane protein of the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 1998; 273: 25880-8. Staines, H.M., Dee, B.C., O'Brien, M., Lang, H.J., Englert, H., Horner, H.A., Ellory, J.C., Kirk, K. Furosemide analogues as potent inhibitors of the new permeability pathways of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes. Mol Biochem Parasitol. 2004; 133: 315-8. Staines, H.M., Dee, B.C., Shen, M.R., Ellory, J.C. The effect of mefloquine and volume-regulated anion channel inhibitors on induced transport in Plasmodium falciparum-infected human red blood cells. Blood Cells Mol Dis. 2004; 32: 344-8. Stellwagen, E. Chromatography on immobilized reactive dyes. Methods Enzymol. 1990; 182: 343-57. Straus, A.H., Levery, S.B., Jasiulionis, M.G., Salyan, M.E., Steele, S.J., Travassos, L.R., Hakomori, S., Takahashi, H.K. Stage-specific glycosphingolipids from amastigote forms of Leishmania (L.) amazonensis. Immunogenicity and role in parasite binding and invasion of macrophages. J Biol Chem. 1993; 268: 13723-30. Suh, K.N., Kain, K.C., Keystone, J.S. Malaria. CMAJ. 2004; 170: 1693-702. Sutterwala, S.S., Creswell, C.H., Sanyal, S., Menon, A.K., Bangs, J.D. De novo sphingolipid synthesis is essential for viability, but not for transport of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins, in African trypanosomes. Eukaryot Cell. 2007; 6: 454-64. Sutterwala, S.S., Hsu, F.F., Sevova, E.S., Schwartz, K.J., Zhang, K., Key, P., Turk, J., Beverley, S.M., Bangs, J.D. Developmentally regulated sphingolipid synthesis in African trypanosomes. Mol Microbiol. 2008; 70: 281-96 Tafesse, F.G., Ternes, P., Holthuis, J.C. The multigenic sphingomyelin synthase family. J Biol Chem. 2006; 281: 29421-5. Takeda, T., Utsuno, A., Okamoto, N., Ogihara, Y., Shibata, S. Synthesis of the alpha and beta anomer of an N-triglycosyl dipeptide. Carbohydr Res. 1990; 207: 71-9. Tamez, P.A., Bhattacharjee, S., van Ooij, C., Hiller, N.L., Llinás, M., Balu, B., Adams, J.H., Haldar, K. An erythrocyte vesicle protein exported by the malaria parasite promotes tubovesicular lipid import from the host cell surface. PLoS Pathog. 2008; 4: e1000118. Thompson, T.E., Tillack, T.W. Organization of glycosphingolipids in bilayers and plasma membranes of mammalian cells. Annu Rev Biophys Biophys Chem. 1985; 14: 361-86. Tilley, L., Hanssen, E. A 3D view of the host cell compartment in P. falciparum-infected erythrocytes. Transfus Clin Biol. 2008; 15: 72-81. Tissot, B., Gasiunas, N., Powell, A.K., Ahmed, Y., Zhi, Z.L., Haslam, S.M., Morris, H.R., Turnbull, J.E., Gallagher, J.T., Dell, A. Towards GAG glycomics: analysis of highly sulfated heparins by MALDI-TOF mass spectrometry. Glycobiology. 2007; 17: 972-82. Tomlinson, S., Raper, J. Natural human immunity to trypanosomes. Parasitol Today. 1998; 14: 354-9. Trager, W., Jensen, J.B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 1976; 193: 673-5.

Referencias

206

Trinchera, M., Carrettoni, D., Ghidoni, R. A part of glucosylceramide formed from exogenous lactosylceramide is not degraded to ceramide but re-cycled and glycosylated in the Golgi apparatus. J Biol Chem. 1991; 266: 9093-9. Trinchera, M., Fabbri, M., Ghidoni, R. Topography of glycosyltransferases involved in the initial glycosylations of gangliosides. J Biol Chem. 1991; 266: 20907-12. Trinchera, M., Fiorilli, A., Ghidoni, R. Localization in the Golgi apparatus of rat liver UDP-Gal:glucosylceramide beta 1-> 4galactosyltransferase. Biochemistry. 1991; 30: 2719-24. Turco, S.J. The leishmanial lipophosphoglycan: a multifunctional molecule. Exp Parasitol. 1990; 70: 241-5. Tuteja, R. Malaria - an overview. FEBS J. 2007; 274: 4670-9. Tuteja, R. Malaria - the global disease. FEBS J. 2007; 274: 4669 Uemura, A., Watarai, S., Kushi, Y., Kasama, T., Ohnishi, Y., Kodama, H. Analysis of neutral glycosphingolipids from Trypanosoma brucei. Vet Parasitol. 2006; 140: 264-72. Uhrig, M.L., Couto, A.S., Alves, M.J., Colli, W., de Lederkremer, R.M. Trypanosoma cruzi: nitrogenous-base-containing phosphatides in trypomastigote forms--isolation and chemical analysis. Exp Parasitol. 1997; 87: 8-19. Uhrig, M.L., Couto, A.S., Colli, W., de Lederkremer, R.M. Characterization of inositolphospholipids in Trypanosoma cruzi trypomastigote forms. Biochim Biophys Acta. 1996; 1300: 233-9. Uhrig, M.L., Couto, A.S., de Lederkremer, R.M., Zingales, B., Colli, W. Metabolic labelling and partial characterisation of a sulfoglycolipid in Trypanosoma cruzi trypomastigotes. Carbohydr Res. 1992; 231: 329-34. van Meer, G. Cellular organelles: how lipids get there, and back. Trends Cell Biol. 2000; 10: 550-2. van Meer, G., Holthuis, J.C. Sphingolipid transport in eukaryotic cells. Biochim Biophys Acta. 2000; 1486: 145-70. van Meer, G., Stelzer, E.H., Wijnaendts-van-Resandt, R.W., Simons, K. Sorting of sphingolipids in epithelial (Madin-Darby canine kidney) cells. J Cell Biol. 1987; 105: 1623-35. van Overloop, H., Gijsbers, S., Van Veldhoven, P.P. Further characterization of mammalian ceramide kinase: substrate delivery and (stereo)specificity, tissue distribution, and subcellular localization studies. J Lipid Res. 2006; 47: 268-83. Venable, M.E., Lee, J.Y., Smyth, M.J., Bielawska, A., Obeid, L.M. Role of ceramide in cellular senescence. J Biol Chem. 1995; 270: 30701-8. Venkataraman, K., Futerman, A.H. Ceramide as a second messenger: sticky solutions to sticky problems. Trends Cell Biol. 2000; 10: 408-12. Vermelho, A.B., de Meirelles Mde, N., Pereira, M.C., Pohlentz, G., Barreto-Bergter, E. Heart muscle cells share common neutral glycosphingolipids with Trypanosoma cruzi. Acta Trop. 1997; 64: 131-43. Vermelho, A.B., Hogge, L., Barreto-Bergter, E. Isolation and characterization of a neutral glycosphingolipid from the epimastigote form of Trypanosoma mega. J Protozool. 1986; 33: 208-13. Vesper, H., Schmelz, E.M., Nikolova-Karakashian, M.N., Dillehay, D.L., Lynch, D.V., Merrill, A.H. Jr. Sphingolipids in food and the emerging importance of sphingolipids to nutrition. J Nutr. 1999; 129: 1239-50.

Referencias

207

Vetter, D., Gallop, M.A. Strategies for the synthesis and screening of glycoconjugates. 1. A library of glycosylamines. Bioconjug Chem. 1995; 6: 316-8. Vial, H.J., Ancelin, M.L., Philippot, J.R., Thuet, M.J. Biosynthesis and dynamics of lipids in Plasmodium-infected mature mammalian erythrocytes. Blood Cells. 1990;16: 531-55; discussion 556-61. Vial, H.J., Thuet, M.J., Broussal, J.L., Philippot, J.R. Phospholipid biosynthesis by Plasmodium knowlesi-infected erythrocytes: the incorporation of phospohlipid precursors and the identification of previously undetected metabolic pathways. J Parasitol. 1982; 68: 379-91. Vial, H.J., Thuet, M.J., Philippot, J.R. Phospholipid biosynthesis in synchronous Plasmodium falciparum cultures. J Protozool. 1982; 29: 258-63. Villas-Boas, M.H., Wait, R., Silva, R.B., Rodrigues, M.L., Barreto-Bergter, E. Ceramide glycosylation and fatty acid hydroxylation influence serological reactivity in Trypanosoma cruzi glycosphingolipids. FEMS Microbiol Lett. 2005; 244: 47-52. Vunnam, R.R., Radin, N.S. Analogs of ceramide that inhibit glucocerebroside synthetase in mouse brain. Chem Phys Lipids. 1980; 26: 265-78. Vunnam, R.R., Radin, N.S. Short chain ceramides as substrates for glucocerebroside synthetase. Differences between liver and brain enzymes. Biochim Biophys Acta. 1979; 573: 73-82. Wang, T.Y., Leventis, R., Silvius, J.R. Fluorescence-based evaluation of the partitioning of lipids and lipidated peptides into liquid-ordered lipid microdomains: a model for molecular partitioning into "lipid rafts". Biophys J. 2000; 79: 919-33. Wang, T.Y., Silvius, J.R. Different sphingolipids show differential partitioning into sphingolipid/cholesterol-rich domains in lipid bilayers. Biophys J. 2000; 79: 1478-89. Ward, G.E., Miller, L.H., Dvorak, J.A. The origin of parasitophorous vacuole membrane lipids in malaria-infected erythrocytes. J Cell Sci. 1993; 106: 237-48. Welti, R., Mui, E., Sparks, A., Wernimont, S., Isaac, G., Kirisits, M., Roth, M., Roberts, C.W., Botté, C., Maréchal, E., McLeod, R. Lipidomic analysis of Toxoplasma gondii reveals unusual polar lipids. Biochemistry. 2007; 46: 13882-90. Wheeler, S.F., and Harvey, D.J. Extension of the in-gel release method for structural analysis of neutral and sialylated N-linked glycans to the analysis of sulfated glycans: application to the glycans from bovine thyroid-stimulating hormone. Anal Biochem. 2001; 296, 92-100. White, J.H., Kilbey, B.J. DNA replication in the malaria parasite. Parasitol Today. 1996; 12: 151-5. White, N.J. How antimalarial drug resistance affects post-treatment prophylaxis. Malar J. 2008; 7: 9. White, N.J. Plasmodium knowlesi: the fifth human malaria parasite. Clin Infect Dis. 2008; 46: 172-3. White, N.J. Qinghaosu (artemisinin): the price of success. Science. 2008; 320: 330-4. Winter, G., Fuchs, M., McConville, M.J., Stierhof, Y.D., Overath, P. Surface antigens of Leishmania mexicana amastigotes: characterization of glycoinositol phospholipids and a macrophage-derived glycosphingolipid. J Cell Sci. 1994; 107: 2471-82. Wiseman, H., Halliwell, B. Tamoxifen and related compounds protect against lipid peroxidation in isolated nuclei: relevance to the potential anticarcinogenic benefits of breast cancer prevention and therapy with tamoxifen? Free Radic Biol Med. 1994; 17: 485-8. Wolf, D.E., Winiski, A.P., Ting, A.E., Bocian, K.M., Pagano, R.E. Determination of the transbilayer distribution of fluorescent lipid analogues by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry. 1992; 31: 2865-73.

Referencias

208

Zhang, K., Hsu, F.F., Scott, D.A., Docampo, R., Turk, J., Beverley, S.M. Leishmania salvage and remodelling of host sphingolipids in amastigote survival and acidocalcisome biogenesis. Mol Microbiol. 2005; 55: 1566-78. Zhang, K., Showalter, M., Revollo, J., Hsu, F.F., Turk, J., Beverley, S.M. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO J. 2003; 22: 6016-26. Zheng, W., Kollmeyer, J., Symolon, H., Momin, A., Munter, E., Wang, E., Kelly, S., Allegood, J.C., Liu, Y., Peng, Q., Ramaraju, H., Sullards, M.C., Cabot, M., Merrill, A.H. Jr. Ceramides and other bioactive sphingolipid backbones in health and disease: lipidomic analysis, metabolism and roles in membrane structure, dynamics, signaling and autophagy. Biochim Biophys Acta. 2006; 1758: 1864-84.