GPC-光散乱法による高分子特性解析

昭光サイエンティフィック（株）理化学機器事業本部

発表内容  GPC（SEC）法の概要とその問題点  静的光散乱法の概要

 GPC-光散乱システムの構成  アプリケーションの紹介

 粘度検出器の紹介

代表的な高分子の分子量測定法

方法 型 平均分子量 有効な測定分子量範囲

膜浸透圧 絶対法 Mn 104～106

蒸気圧浸透法 絶対法 Mn ＜105

NMR 絶対法 Mn ＜105

光散乱 絶対法 Mw 103～5×107

X線小角散乱 絶対法 Mw 102～106

沈降平衡 絶対法 Mw,Mz 102～106

固有粘度 相対法 Mv 102～5×107

GPC 相対法 Mn,Mw,Mz 102～5×106

高分子学会編　新高分子実験学　高分子実験の基礎‐分子特性解析‐（共立出版）より一部抜粋

GPC（SEC）法とは

時間 排除限界容量

排除

排除限界分子量：100,000 排除限界分子量：4,000,000

分子量既知の標準品で較正曲線を作る。 分子量未知の試料を測定する。 作成した較正曲線で 分子量の計算をする。

Elution volume

● ●

● ●

●

●

Elution volume

●

● ●

● ●

●

MW

Elution volume

●

分子量分布測定の手順

GPC法の問題点  標準試料との相対比較法であり、標準試料と構造の異なる試料に対しての分子量測定精度を期待できない。

 GPCカラム内の充填ゲルとの相互作用（吸着、排除）がある試料に対して適応しない。

多角度光散乱検出器の紹介Multi Angle Light Scattering;MALS

GPCに接続可能な光散乱検出器   多角度光散乱検出器（Wyatt Technology社製） 18角度、8角度、3角度検出器がある。オプションで粘度検出器も追加可能

  2角度式光散乱検出器（Precision Detectors社製） 90°と15°の2角度検出器

  トリプル検出器（Viscotek社製） 90°＋15°光散乱検出器、粘度検出器、RI検出器の組み合わせ

  低角度光散乱検出器；LALLS（東ソー製他） 低角度1点の検出器、現在は販売されていない。

  フロー式動的光散乱測定器（Malvern社製他） 粒子径測定のみで、分子量は測定できない

光散乱

分子に光があたると、 分子には振動双極子が誘起される。

光の波長と同じ電磁波（光）を放射=光散乱

濃度→0、測定角度→0の外挿点で

散乱強度 ∝（濃度） （分子量） （dn/dc）２

静的光散乱測定（分子量）

重い粒子も軽い粒子も同じ波長で振動する 溶液中では分極率は屈折率増分（dn/dc）の2乗に比例

scattered lightincident beam

静的光散乱測定（分子量）

分子量1万×10個　濃度1mg/mL　散乱強度

分子量2万×5個　濃度1mg/mL　散乱強度

濃度検出器は応答量変わらない　

分子量10万×1個　濃度1mg/mL　散乱強度

濃度検出器は応答量変わらない　

蛋白質が会合するとした場合のシュミレーション 　　　　　　　　　　（dn/dcが変化しないと仮定する）

モノマー

ダイマー

会合体

1V

1０V

２V

ﾚｰｻﾞｰ光

分子ｻｲｽﾞ大 散乱点が複数

分子ｻｲｽﾞ小 散乱点が１つ

各角度の 散乱強度 が同じ

角度により 散乱強度が 違ってくる

強 弱

静的光散乱測定（分子サイズ）

散乱光の干渉作用

微小ｻｲｽﾞ分子 Rg ＜10nm

巨大ｻｲｽﾞ分子 Rg ＞10nm

非等方散乱

等方散乱

Rg：根平均慣性回転半径

静的光散乱測定（分子サイズ）

散乱光の干渉作用

静的光散乱法理論式

( ) ( )cA

MPRcK

221+=

∗

θθ

( ) McA

RcK 120 2 +=∗K　：光学定数＝4π2（dn/dc)2 n0

2／Naλ04

n0　：溶媒の屈折率、Na：アボガドロ数 λ0：真空中の入射光の波長

R（θ） ：過剰還元散乱強度 C　 ：試料濃度 M　 ：重量平均分子量 A2　 ：第二ビリアル係数 P（θ） ：分子内干渉因子 P（θ）-１＝１＋1/3k2＜S2＞＋O（k4） k＝（4π/（λ0/n0））sinθ/2

角度を0°に近似すると・・・ P(0°) → 1

( ) Mr

Mn

RcK

g1

2sin

316 22

20

20

2

+⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛=∗ θ

λπ

θ

濃度を0に近似すると・・・C→0

A2 from initial slope !

rms radius from initial slope!

Zimm plot: ( )kc

RcK

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∗

2sin vs.Plot 2 θ

θ

Zero angle: Zero concentration:

( ) McA

RcK 120 2 +=∗

( ) Mr

Mn

RcK

g1

2sin

316 22

20

20

2

+⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛=∗ θ

λπ

θ

GPC-MALS測定では、 光散乱測定時には非常に希薄濃度状態を検出している。

散乱強度の測定角度変化∝分子ｻｲｽﾞ （RMS半径＝慣性回転半径＝Rg）

ポリスチレンMw=8,000,000g/mol 15角度測定例

青点=散乱強度の逆数

初期勾配∝Rg

Y軸切片=1/Mw

MALS測定実測例

laser

θ

検出フォトダイオード

低角度 高角度

MALS（DAWN HELEOS）の検出部

フローセルの周りに18個の検出器を設置

GPC-MALSシステムの構成

MALSのﾃﾞｰﾀ取り込み

・ 全検出器同時に1～8 ﾎﾟｲﾝﾄ / secで取り込み ・ 各ｽﾗｲｽ毎、分子量（Mw）RMS半径（Rg）測定

3D Plot - stdpst7s

17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3

ｽﾗｲｽﾃﾞｰﾀ

溶出容量 測定角度

高角度

低角度

散乱強度

・ｽﾗｲｽﾃﾞｰﾀ例 Ve:12.342（mL） 　Mw:7.3E+6 (g/mol) 　　　　Rg:165.5 (nm)

・ MALS 3Dﾌﾟﾛｯﾄ　　　　　　　736ｽﾗｲｽ 測定角度　　23°～　147°　 全15角度

SEC-MALS

dn/dcとは…

①　溶媒

②　試料

③　温度

④　波長

Ｃ=２ Ｃ=１ Ｃ=０

試料濃度による屈折率の増分

一定の条件下では変化しない物理量

Mw>2000では分子量にほとんど依存しない

空気

溶媒

光

入射光の角度が濃度に比例する

屈折率増分（dn/dc）

dn/dc値の測定方法

 専用の示差屈折率計を使用する。 （最適な測定法）

 GPCカラムからのサンプル回収率を100%と仮定し、dn/dc既知の物質を用いて校正したRI検出器より得られたピーク面積値とサンプル注入量からdn/dc値を見積もる。 （簡易的に求める方法ではあるが、様々な問題点あり）

示差屈折率検出器 Optilab rEX

機能  dn/dc測定が可能  絶対屈折率測定が可能  HPLC用RI検出器として使用可能

特長  光源波長の選択が可能（LED交換）  （633、658、690nm　etc.）  温調範囲；4～50℃  ワイドダイナミックレンジ

第　５　回　M A L S　研　究　会　談　話　会

0 5 10 15 20-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Time (minutes)

Adj

uste

d O

utpu

t (vo

lts)

Set Concentrations

C=0.05%

C=0.10% C=0.15%

C=0.20% C=0.25%

測定時間

OPT

ILA

B 信号強度

dn/dc測定 実際例　Pullulan48K in 50mM NaNO3

dn/dc測定 実際例　Pullulan48K in 50mM NaNO3

0.00

-41.00x10

-42.00x10

-43.00x10

-44.00x10

dn

dn/dc Curve

0.0 5.0x10-4 1.0x10-3 1.5x10-3 2.0x10-3 2.5x10-3

Concentration (g/mL)

-11.30x10

-11.35x10

-11.40x10

-11.45x10

-11.50x10

-11.55x10

dn/c

(mL/

g)

Known Calibration constant (1/volts): 1.1888e-03dn/dc (mL/g) : 0.1425 ± 0.0002

試料濃度 (g/mL)

dn/

dc (m

L/g

) n

各種ポリスチレンの測定 サンプル

１．National Institute of Standards and Technology;NIST（米国）多分散ポリスチレン標準　SRM-706a 　Mw=285,000（保証値）

２. Polymer Standard Service社（ドイツ） ポリスチレン標準 8-star, Mn=45,500 one arm

GPC-MALS測定条件 カラム ：Shodex GPC KF-806L（昭和電工製） 溶離液 ：トルエン

流速 ：1.0mL/min 光散乱 ：DAWN HELEOS（Wyatt Technology社製） RI検出器 ：Optilab rEX（Wyatt Technology社製）

分子量vs.溶出時間

測定値　 SRM706a Mw＝2.896×105

8-Star Mw＝3.854×105

SRM706a 8-Star

参考値　 SRM706a Mw＝2.85×105

8-Star＊ Mw＝3.64×105

8-StarのMw値は、Mn=45,500（one arm)×8 とした計算値

回転半径vs.溶出時間

測定値 SRM-706a Rz=27.9nm 8-Star Rz=15.6nm

参考値 SRM-706a Rz=27.8nm

SRM706a

8-Star

コンフォメーションプロット（logMw vs.log〈rg〉

SRM706a；傾き0.62

8-Star；傾き0.55

SRM706a　GPC測定

mV

Log M

minutes6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0

0.0

0.5

1.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

1

測定結果 Mn＝103,015 Mw＝292,369

較正曲線作成に使用したPS標準（8点） Mw= 3,053,000

956,000 483,000 189,300

60,450 30,300 10,050

3,790

保証値 Mw＝285,000

8-StarポリスチレンのGPC測定

mV

Log M

minutes6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

1

測定値 Mn＝187,511 Mw＝254,115

較正曲線作成に使用したPS標準（8点） Mw= 3,053,000

956,000 483,000 189,300

60,450 30,300 10,050

3,790

参考値 M＝364,000

GPC-MALS-粘度検出器への展開

  固有粘度[η]の測定   GPCの検出器として使用   MALSとの組み合わせによりMark-Howink-Sakurada　Plotを容易に作成可能

( )4 / 2sp P IP Pη = Δ − Δ

粘度検出器測定原理

•  4 Capillary Bridge

0/ 1spη η η= −

0[ ] lim /spc

cη η→

=  固有粘度[η]

  比粘度ηsp

·Rod-like polymer → > 1.0

·Random coil polymer → 0.5 – 0.7

[η] = KM α

log [η] = logK + α log M

·Spherical molecule → < 0.5

Mark-Houwink-Sakurada equation

北海道大学　工学研究科　生物機能高分子専攻　佐藤敏文准教授よりご提供

Figure. Mark-Houwink plots in DMF at 25 oC of �����poly-1 (hyperbranched) and poly-3(linear).

Satoh, T. Kakuchi, T. et al�Macromolecules, 40(26), 9313-9321(2007)

Z�

Mark-Houwink-Sakurada plots

北海道大学　工学研究科　生物機能高分子専攻　佐藤敏文准教授よりご提供

まとめ

GPC-光散乱法は・・・  構造の影響や、サンプルとカラム充填剤との相互作用の影響を受けず真の分子量分布、分子サイズ分布を測定可能である。

 分岐度、形状情報を得られる。粘度検出器を付加することにより、その範囲はさらに広がる。