Guia Tp 2013

7/25/2019 Guia Tp 2013

1/61

QUMICA BIOLGICA GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

1

FFaaccuullttaaddddeeCCiieenncciiaassEExxaaccttaassQQuummiiccaassyyNNaattuurraalleessUUnniivveerrssiiddaaddNNaacciioonnaallddeeMMiissiioonneess

GGUUIIAADDEETTRRAABBAAJJOOSSPPRRAACCTTIICCOOSS Licenciatura en Gentica Profesorado en Biologa

Equipo Docente:

Ing. Eusebia ValdezIng. Nora SosaIng. Daro FerreyraLic. Pablo Martina

Auxiliares

Armella Sierra, Alicia B.Galeano Mariana BelnVillan Claudio Sebastian

AO 2013

7/25/2019 Guia Tp 2013

2/61


2

TRABAJO PRCTICO N 1OBTENCIN EXPERIMENTAL DEL PK

AMINOCIDOS

OBJETIVOS:

Obtencin experimental de los pK de dos aminocidos: cido asprtico y glicina, a partirde sus correspondientes curvas de titulacin.

FUNDAMENTOS TERICOS:

El conocimiento de las propiedades cido-base de los aminocidos es sumamenteimportante para la comprensin y el anlisis de las protenas.

Los aminocidos cristalizados poseen puntos de fusin relativamente elevados,generalmente por encima de los 200C. Son mucho ms solubles en agua que en disolventesno polares. Tales propiedades son precisamente las que deben esperarse si el retculo de lasmolculas en estado cristalino est estabilizado por fuerzas electrostticas de atraccin entregrupos con cargas opuestas, como ocurre con el elevado punto de fusin de la red cristalina delas sales, como el cloruro de sodio.

Estos y otros datos han conducido a la conclusin de que los aminocidos seencuentran y cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras en forma de ionesdipolares:

H H

R C COOH R C COO-

NH2 NH3+

Forma no disociada Forma dipolar o de ion hbrido

Cuando se disuelve en agua un in hbrido cristalizado como la alanina, puede actuar comocido (dador de protones) o como base (aceptor de protones):

H H

Como cido: CH3 C COO- H+ + CH3 C COO-

NH3+

NH2

H H

Como base: H+ + CH3 C COO- CH3 C COOH

NH3+

NH3+

7/25/2019 Guia Tp 2013

3/61


3

Un (-aminocido sencillo, monoamnico y monocarboxlico, por ejemplo la alanina, esconsiderado como un cido dibsico cuando se halla en su forma totalmente protagonizada;puede ceder dos protones durante su valoracin completa como una base. El curso de talvaloracin en dos etapas con NaOH puede representarse mediante las siguientes ecuaciones,que indican la naturaleza de las especies inicas que intervienen:Cada etapa de la disociacin tiene un valor de pK.

El pK1 indica el valor de pH al cual se encuentran presentes concentracionesequimoleculares del dador de protones (H3N

+CHROCOOH) y del aceptor de protones(H3N

+CHROO-); el pK2 es el correspondiente valor de pH cuando se encuentran presentesconcentraciones equimoleculares de H3N

+CHROO-y H2NCHROO-.

El pH al cual la molcula no posee carga elctrica neta y no se desplaza en un campo elctrico,es el pH isoelctrico, que es la media aritmtica entre los valores de pK 1y pK2.

MATERIALES:

Equipos: pHmetro

Reactivos: Aspartato al 5% Glicina al 5% HCl 2N NaOH 1N

DESARROLLO DEL PRCTICO:

Titulacin con cido Asprtico:En un vaso de precipitado se colocan 50 ml de aspartato al 5% acidulado con HCl 2N.

Esta solucin se titula con NaOH 1N.

Se confecciona una tabla consignando los valores de pH obtenidos por cada volumende lcali agregado (volumen = 0,5 ml por vez). Con estos datos se confecciona la curva detitulacin correspondiente, en papel milimetrado.

Titulacin con Glicina:En un vaso de precipitado se colocan 50 ml de glicina al 5% alcalinizada con NaOH 1N.

Esta solucin se titula con HCl 2N.Se confecciona una tabla consignando los valores de pH obtenidos por cada volumen de cidoagregado (volumen = 0,5 ml por vez). Con estos datos se confecciona la curva de titulacincorrespondiente, en papel milimetrado.

COMPLEMENTO PRCTICO N1Consideraciones tericas

Amortiguadores: Se llaman disoluciones amortiguadoras, tampones o buffers aquellasdisoluciones cuyo pH vara muy poco cuando se le aaden cantidades moderadas de cidos obases fuertes. Desde el punto de vista biolgico los amortiguadores controlan el pH de lasclulas y de los diversos lquidos corporales: sangre, lquido intersticial, etc. y desde el puntode vista del laboratorio, los amortiguadores son indispensables para controlar el pH de casitodas las reacciones bioqumicas: cinticas, enzimticas, cultivos de rganos y tejidos.Propiedades de los amortiguadores: Deduciendo de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch

pH= pK+ log (sal/ cido)

7/25/2019 Guia Tp 2013

4/61


4

1) El pH del amortiguador depende de la naturaleza del cido dbil que lo integra. Cuando laconcentracin del cido y la sal son iguales, el pH coincide con el pK.

2) El pH depende de la proporcin sal/cido, pero no de las concentraciones absolutas; as alaadir agua el pH no vara.

3) Prcticamente hasta que uno de los dos est prximo a agotarse la fluctuacin del pH esmnima.

4) La capacidad amortiguadora, definida como la cantidad de cido o base que admite unamortiguador sufriendo un cambio de pH en una unidad, es mxima en su pK

PROBLEMAS DE pK Y DE pH.

1. Calcular el pKadel cido lctico, dado que cuando la concentracin de cido lctico libre es0,010 M y la concentracin de lactato es 0,087 M, el pH es 4,80.

2. Calcular el pH de una mezcla de cido actico 0,1 M y de acetato sdico 0,2 M. El pKadelcido actico es 4,76.

3. Calcular la relacin de la concentracin de acetato y de cido actico requerida en unsistema tampn a pH 5,3.

4. Propiedades de un tampn. El aminocido glicina se utiliza a menudo como principalingrediente de un tampn en experimentos bioqumicos. El grupo amino de la glicina quetiene un pKade 9,6, puede existir bien en la forma protonada (-NH3

+) o bien como base libre(-NH2) debido al equilibrio reversible:

R-NH3+ R-NH2+ H

+

En qu intervalo de pH puede utilizarse la glicina como tampn eficiente debido a su grupoamino?

5. En una solucin 0,1 M de glicina a pH 9,0. qu fraccin del grupo amino tiene la glicina enla formaNH3

+?6. Qu cantidad de KOH 5 M debe aadirse a 1,0 L de glicina 0,1 M a pH 9,0 para elevar su

pH exactamente a 10,0?7. Para que el 99% de la glicina est en su forma NH3+, cul debe ser la relacin numrica

entre el pH de la solucin y el pKadel grupo amino de la glicina?8. Efecto del pH sobre la solubilidad. La naturaleza fuerte polar y formadora de puentes de

hidrgeno del agua hace que sea un disolvente excelente para las especies inicas(cargadas). En cambio, las molculas orgnicas apolares no ionizadas, tales como elbenceno son relativamente insolubles en agua. En principio, la solubilidad en agua de todoslos cidos o bases orgnicos se puede incrementar por desprotonacin o protonacin,respectivamente, de las molculas, para que formen una especie cargada. Por ejemplo, lasolubilidad del cido

benzoico en agua es baja. La adicin de bicarbonato sdico sube el pH de la solucin ydesprotona el cido benzoico formando el ion benzoato que es bastante soluble en agua.

9. Las molculas (a) a (c) (segunda columna) son ms solubles en solucin de NaOH 0,1 Mo en HCl 0,1 M?

7/25/2019 Guia Tp 2013

5/61


5

10. Tratamiento de la urticaria por veneno de hiedra.Catecoles sustituidos con grupos alquilode cadena larga son los componentes del veneno de hiedra y de roble que producenurticaria caracterstica. Si estuviera sometido a la accin del veneno de hiedra, cul de lostratamientos siguientes aplicara al rea afectada? Justifique su eleccin.

Lavar el rea con agua fra.

Lavar el rea con vinagre diluido o jugo de limn. Lavar el rea con jabn y agua Lavar el rea con jabn, agua y bicarbonato sdico.

11. pH y absorcin de frmacos. La aspirina es un cido dbil con un pK ade 3,5.12. Se absorbe a la sangre a travs de las clulas que forran el estmago y el intestino

delgado. La absorcin requiere el paso a travs de la membrana celular, que vienedeterminado por la polaridad de la molcula. Las molculas cargadas y muy polares pasanlentamente mientras que las que son hidrofbicas y neutras pasan rpidamente. El pH deljugo gstrico en el estmago es alrededor de 1,5 y el pH del contenido en el intestinodelgado es alrededor de 6 se absorbe en sangre ms aspirina del estmago o del intestinodelgado? Justifique claramente su eleccin.

13. En qu punto se presenta la glicina predominantemente en la forma H3N-CH2-CO.OH?

14. En qu punto la carga neta media de la glicina es de +1/2?15. En qu punto esta ionizado el grupo amino en la mitad de las molculas?16. En qu punto es el pH igual al pK del grupo carboxilo?17. En qu punto es el pH igual al pK del grupo amino protonado?18. En qu punto tiene la glicina su mxima capacidad tamponante?19. En qu punto es la carga neta media igual a cero?20. En qu punto ha sido ya completamente titulado el grupo carboxilo?21. En qu puntos estn la mitad de los carboxilos ionizados?22. En qu punto esta totalmente titulada la glicina?23. En qu punto la estructura de la especie predominante es H3N

+-CH2-CO.O-?

24. En qu punto las estructuras de las especies predominantes corresponden a una mezcla50:50 de H3N

+-CH2-CO.O-y H2N-CH2-CO.O

-?

25. En qu punto la carga neta media de la glicina es 1?26. En qu punto las estructuras de las especies predominantes consisten en una mezcla

50:50 de H3N+-CH2-CO.OH y H3N

+-CH2-CO.O-?

27. Qu punto corresponde al punto isoelctrico?28. En qu punto la carga neta media de la glicina es 1/2?29. Qu punto representa el final de la titulacin?30. Si uno quisiese utilizar la glicina como un tampn eficiente, qu puntos representaran las

peores regiones de pH para su poder tamponante?.31. En qu punto de la titulacin la especie predominante es H2N-CH2-CO.O

-?

7/25/2019 Guia Tp 2013

6/61


6

TRABAJO PRCTICO N 2AMINOCIDOS

CROMATOGRAFA MONO Y BIDIMENSIONAL EN PAPEL.EFECTOS DE LAS SALES.

OBJETIVO DEL PRCTICO:

1. Separacin e identificacin de aminocidos individuales por CromatografaBidimensional en papel, utilizando diferentes solventes.

2. Demostrar el efecto adverso del aumento de la concentracin de sal inorgnicacontenida en la muestra original.

FUNDAMENTO TERICO:

La separacin de una mezcla de sustancias se puede efectuar satisfactoriamente enuna direccin nica, pero en algunos casos, cuando la complejidad de la mezcla da lugar a unaincompleta separacin de los componentes en un solo disolvente, se emplea la cromatografa

bidimensional, con dos disolventes para producir una mejor resolucin de las manchas.Los dos disolventes actan sucesivamente, en dos direcciones que forman un ngulorecto, y el papel se seca entre las dos actuaciones.

En la Cromatografa Bidimensional, se aprovecha el comportamiento diferente de lassustancias ante dos solventes distintos, para separar mezclas que eran inseparables en cadauno de los solventes aislados.

Se aplica la mancha o siembra en una esquina del papel de filtro y se eluye con undisolvente S1en direccin ascendente, que corresponde al eje Y.

Se seca, y se lo hace girar 90 en sentido de las agujas del reloj, de modo tal que el ejeX quede en posicin vertical. Se eluye nuevamente pero esta vez con el disolvente S2, queascender verticalmente.

El efecto final es una mayor resolucin en virtud de:

a) El aumento de trayectoria cromatogrfica disponible.b) Las sustancias que circulan juntas en un solvente, circulan separadas en unsegundo solvente.

El anlisis de aminocidos tiene un valor incalculable para el estudio del metabolismo.El examen de las reacciones de las enzimas y para la determinacin de los patrones normalescaractersticos que se encuentran en sangre y orina en algunas enfermedades.

Los aminocidos o sus mezclas pueden ser analizados por cromatografa,descendentes sobre papel.

En el caso de mezclas complejas es preferible la cromatografa bidimensional. Los RFde los aminocidos son los mismos, acten solos o en mezcla con otros.

Las cantidades crecientes de sales inorgnicas afectan de manera adversa a la

cromatografa de aminocidos (y de otros compuestos orgnicos). Las sales producendistorsin, as mismo, en el patrn de aminocidos de la orina. Con frecuencia, el RF de lassustancias individuales cambia considerablemente en presencia de la sal. No es seguro que enpresencia de la sal se produzca la reaccin con la ninhidrina. La eliminacin de la sal de lassoluciones biolgicas puede llevarse a cabo fcil y completamente con resinas de intercambioinico.

Los aminocidos Leucina, Fenilalanina, Metionina, Tirosina y Triptfano se separanmediante los sistemas: Bu tanol terciar io : Meti let i lcetona : Agu a : Diet i lamin a, o,Agua :Butano l : Metanol.

Los restantes aminocidos no migran y pueden separarse con el sistema Fenol : Aguao n-Butano : A gua.

El secado del papel debe hacerse a la menor temperatura posible ya que el exceso decalor provoca prdidas de los aminocidos, especialmente cuando se utiliza fenol comodisolvente.

7/25/2019 Guia Tp 2013

7/61


7

El reactivo ms utilizado para localizar las manchas es la ninhidrina, pudiendopulverizarse sobre el papel o sumergirse el papel en una cubeta con solucin de ninhidrinacomo si fuera un eluyente.

Los cromatogramas revelados con nihidrina pueden conservarse sumergiendo el papelen algn barniz adecuado.

MARCHA PRCTICA:

Aminocidos utilizados: Tirosina, Asparagina, Cistena y Glutamina. Revelador: Ninhidrina (disolver 200 mg de ninhidrina en 100 ml de acetona) Solventes: S1 Butanol : Metanol : Agua (4 : 5 : 1)

S2 Fenol : Agua (4 : 1)

Nota: es preciso lavarse bien las manos antes de tocar el papel porque los aminocidos sehallan en el sudor. De todos modos, el papel debe sujetarse nicamente por los bordes, ya quelas huellas digitales aparecen como manchas confusas de color, luego del tratamiento conrevelador.

DESARROLLO DEL PRCTICO:

Se formarn dos comisiones:

COMISIN 1:1) Preparar S1(aproximadamente 25 ml), colocarlo en la cubeta y taparlo.2) Sembrar la mezcla de aminocidos sobre el borde derecho anterior del papel de

filtro. Hacer una marca en el borde superior derecho. Dejar secar.3) Dar al papel la forma de un cilindro, sujetar con un clip, colocar el cilindro en la

cubeta con la zona sembrada hacia abajo, cuidando que el papel no toque las

paredes del vidrio. Cerrar rpidamente la cubeta.4) Retirar el cromatograma cuando el solvente ha llegado hasta aproximadamente 2

cm del borde superior. Dejar secar.5) Girar 90 el papel en el sentido de las agujas del reloj.6) Formar nuevamente un cilindro e introducir en la cubeta con S 2 (previamente

saturada).7) Dejar actuar el eluyente, retirar, dejar secar y revelar con ninhidrina.

COMISIN 2:1) Preparar S1(aproximadamente 25 ml), colocarlo en la cubeta y taparlo.2) Marcar suavemente la lnea de base como para realizar cuatro siembras. Sembrar,

partiendo del borde inferior izquierdo un aminocido (Tirosina), realizar en total tressiembras (tres veces en cada uno). Sobre la segunda siembra, una vez seco elcromatograma, sembrar dos veces ClNa, dejando secar entre cada siembra. Sobrela tercer marca, sembrar cuatro veces ClNa. Sobre la cuarta marca solo sembrarClNa, dejando secar entre cada siembra.

3) Enrollar el papel de filtro, sujetar con un clip, colocar en la cubeta y tapar.4) Retirar el cromatograma cuando el disolvente ha llegado hasta unos 2 cm del borde

superior. Dejar secar.5) Revelar con ninhidrina y observar el efecto que producen las cantidades crecientes

de sales inorgnicas sobre la Cromatografa de los aminocidos.

7/25/2019 Guia Tp 2013

8/61


8

TRABAJO PRCTICO N 3LPIDOS

CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA: SEPARACIN DE FOSFOLPIDOS.

OBJETIVO:

Este trabajo prctico tiene por objetivo separar los fosfolpidos presente en la yema delhuevo, utilizando la tcnica de Cromatografa en capa delgada.

FUNDAMENTO TERICO:

Los lpidos cumplen en el cuerpo humano varias funciones: son componentesestructurales de las membranas celulares, constituyen una importante fuente de energamediante la oxidacin de los cidos grasos, siendo esta fuente energtica acumulada comoreserva en forma de triacilglicridos en el tejido adiposo. Adems existen cuatro vitaminas (A,D, E y K) de naturaleza lipdica, y de las prostaglandina, sustancias que intervienen en

procesos diversos : como la contraccin del msculo liso y la regulacin intercelular, sonderivados lipdicos.Desde el punto de vista de la salud, el transporte de lpidos en la sangre es un tema

extremadamente importante, ya que anormalidades en este proceso puede ser un factorimportante en el desarrollo de la arteriosclerosis. La obesidad resulta del deposito excesivo delpidos en el organismo.

La Diabetes Mellitus, la Icteria obstructiva, la Pancreatitis, estn asociados conanormalidades en los lpidos sanguneos. Por ultimo, no pueden dejar de mencionarseenfermedades genticas no muy difundidas, denominadas Lipidosis causadas por laacumulacin de esfingolpidos en diversos rganos. Por esta razn es necesario familiarizarsecon los fundamentos de la bioqumica de los lpidos y su metabolismo, para comprender losefectos metablicas asociados a los trastornos patolgicos a los que se hizo mencin.

Los lpidos se han clasificados de diversas manera, una de las formas ms satisfactoriaes la que se basa en la estructura de sus esqueletos. Los lpidos complejos que se caracterizanpor tener cidos grasos como componente, tambin son llamados lpidos saponificables porque producen jabones por hidrlisis alcalina. Los lpidos sencillos no tienen cidos grasos, ypor lo tanto no son saponificables.

Tabla 1: Clasificacin de lpidos.

Tipo de lpido Esqueleto

Complejos(saponificables)Acilglicridos Glicerina

Fosfoglicridos 3-fosfato glicerolEsfingolpidos Esfingosina

Ceras Alcoholes no polares de PMelevado

Simples(insaponificables)

TerpenosEsteroides

Prostaglandina

7/25/2019 Guia Tp 2013

9/61


9

MARCHA PRCTICA

1. Preparacin de las placas: Tomar con pinzas dos portaobjetos limpios ydesengrasados; sumergirlo en una solucin de slicagel. Dejar secar en posicinhorizontal. Llevar las placas a una estufa a 120 durante 1 hora, para activarlas.Guardarla en un desecador si no se las utilizan de inmediato.

2. Extraccin de fosfolpidos de la yema de huevo: A 1 ml de solucin de yemade huevo agregar 4 ml de una mezcla de cloroformo:etanol (2:1); agitar. Separar lasfases con una pipeta Pasteur. Descartar la superior.

3. Siembra del material: Sembrar una pequea gota en la fase clorofrmica en unpunto medio a 0.5 cm del borde inferior de la placa. El borde inferior es aquel hastael cual llega la capa de slicagel, siendo el borde superior aquel con una franjalibre que permita manipular la placa.

4. Preparar el Solvente: Cloroformo : metanol : agua (65 : 35 : 4)5. Desarrollo del cromatograma: Colocar la placa con el borde sembrado hacia

debajo de modo que la capa de slicagel quede sumergida 1 o 2 ml en el solvente(el nivel de este no debe llegar al lugar de siembra). Tapar la cuba. Dejar correrhasta que el frente de solvente llegue casi al borde superior. Sacar la placa de la

cuba y dejar secar en posicin horizontal. Tapar la cuba para evitar la evaporacindel solvente.6. Revelado de las placas:Colocar las placas en un frasco conteniendo yodo slido.

Se produce la tincin de los lpidos por accin de los vapores de yodo.

7/25/2019 Guia Tp 2013

10/61


10

TRABAJO PRCTICO N 4CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA HPLC

1. Qu es HPLC?2. Tipos de cromatografa lquida3. Diagrama de un sistema HPLC4. Solventes utilizados5. Bombas6. Sistema de inyeccin de muestras7. Columnas y fases estacionarias8. Deteccin9. Anlisis cuantitativo

1. Qu es HPLC?La cromatografa lquida es una versin de la cromatografa, es un mtodo fsico deseparacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases:

Una fase estacionaria: slida o lquida Y la otra fase es mvil: lquida, movindose por percolacin a travs de este lecho.

2. Tipos de cromatografa lquidaBasndonos en la naturaleza de la fase estacionaria se clasifican en:

Cromatografa de adsorcin Cromatografa de particin Cromatografa de intercambio inico Cromatografa de exclusin

Cromatografa de adsorcin: la separacin se basa en repetidas etapas deadsorcin - desorcin, es un fenmeno superficial de interaccin entre la faseestacionaria (adsorbente) y el soluto.

Cromatografa de particin:la separacin se realiza por etapas de particin(distribucin de los componentes entre dos fases) entre la fase mvil y la faseestacionaria.

Cromatografa de intercambio fnico: La fase estacionaria tiene la superficie

cargada de iones con una carga contraria a los componentes que queremosseparar. As cuanto mayor sea la carga de la muestra mas fuertemente seratrada por la fase estacionaria y ms tiempo tardar en salir de la columna (eluir).La fase mvil es un tampn acuoso en el que el pH y la polaridad son las variablesque se utilizan para controlar el tiempo de elusin, esto es, la separacin.

Cromatografa de exclusin:Aqu la fase estacionaria posee poros de dimensionescomprendidas entre ciertos lmites y la muestra es entonces retenida o filtradasegn su tamao molecular. Los componentes de mayor tamao eluyen primero ylos de menor tamao por ltimo ya que estas ltimas tienen que recorrer un mayorcamino en los poros de la fase estacionaria.

7/25/2019 Guia Tp 2013

11/61


11

CLASIFICACIN SEGN LA POLARIDAD RELATIVA DE LAS DOS FASES.

En cuanto a la cromatografa de adsorcin y de reparto no siempre se puede asegurar cual delos dos procesos implicados desempea el papel ms importante, por esta razn, en laprctica se define la cromatografa segn sea la polaridad relativa de las dos fases:

Cromatografa en fase normal Cromatografa en fase inversa

Cromatografa en fase normal:la fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar y lafase mvil es apolar. As las muestras polares son retenidas en la columna durante tiemposmayores que las muestra menos polares o apolares.

Cromatografa en fase inversa:la fase estacionaria es de naturaleza apolar mientras que lafase mvil es un lquido polar. En este caso cuanto ms apolar sea la muestra, mayor ser suretencin.

cromatografa en fase normal cromatografa en fase inversa

7/25/2019 Guia Tp 2013

12/61


12

4. Fase MvilLa fase mvil desempea una parte activa en el proceso de separacin en HPLCmientras que en la cromatografa gaseosa no tiene accin alguna.

La mayora de los solventes se pueden utilizar siempre que renan ciertas caractersticascomo: Disolver la muestra Miscible con otros solventes para formar mezclas tiles No degradar o disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad para reducir la cada de presin Disponibilidad, precio Ser compatible con el detector utilizado. Tener transparencia ptica cuando se usa un detector UV.

Los solventes ms utilizados son: hexano, isooctano, cloruro de butilo,cloroformo, diclorometano, tetrahidrofurano, acetonitrilo, iso y n-propanol,metanol y agua.

Estos solventes deben filtrarse y desgasificarse. Se f iltran porque pueden acumularpartculas en suspensin y daar los componentes del HPLC. Se desgasifican porque alexponer el solvente a la atmsfera este comienza a acumular los gases disueltos que seencuentran en la atmsfera y si no se eliminan pueden producir interferencia en losdetectores, producir picos falsos y desviaciones de la lnea de base.Los mtodos de filtracin usados son: Filtro a la entrada del solvente Filtracin en lneaLos mtodos de desgasificacin mas usados son:

Ultrasonido Burbujear Helio Degasificacin al vaco en lnea

5. Bombas

La bomba es el dispositivo que se utiliza para impulsar el solvente o diluyente.

Se clasifican en dos tipos:

Bombas de presin constante: son sencillas, econmicas y fciles de operar, sin

embargo el caudal puede cambiar debidos a cambios en la viscosidad del solvente. Bombas de caudal constante: son las mas usadas, son normalmente de dos tipos.

1. Bombas alternantes: la mas importante tiene un pistn nico conectado a una leva que

7/25/2019 Guia Tp 2013

13/61


13

fuerza el lquido a travs de una vlvula de direccin nica.

2. De desplazamiento continuo (bombas jeringa): consta de un cilindro de gran volumenque contiene la fase mvil que es expelida por un pistn.

6. Programacin del solventeExisten dos mtodos de programacin de solvente en HPLC. Isocrtico: cuando la composicin de la fase mvil se mantiene constante durante un

anlisis. Gradiente de elusin: cuando se vara la composicin de la fase mvil, con lo cual

se vara la polaridad.La elusin por gradiente se utiliza con muestras cuyos componentes poseen polaridades muydiferentes por que en estos casos es preferible variar la polaridad de la fase mvil durante elanlisis con el fin de mejorar la separacin de los componentes que eluyen en ltimo lugar.

7. Sistema de inyeccin de muestrasLas muestras se introducen a la columna usando vlvulas inyectoras, que pueden ser:

Manuales Automticas

7/25/2019 Guia Tp 2013

14/61


14

8. Columnas y fases estacionariasLa separacin en cromatografa lquida se lleva a cabo mediante interaccionesentre la muestra y la fase estacionaria, estas pueden ser: Fases porosas:son partculas porosas que difieren en su composicin

qumica, estructura y tamao. Pueden ser cuerpos porosos, peliculares omicropartculas.

Fases enlazadas:formada por partculas (soporte) que tienen la faseestacionaria qumicamente enlazada a las mismas. Se enlazan hidrocarburos dediferente longitud al soporte con lo cual se obtiene una fase apolar (Ej.: octadecilo)que se utilizan en fase inversa y si al final de la cadena hidrocarbonada se enlazan

grupos polares (amino o ciano) se obtienen las fases polares que se usan en fasenormal.

7/25/2019 Guia Tp 2013

15/61


15

9. DeteccinUn detector ideal es sensible a bajas concentraciones de cualquier compuesto, tiene unarespuesta lineal y no produce el ensanchamiento de los picos.Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: Detectores basados en una propiedad de la fase mvil. Ej. Detector de ndice de refraccin. Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ej. Detector de

Fluorescencia, DetectorUltravioleta.

Los detectores ms usados en HPLC son:Detector UV: mide la absorbancia de un compuesto en la fase mvil y determina suconcentracin utilizando la ley de Beer.Hay bsicamente tres tipos: Detector de onda fija Detector de longitud de onda variable Detector de arreglo de diodos

Detector de ndice de refraccin: mide la diferencia de ndice de refraccin entre el

solvente puro y el solvente que contiene la muestra.

7/25/2019 Guia Tp 2013

16/61


16

Detector de fluorescencia: solamente detectan compuestos que tenganfluorescencia nativo o inducida por derivatizacin

Detectores electroqumicos: detecta compuestos que pueden se oxidados oreducidos. Se clasifican en tres tipos:

Detector amperomtrico Detector conductimtrico Detector potenciomtrico

10. Anlisis cuantitativoLa concentracin de un analito (componente) en la muestra se puede calcular por diferentes

mtodos: Normalizacin interna Estndar externo Estndar interno

Normalizacin interna: Consiste en referir el contenido de analito al total de reas en elcromatograma. Para ello se suman las reas de todos los picos presentes y el contenido deanalito se calcula segn:

P = 100 *(Ai/Ai)

Pies el porcentaje del componente i en la mezclaAies el rea del componente i

Aies la sumatoria de todas las reas del cromatograma

Ventajas: No requiere estndar de referencia Es muy preciso porque los errores de inyeccin y preparacin de muestra se

compensan.Desventajas:

Es necesario que todos los componentes de la mezcla se separen, lo cual no siempreocurre.

Se requiere que todos lo s componentes tengan el mismo factor de respuesta (fi); estosignifica que si se trabaja con un detector UV todos los compuestos deben tener elmismo valor de absortividad a la longitud de onda elegida.

7/25/2019 Guia Tp 2013

17/61


17

Si se tienen patrones puros de todos los compuestos se calculan los factores de respuestasegn:

f-i- = Pi/Ai

Fies el factor de respuesta del patrn iPies el porcentaje del patrn iAies el rea del patrn

Y el porcentaje de los compuestos se calcula de la siguiente manera:

P = 100 *(fi.Ai/fi.Ai)

Estndar externo: Es el mtodo mas utilizado en HPLC. Consiste en preparar estndares deconcentracin semejante al analito en la muestra y determinar sus respectivas reasen las mismas condiciones de operacin que las muestras. Luego se determina elrea del analito y se calcula su concentracin:

Utilizando la siguiente ecuacin donde se compara el rea del analito en cuestin con el rea

correspondiente al estndar de referencia:

P = 100 * D *(AmCs/ AS)

P es el porcentaje de analito en la muestraAmy Asson las reas de la muestra y estndar respectivamente.Cses la concentracin del estndarD es un factor de dilucin

En este mtodo la precisin de los datos depende de: La calidad del estndar utilizado De la preparacin de la muestra y el estndar Y de los errores de inyeccin de ambos

Estndar interno: Consiste en agregar cantidades exactamente medidas de una sustanciatanto en la muestra como a un estndar que contiene el analito.Para determinar la concentracin de analito en la muestra se calcula la relacin de rea deanalito a estndar interno tanto en la muestra como en el estndar y se calcula:

P = 100 * D *(RmC, / RS)

Pi es el porcentaje de analito en la muestraRmy R, son las relaciones de reas de analito a estndar interno en la muestra yestndar respectivamente.CSes la concentracin del estndarD es un factor de dilucin

La exactitud del mtodo depender de la pureza delestndar.

Ventajas: El estndar interno no tiene que ser de pureza controlada No depende de los errores de inyeccin Compensa los errores generados en la preparacin de la muestra como ser: dilucin,

extraccin y derivatizacin.

3. Teoras del proceso cromatogrfico

Las teoras tratan de explicar el comportamiento de los solutos en las columnas. Las msestudiadas son: La teora de los platos tericos

7/25/2019 Guia Tp 2013

18/61


18

La teora cintica (Van Deemter) La teora desarrollada para columnas capilares (Golay)

Segn la teora de los platos, una columna esta constituida por una serie de platos quecontiene una fase estacionaria y supone que: El volumen de la fase estacionaria es constante en cada plato

El volumen de la fase mvil es constante en cada plato Las dos fases en cada plato estn en equilibrio El valor del coeficiente de distribucin es constante e independiente de la

concentracin de solutoLa desventaja de la teora es la falta de conexin entre el tamao de partcula de la faseestacionaria, la difusin, la velocidad de flujo y la temperatura. La ecuacin que rige estateora es

N = 16 (tr/W)2

Donde N es el nmero de platos tericos, tres el tiempo de retencin del soluto y en elancho de la base del pico del soluto.

La teora cintica considera el proceso cromatogrfico en funcin de los siguientesfactores: Las trayectorias mltiples que toma un soluto durante su movimiento a travs del

empaque de la columna (A) Difusin axial o longitudinal del soluto en la fase mvil (B) La resistencia a la transferencia de masa entre la fase mvil y la estacionaria ( C ) La

ecuacin de la teora es la de Van Deemter

HETP o H=A+B/u+C*u

Donde HETP es la altura equivalente de un plato terico, esto es L/H ( L es la longitud de lacolumna) y u es la velocidad lineal de la fase mvil (cm/seg). En el grfico tenemos las curvaspara diferentes gases ( nitrgeno, helio, hidrgeno) donde se observa la variacin de la alturadel plato terico (HEPT) con la velocidad.

7/25/2019 Guia Tp 2013

19/61


19

CROMATOGRAFA DE GASES(GC)

1. Definicin de cromatografa2. Esquema de un cromatgrafo3. Teoras del proceso cromatogrfico4. Cromatgrafo de gases

InyectoresColumnasGas portadoDetectores

5. Cromatograma y su interpretacin6. Anlisis cualitativo7. Anlisis cuantitativa

1. Definicin de cromatografa

Cromatografia: se define como un mtodo de separacin en el cual los :componentes aseparar se distribuyen entre dos fases Fase estacionaria: de gran rea superficial (slida o lquida) Fase mvil: que es un fluido que pasa a travs de la fase estacionaria (gas, lquido o

fluido supercrtico).

2. Esquema de una separacion cromatografica (capilar)

4. Cromatgrafo de gases:

1 2 3 4 5

as

earrasrey

suscontrolesde

Sistemade

inyeccion

Columna

cromatrografica

Sistemade

deteccion

adquisiciony

tratamientode

7/25/2019 Guia Tp 2013

20/61


20

Inyector : el inyector es el dispositivo con el cual se introduce la muestra en la columna.

Columnas:Es el lugar donde ocurre la separacin.Los materiales con los cuales se fabrican columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable,vidrio o tefln. El relleno puede ser un slido o un lquido recubriendo un slido. Seclasifican en:

EmpacadasAnalticaPreparativa

Microempacadas Capilares

WCOT (pared recubierta)SCOT ( soporte recubierto)PLOT (capa porosa)

Cromatografa con temperatura programada.Sea una muestra con un amplio espectro de ebullicin (Ej.: aceites esenciales)

A temperaturas altas se tendr un anlisis rpido sin resolucin y a temperaturas bajas los

anlisis sern lentos pero con alta resolucin.En consecuencia la cromatografia se efecta con aumento progresivo de la temperaturapara resolver este tipo de muestras y realizar el anlisis en un corto tiempo. El aumentoprogresivo de la temperatura esta controlada electrnicamente y se habla entonces decromatografia con temperatura programada.

Gas portadorEl gas portador cumple dos propsitos:

1. Transportar los componentes de la muestra2. Crear una matriz adecuada para el detector (compatibilidad)

Los gases ms usados son: nitrgeno, hidrgeno, oxgeno, helio, argn, nen, dixido de

carbono y monxido de carbono.

Las muestras (lquidas) sonintroducidas a travs de un sellode goma (septum) a un tubo devidrio (liner) que se encuentra enun block de metal caliente el cualvaporiza la muestra que esintroducida por la fase mvil a lacolumna.

7/25/2019 Guia Tp 2013

21/61


21

Ventajas de la cromatografia capilar

Separaciones con alta resolucin Anlisis cualitativos y cuantitativos de mayor exactitud Reduccin del tiempo para el desarrollo de un mtodo

Reduccin del tiempo de anlisis Mayor sensibilidad

Detectores

El detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluidas a la salidade la columna cromatogrfica.Los ms usados en cromatografa gaseosa son:

Detector de conductividad trmica: mide la conductividad trmica del gas portadorproducida por la presencia de sustancias eluidas

Detector de fotometra de llama: mide la intensidad de emisin molecular de la

fluorescencia de los heterotomos en molculas orgnicas. Detector de ionizacin de llama: mide las variaciones de la corriente de ionizacin de

una llama de oxgeno-nitrgeno debido a la presencia de sustancias eluidas.

Detector de ionizacin de llama alcalina: produce partculas cargadas en una llamaalcalina donde los compuestos con P Y N incrementan la corriente de partculas.

Detector de captura electrnica: se basa en la electronegatividad de las sustanciaseluidas y en su capacidad para formar iones negativos por captura de electrones.

Detector de espectrometra de masas: produce fragmentos de molculas porbombardeo electrnico v luego analiza las masas.

Detector selectivo de masas

Las molculas efluentes de la columna cromatogrfica son sujetas a un impacto deelectrones de 70 eve. En vaco, lo cual causa su fragmentacin tpica. El anlisis de esafragmentacin por el detector permite su identif icacin y medicin.

Caractersticas: universal, responde a todos los compuestos con peso molecular mayorque 10.

Sensibilidad: 10 -13 g (monitoreando iones selectivamente) 10-9g (en el modo barrido)En la figura podemos ver como trabaja un GC/MS

7/25/2019 Guia Tp 2013

22/61


22

Como se produce la ionizacin de las molculas

El detector ms sensible es el de captura de electrones (ECD), un detectorespecfico para compuestos electronegativos.

5. Cromatograma y su interpretacin

En un cromatograma cada pico es la seal del detector que representa un compuesto.

Cada compuesto se identifica por su tiempo de retencin (t R) que es un parmetrocualitativo. La concentracin de un compuesto se obtiene empleando el rea del pico (o la altura)

en algn mtodo cuantitativo; este es un parmetro cuantitativo.

Tiempo de Retencin CorregidotR

'= tR- tM

Factor de Capacidad o relacin de capacidad

K = tR / tM= (tRtR)/tM

El factor de capacidad nos indica cuantas veces es retenida una sustancia en relacin unasustancia no retenida.

7/25/2019 Guia Tp 2013

23/61


23

6. Anlisis cualitativo

El anlisis cualitativo es un procedimiento para la identificacin de los picoscromatogrficos, este anlisis puede hacerse por:

Por datos de retencin Por series homlogas (ndices de retencin de Kovat)

7. Anlisis cuantitativo

Existen varios mtodos para cuantificar un pico cromatogrficoNormalizacin de rea Normalizacin de rea con factores de respuestaPatrn externoPatrn interno

(Ver estos mtodos en el apunte de HPLC)

Sobre sus aplicaciones

Sus aplicaciones son muy numerosas, particularmente en el campo de la qumicaorgnica y la biologa.

Anlisis orgnico de aguas

Todos los compuestos voltiles y estables a una temperatura elevada:

Qumica orgnica general.

Los hidrocarburos constituyen el mejor terreno de aplicacin de la

cromatografa en fase gaseosa. Algunos de los casos ms frecuentes son elmetano, aromticos, terpenos.

La separacin de terpenos y de sus derivados oxigenados. En particular, la

industria alimentaria. Ej.: la separacin de los componentes de un zumo de

naranja.

Perfumes

Alcoholes. Por ejemplo la deteccin clnica del etanol en la sangre.

Otros compuestos oxigenados tales como aldehdos, cetonas, acetatos y

los heterociclos.

Compuestos orgnicos halogenados, no polares

Insecticidas. La industria alimentaria se interesa en la deteccin de residuos

de insecticidas.

Materiales plsticos. polmeros

Anlisis de las sustancias no orgnicas: gases permanentes, agua

En qumica biolgica y farmacutica.

7/25/2019 Guia Tp 2013

24/61


24

TRABAJO PRCTICO N 5

ESPECTROFOTOMETRIA UVVISIBLELaboratorio CentralFCEQyN UnaM

OBJETIVOS: Conocer los fundamentos de la espectrofotometria para su utilizacin como recurso de

investigacin. Lograr que el alumno aprenda a manejar este instrumento como una herramienta de

analisis, conociendo sus ventajas, cuidados y limitaciones.

FUNDAMENTOS TERICOS:

Introduccin Propiedades de la luz Absorcin de la luz El espectrofotmetro Errores en espectrofotometra

Curvas de calibracin Trabajo prctico

Introduccin

Espectrofotometra: es cualquier procedimiento que usa la luz para medir laconcentracin de compuestos qumicos.

Instrumental:Esquema de un espectrofotmetroconvencional

fuente monocromador

o ranura de entradao elemento de dispersino ranura de salida

muestra detector

Aplicaciones: Dos propsitos diferentes1. Anlisis Cualitativo: Determinar el espectro de absorcin de una sustancia pura.2. Anlisis Cuantitativo: Determinar la concentracin de una solucin.

Propiedades de la luzLa radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende una pequea parte del espectro

electromagntico, entre 190 y 1000 nm.), que incluye otras formas de radiacin como las deradio, infrarrojo (IR), csmica y rayos X.

7/25/2019 Guia Tp 2013

25/61


25

Esta radiacin o energa radiante se puede describir por sus propiedades ondulatorias, esto es:Longitud de onda (): es la distancia entre dos mximos sucesivos de una onda; se mideen nanmetros (nm) que equivale a 10-9m.Frecuencia (): es el nmero de mximos de una onda que pasa en un punto del espacioen un segundo, se mide en Hertz que corresponde a un ciclo por segundo (1/s).

que estn relacionados por la velocidad de la luz c (2.998 * 108m/s).

.

cAdems la energa radiante se comporta como si esta formado por paquetes de energallamados fotones.La energa de los fotones depende de la frecuencia de la radiacin y esta dada por la siguienterelacin.

E(fotn)= h (fotn) (h = 6.626 * 10-34J.s es la constante de Planck )

Que podemos poner en funcin de la longitud de onda, esto es:E = h c /

Absorcin de la luzCuando una intensidad (I) de luz (esto es, energa por unidad de rea y de tiempo) atraviesa unespesor dx de disolucin de concentracin c sufre una absorcin dI que es proporcional alespesor, a la intensidad incidente y a la concentracin de la disolucin.

- dI I c dxexpresin que podemos igualar agregando un parmetro k que ser funcin de la naturaleza dela sustancia y de la longitud de onda.

- dI = k I c dxoperando e integrando entre el espesor cero (intensidad incidente Io) y el espesor l (intensidadtransmitida I) se obtiene:

I = Ioe-kcl

Esto es, la intensidad de luz transmitida.A partir de esta expresin se define la: transmitancia T = I/ Io= e

-kclComo la fraccin de luz incidente que pasa a travs de la muestra.Como la transmitancia no es proporcional a la concentracin de soluto se convierte la mismaen Absorbancia A (aplicando logaritmo) la cual si es proporcional a la concentracin:A = log10(I/ Io= e-kcl)A = -log10 T = c lRelacin que se conoce como la ley de Beer

A = c lDonde c es la concentracin molar (moles/litro)esla absorcin molar (lt/mol*cm). l longitud del caminoptico (cm).La ley de Beer es aplicable a soluciones diluidas deconcentraciones iguales o menores a 0.01 M (0.01mol/lt) .

El espectrofotmetroUn espectrofotmetro es un instrumento para medir la transmitancia o la absorbancia de unamuestra como una funcin de la longitud de onda de laradiacin electromagntica.Las partes de un espectrofotmetro son:

o Una fuente que genera una radiacinelectromagntica en un amplio rango delongitudes de onda.

o Un equipo de dispersin que seleccionauna longitud de onda en particular ( enrealidad selecciona ancho de banda).

o Un compartimiento para la muestra.o Uno o ms detectores para medir la

intensidad de la radiacin.

7/25/2019 Guia Tp 2013

26/61


26

FuenteUna fuente ideal debera tener una intensidad constante para todas las longitudes de onda,bajo ruido y una gran estabilidad trmica; desafortunadamente tal fuente no existe.Dos fuentes son las mas comnmente usadas en espectrofotometra UV-Visible.

La lmpara de deuterio:Que tiene una buena intensidad continua en la regin UV pero disminuye a medidaque nos acercamos a la regin visible. Se la usa en el rango de 190 a 360 nm.Con el tiempo de uso la intensidad de la luz de la lmpara disminuye rpidamente,teniendo una vida media (tiempo en el cual su intensidad disminuye a la mitad de suvalor inicial) de 1000 hs.

La lmpara halgena de tungsteno:Tiene buena intensidad en parte del espectroUV y en todo el rango visible. Se la usa en elrango de 360 a 1000 nm y tiene una vidamedia de 10000 hs.

La mayora de los espectrofotmetros usanambos tipos de lmparas para medir en elrango UVVisible, cambiandoautomticamente de fuente de acuerdo a lalongitud de onda buscada.

Elementos de dispersinUn elemento de dispersin desva las diferentes longitudes de onda de la radiacin endiferentes ngulos. Cuando se combina con una ranura de salida apropiada estoselementos pueden ser usados para seleccionar unalongitud de onda en particular.Dos son los ms usados: a) prismas y b) redes de

difraccino Prismas

Estos generan un arco iris a partir de la luz solar. Estemismo principio es usado en los espectrofotmetros.Son simples, econmicos pero producen unadispersin angular no lineal y adems estos ngulos dedispersin son sensibles a la temperatura.Por esta razn los espectrofotmetros ms modernoscontienen redes de difraccin.

o Redes de difraccinEstos consisten en un gran nmero de lneasigualmente espaciadas y paralelas entre s, sobre unasuperficie de vidrio a la que se aplica un recubrimiento de aluminio para crear unasuperficie reflejante.La luz que incide sobre la red es reflejada en diferentes ngulos, dependiendo de lalongitud de onda. Adems la dispersin angular es lineal y no depende de la temperatura.Sin embargo, estos elementos reflejan la luz en diferentesordenes, los cuales se superponen; en consecuencia, se usanfiltros o redes cncavas para dispersar y enfocar la radiacin

simultneamente.Un monocromador: consiste de una ranura de entrada, unelemento de dispersin y una ranura de salida. Idealmente lasalida de un monocromador es una luz monocromtica.

7/25/2019 Guia Tp 2013

27/61


27

En la prctica, la salida es siempre una banda aguda simtricamente distribuida. Elancho de banda a la media altura el ancho de banda instrumental (SBB).

Compartimiento para la muestraLa espectroscopia se usa para medir lquidos osoluciones.Las muestras se colocan en recipientes denominadoscubetaso celdas para realizar las mediciones.Material: Idealmente las celdas deben sercompletamente transparentes a todas las longitudes deonda ya que cualquier absorbancia de la cubeta reduceel rango lineal efectivo para la muestra.Las celdas de mas bajo costo son las de plstico, estasceldas no resisten a todos los solventes y absorbenfuertemente por debajo de 300 nm no pudiendoutilizarse para medir en esta regin.Las celdas de vidrioson un poco ms costosas que las de plstico peroson ms durables y resisten la mayora de los solventes, sin embargo,

absorben fuertemente a partir de los 320 nm. Las celdas de cuarzofundidoson razonablemente transparentes por debajo de 210 nm.Las mejores celdas son hechas de slice sinttica fundida de altapureza y son transparentes por debajo de 190 nm.

Tipos de celdasHay una gran variedad de celdas disponibles pero las mas usadas son:

a) La celda rectangular con extremo superior abierto con dimensiones internas(camino ptico) que van desde 1 a 100 mm, la ms popular es la de 10 mm.

b) La celda ranurada que es idntica a la anterior pero se usa cuando los volmenesde las muestras son pequeo.

DetectoresUn detector convierte una seal luminosa en una seal elctrica, este puede ser un tubofotomultiplicador o un detector de fotodiodo.Fotomultiplicador:Es un tubo electrnico capaz de amplificarsignificativamente una corriente. El ctodo estaconstruido con un metal sensible a la luz capaz deabsorber energa radiante y emitir electrones en formaproporcional a la energa radiante que hace impacto enla superficie del metal sensible a la luz. Los electronesproducidos en el primer nivel de energa pasan a chocarcon una superficie secundaria donde cada electrnproducen entre 4 a 6 electrones secundarios que va aotro nivel, repitiendo la multiplicacin de electrones hastael nivel final donde llega una corriente electrnicaamplificada.Fotodiodo:En un fotodiodo la luz incide sobre un materialsemiconductor y hace que los electrones fluyan a travsdel mismo, de ese modo agota la carga de un capacitorconectado a travs del material. La cantidad de carganecesaria para recargar el capacitor en intervalos

regulares es proporcional a la intensidad de la luz.Algunos espectrofotmetros ms modernos contienenarreglo de diodos en lugar de un solo detector: este consiste de una serie de diodosubicados lado a lado sobre un cristal de silicona. Cada diodo tiene un capacitor individual

7/25/2019 Guia Tp 2013

28/61


28

que esta conectado por un conmutador de estado slido a una lnea de salida comn. Lacantidad de carga necesaria para recargar los capacitores es proporcional al nmero defotones detectado por cada diodo, el cual es proporcional a la intensidad de la luz. De estamanera se obtiene el espectro de absorcin midiendo la variacin de la intensidad en todoel rango delongitud de onda.Un arreglo tpico comprende entre 200 y 1000 elementos.

Tipos de espectrofotmetroso Espectrofotmetro de simple haz:Primero se mide Io para una cubeta de referencia que contiene el solvente puro. Entoncesse reemplaza la cubeta de referencia por la cubeta que contiene la muestra a medir y seobtiene I.

o Espectrofotmetro de doble haz:La luz pasa alternativamente a travs de la cubeta de referencia y de la muestra. Unespejo giratorio (choper) hace pasar la luz alternativamente entre las cubetas de muestra yde referencia. En los procedimientos de rutina primero se registra un espectro de lnea de

base con dos cubetas de referencia. As la absorbancia de referencia es restada de laabsorbancia de la muestra para obtener la absorbancia verdadera de la muestra a cadalongitud de onda.

Precauciones:La mayora de los espectrofotmetros operan mejor a A (absorbancia) entre 0.40.9.Si la absorbancia es muy elevada la intensidad es difcil de medir.Si la absorbancia es muy baja es muy difcil distinguir entre la referencia y la muestra.

Errores en espectrofotometraLa medicin de las concentraciones se basa en la linealidad de la absorbancia con laconcentracin, esto es, en la ley de Beer. Por lo tanto desviaciones a la ley son fuentes deerrores, esto sucede cuando:

o Se miden concentraciones muy elevadas.

7/25/2019 Guia Tp 2013

29/61


29

o La energa de la radiacin incidente no es monocromtica.o La absorcin del solvente es significativa comparada con la absorcin del soluto.o La energa radiante es transmitida por otros mecanismos (luz errtica).o Los lados de las celdas no son paralelos

Curvas de calibracinEn una curva de calibracin la absorbancia es graficada como una funcin de una cantidadconocida de un analito derivado de una muestra patrn.

Procedim iento para la con struc cin de una curva de cal ibracin.Paso 1: Preparar muestras de concentraciones conocidas de un analito cubriendo unrango de concentracin conveniente y medir la absorbancia (A) de estos patrones.Paso 2: Restar la absorbancia de la muestra de referencia si se uso un equipo desimple haz.Paso 3: Hacer un grfico de la absorbancia corregida versus la concentracin de analitoanalizado.

Ejemplo:Se desea construir una curva de calibracin para determinar la concentracin de plomo enagua potable. Se obtiene la siguiente informacin durante la medicin de absorbancias a427 nm.Paso 1: Preparar patrones y medir sus absorbancias.

Se realizaron 3 repeticiones de cada patrn.

Patrn Concentracin Absorbancia(A)

A A A (promedio)

1 0.100 0.923 0.929 0.926 0.9262 0.060 0.681 0.682 0.677 0.6803 0.030 0.453 0.454 0.453 0.4534 0.004 0.258 0.257 0.265 0.260

Paso 2: Medicin de la absorbancia del blanco y resta de la absorbancia de los patrones.Si el espectrofotmetro es de doble haz no es necesario hacer este paso.

Blanco Concentracin A A A A (promedio)0.000 0.081 0.083 0.079 0.081

Patrn Concentracin A (corregida)1 0.100 0.8452 0.060 0.5993 0.030 0.3724 0.004 0.179

Paso 3: Grafico de datos y curva de calibracin

a) Si se cumple la ley de Beer podemos obtener los parmetros de la ecuacin que es unalnea recta.Por regresin lineal obtenemos para A = m * C + bDonde m = 6.96 y b = 0.16

7/25/2019 Guia Tp 2013

30/61


30

b) Grfico de absorbancia vs. Concentracin:

Curva de Calibracin

0

0,1

0,2

0,3

0,40,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0,000 0,050 0,100Concentracin

Absorbanci

a

Anlisis cuantitativo de un compuesto

A. Experiencia Datos

o Solucin patrn (std) cafena, [ ]g/lo Peso molecular (PM): 194,22 g/molo Peso de la muestra: W1= 0,9 go Concentracin de la muestra a preparar: Cm= 0.5 (g/lt)

Medir el espectro de Absorbancia del patrn en el rango de 200400 nm

Medir el espectro de Absorbancia de la muestra problema en el rango 200400 nmB. Evaluacin

1. Determinar maxde la solucin patrn2. medir Amax

std3. medir la absorbancia de la muestra a esa longitud de onda4. Calcular la concentracin de la muestra usando la ley de Lambert-Beer A= c d5. Determinar el % p/p de cafena en la muestra

Problemas

1-Calcular la absorbancia de una solucin con un 80% de tramitancia.2-Calcular la absorbancia de una disolucin cuya tramitancia es de 1%.3-Calcular la tramitancia de una disolucin cuya absorbancia es de 1.4- Calcular la absorbancia a 340nm de una disolucin 100 M de NADH, si su coeficiente deabsorcin molar es de 6,22 x 103M-1cm-1.5-Una disolucin de creatinina a 540nm manifiesta una absorbancia de 0,42 y en las mismascondiciones experimentales un patrn de 1mg de creatinina en 100 ml presenta unaabsorbancia de 0,57. Averiguar la concentracin de la creatinina problema.6-Una disolucin de NADH tiene una concentracin de 1mg/ml. la masa molecular del NADHes 709. Calcular la absorbancia de esta disolucin a 340 nm. (NADH) = 6,22 x 10

3M-1cm-1.7-Se prepara una disolucin de ATP-Mg puro (masa molecular = 529) de concentracin 100g/ml. La absorbancia medida a 259 nm resulta ser igual a 2,91. Calcular en estas condicionesel coeficiente de absorcin molar del ATP.8- Para determinar la concentracin de glucgeno en una muestra se produce la reaccinglucgeno-ioduro y a 450 nm en cubeta de 1 cm se mide una absorbancia de 0,25. En las

7/25/2019 Guia Tp 2013

31/61


31

mismas condiciones una disolucin de glucgeno patrn de concentracin 10 mg/ml producirauna absorbancia de 0,2. Cul es la concentracin de la muestra?9-Calcular el coeficiente de absorcin (a 1cm1%) a 328 nm de la vitamina A si una muestra deesa sustancia de concentracin 2 g/ml en cloroformo produce una absorbancia de 0,31.10- Para determinar la concentracin de creatinina en orina de tres pacientes A, B y C serealiza la reaccin de Haffe con una serie de patrones y con las orinas de estos pacientesobteniendo los resultados de la siguiente tabla. Determinar grficamente las concentracionesde A, B y C.

Patrn(mg/ml)

A a 520nm

Problemas

A a 520 nm

1 0,18 A 0,242 0,353 0,52 B 0,084 0,675 0,80 C 0,41

7/25/2019 Guia Tp 2013

32/61


32

TRABAJO PRCTICO N 6APLICACIN DE ESPECTROFOTOMETRA COMO MTODO

DE CUANTIFICACIN DE BIOMOLCULAS

OBJETIVOS:Aprender a utilizar como herramienta de determinacin cuantitativa, de

molculas orgnicas, el mtodo espectrofotomtrico.Determinar empricamente los valores de concentracin de protenas, glucosa y

colesterol, como as tambin conocer los parmetros normales y anormales, en sereshumanos.

INTRODUCCIN:

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en lasinvestigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar laradiacinabsorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida desoluto(muestra a analizar), y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.En otras palabras la determinacin cuantitativa de una especie, con base en observaciones

que dependan de la cantidad de radiacin absorbida, dependen de la comparacin entre elvalor de la absorcin de un patrn de referencia y la absorcin de la muestra. Losespectrofotmetros deben permitir efectuar la comparacin entre la seal obtenida por unamezcla que no contiene el analito (blanco) y otra que si lo tiene, para obtener de esta manerasolo la absorbancia del analito [Abs. patrn (Sn + analito)Abs. blanco (Sn)].

DETERMINACIN DE GLUCOSA

La determinacin de glucosa sangunea, es el dato mas importante y de mas larga datapara el estudio de pacientes con alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos.

La concentracin de glucosa, se mantiene constante dentro de ciertos lmites. Losmecanismos de regulacin de los niveles de glucosa sangunea se producen a expensa de unequilibrio entre la produccin y el consumo, procesos regulados por hormonas (insulina,glucagn, adrenalina, somatostatina ) y glucocorticoides intervinientes en el proceso.

La variaciones de los niveles de concentracin de glucosa fuera de los limites normales,tanto para sangre, liquido cefaloraquideo y otros, pueden derivarse en una gran cantidad deestados patolgicos.

Se produce hiperglucemia en enfermedades como: Diabetes Mellitus, Pancreatitiscrnica y aguda, insuficiencia heptica y renal, etc.

Se produce hipoglucemia en enfermedades como: Enfermedad de Adisson-mixedema,tumores extrapancreticos, productores de sustancia insulinoides, etc (consultar apunte teoricopara el parcial).

FUNDAMENTO DEL MTODO

La glucosa de la muestra se determina calorimtrica mente segn la siguiente ecuacin:

Glucosa + Oxigeno GOD Ac. Glucnico + H2O2

2 H2O2+ Fenol + 4-AF POD Quinoneimina + 4 H2O

La Quinoneimina es cromgeno rojo con pico de absorcin a 505 nm.
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_%C3%B3ptico&action=edithttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_%C3%B3ptico&action=edithttp://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Solutohttp://es.wikipedia.org/wiki/Solutohttp://es.wikipedia.org/wiki/Solutohttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_%C3%B3ptico&action=edit

7/25/2019 Guia Tp 2013

33/61


33

MARCHA PRCTICA

Materiales:

Reactivo 1: 4-aminofenazona. Reactivo 2: Fenol.

Reactivo 3: Enzimas GOD y POD. Patrn: Solucin de Glucosa. Muestra: Suero o Plasma Heparinizado. Timer Espectrofotmetro o colormetro. Micropipetas y pipetas Probeta Bao Mara a 37

Preparacin del reactivo de trabajo

En una probeta agregar respetando el orden:

1. Agua destilada partes del volumen.2. Los reactivos 1 y 2.3. Levar a volumen con agua destilada y mezclar.4. Homogeneizar suavemente las enzimas. Agregar y mezclar.

Reactivo 1 Reactivo 2 AguaC.S.P.

Reactivo 3

12 cm3 12 cm3 300 cm3 1.2 cm3

Procedimiento:

En tres tubos marcados como B (blanco), P (patrn o standard), M (muestra),colocar:

B P M

Muestra

- - 20 l

Testigo - 20 l -Reactivo de

trabajo2 cm3 2 cm3 2 cm3

Mezclar, incubar a 37, 10 minutos. Leer en el espectrofotmetro a 505 nm o en elfoto colormetro con filtro verde (490 530 nm) llevando a cero en aparato con elblanco de reactivo.

Clculos:

= 1 / (Abs . Pabs B) = g/l

Glucosa en g/l : . Abs M

7/25/2019 Guia Tp 2013

34/61


34

Valores de Referencia de Glucosa, entre: 0.701.10 g/l

* Si se utiliza un espectrofotmetro con doble haz de luz debe omitirse en el clculo del factor laabsorbancia del blanco.

DETERMINACIN DE COLESTEROL

El nivel srico de colesterol ha sido objeto en los ltimos aos de numerosasinvestigaciones, tanto en individuos sanos como en enfermo.

El colesterol srico, es influenciado por un gran nmero de condiciones patolgicas.Teniendo en cuenta la notable prevalenca de problemas asterosclerticos y

enfermedades coronarias en la poblacin actual y la relacin estadstica significativa entre dichapatologa y la hipercolesterolemia, la determinacin del colesterol srico es un aporte importanteen el control de los llamados factores de riesgos, para el desarrollo de las enfermedades

coronarias.

FUNDAMENTO DEL MTODO

El colesterol es oxidado enzimticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previahidrlisis enzimtica de los steres mediante una lipasa de origen fngico. El agua oxigenadagenera la oxidacin , produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF)mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinona conabsorbancia mxima a 505 nm.

La secuencia es la siguiente:

Esteres de colesterol + Oxgeno Lipasa Colesterol + cidos Grasos

Colesterol + Oxgeno CHOD Colesterol-3-ona + H2O2

H2O2 + 4-AF + Fenol POD 4(P-benzoquinona monoimino) fenazona + H2O

MARCHA PRCTICA

Materiales:

Patrn: solucin de colesterol. Enzimas: suspensin conteniendo lipasa, colesterol oxidasa y peroxidasa. Reactivo: 4-AF. Reactivo : fenol. Timer Espectrofotmetro o colormetro. Micropipetas y pipetas Probeta Bao Mara a 37

7/25/2019 Guia Tp 2013

35/61


35

Con los reactivos anteriores, se prepara la solucin de trabajo en un frasco colorcaramelo, en las proporciones mostradas en la Tabla.

Agua c.s.p. Reactivo : 4-AF Reactivo fenol Enzimas80 cm 4 cm 4 cm 1.6 cm

250 cm 12.5 cm 12.5 cm 5 cm Muestra : suero o plasma heparinizado

Procedimiento

En tres tubos o cubetas espectrofotomtricas marcadas como: B (blanco), P (patrn ostandard), M ( muestra), colocar :

B P M

Muestra - - 20 lStandard - 20 l -

Reactivo de trabajo 2 cm3 2 cm3 2 cm3

Incubar 15 minutos a bao Mara 37 o 30 minutos a temperatura ambiente ( 25 ). Leer en el foto colormetro, con filtro verde (490 a 530 nm), o en espectrofotmetro a

505nm , llevando el aparato a cero con el blanco. El color es estable 2 horas, por lo que la absorbanciapuede ser leda dentro de ese

lapso.

Clculos:

Factor = 2/ (Abs. P abs B) = g/l

Colesterol en g/l = . (Abs. M)


Valores de referencia (pacientes mayores de 20 aos)

Valor deseable: hasta 2 g/lValor limite: hasta 2.4 g/lValor elevado: mayor a 2.4 g/l

7/25/2019 Guia Tp 2013

36/61


36

DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES Y ALBMINAS

Las protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente distribuidosen el organismo.

Actan como elementos estructurales y de transporte, y aparecen bajo la forma deenzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulacin, etc.

Esta multiplicidad de funciones hace que las protenas resulten esenciales para la vida.En el plasma las protenas contribuyen a mantener el volumen de fluido circulante, transportansustancias relativamente insolubles y actan en la inactivacin de compuestos txicos y en ladefensa contra agentes invasores.

Normalmente las protenas ms abundante en el plasma es la albmina, cuya funcinms importante es la de permitir el transporte de cidos grasos, hormonas esteroides,bilirrubina y catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso.La concentracin de albminas en el plasma influye notablemente en el mantenimiento de lapresin coloidosmtica, lo que estara relacionado con su relativamente bajo peso molecular ysu gran carga neta.

En condiciones patolgicas, como perdidas renales, desnutricin, infecciones

prolongadas, suele presentarse hipoproteinemia, mientras que en otras situaciones comomieloma mltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de diverso origen sepresenta hiperproteinemia.

En general, ambas situaciones se ven acompaadas tambin por hipoalbuminemias.Los aumentos anormales de albminas son ocasionales y se relacionan casi siempre

con deshidratacin, que produce el consecuente aumento del contenido proteico del plasma.

FUNDAMENTO DEL MTODO:

Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico en medio alcalino,para dar un complejo de color violeta con mximo de absorcin a 540 nm cuya intensidad esproporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra.

MARCHA PRCTICA:

Materiales:

Reactivo EDTA/Cu: Complejo EDTA/Cu 13mmol/lt y alquil aril polieter (AAP). Suero Patrn: Solucin de albminas y globulinas en estado nativo con titulo

conocido de protenas y albminas. Muestra: Suero libre de hemlisis. Espectrofotmetro o Colormetro. Micropipetas y pipetas.

Tubos de ensayo. Bao Mara a 37 C.

7/25/2019 Guia Tp 2013

37/61


37

Procedimiento:

En tres tubos, marcados cada uno como: B (blanco), P (patrn o standard) y M(muestra); colocar:

B P MAgua Destilada 50 l - -

Suero Patrn - 50 l -Muestra - - 50 lReactivoEDTA/Cu

3,5 cm3 3,5 cm3 3,5 cm3

Mezclar, incubar 15 min. a 37 C, y leer en espectrofotmetro a 540 nm llevando acero con el Blanco de Reactivo.

Clculos:f = factor =(Pro tenas To tal esg/dl) / (A bs. Pabs B)

Pro tenas Tot ales en g /dl = Ab s. M . f


Valor de Referencia: Protenas Totales = 6,1 a 7,9 g/dl

DETERMINACIN DE ALBMINAS

FUNDAMENTO DEL MTODO:La albmina reacciona especficamente con la forma aninica de la

Bromocresolsulfonftalena (BCF) en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponadoa pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo es proporcionala la concentracin de albmina.

MARCHA PRCTICA:

Materiales: Reactivo(BCF): Solucin deBromocresolsulfonftalena. Suero Patrn. Muestra: Suero libre de hemlisis.

Procedimiento:

En tres tubos, marcados cada uno como: B (blanco), P (patrn o standard) y M

(muestra); colocar: B P MSueroPatrn

- 10 l -

Muestra - - 10 lReactivo

BCF3,5 cm3 3,5 cm3 3,5 cm3

Clculos:f = factor =(Albminasg/dl) / (A bs. P abs B)Alb . en g/dl = (Abs . M) . f

7/25/2019 Guia Tp 2013

38/61


38


Valor de Referencia: Albmina = 3,5 a 4,8 g/dl

Cuestionario:Por que se debe incubar a 37 C y no a 25 C que es la temperatura estndar de laboratorio?Por que la concentracin del patrn de glucosa es 1 g/l?Por qu se debe restar el blanco?Qu cuidados debe tener al manejar muestras biolgicas?Qu cuidados debe tener con el almacenamiento de los reactivos, en especial los quepresentan actividad biolgica?

7/25/2019 Guia Tp 2013

39/61


39

TRABAJO PRCTICO N 7ELECTROFORESIS DE ZONA

OBJETIVO: Conocer los fundamentos de la electroforesis para su utilizacin como recurso de

investigacin. Lograr que el alumno aprenda a manejar esta tecnica como una herramienta de

analisis, conociendo sus ventajas, cuidados y limitaciones. Permitir que el alumno se afiance en la utilizacin de material de laboratorio.

INTRODUCCIN:La electroforesis es un mtodo electroanaltico-semipreparativo basado en la

migracin de las partculas cargadas o potencialmente cargadas al ser sometidas a la accinde un campo elctrico. Nos permite separar cidos nucleicos, protenas y otrasmacromolculas.

Analtico: nos permite determinar el nmero mnimo de componentes de unamezcla, sus propiedades.

Preparativo: nos permite purificar la mayor cantidad posible de una determinada molcula(Skoog 2000).La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto

de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcionalal coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia quele ofrece el medio (soporte).

V = q E / f

La electroforesis se puede clasificar en dos tipos principales:

Electroforesis libre: el campo elctrico es aplicado a disoluciones.

Electroforesis de zona: el campo elctrico es aplicado a un soporte.

El equipo para realizar una electroforesis de zona es el siguiente:

Fuente Cuba Buffer Soporte

Se han empleado varios tipos de soporte para la electroforesis de zona:

1) PAPEL. Aunque no es exactamente un gel, se puede considerar similar a ellos para lo queaqu nos interesa ya que realmente es una malla de fibras de celulosa. Es poco restrictivo, peroes difcil de obtener tamaos de poro y espesores totalmente homogneos. Adems, muchasmacromolculas se adsorben a las fibras que lo forman, lo que da lugar a artefactos yseparaciones defectuosas. Se empleaba fundamentalmente para molculas pequeas, comopptidos y aminocidos.

2) ACETATO DE CELULOSA. Este derivado de la celulosa forma un gel de poro grande, muypoco restrictivo para las protenas de tamao corriente. A diferencia del papel, es inerte frente a lamayor parte de las protenas y se puede conseguir en lminas de caractersticas estructuralesconstantes y definidas. Esto, junto con su facilidad de manejo, costo relativamente bajo y larapidez y reproducibilidad con que se pueden efectuar separaciones hace que este tipo de geltenga utilidad en los laboratorios de anlisis clnicos (para el anlisis de protenas sricas, p.ej.).

7/25/2019 Guia Tp 2013

40/61


40

3) ALMIDON. Se emplean geles formados con almidn parcialmente hidrolizado procedentede diversas fuentes naturales. El poro es menor que para el caso del acetato de celulosa, y sesuelen obtener mejores separaciones que con ste ltimo, ya que la difusin es menor. Sinembargo, y a pesar de haber sido muy utilizados hasta hace algn tiempo, han sido sustituidos porgeles de poliacrilamida debido a la dificultad que supone el obtener resultados reproduciblesempleando un producto de origen natural.

4) AGAROSA. Uno de los dos componentes del agar. Es un polisacrido lineal que formageles de tamao de poro muy grande; se usa fundamentalmente para la separacin de cidosnucleicos (de 70 pb a 9 Mpb de ADN; hasta 12 Mpb en la electroforesis de campo pulsante) y parainmunoelectroforesis, donde se precisa una difusin elevada

5) POLIACRILAMIDA. A diferencia de los anteriores, el gel se forma "in situ" por lapolimerizacin de una disolucin del monmero. Es posible controlar el tamao del poro de unaforma muy reproducible. Es el tipo de gel ms empleado para la electroforesis de protenas detamao comprendido entre 10.000 a 250.000 dalton, y de otras molculas de tamaos similares,incluyendo cidos nucleicos. Son geles completamente inertes, mecnicamente estables ytransparentes, lo que facilita tanto su manejo como la deteccin de las molculas separadas en

ellos. La tcnica se conoce como PAGE (acrnimo de PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).

Un gel para electroforesis debe poseer las siguientes caractersticas:

1) No debe interaccionar ni con la muestra ni con los componentes del medio.2) Debe ser qumica y mecnicamente estable bajo las condiciones de operacin.3) Debe permitir la deteccin de las molculas separadas.4) Es deseable que se pueda controlar su reticulacin, o, lo que es lo mismo, el dimetro mediodel poro.

Al utilizar esta tecnica se debe tener ciertas precausiones:El campo electrico utilizado para la migracin de las biomoleculas produce un aumento detemperatura. Es importante tener esto en cuenta ya que el calor puede desnaturalizar lasmuestras, estropear el soporte y el equipo.La eleccion del soporte es fundamental para evitar la adsorcion inespecifica de las molculaspor este.

Equipo para electroforesis de geles de agarosa

7/25/2019 Guia Tp 2013

41/61


41

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS PLASMATICAS

INTRODUCCIN:

El suero humano contiene mas de 125 protenas identificadas que cumplen variasfunciones (Transporte, defensa, inhibidores enzimticos, etc.).Las mismas pueden agruparse deacuerdo a su caractersticas de solubilidad y

desplazamiento electrofortico, en distintas fracciones, las que varan deacuerdo a la muestra ysoporte utilizados.

Empleando un suero standard normal y un soporte de acetato de celulosa, tendramosla siguiente distribucin relativa de las fracciones de protenas separadas medianteelectroforsis, como se observa en la Fig. 1. Y un trazado densitomtrico como el de la Fig. 2.Los rangos y valores promedios de cada fraccin se detallan en la Tabla 1.

Tabla 1

FRACCION RANGO PROMEDIO

Albmina 47 a 70 % 59 %1globulina 3 a 7 % 4,5 %2globulina 5 a 12 % 9 % globulina 5 a 16 % 12 %

Gamaglobulina

10 a 20 % 15,5 %

Si la muestra es plasma en vez de suero, se observa una fraccin mas que se ubicaentre Beta y Gama, la cual corresponde al Fibringeno. La Tabla 2, muestra los principales

componentes de cada fraccin.

Tabla 2

FRACCION COMPONENTES

Albmina Albmina.1globulina Glucoprotenas, Lipoprotenas, Antitripsina, Protrombina.2globulina Macroglobulinas, Haptoglobina, Lipoprotena, Eritropoyetina. globulina Transferrina, Microprotenas, Complemento (C3y C4), Hemopoyetina.

Gama globulina Inmunoglobulinas IgAIgDIgEIgGIgM.

En el estudio de las protenas plasmticas, las primeras pruebas a realizar deben ser: Cuantificacin de Protenas Totales. Electroforesis de Protenas.

Si ambas pruebas son normales, finaliza el estudio, pero si se detectan bandassospechosas en la electroforesis se debe completar el estudio con pruebas de confirmacin,como por ejemplo: Inmunoelectroforesis.

7/25/2019 Guia Tp 2013

42/61


42

MARCHA PRCTICA:

Reactivos y Materiales:

Muestra: Suero libre de hemlisis. Solucin Buffer pH 8,6*.

Colorante: Negro Amido 10 B 5 g/l. Metanol al 45 %. Acido Actico al 15 %. Decolorante: Metanol al 50 %. Acido Actico: 0,05 ml/l. Tiras de Acetato de celulosa conservadas en solucin de alcohol metlico al 40 %

(evitar el secado de las mismas, de lo contrario se inutilizan). Fuente de poder para electroforesis (100 a 500 Volt1 a 30 mA). Sembrador.

* El buffer debe tener un pH de 8,6. Debe cumplir la funcin de mantener constante esepH durante todo el proceso de fraccionamiento, no precipita ni desnaturaliza lasprotenas, un pH estable es fundamental para obtener patrones reproducibles.

Nota:Sembrar un suero control para interpretar los resultados.

Procedimiento:

1. Sumergir las tiras en un exceso de buffer (150 cm3 para tres tiras), durante unmnimo de 15 min.

2. Absorber el exceso de buffer de las tiras entre dos hojas de papel filtro.3. Montar las tiras sobre el puente correspondiente, asegurndose que la cara

absorbente este hacia arriba. (Situar la esquina cortada hacia abajo y a la derecha)

4. Llenar con buffer ambos lados de la cuba hasta un nivel idntico y suficiente paraasegurar que entre en contacto con las tiras.5. Aplicar las muestras en las tiras a 1 cm del borde catdico.6. Cubrir la cuba con su tapa y conectarla a la fuente de poder ajustando el voltaje a

200 volt. Mantener la electroforesis durante 50 min.7. Desconectar la fuente y sacar las tiras del puente, sumergirlas con la cara

absorbente en una cantidad suficiente de colorante (200 cm3 para tres tiras).Dejarlas en agitacin durante un mnimo de 5 minutos (Situar la esquina cortadahacia la abajo y a la derecha).

8. Decolorar las tiras efectuando tres o cuatro baos con decolorante en agitacin,hasta obtener un fondo completamente blanco.

9. Deshidratar las tiras en un bao de metanol absoluto durante 1 min. en agitacin.

10. Pasar las tiras a un bao de solucin transparentadora, recientemente preparada ymantenerlas en agitacin durante 1 o 2 min.. extenderlas sobre una placa de vidrio(cara absorbente en contacto con el cristal) eliminando las burbujas de aire con unrodillo.

11. Calentar la placa en una estufa o lampara de infrarrojos a una T de 60-70 C, hastaque la trasparencia sea completa (3 a 4 min.). Dejar enfriar a temperatura ambiente.

12. Leer las tiras en un densitmetro a 600 nm. Se obtiene la expresin grfica de unacurva con los valores de cada fraccin.

Nota:Si no se cuenta con los elementos para realizar la cuantificacin pordensitometria, se realiza una cuantificacin por elucin.

7/25/2019 Guia Tp 2013

43/61


43

CUANTIFICACIN POR ELUCIN

Procedimiento:

1. Proceder a la separacin de las distintas fracciones (Cortando las tiras deacetato de celulosa y colocando cada una en un tubo).

2. Agregar 10 cm3de eluyente al tubo de Albmina, y 5 cm3para cada una delas restantes fracciones (disolver).

3. El blanco de reactivo se prepara con un pedazo de tira bien decolorado detamao similar a una de las fracciones y agregando 5 cm3de eluyente.

4. Leer a 540 nm las Densidades Opticas, de cada fraccin, llevando a cero conel blanco correspondiente. Tomar nota de todas las fracciones.

Clculos

FRACCION Densidades Opticas

Albmina A1 x 2

1globulinaB

1

2globulina B2 globulina C1

Gama globulina D1

SUMATORIA TOTAL = A1x 2 + B1+B2+ C1+ D1= F

Albmina en %:F 100%(A1x 2) X = 58 %

Idemtico para las demas fracciones.

Albmina en g/dl:

100 % 6,9 g/dl58 % X=

Idemdentico para las demas fracciones.

Valores de referencia: Protenas Totales: 6,1 a 7,9 g/dl

FRACCION % Relativo Absol. g/cl

Albmina 50 a 58 3,4 a 4,51globulina 4 a 8 0,35 a 0,452globulina 7 a 11 0,60 a 0,77 globulina 11 a 15 0,75 a 1,00

Gama globulina 14 a 22 0,90 a 1,30

7/25/2019 Guia Tp 2013

44/61


44

Cuestionario:

1- Cuales considera Ud. son las correctas maneras de proceder en la manipulacin de los

soportes para electroforesis ?

2- Nombre cuales son las bandas que aparecen en un densitogrma, si la muestra es suero?

y si la muestra fuese plasma?

3- Normalmente en una electroforesis de zona para protenas sricas el voltaje es de 80-110V,

pero en una electroforesis PAGE los voltajes fluctan entre 8001400 V, por que?

4- El colorante utilizado durante el practico, A que debe su especificidad de tincin? Cual

otro podra utilizarse?

7/25/2019 Guia Tp 2013

45/61


45

TRABAJO PRCTICO N 8ANTICUERPOS

Objetivos:

Utilizar los anticuerpos como herramienta para evidenciar la presencia de antgenos Conocer los alcances de esta herramienta

Fundamentos Tericos:

Los anticuerpos son molculas con forma de Y formados por dos cadenas pesadasidnticas y dos cadenas livianas idnticas. Cada brazo de una molcula de anticuerpo contieneuna cadena liviana unida a una cadena pesada por un puente disulfuro. Cerca del final de cadabrazo hay giros altamente variables, llamadas regiones determinante de la complementariedad(CDRs), las cuales forman el sitio de unin de los antgenos (cualquier molcula capaz degenerar una respuesta inmune). La secuencia de los seis giros es altamente variable entre losanticuerpos, hacindolos especficos para cada antgeno. La interaccin entre un anticuerpo y

un eptope en un antgeno es complementaria en todos los casos; esto es, la superficie del sitiode unin de un antgeno en un anticuerpo coincide fsicamente con el correspondiente eptope.El intimo contacto entre las dos superficies, estabilizado por numerosas uniones no covalentes,es responsable de la alta especificidad exhibida por los anticuerpo.

La especificidad de los anticuerpos es tan alta que incluso en algunos casos puedendistinguir entre proteinas que difieren en un solo aminocido. Por esta razn y la forma en quepueden ser producidos estos son altamente utilizados en diferentes experimentos.

a) Anticuerpo b)interaccin antgeno-anticuerpo

Las propiedades los anticuerpos los vuelve una herramienta interesante para el trabajoen el laboratorio. Sin embargo una vez que los Ac. Se unen a los Ag. Se vuelve fundamentalevidenciarla, por esta razn se han desarrollado varias formas para hacerlo. Entre las variantesse encuentra la posibilidad de unir al los Ac. Grupos cromgenos, grupos fluorescentes, oenzimas, de esta manera el complejo Ac-Ag es evidenciado por la presencia de color o elproducto de una reaccin qumica.

En algunos casos no es necesario modificar los Ac para mostrar la presencia de Ag. Yaque cuando los primeros encuentran en la muestra un ag con mas de dos epitopes se puede

producir una red, debida a la interaccin de varios epitopes con varios paratopos, que es visiblea simple vista como una aglutinacin

7/25/2019 Guia Tp 2013

46/61


46

DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS Y FACTOR RH.

GRUPOS SANGUNEOSIntroduccin:

En la superficie celular de los glbulos rojos de las diferentes personas hay dos tipos deantgenos relacionados entre s, los tipos A y B. Dada la forma en que estos antgenos seheredan, una persona puede no tener ninguno, tener uno de ellos o tener los dossimultneamente. De esta manera los glbulos rojos humanos pueden ser clasificados en 0(cero), A, By AB.

En el plasma de las personas que no poseen uno de estos antgenos en sus eritrocitosexisten habitualmente potentes anticuerpos que reaccionan especficamente contra esosantgenos provocando aglutinacin.

En otras palabras existen anticuerpos (aglutininas) para los antgenos (aglutingenos) Ay B. Se demostr que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antgenopresente en sus propios glbulos rojos, pero si contra los que no posee.

Se aclara mejor en el siguiente cuadro:

GRUPOHEMATES

AGLUTINGENOS (Ag)SUERO

AGLUTININAS (Ac)

0 0

, A A (anti-B)B B

(anti-A)AB AB NINGUNO

Cuando los glbulos no contienen ni aglutingeno A ni aglutingeno B, la sangre esde tipo 0.

Cuando solo existen aglutingenos del grupo, B la sangre es del grupo B. Cuando existen ambos aglutingenos A y B, la sangre es del grupo AB. Las aglutininas son gamma globulinas igual que otros anticuerpos, producidas por

las mismas clulas que elaboran anticuerpos para cualquier otro antgeno. Casitodas son molculas de inmunoglobulinas de tipo IgM e IgG.

Grupos Sanguneos y Transfusin:

La transfusin ideal consiste en infundir sangre de la misma composicin antignica que elreceptor, esto solo es posible en contadas ocasiones (gemelos idnticos o sangre guardadadel mismo receptor).En la gran mayora de los casos se trata de que sean compatibles en los sistemas

antignicos ms importantes: AB0 y Rh.En el sistema AB0 se debe usar sangre del mismo grupo, siempre que sea posible. Si no esas los glbulos infundidos deben ser compatibles con el suero del receptor de acuerdo alsiguiente esquema, en que las posibilidades de donar sangre se indican en la direccin delas flechas.

A

0 AB

B El individuo 0 puede ser transfundido con sangre 0, el individuo A puede ser

transfundido con sangre A o B.

7/25/2019 Guia Tp 2013

47/61


47

El individuo B puede ser transfundido con sangre B o 0. El individuo AB puede ser transfundido con sangre AB, B, A o 0.

En todos los casos de no coincidencia del grupo, se debe verificar que el titulo deaglutininas del dador no sea alto, siendo as es un dador peligroso.

FUNDAMENTOS DEL MTODO:Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con reactivo anti-A, o anti-B. Siexisten en la misma superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, seproducir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin entodos los casos, implica grupo 0.

MARCHA PRCTICAReactivos

Anti-A monoclonal* Anti-B monoclonal* Muestra: Glbulos rojos o sangre entera.

*Reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por lneascelulares de hibridomas de ratn (consultar: Biologa Celular y Molecular de la Clula,3er o 4ta ed., Alberts et al.)

Recoleccin:La sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.

Aditivos:Pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, Heparina, ACD, etc.

Material Requerido: Placas de vidrio Palillos mezcladores descartables

Limitaciones del Mtodo: Reacciones dbiles pueden observarse en los siguientes casos: Neonatos; los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin

nacido. Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en losprematuros.

Leucemias u otros desrdenes malignos. Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de

grupo no idntico.

Procedimiento:Tcni ca en Placa:Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%, o sangre entera.En una placa limpia colocar:

1. Una gota de sangra entera. Una gota de reactivo anti-A o anti-B.2. Mezclar el reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea

circular de 2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos.3. Observar la aglutinacin visible macroscpicamente hasta los 2 minutos.

Consignas a responder- Cual es la diferencia entre suero y plasma? Para esta experiencia vale tener

encuenta tal connotacin?

- En personas con eritroblastosi fetal se puede determinar el grupo y facto

7/25/2019 Guia Tp 2013

48/61


48

TRABAJO PRCTICO N 9HIDRATOS DE CARBONO

OBJETIVO DEL PRCTICO:

Familiarizar al alumno con las propiedades qumicas generales de los hidratos decarbono.

INTRODUCCIN:Los hidratos de carbono abundan en prcticamente todos los seres vivos. En los tejidos

vegetales constituyen los elementos fibrosos de su estructura o los productos de la reservanutricia de tubrculos, semillas y frutos. En los tejidos animales constituyen la reservaenergtica de las clulas o integran complejas molculas que participan en diversas funciones.

En la alimentacin humana, los hidratos de carbono constituyen el principal aportedesde el punto de vista energtico.

Qumicamente, estn compuestos por carbono, hidrogeno y oxigeno, y pueden definirsecomo polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas. Esto es, son compuestos que poseen unafuncin aldehdo o cetona y varias funciones alcohlicas, o compuestos que por hidrlisisoriginan polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas.

Segn la complejidad de la molcula se clasifican en monosacridos, oligosacridos ypolisacridos.

ACCIN DE LOS CIDOS

HIDRLISIS:

El tratamiento de los oligo y polisacaridos compuestos por azucares neutros con todoslos anillos en forma piransica, con HC

Documents

Guia Tp 2013