Grado en Química 4º Curso

Bioquímica

Guión de Prácticas

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UTILES A TRAER POR EL ALUMNO Bata

Gafas de Seguridad

Cuaderno de Laboratorio

NORMAS DE TRABAJO Antes de empezar

Antes de empezar cada práctica, el profesor comprobará que el alumno ha leido el guión

correspondiente y contestado las preguntas previas.

Durante las sesiones

Las prácticas son en grupos de dos, salvo que se indique lo contrario.

Cada alumno tendrá asignado una mesa y una taquilla con el equipo individual.

Trabajar siempre en la mesa.

Mantener siempre limpia la mesa de trabajo.

Al acabar

Limpiar la mesa y el material utilizado.

Dejar el equipo individual en la mesa de trabajo.

Avisar al profesor antes de abandonar el laboratorio.

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Día 1 Parte 1- Células eucariotas 1- Observación de células eucariotas en cultivo y obtención de extractos celulares. El objetivo de esta primera parte de la práctica consiste en iniciarse en el manejo de células eucariotas. Estas células pueden cultivarse de 2 formas distintas: i) en suspensión, en frascos de cultivo especiales provistos de barras de agitación magnética, o ii) en monocapa, formando una película adherida al fondo de placas o frascos de cultivo de plástico y recubiertas por medio de cultivo líquido. Para observar el crecimiento diario y el aspecto de las células, se utilizan microscopios invertidos, que tienen las ópticas en la parte inferior y la iluminación en la superior, con objeto de acercar la óptica al fondo de los frascos, que es donde se encuentran las células. Para esta práctica utilizaremos células (CEF: fibroblastos embrionarios de pollo) en monocapas cultivadas en placas de 35 mm de diámetro, a partir de las cuales obtendremos extractos totales (todo el contenido celular) y extractos citoplasmáticos que analizaremos posteriormente por electroforesis en geles de poliacrilamida, en la segunda parte de la práctica. PROTOCOLO: 1- Observar las células al microscopio invertido procurando identificar las formas celulares y, si es posible, el núcleo. 2- Lavar las células 3 veces con tampón salino isotónico (PBS) para eliminar los restos de medio de cultivo y suero, manteniendo la integridad celular. 3- Obtención de los extractos: tras eliminar el máximo posible de PBS de las placas de cultivo inclinándolas, añadir

- Para el extracto citosólico: 100 µl de tampón de lisis A a una de las placas y observar la lisis al microscopio.

- Para el extracto total: 100 µl de tampón de carga de SDS-PAGE 1X (ver electroforesis). La ruptura de los núcleos y la liberación del DNA genómico provocarán un aumento de la viscosidad.

- Guardar los extractos obtenidos en tubos eppendorf convenientemente marcados. El extracto citosólico deberá centrifugarse durante 5 minutos a 10.000 rpm en una microfuga, con objeto de eliminar en lo posible los restos celulares (membranas, nucleos...). Tras la centrifugación recuperaremos el sobrenadante que transferiremos a un tubo eppendorf limpio.

Tampones utilizados: PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,47mM KH2PO4, 8,1mM Na2HPO4; pH 7.4. Tampón de lisis A: 20 mM Tris-HCl pH 8.0; 150mM NaCl, 0,5% NP40.

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2- Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida (PAGE). El objetivo consiste en resolver y analizar las proteínas presentes en los extractos obtenidos en la

primera parte de la práctica. La electroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las técnicas analíticas

más habituales dentro de la Bioquímica. Las moléculas biológicas (ADN, proteínas, vitaminas, etc.) poseen cargas eléctricas, y por tanto pueden migrar al someterse a un campo eléctrico. La movilidad dependerá de la carga que presentan al pH que trabajemos. La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas (ADN y proteínas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional y opone una resistencia fisica a la migración de las moléculas, que será mayor cuanto mayor sea la molécula. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del líquido en sus poros. Los geles pueden ser más o menos restrictivos según que el tamaño de poros limite o impida más o menos el paso de las moléculas. Los más restrictivos, como los geles de acrilamida-bisacrilamida, oponen impedimento al paso de las moléculas, participando así en el proceso de separación. Entre los menos restrictivos está la agarosa, más utilizada en separación de moléculas de DNA y que utilizaremos en el segundo día de prácticas.

Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensión que proporciona el campo eléctrico, mediante dos electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitúan los electrodos. C) un soporte electroforético. D) el tampón de electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la proximidad del cátodo; el tampón evitará que el entorno anódico se acidifique y el catódico se haga más básico a lo largo de la electroforesis.

En esta práctica, el polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bis-

acrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato amónico, TEMED). En nuestro caso, la separación de las proteínas se verá condicionada sólo por su tamaño y no por su carga ya que, antes de ser sometidas a electroforesis, las proteínas serán desnaturalizadas utilizando un detergente denominado SDS (dodecil-sulfato sódico), que despliega a las proteínas y se queda pegado a su superficie confiriéndole una gran carga negativa. Esta carga del SDS enmascara la carga intrínseca de la proteína y hace que todas las proteínas presenten la misma densidad de cargas negativas, lo que provoca que la mayor o menor migración de las proteínas en el gel va a estar directa y únicamente relacionada con la masa molecular de cada proteína.

Para hacer los geles utilizaremos el método inicialmente descrito por Laemli de geles discontinuos. La electroforesis en geles de acrilamida se puede realizar empleando sistemas de uno o más tampones, en estos casos se habla de sistemas tampón continuos o discontinuos. En los sistemas discontinuos el primer tampón asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocándose la acumulación de todas las que se han cargado en el pocillo en una franja muy estrecha. La separación realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración alcanza la frontera del segundo tampón (en el límite del gel separador). En el esquema se muestran secuencialmente la situación en (a) al principio de la electroforesis, (b) durante el proceso de apilamiento ('stacking') y (c) durante la separación en el gel resolutivo. El primer gel ('stacking') es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel que es el que realmente separa las proteínas. Este sistema es mucho más resolutivo que los sistemas continuos.

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PROTOCOLO: 1- En primer lugar montaremos las placas donde polimerizaremos los geles. Utilizaremos el sistema mini-protean III de BioRad. Siguiendo el esquema, hemos de colocar dos placas de vidrio juntas: una más grande, (que tiene a los lados unos espaciadores para que exista un hueco entre las 2 placas para contener el gel) y otra más pequeña. Se introducen en las pinzas verdes para que queden presionadas una contra la otra y se sellan por la parte de abajo, presionándolos contra goma.

2- A continuación haremos las mezclas de acrilamida-bis para los geles mediante el siguiente protocolo:

Gel separador del 10%: Gel concentrador del 4%: Mezcla acrilamida-bis (30-0,8%) 3,3ml 650µl 1,5M Tris-HCl pH 8.8 2,5ml __ 0,5M Tris-HCl pH 6.8 __ 1,25ml H2O 4,1ml 3,05ml 10% SDS 100µl 50 µl 10% Persulfato amónico 50µl 50µl TEMED 6µl 6µl Una vez añadido el TEMED, introduciremos la mezcla del gel separador entre las 2 placas de vidrio, recubriremos con agua con mucho cuidado y dejaremos polimerizar. IMPORTANTE: Sólo añadiremos los agentes polimerizantes (persulfato y TEMED) justo antes de pipetear la mezcla entre las placas. Una vez polimerizado el gel separador, retiraremos el agua, añadiremos PSA y TEMED a la mezcla del concentrador y lo pondremos encima del separador. Inmediatamente introduciremos un “peine” para que al polimerizar queden formados unos pocillos donde pondremos las muestras. Cuando hayan polimerizado ambos geles, montaremos las placas en la cubeta de electroforesis como se ve en la siguiente secuencia de imágenes, de forma que quedará un compartimento estanco en la parte interior que llenaremos de tampón, que pondrá en contacto al cátodo con la parte superior del gel y todo el conjunto lo introduciremos en una cubeta a la que añadiremos el tampón suficiente para poner en contacto la parte inferior del gel con el ánodo.

3- Preparación de la muestra:

a b

c

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Cada grupo va a cargar 2 muestras en el gel, correspondientes a i) los extractos totales y ii) extractos citosólicos obtenidos en la primera parte de la práctica. Prepararemos pues 2 tubos:

1-­‐ Total:  10  µl  del  extracto  total  (ya  está  disuelto  en  el  tampón  de  carga  de  SDS-­‐PAGE)  2-­‐ Citosólico:  10  µl  de  extracto  citosólico  +  4  microlitros  de  tampón  de  carga  de  SDS-­‐PAGE  

3X.  

Tampón de carga de SDS-PAGE 3X: 60mM Tris-HCl pH 6,8; 2%SDS; 5% β-mercaptoetanol, 10% glicerol, 0,005% azul de bromofenol. Tampón de desarrollo de electroforesis: 25 mM Tris, 192 mM glicina, 0.1% SDS, pH8.3. Incubaremos los tubos a 100ºC durante 5 minutos y cargaremos cada una de las muestras en un pocillo del gel. En el primer pocillo cargaremos un marcador de peso molecular como guía para identificar el tamaño aparente de las proteínas de los extractos. La electroforesis se desarrollará a 200 voltios hasta que el frente de migración se acerque al final del gel. Teñiremos los geles incubándolos durante 30 minutos con una solución de azul de Coomasie al 0,25% en 33% metanol y 10% acético con el doble fin de teñir las proteínas y precipitarlas en el gel para impedir su difusión. El gel se desteñirá con la misma solución sin contener el colorante. Resultados: identificar diferencias entre los 2 extractos e identificar los pesos moleculares aproximados de esas proteínas por comparación con el patrón. Parte 2: Transformación de bacterias competentes con un plásmido con resistencia a Ampicilina Fundamento

Los plásmidos se pueden introducir en la célula bacteriana mediante un proceso denominado transformación. En este proceso se usan células bacterianas con la pared debilitada al haber sido obtenidas en la fase exponencial de su crecimiento, que denominamos “competentes” al ser más susceptibles de incorporar DNA exógeno debido a la debilidad de su pared. El DNA plasmídico se incuba con iones divalente que neutralizan la carga de sus fosfatos facilitando la interacción con la membrana celular. Tras ser sometidas a un choque térmico (heat-shock), las bacterias competentes incorporarán el DNA del plásmido así tratado. A continuación, se inoculan las células en la superficie de placas de agar y se dispersan con ayuda de una varilla. Sólo algunas células captan el DNA plasmídico y se necesitará un método para la selección de las células que lo han incorporado. La estrategia más común es insertar en el plásmido un gen, llamado gen de selección, que generalmente confiere a las células resistencia a antibióticos. El plásmido Bsct lleva el gen de resistencia a la ampicilina. La transformación de pBsct en las cepas de E.coli DH5 o JM109 supondrá la introducción de este genoma foráneo en una bacteria competente. Sólo las células de E.coli que hayan incorporado una molécula de pBsct podrán crecer en la placa de agar con ampicilina y formar una colonia visible (montoncito redondo de células) después de 12 horas de incubación. El número de colonias resistentes a la ampicilina pueden ser contadas. El cálculo de la eficiencia de transformación de las células competentes se expresa como Nº de transformantes/µg de DNA. Se describen los protocolos de preparación de células competentes y de las placas de agar-Ampicilina, pero en la práctica sólo realizaremos la transformación. Material Células competentes: Plásmidos: DH5 pBsct-1.4Fneu JM109 pBsct-1.2Fneu Transformación Para la transformación de células bacterianas con un plásmido se utilizarán células competentes, pertenecientes a los tipos DH5 o JM109 de E.coli, previamente preparadas con CaCl2 y conservadas a -70oC en alícuotas de 150-200µl. 1.- Descongelar las células en hielo y añadir 50µl en un tubo Eppendorf. 2.- Añadir 1µl del plásmido DNA (pBsct-1.4Fneu o pBsct-1.2Fneu) y mantener 25-30' en hielo.

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3.- Someter la mezcla a un choque térmico a 42oC, durante 90'' y poner en hielo inmediatamente, durante 2'. 4.- Dispensar las células en placas de agar con ampicilina y extenderlas sobre la superficie cuidadosamente con ayuda de una varilla de vidrio. 5.- Incubar toda la noche a 37oC, en una estufa. 6.- Al día siguiente, comprobar el crecimiento de colonias bacterianas, resistentes a la ampicilina, que serán las que llevan en su interior el plásmido, que le confiere a la célula resistencia al antibiótico. 7.- Calcular la eficiencia de la transformación, expresada en nº de transformantes/µg de DNA. Preparación de placas de ampicilina 1.- Preparar el medio líquido LB (medio Luria-Bertani) según la receta siguiente: A 950ml de agua destilada añadir: Bactotriptona 10g Bactolevadura 5g NaCl 10g Ajustar el pH a 7,5 con 1M NaOH y completar el volumen con agua hasta 1l. Añadir 12g de bactoagar/1l de medio. Esterilizar en autoclave, durante 20', 120oC. 2.- Cuando el medio se retira del autoclave, se agita suavemente para mezclar bien el agar con el medio. Dejar enfriar el medio hasta unos 50oC y añadir ampicilina hasta una concentración de 0.1mg/ml. Agitar bien sin hacer burbujas y rellenar las placas con unos 15ml de medio aproximadamente. 3.- Cuando el medio haya solidificado totalmente, las placas se invierten y almacenan a 4oC, deben ser retiradas un par de horas antes de su utilización. Para prevenir la contaminación, todo el proceso debe realizarse utilizando un mechero bunsen o en una campana de cultivo. Preparación de células competentes 1.- Se crece durante toda la noche un cultivo de 1,5 ml de LB de la cepa hospedadora (DH5 o JM109), a 37oC. 2.- Inocular 50 ml de medio LB con el cultivo de 12 hrs. 3.- Crecer las células hasta que la absorbancia a 600nm se encuentre entre 0,4-0,6. 4.- Centrifugar las células a 2,5K, 10' y resuspenderlas en 17ml de 50 mM CaCl2, previamente enfriado en hielo. 5.- Dejar la suspensión celular en hielo, 30'. 6.- Centrifugar nuevamente 10', 2,5K. 7.- Resuspender las células en 2,5ml de CaCl2-15% glicerol. 8.- Distribuir en alícuotas de 75µl, congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -70oC.

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Día 2 Parte 1- Digestión de un plásmido con enzimas de restricción

En esta práctica se utilizarán un procedimiento esencial en Biología Molecular: la digestión de DNA con endonucleasas de restricción de tipo II, que permiten cortar el DNA de forma reproducible y específica de secuencia. El mecanismo de actuación de estos enzimas se explica en el seminario correspondiente. La digestión del plásmido Bsct, con diferentes enzimas de restricción, supondrá la linearización del plásmido y la liberación del inserto clonado en el sitio de restricción de EcoRI y/u otros fragmentos, según los enzimas utilizados. La electroforesis de los fragmentos de DNA resultantes de la digestión (parte 3), permitirá la separación del DNA por tamaños, los fragmentos pequeños migrarán más lejos del origen que los fragmentos de mayor peso molecular. La visualización del DNA se realizará bajo luz ultravioleta, después de tinción con bromuro de etidio. El EtBr es un colorante fluorescente que se intercala entre las bases del DNA. La radiación ultravioleta a 254nm es absorbida por el DNA y puede ser utilizado para detectar DNA y RNA de cadena sencilla y doble. La cuantificación de los distintos fragmentos se realizará por comparación con un marcador de pesos moleculares: fragmentos de DNA del fago lambda digerido con HindIII. Comparando los tamaños de los diferentes fragmentos generados, podremos establecer un pequeño “mapa” de restricción del plásmido. Material Plásmidos: Enzimas de restricción: pBsct-1.4Fneu BamHI 10U/µl pBsct-1.2Fneu HindIII 10U/µl Tampón de digestión: 10 x OFB : Solución stop 330 mM Tris acetato pH7.9 20% Ficoll 660 mM Acetato potásico 0,25% Azul de bromofenol 100 mM Acetato magnésico 0,25% Xileno cianol 1 mg/ml BSA 10 mM EDTA 30 mM Espermidina 10 mM DTT Digestión del plásmido y cuantificación del DNA 1.- En un tubo Eppendorf de 1.5ml pipetear los diferentes componentes necesarios para la digestión en el orden que se indica, (hacer una muestra igual sin añadirle el anzima de restricción)

H2O 16µl 14µl 14µl

10xOFB 2µl 2µl 2µl

10mM DTT --- 2µl 2µl

DNA 1µl 1µl 1µl

EcoRI 1µl --- ---

BamHI --- 1µl ---

HindIII --- --- 1µl

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20µl 20µl 20µl

2.- Mezclar bien el contenido del tubo con el propio "tip", evitando que quede líquido en las paredes. 3.- Incubar los tubos en un baño termostatizado durante 30'-1hr. a 37oC, para permitir que la digestión del plásmido sea completa. 4.- Parar la actividad de la enzima con 2µl de solución stop, que se utilizará también como tampón de carga en la electroforesis posterior (parte 3). Parte 2- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Esta parte será más una demostración que una práctica y será realizada por el profesor o por un voluntario. Haremos sólo una reacción por práctica. Esta técnica ha sido explicada en el seminario y consiste en la amplificación de fragmentos de DNA que están comprendidos entre 2 secuencias conocidas a partir de las cuales diseñaremos los cebadores específicos utilizados en la reacción. Mediante la repetición sucesiva de ciclos de: i) desnaturalización, ii) hibridación y iii) extensión, la polimerasa termoestable denominada Taq, extenderá los cebadores tomando como molde las secuencias del DNA proporcionado y amplificando la región comprendida entre los 2 cebadores. En esta demostración realizaremos la amplificación de un fragmento de DNA de 500 pares de bases a partir de un plásmido recombinante que contiene la secuencia diana. Para ello, haremos la siguiente mezcla en un tubo de PCR: Mezcla PCR Tampón 10X 10µl 50mM MgCl2 4µl 20 µM Cebadores (2X) 2µl (2X) 10mM dNTPs 2µl DNA 1µl (50 ng) BioTaq 1µl H2O 78µl 100µl Tampón 10X: 160mM (NH4)2SO4; 670mM Tris-HCl pH 8.8; 0,1% Tween 20. La mezcla se dividirá en 2 tubos de PCR: uno se dejará encima de la mesa, mientras que el otro se intruducirá en el termociclador previamente programado con los siguientes ciclos de temperatura: 1º- 95ºC 2 minutos 2º- 94ºC 30 segundos 65ºC 30 segundos Repetir 32 veces 72ºC 30 segundos 3º- 72ºC 10minutos Parte 3- Electroforesis de DNA en geles de agarosa La mayor parte de las separaciones rutinarias de moléculas de DNA se realizan en geles “submarinos” de agarosa. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato a los valores de pH normalmente utilizados en electroforesis (alrededor de 8). Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo, sin necesidad de añadirles detergentes. La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se vuelve líquido. Esta característica

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permite una fácil preparación de una matriz para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un tampón adecuado, se calienta y se vierte sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de superenrollamiento que éste poseea. La visualización del DNA se realizará bajo luz ultravioleta, después de tinción con bromuro de etidio. El EtBr es un colorante fluorescente que se intercala entre las bases del DNA. La radiación ultravioleta a 254nm es absorbida por el DNA y puede ser utilizado para detectar DNA y RNA de cadena sencilla y doble. La cuantificación de los distintos fragmentos se realizará por comparación con un marcador de pesos moleculares: fragmentos de DNA del fago lambda digerido con HindIII. Preparación de un gel del 1% de agarosa 1.- Preparar el tampón de electroforesis 0.5X TBE, en cantidad suficiente para rellenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel de agarosa. 0,5xTBE: 0,045 mM Tris 0,045 mM Acido bórico 0,001M EDTA 2.- En un matraz de 250ml, añadir 1g de agarosa a 100ml de 0,5X TBE, calentándolo en el microondas hasta que se disuelva. Tener cuidado con la solución de agarosa, puede sobrecalentarse o hervir violentamente si ha sido calentada por mucho tiempo en el microondas. Controlar que toda la agarosa está disuelta y que el volumen de la disolución no ha disminuido por evaporación, en cuyo caso deberá ser repuesto. 3.- Dejar que la disolución enfríe hasta 60oC y añadir Bromuro de Etidio hasta una concentración final de 0,5 µg/ml utilizando una disolución stock de 10 mg/ml de EtBr. Todas las disoluciones que contengan EtBr no deben tocarse con las manos desprovistas de guantes, ya que es tóxico. 4.- Colocar el peine en la cubeta de electroforesis a 1-2 mm de la superficie de la cubeta, sin tocarla, para que así los pocillos queden bien formados. 5.- Añadir la disolución de agarosa que acabamos de preparar. El gel debe tener entre 4-5mm de espesor. Controlar que no se han formado burbujas de aire, bajo o entre los dientes del peine. 6.- Dejar que el gel solidifique a temperatura ambiente, posteriormente retirar cuidadosamente el peine. 7.- Añadir el tampón de electroforesis, de forma que cubra totalmente el gel. 8.- Cargar cuidadosamente las muestras (ver más abajo), con una micropipeta, en un gel del 1% de agarosa. 9.- Desarrollar la electroforesis durante 30-45', a 40 mAmps. El DNA migrará hacia el ánodo (rojo). 10.- Visualizar el DNA, examinando el gel con luz ultravioleta. Los fragmentos de DNA aparecerán anaranjados. En la figura de abajo puede observarse cómo se ensambla la cubeta donde montaremos el gel de agarosa.

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Muestras para analizar en el gel de agarosa: Cada grupo cargará 2 muestras en el gel, correspondientes a i) el plásmido sin cortar y ii) el plásmido cortado con el enzima de restricción: ambas preparadas en la parte 1 de esta práctica. Adicionalmente, se cargarán los tubos con las mezclas de PCR (parte 2), tanto las del termociclador como la que no se incubó. Resultados: Se comprobará la eficacia de la digestión con los enzimas de restricción y se analizará el tamaño del

plásmido y del fragmento liberado tras la digestión (si lo hubiere). Asimismo comprobaremos el

resultado del PCR y el efecto de las variaciones de temperatura sobre el éxito de la técnica.