GVO - Screening qualitativ 2015/Auswertung DLA 24-2015 GMO-Screening.pdf · August 2015 DLA – 24/2015 – GVO-Screening qualitativ DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht

August 2015 DLA – 24/2015 – GVO-Screening qualitativ

DLADienstleistung

LebensmittelAnalytik GbR

Auswertungs-BerichtLaborvergleichsuntersuchung

24/2015

GVO - Screening qualitativ:

5 Proben mit positiv/negativ Gehalten an GVO-Mais (Bt11) oder GVO-Soja (RR)

Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbRWaldemar-Bonsels-Weg 17022926 Ahrensburg, Germany

[email protected] www.dla-lvu.de

Koordinator der LVU: Dr. Matthias Besler

Nachdruck, auch auszugsweise, nur mit schriftlicher Genehmigung von DLA-AhrensburgSeite 1 von 26


Inhalt1. Einleitung....................................................32. Durchführung..................................................3

2.1 Untersuchungsmaterial.....................................32.2 Untersuchung..............................................32.3 Ergebnisübermittlung......................................3

3. Auswertung....................................................54. Ergebnisse....................................................5

4.1 Vergleichsuntersuchung....................................64.1.1 Ergebnisse: 35S-Screening-Sequenz.......................64.1.2 Ergebnisse: NOS-Screening-Sequenz.......................74.1.3 Ergebnisse: GVO-Soja (RR-Round-Up-Ready-Soja)...........84.1.4 Ergebnisse: Lektin-DNA (Soja-spezifisch)................94.1.5 Ergebnisse: GVO-Mais (bt11-Mais).......................104.1.6 Ergebnisse: Mais-DNA (Mais-spezifisch).................114.1.7 Ergebnisse: Weitere Parameter (DNA)....................12

5. Dokumentation................................................135.1 Angaben der Teilnehmer zur DNA-Extraktion................135.1.1 35S-Screening Sequenz..................................135.1.2 NOS-Screening Sequenz..................................145.1.3 GVO-Soja (RR-Round-Up-Ready-Soja)......................155.1.4 Lektin-DNA (Soja-spezifisch)...........................155.1.5 GVO-Mais (bt11-Mais)...................................165.1.6 Mais-DNA (Mais-spezifisch).............................165.1.7 Weitere Parameter (DNA)................................175.2 Angaben der Teilnehmer zur PCR-Reaktion..................185.2.1 35S-Screening Sequenz..................................185.2.2 NOS-Screening Sequenz..................................195.2.3 GVO-Soja (RR-Round-Up-Ready-Soja)......................205.2.4 Lektin-DNA (Soja-spezifisch)...........................215.2.5 GVO-Mais (bt11-Mais)...................................225.2.6 Mais-DNA (Mais-spezifisch).............................225.2.7 Weitere Parameter (DNA)................................23

6. Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge.....................................................247. Verzeichnis relevanter Literatur.............................25



1. Einleitung

Die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen (LVU) ist einunverzichtbarer Baustein für das Qualitäts-Management-System eines jeden,mit der Untersuchung von Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetik undBedarfsgegenständen befassten Labors. Die Durchführung vonLaborvergleichsuntersuchungen ermöglicht den teilnehmenden Instituten dieeigene analytische Kompetenz unter realen Bedingungen nachzuweisen.Gleichzeitig erhalten sie wertvolle Daten zur Validität derdurchgeführten Untersuchungsmethode. Das Ziel von DLA ist es, LVU für ausgesuchte Parameter in praxis-relevanten Konzentrationen anzubieten. Durchführung und Auswertung der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchungerfolgten nach den technischen Anforderungen der DIN EN ISO/IEC 17043(2010) und DIN ISO 13528-2009.

2. Durchführung

2.1 Untersuchungsmaterial

Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um 5 verschiedeneMischungen handelsüblicher Lebensmittelproben Europäischer und/oder US-Amerikanischer Anbieter (s. Tabelle 1).Die Zutaten wurden gemischt und homogenisiert. Anschließend wurde dasMaterial in Portionen zu ca. 10 Gramm abgepackt. Das Material wurde auf Homogenität getestet.

2.2 Untersuchung

An jedes teilnehmende Labor wurden in der 21. Kalenderwoche 2015 je einePortion der 5 Untersuchungsmaterialien verschickt. Die Untersuchungsver-fahren wurden freigestellt. Die Untersuchungen waren durchzuführen bisspätestens 3. Juli 2015.

2.3 Ergebnisübermittlung

Die Ergebnisabgabe erfolgte einheitlich mittels, den teilnehmenden Insti-tuten übermittelten Abgabedateien. Zur Auswertung kamen die Ergebnisseals positiv/negativ Angaben bezüglich der jeweils getesteten Analyten.Abgefragt und dokumentiert wurden die o.g. Ergebnisse sowie Angaben zuden Testmethoden wie Spezifitäten, Testkit-Hersteller und Stichpunkte zurDurchführung der Methoden. Alle Teilnehmer haben ihre Ergebnisse fristgerecht übermittelt.



Tabelle 1: Zusammensetzung der DLA-Proben

DLA-Probe

Zutaten (pro 100 g) GVO-AnteilMais

GVO-AnteilSoja

1 Maisgrieß, Europäischer Anbieter (62,5 g)Zutaten: MaisgrießNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 7,5 g, Kohlenhydrate 74 g, Fett 1 g

Kartoffelmehl (37,5 g)Zutaten: KartoffelmehlNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 0,6 g, Kohlenhydrate 83 g, Fett 0,1 g

-

-

-

-

2 Maisgrieß, Europäischer Anbieter (50 g)Zutaten: MaisgrießNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 7,5 g, Kohlenhydrate 74 g, Fett 1 g


Maismehl, USA-Anbieter (12,5 g)Zutaten: MaismehlNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 9 g, Kohlenhydrate 79 g, Fett 0 g

-

-

positiv(bt11-Mais experimentell)

-

-

-

3 Sojaflocken, Europäischer Anbieter (62 g)Zutaten: SojabohnenNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 41 g, Kohlenhydrate 3,1 g, Fett 21 g

Glucose (19 g)Lactose (19 g)

-

- -

-

- -

4 Mahlzeitersatz, Diät-Lebensmittel (62,5 g)Zutaten: Sojaeiweiß-Isolat, Honig, Magermilch-Joghurtpulver, Eisenfu-marat, Zinkoxid, Kupfergluconat, Mangansulfat, Kaliumiodid, Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6, Vitamin B12, Biotin, Calciumpanto-thenat, Folsäure, Nicotinsäureamid, Vitamin D3, DL-alpha-Tocopherylace-tat


-

-

positiv(RR-Soja experimentell)

-

5 Sojaflocken, Europäischer Anbieter (59 g)Zutaten: SojabohnenNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 41 g, Kohlenhydrate 3,1 g, Fett 21 g

Glucose (18 g)Lactose (18 g)

Soya Chunks, USA-Anbieter (5,4 g)Zutaten: SojamehlNährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 47 g, Kohlenhydrate 17 g, Fett 0,8 g

-

- -

-

-

- -

positiv(RR-Soja experimentell)



3. Auswertung

Die Auswertung der GVO-Screening Laborvergleichsuntersuchung erfolgteausschließlich qualitativ.

Im Ergebnisteil werden getrennt nach den jeweiligen Parametern 35S, NOS,GVO-Soja (RR), Lektin-DNA, GVO-Mais (bt11), Mais-DNA und andere DNA dieErgebnisse für die 5 LVU-Proben in einer Tabelle dargestellt.Am Ende der betreffenden Tabelle werden die Anzahl und der Prozentsatzpositiver und negativer Ergebnisse angegeben. Die teilnehmenden Laboreentscheiden dabei selbst nach ihren internen Kriterien, ob ein Ergebnispositiv oder negativ zu werten ist.Sofern ≥ 75 % positive oder negative Ergebnisse vorliegen, wird für diebetreffende Probe ein Konsens-Ergebnis festgestellt.

Für jeden Teilnehmer wird in Bezug auf die Konsens-Ergebnisse einequalitative Bewertung vorgenommen. Hier werden die Anzahl und derProzentsatz der bezüglich der Konsens-Werte als "richtig" angesehenenErgebnisse angegeben.

4. Ergebnisse

Alle folgenden Tabellen sind anonymisiert. Den teilnehmenden Laboratorienwird mit dem Versand dieser Auswertung ihre individuelle Auswertenummermitgeteilt.

Die Ergebnisse der teilnehmenden Institute sind tabellarisch folgenderma-ßen aufgeführt:


Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Hinweis

Parameter

Auswerte-nummer

Qualitative Bewertung

pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg Übereinstimmungen mit Konsenswerten


4.1 Vergleichsuntersuchung

4.1.1 Ergebnisse: 35S-Screening-Sequenz

Anmerkung zu den Ergebnissen:

Es wurden für 4 Proben Konsenswerte mit zweimal 100%, einmal 90% und 86%positiven bzw. negativen Ergebnissen festgestellt. Für Probe 3 wurden zu 71% negative und 29% positive Ergebnisse erhalten.Ein Konsenswert mit ≥ 75% konnte somit nicht festgestellt werden. Daherwurde Probe 3 nicht für die "qualitative Bewertung" berücksichtigt.



35S

1 positiv positiv negativ positiv positiv 3/4 (75%)

2 negativ positiv positiv positiv positiv 4/4 (100%)

3 negativ positiv negativ positiv positiv 4/4 (100%)

4 positiv positiv positiv positiv positiv 3/4 (75%)










15 negativ positiv negativ negativ positiv 3/4 (75%)








Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5Anzahl positiv 3 21 6 19 21Anzahl negativ 18 0 15 2 0Prozent positiv 14 100 29 90 100Prozent negativ 86 0 71 10 0

negativ positiv keiner positiv positiv

Auswerte-nummer


pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg pos/negÜbereinstimmungen mit Konsenswerten

Probe 3: Spuren kleiner absoluter Nachweisgrenze

Probe 3: Spuren ct 38,5

Konsenswert


4.1.2 Ergebnisse: NOS-Screening-Sequenz


Es wurden für alle 5 Proben Konsenswerte mit zweimal 100%, einmal 90%,einmal 86% und einmal 81% positiven bzw. negativen Ergebnissenfestgestellt.



NOS























negativ positiv negativ positiv positiv

Auswerte-nummer


pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg pos/negÜbereinstimmungen mit

Konsenswerten

Probe 3: Spuren kleiner absoluter

Nachw eisgrenze

* Probe 3: Spuren ct 38,8

Konsenswert


4.1.3 Ergebnisse: GVO-Soja (RR-Round-Up-Ready-Soja)


Es wurden für 4 Proben Konsenswerte mit einmal 100%, zweimal 86% undeinmal 79% positiven bzw. negativen Ergebnissen festgestellt. Für Probe 4 wurden zu 71% positive Ergebnisse erhalten. Ein Konsenswertmit ≥ 75% konnte somit nicht festgestellt werden. Daher wurde Probe 4nicht für die "qualitative Bewertung" berücksichtigt.



1 positiv negativ positiv positiv positiv 2/4 (50%)

2 negativ negativ negativ negativ positiv 4/4 (100%)

3 negativ negativ negativ positiv positiv 4/4 (100%)

5 negativ negativ positiv positiv positiv 3/4 (75%)












negativ negativ negativ keiner positiv

Auswerte-nummer


RR-Soja pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg pos/negÜbereinstimmungen mit Konsenswerten

Probe 3: Spuren kleiner relativer

Nachweisgrenze

Konsenswert


4.1.4 Ergebnisse: Lektin-DNA (Soja-spezifisch)


Es wurden für 3 Proben Konsenswerte mit 100% positiven Ergebnissenfestgestellt. Für Probe 1 und Probe 2 wurden zu je 67% negative Ergebnisse erhalten.Ein Konsenswert mit ≥ 75% konnte somit nicht festgestellt werden. Daherwurden Probe 1 und Probe 2 nicht für die "qualitative Bewertung"berücksichtigt.



Lectin












21 positiv negativ positiv positiv positiv 3/3 (100%)


keiner keiner positiv positiv positiv

Auswerte-nummer


pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg pos/negÜbereinstimmungen mit Konsenswerten

Bei Proben 1 und 2 späte Amplifikationskurven, aber

nicht eindeutig positiv

Probe 1: geringe Sojaspuren

Konsenswert


4.1.5 Ergebnisse: GVO-Mais (bt11-Mais)


Für alle Proben wurden Konsenswerte mit dreimal 100% und zweimal 90%positiven bzw. negativen Ergebnissen erhalten.



bt11 Mais

1 negativ positiv negativ positiv negativ 4/5 (80%)

3 negativ positiv negativ negativ negativ 5/5 (100%)










negativ positiv negativ negativ negativ

Auswerte-nummer



Konsenswert


4.1.6 Ergebnisse: Mais-DNA (Mais-spezifisch)


Es wurden für drei Proben Konsenswerte mit zweimal 92% und einmal 83%positiven Ergebnissen festgestellt. Für Probe 3 und Probe 5 wurden jeweils zu 50% positive und negativeErgebnisse erhalten. Ein Konsenswert mit ≥ 75% konnte somit nichtfestgestellt werden. Daher wurden Probe 3 und Probe 5 nicht für die"qualitative Bewertung" berücksichtigt. Laut Hinweisen der Teilnehmerwurden in den Proben 3 bis 5 nur „Spuren“ von Mais-DNA nachgewiesen.



Mais

1 positiv positiv positiv positiv positiv 3/3 (100%)3 positiv positiv negativ positiv positiv 3/3 (100%)5 positiv positiv positiv positiv positiv 3/3 (100%)6 positiv positiv negativ negativ negativ 2/3 (100%)


12 positiv positiv negativ positiv negativ 3/3 (100%)

13 positiv positiv positiv positiv positiv 3/3 (100%)15 negativ negativ negativ negativ negativ 0/3 (0%)17 positiv positiv positiv positiv positiv 3/3 (100%)18 positiv positiv negativ positiv negativ 3/3 (100%)19 positiv positiv negativ positiv negativ 3/3 (100%)

21 positiv positiv positiv positiv negativ 3/3 (100%)


positiv positiv keiner positiv keiner

Auswerte-nummer



Probe 3 und 5 nicht zur Analyse auf gvMais

geeignet, sie enthalten zu w enig

amplif izierbare Mais DNA.

Probe 3 und 5: Mais in Spuren

nachgew iesen;Probe 4: Mais deutliche

Spuren nachgew iesen

Proben 3+4: geringe Maisspuren

Konsenswert


4.1.7 Ergebnisse: Weitere Parameter (DNA)


Parameter Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Hinweise

Weitere DNA

1a NK603 positiv positiv negativ positiv positiv1b negativ positiv negativ positiv positiv1c bar negativ negativ negativ negativ negativ1d FMV negativ negativ negativ negativ negativ1e EPSPS positiv negativ positiv positiv

2 positiv positiv positiv positiv positiv

4 FMV negativ negativ negativ negativ positiv5 FMV negativ negativ negativ negativ positiv7 FMV negativ negativ negativ negativ positiv8 andere negativ negativ negativ negativ negativ

11 negativ positiv negativ positiv positiv

12a p35S-pat negativ positiv negativ negativ negativ12b p35S-pat negativ positiv negativ negativ negativ

12c negativ positiv negativ positiv positiv

12d bar negativ negativ negativ negativ negativ12e negativ negativ negativ negativ negativ14 FMV negativ negativ negativ positiv positiv15 negativ negativ negativ negativ negativ20 Pflanzen-DNA positiv positiv positiv positiv positiv

21a negativ positiv negativ positiv positiv

21b negativ positiv negativ positiv positiv

21c Screening bar negativ negativ negativ negativ negativ21d Screening FMV negativ negativ negativ negativ positiv

21e negativ negativ negativ negativ positiv

24 FMV negativ negativ negativ negativ positiv Probe 4: Spuren

Teilnehmer-nummer

pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg pos/neg

pat

pos / negChloroplasten-

DNA

CTP2-CP4-EPSPS

CTP2-CP4-EPSPS

Proben 4 und 5: deutliche Spuren

pNOS

Target-DNA

Screening Pat-Gen

Screening CTP2-CP4-EPSPS

GVO-Soja MON89788


5. Dokumentation

5.1 Angaben der Teilnehmer zur DNA-Extraktion

5.1.1 35S-Screening Sequenz


Ergebnisangabe als Test-Kit oder Literatur Hinweise zur DNA-Extraktion

35S

12

3 §64 LFGB

45

6

7

8

9

10 unbekannt

11 ASU L 00.00-122

12 p35S-spezifische DNA-Sequenzen ASU L 00.00-122

14 35S1516 35 S, NOS

18 P-35S

1920 ASU L00.00.31

21 35S-promoter

22 GEN-IAL24 35S

Auswerte-nummer

Target-Sequenz / -DNA Anbieter / ASU-Methode z.B. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / DNA-Qualität

Extrakt. 2g mit CTAB und Aufreinigung mit QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Fa. Qiagen)

Kombination: CTAB-Lyse mit Macherey Nagel NucleoSpin® Food Kit

35S CaMV-Promotor SureFood GMO Kit, R-Biopharm NucleoSpin Food, Fa. Machery & NagelGen-ial FFS-Kit, Promega

Positiv / negativ Target-Sequenz 35S Promotor

LLC “Spectrtrading” 1) Qualitativ 35S/tNOS GMO Detection Kit

1 Schritt-Extraktion mit PrepMan ®ultra Sample Preparation Reagent von Applied Biosystems / Life Technologies

Congen: Sure Food GMO/ Screen 35S/NOS/FMV

Extraktion mit SureFood Prep Advaced

Biotecon Diagnostics

35S-Promoter DNA im FAM-KanalSureFood® GMO Screen 4plex

35S/NOS/FMV+IACExtraction mittels SureFood® PREP DNA/RNA Virus

Biotecon Biotecon foodproof Sample Prep. Kit III (S 400 06.1)Promotor des Cauliflower Mosaic

Virus (CaMV35S)Machery&Nagel NucleoSpin Food Kit / 200 mg Einwaage

ASU § 64 LFGB L 15.05-1 (SDS/Guanidiniumchlorid-Puffer mit Proteinase K, Aufarbeitung mittels Wizard-Kit der Fa. Promega)

R-Biopharm R-Biopharm, SureFood PREP Advanced, nach AnleitungTarget - DNA Biotecon Diagnostics foodproof GMO Sample Preparation Kit

Biotecon Biotecon DNA preapration kitfoodproof GMO Screening 1 LyoKit-5'Nuclease-, R 602 17-1, biotecon

DNA Extraktion gemäß foodproof Magnetic Preparation Kit III, biotecon S 400 13L

Macherey Nagel - nucleobondmodifiziertes CTAB-Verfahren mit clean-up

Microsynth Pentaplex AllGVOscB

Macherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen; Proteinase K und RNase A; Clean-up über Silica Röhrchen; DNA-

Gehalt und -Qualität photometrisch bestimmt: Probe 1: 48 ng/µl; A260/A280=1.8 A260/A230=2.1; Probe 2: 48 ng/µl; A260/A280=1,8 A260/A230=2,2 Probe 3: 97ng/µl; A260/A280=1,9 A260/A230=1,5

Probe 4: 146 ng/µl; A260/A280=1,9 A260/A230=1,6 Probe 5: 67 ng/µl; A260/A280=1,9 A260/A230=1,5

Congen 35S / nos / FMV Monoplex Congen PREP Basic Extraktionskit


5.1.2 NOS-Screening Sequenz



NOS

12

3 §64 LFGB

4

5

6

7

8

9

10 unbekannt

11 ASU L 00.00-122

12 ASU L 00.00-122

14 NOS1516 35 S, NOS

18 T-NOS

1920 ASU L00.00.31

21

22 GEN-IAL

24

Auswerte-nummer


innuPREP DNA Micro Kit (845-KS-1010050; Analytik Jena)QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Fa. Qiagen)


NOS-TerminatorSureFood GMO Kit, R-

BiopharmNucleoSpin Food, Fa. Machery & Nagel

Gen-ial FFS-Kit, Promega

Positiv / negativ Target-Sequenz NOS Terminator

2) 35S Sojabohne qualitativ/quantitativ GMO

Detection Kit; Qualität des DNA-Extrakts nicht überprüft

Congen: Sure Food GMO/ Screen 35S/NOS/FMVBiotecon Diagnostics

NOS-Terminator DNA im Cy5-Kanal

SureFood® GMO Screen 4plex 35S/NOS/FMV+IAC

Extraction mittels SureFood® PREP DNA/RNA Virus

Biotecon Biotecon foodproof Sample Prep. Kit III (S 400 06.1)Terminator des Agrobacterium

tumefaciens (nos)Machery&Nagel NucleoSpin Food Kit / 200 mg Einwaage

tNOS-spezifische DNA-Sequenzen



Biotecon Biotecon DNA preapration kitfoodproof GMO Screening 1

LyoKit-5'Nuclease-, R 602 17-1, biotecon


Macherey Nagel - nucleobondmodifiziertes CTAB-Verfahren mit clean-up

Nos-terminatorMicrosynth Pentaplex

AllGVOscBMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;

Proteinase K und RNase A; Clean-up über Silica Röhrchen;

nosCongen 35S / nos / FMV

MonoplexCongen PREP Basic Extraktionskit


5.1.3 GVO-Soja (RR-Round-Up-Ready-Soja)

5.1.4 Lektin-DNA (Soja-spezifisch)



1 L 00.00 105 s.o2

3 §64 LFGB

5

6

11

12 ASU L 00.00-105, Anhang C2

13 P35S/CTP1517

18

19

21 GTS 40-3-2

23

Auswerte-nummer

RR-Soja Target-Sequenz / -DNA Anbieter / ASU-Methode z.B. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / DNA-Qualität

QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Fa. Qiagen)Kombination: CTAB-Lyse mit Macherey Nagel NucleoSpin® Food

KitGen-ial FFS-Kit, Promega

Positiv / negativ Soja RR 40-3-2 Event-spezifische Sequenz

3) 35S Mais qualitativ/quantitativ GMO

Detection Kit Machery&Nagel NucleoSpin Food Kit / 200 mg Einwaage

p35S-CTP1 Konstrukt spezifische DNA-Sequenzen


ASU L 00.00-105 Anh. C.2 CTAB, Proteinase K, RNase A + QIAquickTarget - DNA Biotecon Diagnostics foodproof GMO Sample Preparation Kit

Target-Sequenz EURL-Methode Nucleo-Spin Food Kit (Maccherey & Nagel)

RRs foodproof GMO RR Soya

Quantification Kit-5'Nuclease-, R 302 19, biotecon


Macherey Nagel - nucleobond

Microsynth Pentaplex All SoyMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;

Proteinase K und RNase A; Clean-up über Silica Röhrchen; Sure Food


Lectin

1 L 00.00 105 s.o2

3 §64 LFGB

5

6

11 ASU L 00.00-105

12 ASU L 00.00-105, Anhang C2

13 Lectin-Gen17

18 Lectin

19

21 Lectin

Auswerte-nummer


QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Fa. Qiagen)Kombination: CTAB-Lyse mit Macherey Nagel NucleoSpin® Food

KitGen-ial FFS-Kit, Promega

Positiv / negative Taxon-spezifische Sequenz Soja

(Fragment Lectin-Gen)

4) RR40-3-2 GMO Linie Sojabohne qualitativer

Detection Kit;Lektin-Gen Machery&Nagel NucleoSpin Food Kit / 200 mg Einwaage

Lektin spezifische DNA-Sequenzen


ASU L 00.00-105 Anh. C.2 CTAB, Proteinase K, RNase A + QIAquickTarget-Sequenz EURL-Methode Nucleo-Spin Food Kit (Maccherey & Nagel)

foodproof GMO RR Soya Quantification Kit-5'Nuclease-,

R 302 19, biotecon


Macherey Nagel - nucleobondMicrosynth Pentaplex




5.1.5 GVO-Mais (bt11-Mais)

5.1.6 Mais-DNA (Mais-spezifisch)



bt11 Mais

1 s.o

3 §64 LFGB

5

6

13 ASU L 15.05-11517

18 Bt11

19

21 Bt-11

Auswerte-nummer



Gen-ial FFS-Kit, PromegaPositiv / negativ Mais bt11

Event-spezifische Sequenz 5) bt11 GMO Linie Mais qualitativ Detection Kit

IVS2-2/PAT-B-Primer CTAB, Proteinase K, RNase A + QIAquickTarget - DNA Biotecon Diagnostics foodproof GMO Sample Preparation Kit


SureFood GMO QUANT Bt11 Corn, S2016, r-biopharm


Macherey Nagel - nucleobondJRC protocol event-specific method for the quantification

of maize event Bt11

Macherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen; Proteinase K und RNase A; Clean-up über Silica Röhrchen;


Mais

1 s.o

3 §64 LFGB

5

6

11 ASU L 00.00-105

12

131517

18

19

21

Auswerte-nummer



Gen-ial FFS-Kit, PromegaPositiv / negativ Taxon-

spezifische Sequenz Mais (Fragment Zein-Gen)

Mit Hilfe von Reagentien von Applied Biosystems/ Life

Technologieshmg-Gen Machery&Nagel NucleoSpin Food Kit / 200 mg Einwaage

Invertase spezifische DNA-Sequenzen

Brodmann et al. (2002) J. of AOAC Int. 85(3): 646-653


HMG-Gen ASU L 00.00-105 Anh. D.2 CTAB, Proteinase K, RNase A + QIAquickTarget - DNA Biotecon Diagnostics foodproof GMO Sample Preparation Kit


ZeinSureFood GMO QUANT Bt11

Corn, S2016, r-biopharmDNA Extraktion gemäß foodproof Magnetic Preparation Kit III,

biotecon S 400 13L

Macherey Nagel - nucleobond

mhmgMicrosynth Pentaplex




5.1.7 Weitere Parameter (DNA)


Ergebnisangabe als Test-Kit oder Literatur Hinweise zur Extraktion

1a s.o1b s.o1c s.o1d s.o1e s.o24 Promotor578

11 ASU L 00.00-125

12a ASU G 30.40-1

12b

12c ASU L 00.00-125

12d ASU L 00.00-124, modifiziert

12e ASU L 00.00-141

14 FMV15

20

21a

21b CP2 & CP4 EPSPS

21c Bar-Gen

21d

21e MON89788

24 FMV

Auswerte-nummer


QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Fa. Qiagen)SureFood GMO Kit, R-Biopharm NucleoSpin Food, Fa. Machery & Nagel

Gen-ial FFS-Kit, Promega

Biotecon DiagnosticsÜbergang von CTP2 zu CP4-

EPSPS-GenMachery&Nagel NucleoSpin Food Kit / 200 mg Einwaage

p35S-pat Konstrukt spezifische DNA-Sequenzen


p35S-pat Konstrukt spezifische DNA-Sequenzen

Methodensammlung der Länderarbeitsgemeinschaft

Gentechnik (AM001)


CTP2-CP4-EPSPS Konstrukt spezifische DNA-Sequenzen


bar-spezifische DNA-Sequenzen


pNOS spezifische DNA-Sequenzen



Screening Pflanzen-DNA / Hausverfahren

modifiziertes CTAB-Verfahren mit clean-up

Pat-Gen Microsynth Tetraplex AllGVOscCMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;


Microsynth Tetraplex AllGVOscCMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;


Microsynth Tetraplex AllGVOscCMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;


FMV promoter Microsynth Tetraplex AllGVOscCMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;


Microsynth Pentaplex All SoyMacherey-Nagel Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen;

Proteinase K und RNase A; Clean-up über Silica Röhrchen; Congen 35S / nos / FMV

MonoplexCongen PREP Basic Extraktionskit


5.2 Angaben der Teilnehmer zur PCR-Reaktion

5.2.1 35S-Screening Sequenz


Sonstige Hinweise

1 Real Time PCR

2 Prüfung in Doppelbestimmung

3 Real Time PCR

4

5 Real Time PCR

6

7 Probe 2: 35S im Bereich der NWG

8

9

10

11

12

14

15

16 Real time PCR

18

19 real time PCR

20

21

22

24

Auswerte-nummer

Hinweise zur PCR-Reaktion

z.B. Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen / Amplif ikatlänge / Referenzmaterial

Gelelektrophorese/ 45 Cycles/ 123 bp/ Bt11-Mais, RR-Soja

RT PCR, 45 Cyclen

Real time PCR ( 7300 Real time PCR system). PCR Protokol (Amplifikation) : 1) stage 1 (initial steps: AmpEraseUNG activation) 2 min

50 °C - 1 cycles; 2) stage 2 (initial steps: Ampli Tag DNA polymerase activation) 10 min 95 °C - 1 cycles; 3) stage 3 ( each of 40 cycles)

denaturation 15 sec 95 °C, anneal/extend 1 min 58 °C

Real Time PCR /Multiplex

Real Time PCR, 45 Zyklen, interne Amplifikationskontrolle

real-time PCR (Biotecon foodproof GMO Screening Kit (R 302 17))

Real-time PCR; 45 Zyklen; 82 bp; Referenzmaterial gv-Mais Bt11Probe 3: Spuren kleiner absoluter

Nachweisgrenze (Bewertung negativ)

Real Time PCR, SureFood GVO 4plex, R-Biopharm, nach Anleitung

foodproof GMO Screenig Kit

real time PCR/ 50 cycli

Gelelektrophorese

Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertifiziertes Referenzmaterial: GTS 40-3-2 Soja (IRMM) mit 0.1%, 1% und 10% GVO-Anteil; Zur

Überprüfung auf ev. Inhibitoren wurden die Proben-Eluate auch als 1:5 und 1:25 Verdünnungen angesetzt; Negativkontrolle (Nuclease-free

H2O statt DNA) mitgeführt.

Real Time PCR, 45 Cyclen, Referenzmaterial ERM-BF 410dk * Probe 3: Spuren ct 38,5


5.2.2 NOS-Screening Sequenz


Sonstige Hinweise

1 Real Time PCR


3 Real Time PCR

4

5 Real Time PCR

6

7

8

9

10

11

12

14

15

16 Real time PCR

18

19 real time PCR

20

21

22

24

Auswerte-nummer


z.B. Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen / Amplif ikatlänge / Referenzmaterial

Gelelektrophorese/ 45 Cycles/ 180 bp/ Bt11-Mais, RR-Soja

RT PCR, 45 Cyclen

PCR Kontrollen: 1) PCR Inhibitionskontrolle - Reaktionsmix mit Plasmid DNA ; 2) PCR Reagentienkontrolle (Negativkontrolle) - Reaktionsmix mit

Nucleinsäure-freiem Wasser; 3) PCR positive DNA Target-Kontrolle (Positivkontrolle) - Reaktionsmix mit DNA Extrakt (10% RR 40-3-2 soya; 10

% bt11; 2% MON 810 testkit №3)


Real Time PCR, 45 Zyklen, interne Amplif ikationskontrolle

real-time PCR (Biotecon foodproof GMO Screening Kit (R 302 17))

Real-time PCR; 45 Zyklen; 84 bp; Referenzmaterial gv-Mais Bt11Probe 3: Spuren kleiner absoluter

Nachw eisgrenze (Bew ertung negativ)




Gelelektrophorese

Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertif iziertes Referenzmaterial: GTS 40-3-2 Soja (IRMM) mit 0.1%, 1% und 10% GVO-Anteil; Zur Überprüfung auf ev. Inhibitoren w urden die

Proben-Eluate auch als 1:5 und 1:25 Verdünnungen angesetzt; Negativkontrolle (Nuclease-free H2O statt DNA) mitgeführt.



5.2.3 GVO-Soja (RR-Round-Up-Ready-Soja)


Sonstige Hinweise

1 Real Time PCR


3 Real Time PCR

5 Real Time PCR

6

11

12

1315

17

1819 real time PCR

21

23 real time PCR

Auswerte-nummer


z.B. Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen / Amplif ikatlänge / Refe-renzmaterial

Gelelektrophorese/ 45 Cycles/ 169 bp/ RR-Soja

Zertifiziertes Referenzmaterial: Institute of Reference Materials and Measurements, Geel Belgium

Real-time PCR; 45 Zyklen; 74 bp; Referenzmaterial gv-Soja GTS 40-3-2

Probe 3: Spuren kleiner relativer Nachweisgrenze (Bewertung

negativ)Real-time PCR 74 bp

foodproof GMO Screenig Kit Real Time PCR / 45 Zyklen / Refernzmaterial JRC (Geel Belgien)

/10 bis 100 ng DNA pro well


Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertifiziertes Referenzmaterial: GTS 40-3-2 Soja (IRMM) mit 0.1%, 1% und 10% GVO-Anteil,

sowie 0% GVO-Soja. Für die Identifizierung wurden jeweils 200 ng (40 ng/µl) DNA eingesetzt. Negativkontrolle

(Nuclease-free H2O statt DNA) mitgeführt.

Probe 4: RR-Anteil im Gesamt-Sojaanteil <0,1%; Probe 5: RR-

Anteil 5,2%


5.2.4 Lektin-DNA (Soja-spezifisch)


Sonstige Hinweise

1 Real Time PCR


3 Real Time PCR

5 Real Time PCR

6

11

12

13

17

1819 real time PCR

21

Auswerte-nummer



Gelelektrophorese/ 45 Cycles/ 438 bp/ RR-Soja

Roundup ReadyTM soya beans (ERM-BF410 ak; ERM-BF410 bk; ERM-BF410 dk; ERM-BF410 gk)

Real-time PCR; 45 Zyklen; 74 bp; Referenzmaterial gv-Soja GTS 40-3-2

Real-time PCR, 74 bpBei Proben 1 und 2 späte

Amplifikationskurven, aber nicht eindeutig positiv

Real Time PCR / 45 Zyklen / Refernzmaterial JRC (Geel Belgien) /10 bis 100 ng DNA pro well


Real-Time PCR m. 45 Zyklen; Zur Überprüfung auf ev. Inhibitoren wurden die Proben-Eluate auch als 1:5 und 1:25 Verdünnungen angesetzt; Negativkontrolle (Nuclease-free

H2O statt DNA) mitgeführt.

Probe 1: geringe Sojaspuren


5.2.5 GVO-Mais (bt11-Mais)

5.2.6 Mais-DNA (Mais-spezifisch)


Sonstige Hinweise

1 Real Time PCR

3 Real Time PCR

5 Real Time PCR

6

1315

17

1819 real time PCR

21

Auswerte-nummer



MON 810 maize (ERM-BF413 ak; ERM-BF413 ck; ERM-BF413 ek; ERM-BF413 gk;)

PCR 189 bp + Gelelektrophorese + Restriktion 116+73 bp




Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertifiziertes Referenzmaterial: Bt-11 Mais (IRMM) mit 0.1%, 1% und 5% GVO-Anteil;Für die

Identifizierung wurden jeweils 200 ng (40 ng/µl) DNA eingesetzt. Negativkontrolle (Nuclease-free H2O statt DNA) mitgeführt.

Probe 2: 0,9% Bt-11 im Gesamt-Maisanteil

Sonstige Hinweise

1 Real Time PCR

3 Real Time PCR

5 Real Time PCR

6 Bt-11 Mais (ERM-BF412 f)

11

12

13

15

17

18

19 real time PCR

21

Auswerte-nummer



Probe 3 und 5 nicht zur Analyse auf gvMais geeignet, sie enthalten zu wenig amplifizierbare Mais DNA.

Probe 4 probenspezifische Nachweisgrenze für die Analyse auf

gvMais: 0,7 %.

Real-time PCR; 45 Zyklen; 79 bp; Referenzmaterial gv-Mais Bt11

Probe 3 und 5: Mais in Spuren nachgewiesen (Bewertung negativ);

Probe 4: Mais deutliche Spuren (Verunreinigung?) nachgewiesen

(Bewertung positiv)

Real-time PCR, 79 bp




Real-Time PCR m. 45 Zyklen; Zur Überprüfung auf ev. Inhibitoren wurden die Proben-Eluate auch als 1:5 und 1:25 Verdünnungen

angesetzt;Proben 3+4: geringe Maisspuren


5.2.7 Weitere Parameter (DNA)


Sonstige Hinweise

1a Real Time PCR

1b Real Time PCR

1c Real Time PCR

1d Real Time PCR

1e Real Time PCR


45 Real Time PCR

78 bar-gen,/FMV

11

12a

12b

12c

12d12e141520

21a

21b

21c

21d

21e

24

Auswerte-nummer



mehrfache Extraktion unterschiedliche Ergebnisse, an Nachw eisgrenze?

Gelelektrophorese/ 45 Cycles/ 200-600 bp/ Bt11-Mais, Bt176, RR-Soja

RT PCR, 45 Cyclen


Real-time PCR; 45 Zyklen; 102/111 bzw . 402 bp (Bt11); Referenzmaterial gv-Mais Bt11

konventionelle PCR-RFLP; 45 Zyklen; 370 bzw . 550 bp (Bt11); Referenzmaterial gv-Mais Bt11 und T25

Probe 2: Größe des erhaltenen PCR-Amplif ikates und der

Restriktionsfragmente bei positiver Probe 2 nicht mit gv-Mais Bt11 übereinstimmend

Real-time PCR; 45 Zyklen; 88 bp; Referenzmaterial gv-Raps Gt73Proben 4 und 5: deutliche Spuren (Verunreinigung?) nachgew iesen

(Bew ertung positiv)

Real-time PCR; 45 Zyklen; 110 bp; Referenzmaterial gv-Raps Ms1xRf1

Real-time PCR; 45 Zyklen; 94 bp; Referenzmaterial gv-Raps Ms1xRf1



Gelelektrophorese

Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertif iziertes Referenzmaterial: MON89788 Soja (IRMM) mit 0.1%, 1% und 10% GVO-Anteil. Negativkontrolle


Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertif iziertes Referenzmaterial: MON89788 Soja (IRMM) mit 0.1%, 1% und 10% GVO-Anteil. Negativkontrolle


Real-Time PCR m. 45 Zyklen; Negativkontrolle (Nuclease-f ree H2O statt DNA) mitgeführt.

Real-Time PCR m. 45 Zyklen; Negativkontrolle (Nuclease-f ree H2O statt DNA) mitgeführt.

Real-Time PCR m. 45 Zyklen; zertif iziertes Referenzmaterial: MON89788 Soja (IRMM) mit 0.1%, 1% und 10% GVO-Anteil, sow ie 0% GVO-Soja. Für

die Identif izierung w urden jew eils 200 ng (40 ng/µl) DNA eingesetzt. Negativkontrolle (Nuclease-free H2O statt DNA) mitgeführt.

Probe 5: MON89788-Anteil im Gesamt-Sojaanteil <0,1%



6. Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge

[Die Adressdaten der Teilnehmer wurden für die allgemeine Veröffentli-chung des Auswerte-Berichts nicht angegeben.]

[The address data of the participants were deleted for publication of the evaluation report.]


DeutschlandDeutschlandDeutschlandFrankreichDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandDeutschlandÖsterreichWeißrusslandNiederlandeDeutschlandDeutschlandNiederlande

Teilnehmer / Participants Ort / Town


7. Verzeichnis relevanter Literatur

1. DIN EN ISO/IEC 17043:2010; Konformitätsbewertung – Allgemeine Anforderungen an Eignungsprüfungen / Conformity assessment – General requirements for proficiency testing

2. Verordnung / Regulation 882/2004/EU; Verordnung über amtliche Kontrollen / Regulation on official controls

3. DIN EN ISO/IEC 17025:2005; Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien / General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

4. Richtlinie / Directive 1993/99/EU; über zusätzliche Maßnahmen im Bereich der amtlichen Lebensmittelüberwachung / on additional measuresconcerning the official control of foodstuffs

5. ASU §64 LFGB : Planung und statistische Auswertung von Ringversuchen zur Methodenvalidierung

6. DIN ISO 13528:2009; Statistische Verfahren für Eignungsprüfungen durchRingversuche / Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons

7. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Laboratories ; J.AOAC Int., 76(4), 926 – 940 (1993)

8. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Chemistry Laboratories ; Pure Appl Chem, 78, 145 – 196 (2006)

9. Evaluation of analytical methods used for regulation of food and drugs;W. Horwitz; Analytical Chemistry, 54, 67-76 (1982)

10.A Horwitz-like funktion describes precision in proficiency test; M. Thompson, P.J. Lowthian; Analyst, 120, 271-272 (1995)

11.Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies; W. Horwitz; Pure & Applied Chemistry, 67, 331-343(1995)

12.Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing; M. Thompson; Analyst, 125, 385-386 (2000)

13.European Network of GMO Laboratories, Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing, Version 25-01-2005

14.Powell J, Owen L, Reliability of food measurements: the application of proficiency testing to GMO analysis, Accred Qual. Assur. 7, 392-402(2002)

15.Thompson M, GMO Proficiency testing: Interpreting z-scores derived from log-transformed data, amc technical brief, No. 18 Dec 2004

16.Thompson M et al., Scoring in Genetically Modified Organism Proficiency Tests Based on Log-Transformed Results, J. AOAC Int., 89(1), 232-239 (2006)

17.Žel J et al., Calculation of Measurement Uncertainty in Quantitative Analysis of Genetically Modified Organisms Using Intermediate Precision - A Practical Approach, J. AOAC Int., 90(2), 582-586 (2007)



DLA-24/2015 - GVO-Screening qualitativ

Alle 24 Teilnehmer haben mindestens ein Ergebnis eingereicht. Eswurden 5 Proben mit möglichen Gehalten an GVO-Soja und/oder GVO-Mais untersucht. Die Auswertung erfolgte qualitativ hinsichtlichder Screening-Sequenzen 35S und NOS, Round-Up Ready® Soja, Lektin-DNA, bt11-Mais und Mais-spezifischer DNA.Einzelheiten sind dem Auswertebericht zu entnehmen.4 Teilnehmer hatten ihren Sitz im Europäischen Ausland (Frank-reich, Niederlande, Österreich) und ein Teilnehmer im Außereuro-päischen Ausland (Weißrussland).


Documents

GVO - Screening qualitativ 2015/Auswertung DLA 24-2015 GMO-Screening.pdf · August 2015 DLA – 24/2015 – GVO-Screening qualitativ DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht