HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3

Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)

[…]

http://www.pdb.org

PDB: banca dati di strutture (Protein Data Bank) – ridondante – strutture ottenute sperimentalmente via X-ray o NMR

ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N

ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C

ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C

ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O

ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C

ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C

ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C

ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N

ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C

ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C

ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O

ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C

ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C

ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C

ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C

ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N

ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C

ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C

ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O

ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C

ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O

…

X Y Z

coordinatetipo diatomo

tipo diamminoacido

Classificazioni gerarchiche

SCOP (Structural Classification of Proteins)

• Class – , , /, +, ...

• Fold– Similarità strutturale

• Superfamily– Omologia

• Family– Omologia e funzione

• Principalmente annotata a mano

CATH

• Class (, , /, +, ...)• Architecture • Topology (including connections between sec. str. elements)• Homologous superfamily

• Semiautomatica– Solo Architecture viene assegnata manualmente

Esempi di categorie di fold (CATH architectures)

Come nel confronto di sequenze e’ necessario allinearle, nel confronto di strutture 3D e’ necessario sovrapporle come corpi rigidi scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui nelle due strutture. La prima difficoltà consiste nel fatto che le due proteine molto spesso non hanno lo stesso numero di residui. Per la sovrapposizione si possono utilizzare le catene dei carboni alfa appartenenti agli elementi di struttura secondaria perche’ in genere le inserzioni e delezioni si accumulano nei loop che possono semplicemente venire esclusi dalla sovrapposizione. I metodi di confronto 3D utilizzano l’ allineamento delle sequenze per decidere la regola di corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale

CONFRONTO STRUTTURE 3D DI PROTEINE – ALLINEAMENTO STRUTTURALE

Un allineamento strutturale può essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation o r.m.s.d.), al numero di atomi che sono stati accoppiati nella sovrapposizione e alla valutazione della similarità dei residui sovrapposti.

L’r.m.s.d. o r.m.s. di una sovrapposizione tridimensionale è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato

r.m.s.d Di2 N

i1

N

D = distanza tra coppie di atomi appaiatiN = numero di coppie considerate

RMSD

• Root-mean-square deviation – Deviazione quadratica media– Serve per paragonare strutture identiche, eccetto rotazioni e

traslazioni

rai e rbi sono le posizioni dell´ atomo i nelle strutture a e b,

n è il numero di atomi nelle strutture.

r.m.s.d. di una sovrapposizione 3D è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato

EVOLUZIONE DELLE PROTEINE

RELAZIONE ESISTENTE TRA SIMILARITA’ di sequenza e struttura in omologhi

Studio di un campione di strutture note di proteine omologhe (Chothia, Lesk, 1982)

Similarità strutturale misurata in termini di RMSD

CALCOLO RMS- Confronto di due strutture mediante SOVRAPPOSIZIONE- Determinazione di aa che si corrispondono nelle due strutture- Identificazione degli atomi che si vogliono confrontare (Cα o backbone) RMSD=

n

d 2n = numero residui

d = distanza tra atomi corrispondenti

un altro criterio di valutazione di un allineamento strutturale è rappresentato dal numero di atomi o di residui che sono stati accoppiati

si cerca di massimizzare il numero di atomi accoppiati e di minimizzare la corrispondente r.m.s.

a parità di numero di residui accoppiati, il migliore allineamento strutturale sarà quello con minore r.m.s.

a parità di r.m.s. verrà considerato migliore l’allineamento strutturale operato con un maggior numero di atomi accoppiati

valutazione dell’allineamento strutturale

oltre a questi due valori tipici delle sovrapposizioni tridimensionali, si può anche considerare il punteggio di similarità dei residui accoppiati

DIVERGENZA DI SEQUENZA E STRUTTURA

Se si valuta la relazione esistente tra divergenza strutturale (misurata in termini di RMSD) e

divergenza di sequenza si osserva che esse si corrispondono in MODO ESPONENZIALE (valutato

dal confronto di strutture note)

- (RMSD< 2 Å) possono avere seq molto differenti (degenerazione del codice strutturale-struttura più conservata della seq)

RMSD (A)

%identity

30% id.seq

SOGLIA di significatività per la SIMILARITA’ STRUTTURALE

.confronto a coppie di struttura e seq di proteine 3D note, quantificato usando come parametri: lunghezza allineamento, % id seq, sim.struttura a confronto in un grafico: lunghezza allin vs id seq (e in terza dimensione sim.strutturale)

Sim. Strut.parametrizzata come uguale/diverso (pallino/quadrato): 2 str. Uguali se > 70% della struttura sec è in comune (rmsd bassa).

al di sotto della soglia rumore di fondo elevato 25% (x allin 80 aa) al di sopra del quale chiara similarità strutturale – soglia lunghezza dipendente possibile che proteine con identità < 25% abbiano strutture simili ma anche che non siano correlate strutturalmente (twilight zone)

%id seq

Length alignment

30

0

100

0 150

Sec str identity < 70%

Sec str identity > 70%

Protein ubiquitinationProtein ubiquitination

Passmore, and Bardford, Biochem J, 2004

Pickart, Cell, 2004

Brzovic and Klevit, Cell Cycle, 2006

Hochstrasser, Cell, 2006

Protein ubiquitination: regulatory process influencing several aspect of eukaryoyic cell biology

Polyubiquitin (polyUb) chain: link ε-amino group of a Lys of one Ub to the C-terminal carboxyl group of the next Ub in the chain

E1-E2-E3 responsible for activating and transferring Ub to proteins

Fundamental mechanisms of Ub-chain assembly and of E1-E2-E3 regulation still not clearly understood

Ubiquitin like proteins (Ubls) 8-20 kDa

Ub 76 aa

Globular domain (4βstrands in a antiparallel βsheet +αhelix) + flexible C-terminal terminating with a gly

7 Conserved lysine residues in Ub

N.B. ISG15: ha due domini Ubl

Di-Ubiquitina

Ogni Ubl ha il suo set di E1-E2-E3

E2: Ub-conjugating enzymesE2: Ub-conjugating enzymes

Michelle et al., J Mol Evol, (2009)

Ye and Rape, Nat Rev Mol Cel Biol (2009)

Identification of phosphorylations by Cdks and CK2 kinases affecting E2 activity

Cys forms a thiolester bond to C-terminal Gly of Ub

Asn stabilizes oxyanion transition state

E1E1

E3/E3/E3E3

Multi-domain E2 classification in 17 familes reflecting structural organization of cat. dom.

G76K63

K48

Hydrophobic patch

Monomeric Ub

B_LEU8A_ILE44

B_ILE44

B_VAL70

A_VAL70

A_LEU8

B_Cterm

Legame isopeptidico

polyUb crossilinkata by K48 sono segnale universale per la degradazione da proteasomaAdottano una CONFORMAZIONE CHIUSA in cui L8, I44 and V70 (patch idrofobico sulla superficie di una singola molecola di Ub) sono sequestrati all’interfaccia tra due molecole di Ub adiacenti

K48-linked polyUb

Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K48 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUb crosslinkata via K48

Tetra-Ubiquitina crosslinkata K48

K63-linked polyUb polyUb crosslinkata via K63 agisce come segnale regolatorio piuttosto che degradativo in molti pathway,

Adotta conformazione estesa in soluzione senza contatti diretti tra patch idrofobici

Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K63 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUb crosslinkata via K63