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Hemoglobinúria Paroxística NoturnaDi ó ti T t tDiagnóstico e Tratamento
» Dra. Nydia Strachman Bacal» Hematologista e Patologista Clínica» MBA em Economia e Gestão na Saúde
Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista ClínicaHematologista e Patologista Clínica
Hemoglobinúria Paroxística NoturnagDiagnóstico por Citometria de Fluxo
• Doença HPN• HAM x Citometria de Fluxo• Antígenos envolvidos• Tamanhos de clones HPN na HPN• Clones HPN em falência medular (Anemia Aplástica)
Clones HPN em Desordens medulares: MDS(Anemia Refratária), Mielopatias (Mielofibrose/ LMC)
• Experiência do HIAE e Conclusão
A Doença: Hemoglobinúria P í i NParoxística Noturna
• Expansão clonal adquirida não maligna de• Expansão clonal adquirida, não maligna de células-tronco hematopoéticas
• Hemoglobinúria noturna icterícia hemosiderinúria• Hemoglobinúria noturna, icterícia, hemosiderinúria• Mutação somática adquirida do gene PIG-A• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de
proteínas de superfície• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:
CD55 e CD59 , ambas proteínas inibidoras do complemento e, associadas à patogênese da p , p gdoença clínica.
A Doença: Hemoglobinúria Paroxística NoturnaParoxística Noturna
• Anemia Hemolítica / Trombose e Pancitopenia p• Prevalência: < 1/100.000 (rara)• Sobrevida: 10 a 15 anos • Morte: trombose ou citopenias progressivas• Morte: trombose ou citopenias progressivas
raramente transformação leucêmica (<5%)• Muitos pacientes apresentam hemólise intermitente e
alguns evoluem para remissão espontâneaalguns evoluem para remissão espontânea. • Hemólise intravascular crônica com exacerbações. • Necessidade transfusional e muitas vezes, deficiência de
fferro.• A trombose apresenta predileção pelas veias hepáticas
(S.Budd Chiari). • Pacientes com AA e evidencias laboratoriais de HPN tem
menor probabilidade de trombose.
Quadro laboratorial• Sangue Periférico
– Anemia, Reticulocitosee a, e cu oc ose– Leucopenia e granulocitopenia– Deficiência de ferroDeficiência de ferro
• Medula ósseahiperplasia eritróide– hiperplasia eritróide
– aplasiaU i• Urina – Hemoglobinúria– Hemossiderinúria
Teste de HAMGV com HPN são susceptíveis à lise com complemento
37°C / HCL / pH pMedida colorimétrica da Hb livreHPN: lise de 5% a 80% dos G.V.
Scottish Charles - 1794 (cirurgião)Strübing Paul - 1882 (urina escura matutina, hemólise intravascular, trombose. Defeito no G.V.)Defeito no G.V.)Marchiafava, 1911 / Michelli, 1931 (anemia hemolítica com esplenomegalia e hemoglobinúria e hemosiderinúria)
Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction of red blood cells II. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Certain immunological aspects
f fof the haemolytic mechanism with special reference to serum complement.
J Clin Invest 1939;18:657–72.
Teste de HAM• Não existe Falso (-)
Teste de HAMNão existe Falso ( )
• Existe Falso (+)Diseritropoese congênita tipo II mas não seDiseritropoese congênita tipo II , mas não se
o soro do paciente for utilizado ou se os globulos vermelhos do paciente já foramglobulos vermelhos do paciente já foram lisados com anticorpo à frio. Portanto o Teste de Coombs deve ser realizado em paralelo e se (+) invalida o teste de Ham.
AHAI > HPN
Âncora Glicosil Fosfatidil InositolGPIGPI
proteína ancoradaC-terminal
NH2
âncora ancorada
etanolamina
C terminalatravés da
qual um peptídeo se fixa àse fixa à
superfície das células
âncoraGPI
glican
inositolfosfato
glucosamina
inositolfosfato
membrana celular1,2 diacilglicerol
1980. Low et cols.
Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol
Normal HPNcamada bilipídica
Mutação de
A deficiência da âncora GPI resulta na perda de várias proteínas da superfície da célula.
Mutação de gene PIG-A defeito na
acetilglucosaminil
transferase
Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPIcelular através da âncora GPI
EnzimasAcetilcolinesteraseAcetilcolinesterase Fosfatase Alcalina LeucocitáriaADP-ribosil transferase
Moléculas de adesãoAntígeno associado a função linfocitária - LFA-3 ou CD58CD66bCD66b
Proteínas de superfície reguladoras de complemento D l ti f t DAF CD55Decay accelerating factor - DAF - ou CD55Homologous Restriction Factor HRFMembrance inhibitor of reactive lysis MIRL ou CD59
Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPIcelular através da âncora GPI
ReceptoresFc γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16)Fc-γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16) Antígeno de diferenciação monocitária (CD14)
Antígenos eritrocitáriosAntígenos eritrocitários Yt antigens (AchE) Holley Gregory antigen
Antígenos neutrofílicos NB1/NB2
Outras proteínas de superfície de função desconhecidaCAMPATH-1 antigen (CDw52) CD24 GP500
CD55 - DAFDecay Accelerating FactorDecay Accelerating Factor
P ti i d t l d ti ã dParticipa do controle da ativação do Complemento na superfície da célula
Reduz a ação do complexo C4bC2a impedindo ç p pa ativação de C3
Sua deficiência isoladamente não justifica o quadro clínicoquadro clínico
CD59- MIRL MembraneInhibitor of Reactive LysisInhibitor of Reactive Lysis
I ib f ã d C9 j l ltInibe a formação de C9 cujo complexo resulta na lise da célula
Inibe a interação com C8 e C9
Sua inibição resulta em hemólise
Sua reintrodução restaura a resistência aoSua reintrodução restaura a resistência ao Complemento
CD14 - Receptor da proteina que li à d ise liga à endotoxina
O LPS (lipopolissacaride da parede bacteriana) ligada à uma proteina sérica específica se liga à superfície de monócitos e macrófagos através deste receptor.
Este complexo resulta na liberação de citoquinas TNF-α IL-4 e IL-6citoquinas TNF α, IL 4 e IL 6.
MOLÉCULAS LIGADAS AO GPI NA CÉLULA HEMATOPOÉTICA HUMANA
G.V. PMN Monocitos Plts Linfocitos HSC
Reguladoras Complemento
CD 55 (DAF) (+) (+) (+) (+) (+)
CD 59 (MIRL) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
Moléculas de Adesão
CD 48 (+) (+) (+)
CD 58 (LFA-3) (+)
CD66b e CD66c (+)
Enzimas
Acetilcolinesterase (+)
Fosfatase Alc.Leucocitária (+)
CD 157 (+) (+)
Receptores
CD 14 (+)CD 16 (FcγRIII) (+) (+) - linf B( γ ) ( ) ( )
CD 87 (u-PAR) (+) (+) (+) - linf T
Outros
CD 52 (+) (+)( ) ( )
CD 90 (+) - linf T (+)
Proteina Prion (+) (+) (+) (+) (+)
Hoffbrand A. V.;Catovsky D.; Tuddenham E.G.D. Postgraduate Haematology –2005 5a Ed. Blackwell Publishing
Citometria de Fluxo
E it ó itEritrócitosGranulócitosMonócitosLinfócitosLinfócitosPlaquetas
CD55 DAF
CD59 MIRL
Van der Schoot, 1990
Modos de Apresentação
Citometria de Fluxo
Detectores
FotomultiplicadoresFL2
Detectores
FL1
LASER FSC
SSCFL3
Impulsos Elétricos
Di it li ã
Sistema Hidrodinâmico
Injeção daamostra
FL3
Digitalizaçãoamostra
Citometria de Fluxo de células HPN com anti CD59 em eritrócitoscom anti CD59 em eritrócitos
Nú dNúmero deEventos
Tipo I : NormalCélulas HPN Tipo II
Células HPN Tipo III
Intensidade de fluorescência
anti-CD59 Eritrócitos(b) Células de HPN l e HPN III (c) Discreta população de Células HPN I, HPN II e HPN III (d) Discreta população de Células(d) Discreta população de Células HPN I e HPN II (transição indistinta)(e) Células HPN III
Controle isotipo( )(f) Células HPN II indistintas das
Células HPN I e HPN III
Hall e Rosse, 1996
CD55 e CD59 em Granulócitos
Amostra Controle
Paciente Controle isotipo CD 59 CD 55
CD55 e CD59 em EritrócitosAmostra Controle
Paciente Controle isotipo
CD 59 CD 55
CD14 em MonócitosAmostra Controle Atenção !
C t lPaciente
Controle isotipo
InteressanteInteressante
• Pode ocorrer diminuição do percentual de eritrócitos CD55/CD59 negativos devido à hemólise.
• Eritrócitos com CD59 positivos apresentam vida média maior do que os eritrócitos com CD 59 negativos.
A id d d i h óli hi l i ã• A severidade da anemia por hemólise e hipoplasia não está correlacionada com o percentual de CD59 positivos
Fujioka 1994
Diagnóstico por Citometria de g pFluxo
G ld S dGold Standart
PraticidadePraticidade
Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)
Eritrócitos: interferentes na avaliação do clonemeia-vida diminuídatransfusões
Detecção de pequenos clones
Células HPN na HPNExpressão variável de antígenos ligados através do GPI em 3 linhagens celulares
CD59eritrócitos
CD59granulócitos
CD14monócitos
p g g g
Controle normal
Paciente 1
Paciente 2
Paciente 3Sharon 1996
Interessante
Pacientes com menos de 20% de células anormaisPacientes com menos de 20% de células anormais raramente apresentam hemoglobinúria mas podem ter hemólise e hemossiderinúria.
Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas <5% deQualquer ponto de corte é arbitrário, mas 5% de glóbulos vermelhos tipo HPN não se observa anemia hemolítica.
Clone de células HPN III maior que 60%, apresentam hemoglobinúria, mas às vezes, isto não ocorre por razões desconhecidas
Indicação de Pesquisa de células HPN
Pancitopenias sem causa definida,principalmentese apresentar reticulocitosese apresentar reticulocitose
T b d ti ã d fi idTromboses de repetição sem causa definida
Hemólise intravascular sem causa definida
Clone de células HPN em síndromes defalência medular
Anemia AplasticaHPN Mielodisplasia
11/29 pacientes com Anemia Aplástica (38%) com presença de células HPN.p p ( ) p çSchubert J, 1994
Aumento de células HPN em 21 dos 119 pacientes com Anemia Refratária (17,6%)
AR HPN (+)
ARHPN (-) P
Anormalidades cariotípicas (%) 1 / 21 (4.8) 21 / 64 (32.8) .01p ( ) ( ) ( )
Contagem de plaquetas (x 103/μL) 31 (4-121) 91 (9-126) .01
Resposta terapêutica a ciclosporina (%) 7 / 9 (77.8) 0 / 8 (0) .002Progressão para SMD avançada ou LMA (%) 0 / 21 (0) 4 / 65 (6.2) .57
P i él l HPN t d i t f lê i d d l ó
Wang H, 2002 Blood
Pesquisar células HPN em todos os pacientes com falência de medula óssea antes do tratamento, para auxílio na escolha terapêutica.
Clone de células HPN em
Relação entre HPN e AAA
sindromes de falência medular• Relação entre HPN e AAA• Paciente menos hemolítico e mais pancitopenico pode
evoluir para AA• AAA-Doença auto imune orgão específica mediada por
linfócitos T citotóxico ativado (CD8) que inibe HSC• HPN-Expansão de clone de célula T anormalHPN Expansão de clone de célula T anormal• Tratamento de imunosupressão melhora AAA e HPN• HPN é uma forma de AAA, HPN dano auto imune ao
t ll t ã áti d PIG Astem cell e mutação somática do gene PIG-A• Mutação do PIG-A pode ser demonstrada em população
normal em 10/1.000.000
Pesquisa de HPN• Exames realizados desde 19/01/2004;
• Até 29/03/2007: 107 solicitações;• 5 casos positivos (4,7%).
• Técnica• CD 55 – PE / CD59 – FITC (Immunotech)• CD 14 (clone My4) – PE (Coulter)• CD 64 – FITC (Immunotech)• CD13 PE (B D )• CD13 – PE (B.D.)• Glicoforina A (CD235) – PE (Dako)
Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223 233Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223-23342: 234-238 – Aug 15, 2000
Pratical Haematology – Dacie JV., Lewis SM
Controle de QualidadeControle de Qualidade• Proficiência através dos interlaboratoriais
• CAP - desde Abril/2006; -média de 51 laboratórios participantes.CD55/CD59
• UKNEQAS - desde Novembro/2004;UKNEQAS desde Novembro/2004;média de 65 laboratórios participantesCD55/CD59/CD14CD55/CD59/CD14CD16 / CD24 / CD66b
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - HemáciasLEFS, 56 anos 08/03/2006 Hemácias
Ausência de expressão antigênica d CD55 46 5%
Ausência de expressão antigênica d CD59 34 9% d él ldo CD55 em 46,5% do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - NeutrófilosLEFS, 56 anos 08/03/2006 Neutrófilos
Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - NeutrófilosLEFS, 56 anos 08/03/2006 Neutrófilos
Controle normal: CD59 (+) = 100 0%
Ausência de expressão antigênica de 100,0%
gCD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.
LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - MonócitosLEFS, 56 anos 08/03/2006 Monócitos
Controle normal: CD14(+) = 99 8% Ausência de expressão do CD14 em Controle normal: CD14(+) = 99,8% p98,3% das células CD 64 (+)
RTS, 16 anos – 16/05/2006 Hemácias não realizado pois recebeuHemácias -não realizado, pois recebeu
transfusão. Neutrófilos:
Controle normal: CD55(+) = Ausência de expressão de CD55Controle normal: CD55(+) = 99,0%
Ausência de expressão de CD55 em 5,7% dos neutrófilos
RTS, 16 anos – 16/05/2006 - NeutrófilosRTS, 16 anos 16/05/2006 Neutrófilos
Controle normal: CD59(+) = 99,3% Ausência de expressão do CD59 em 6 1% das células CD13 (+)6,1% das células CD13 (+).
RTS, 16 anos – 16/05/2006 – MonócitosRTS, 16 anos 16/05/2006 Monócitos
Controle normal: CD14(+) = 99 0% Ausência de expressão do CD14 emControle normal: CD14(+) = 99,0% Ausência de expressão do CD14 em 14,3% das células CD64+.
HPN – Acompanhamento e T ê iTerapêutica
• Tratamento de suporte: pÁcido fólico, ferro suplementar se necessárioTransfusãoC ti óid tCorticóide – controversoprofilaxia com anticoagulante em caso de trombosetromboseterapia trombolítica (tPA)
• Transplante e terapia imunosupressora - ATG e ciclosporina• Eculizumab – inibe a ativação do complemento (C5)
reduz hemólise intravascular, diminui hemoglobinuria e diminui a necessidade de transfusão
Raiola AM, Van Lint MT, Lamparelli T. Haematologica 85 (1): 59-62 -2000.Hillmen P., Hall C., Marsh JC. New England Journal of Medicine 350: 552-9 2004
ConclusõesConclusõesO estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica deO estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de citometria de fluxo é o método de escolha para o diagnóstico de HPN devido à maior sensibilidade.
As proteínas mais estudadas são o CD55 e CD59 em granulócitos e eritrócitos e CD14 em monócitos.
A CMF permite a detecção de quantidades pequenas de células com deficiência parcial ou total das proteínascélulas com deficiência parcial ou total das proteínas dependentes de GPI,
M ó i h líti d liMesmo após crises hemolíticas severas, pode-se analisar a ausência de expressão na população de leucócitos.
• EQUIPE •
Ana Claudia M Brito• Ana Claudia M. Brito João Carlos C Guerra
• Nydia Strachman Bacaly• Alexandra M.Cavalcante• Ruth Hissae Kanayama• Sonia Tsukasa Nozawa
• Obrigada !
Gene PIG-A Localizado noLocalizado no braço curto do cromossomo X
Xp22
Miyata, 1993 Science