Herpes Simplex Virus Type 1 Entry into Host Cells:

Reconstitution of Capsid Binding and Uncoating

at the Nuclear Pore Complex In Vitro

PAIVI M. OJALA, BEATE SODEIK, MELANIE W. EBERSOLD, ULRIKE KUTAY, and ARI HELENIUS

Department of Cell Biology, Yale University, New Haven, Connecticut, andInstitute of Biochemistry, ETH-Zürich, Zürich, Switzerland

MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, July 2000

HSV-1

Herpesviridae Virus enveloppé Capside icosaédrique :

6 protéines VP5 Tégument

Protéine majeur VP1-3 (VP1/2)

VP11/12, VP13/14, VP 16, VP18.8 & VP22

ADN db linéaire

Pénétration dans la cellule hôte

Interaction avec la membrane cellulaire Glycoprotéines gB, gC Heparan sulfate chain

Fusion enveloppe/membrane gD corécepteurs HVEM (HveA ou TNFRSF14) &

Ig Transport au travers du cytosol

vers le noyau Micotubules Dyneim

Liaison de la capside au NPC Décapsidation de l’ADN dans

le noyau

Complexe du pore nucléaire

Grand complexe protéique 125 000 kDa

Permettent les échanges entre noyau et cytoplasme Transport actif/passif Import/export

3000 à 5000 pores par noyau

Structure : Composé de nucléoporines Diamètre intérieur 45 nm 2 anneaux 8 fibrilles sur la face

cytoplasmique Structure en panier sur la

face nucléaire

But de l’article

Analyse de l’interaction de la capside de HSV-1 avec le NPC

Caractérisation biochimique de la libération de l’ADN

Reconstitution in vitro de la liaison et de la décapsidation

Déterminer les paramètres de liaison et d’expulsion de l’ADN de HSV-1 au niveau du noyau

In vivo : Décapsidation de HSV-1 dans les cellules Vero

ME :Infection de cellules Vero avec HSV-1 en présence de cyclohéximide

Résultats : Liaison de la capside à

la membrane nucléaire à H1 après pénétration

Localisation à 50 nm d’un NPC

Attachement aux filaments issus du pore

Perte rapide de l’ADN : 2 à 4h après infection

In vivo : Décapsidation de HSV-1 dans les cellules Vero

Caractérisation biochimique : Libération de l’ADN Apparition de capsides vides

Méthode : Culture de cellules Vero

inoculation virus [3H]thymidine ou [35S]cystéine-méthionne

Traitement au Cytochalasine D Protéinase K 1h Lyse : Triton X-100

30 min 4 h

Centrifugation : culot gradient de saccharose compteur à scintillation

Liaison des capsides au noyau in vitro

Capsides isolées Incubation avec des noyaux d’hépatocytes de rat Présence ou absence de cytosol Évaluation liaison : Microscopie après IFI

Ac anti capside : anti-ROM VAc anti NPC : Mab414, Anti-RL1, Anti-RL2 & anti-WGA

Caractérisation des capsides purifiées

Capsides isolées de virus matures

Élimination de enveloppe : Triton X100Tampon hypersalé

SDS-page ou immunoblot avec ou sans trypsine

Présence des composants du tégument liés à capside

Ceux-ci sont éliminés par la trypsine

Structure de la capside intacte

Liaison nucléaire

Les capsides sont localisées

exclusivement au niveau de l’enveloppe

nucléaire

Liaison au noyau est indépendant :

• De la température

• De l’ATP

Analyse in vitro : Liaison des capsides de HSV-1 en présence de cytosol

• Microscopie confocale/immunofluorescence

• Anti-Rom V VP-5 & Mab414 nucléoporines

Liaison nucléaire

In vitro : Liaison des capsides de HSV-1 en absence de cytosol

Faibles liaisons en absence de

cytosol

Blocage de l’import

nucléaire par RanQ69L

Importine β est impliquée dans la liaison de la capside

Remarques :

Pas de rôle de l’importine α

Pas de rôle de la transportine, facteur importine β-like

Liaison nucléaire

In vitro : Rôles de l’Importine β et de RanQ69L

L’amarrage de la capside de HSV-1 au noyau médié par l’importine β est sous la dépendance du cycle de Ran GTPase.

Liaison nucléaire

In vitro : Liaison préférentielle aux NPC :

Anticorps dirigés contre les protéines du NPC : blocage de la liaison des protéines karyophiliques

• Mab414 GFXFG des nucléoporines

• Anti-RL1 & RL2 O-linked N-acétylglucosamine

• Anti-WGA lectine s’associant au NPC

• Anticalnexine

Nombreux facteurs intervenant dans la liaison

Liaison in vitro au NPC similaire à celle observée dans les cellules infectées in vivo

Liaison nucléaire

In vitro : réduction de liaison de la capside par un traitement à la trypsine

Evaluation de du rôle des protéines de la capside dans sa liaison au NPC :

Traitement à la trypsine action sélective sur les protéines du tégument VP1-3, VP13/14, VP16 & VP22

Baisse de la liaison de 85 % / capsides non traitées

Les protéines du tégument sont nécessaires à la liaison de la capside au NPC

Décapsidation in vitro Incubation de capsides marquées au [3H]thymidine avec des noyaux Analyse de l’accessibilité de l’ADN viral aux DNAses : TCA précipitation

Décapsidation de HSV-1

1. BSA : capsides non traitées

2. BSA et noyaux de foie de rat

3. BSA et lysat de réticulocytes de lapin

4. BSA, lysat de réticulocytes de lapin et noyaux de foie de rat en présente d’ATP-regenerating system

5. SDS : digestion complète

Inhibition de la décapsidation :

1. BSA, lysat de R, nx d’hépatocytes & ATP-RS :

2. Mab414

3. Anti-importine β

4. Anti-WGA

5. Déplétion en ATP

6. GTPγS

L’interaction spécifique des capsides avec les NPC in vitro induit la libération de l’ADN viral

L’efficacité de la libération est augmentée par des facteurs notamment métaboliques présents dans le cytosol

Conclusion et discussion

Meilleure compréhension de l’évolution de HSV-1 dans la cellule

Désassemblage commence à la membranePerte d’une partie des protéines du tégumentLiaison aux dyneim

Liaison spécifique de la capside au NPC Import médié par importine β

○ Plutôt que importine α○ HIV : cycline B1 et protéines Tat & Rev

Ran GTP dépendant

Conclusion et discussion

Libération de l’ADN identique dans la cellule et in vitro Liaison aux protéines du NPC induit la libérationVP1-3

○ Contient NLS○ Similarité avec le HIV

Capsides nouvellement forméesPas d’affinité pour les NPCAcquisition de l’adressage nucléaire durant

l’assemblage ou hors de la cellule

Merci de votre attention !