Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen ... · Das Prion-Konzept besagt, dass der infektiöse Erreger aus einem körpereigenen Protein mit veränderter Gestalt besteht

Herstellung und Charakterisierung von

Antikörpern gegen das Prion-Protein mit

inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation

in Zellkultur

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Tanja Hoffmann

aus Datteln

Würzburg, Juli 2008

Eingereicht am: …………………………………………..…………..

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender: ………………………………………………………….

Gutachter: Prof. Dr. M. A. Klein

Gutachter: Prof. Dr. J. Hacker

Tag des Promotionskolloquiums: ……………………………..……

Doktorurkunde ausgehändigt am: ………………………………….

„Magna pars est profectus velle proficere.“

„Ein großer Teil des Fortschreitens besteht darin, dass wir fortschreiten wollen.“

(Lucius Annaeus Seneca, 4 v. Chr./65 n. Chr.)

INHALTSVERZEICHNIS

i

1 Einführung und Problemstellung 5

1.1 Prionen und Prionenerkrankungen 5

1.1.1 Übertragbare spongiforme Enzephalopathien 5

1.1.2 Prionenerkrankungen bei Tieren 6

1.1.3 Prionenerkrankungen beim Menschen 6

1.1.4 Das Prion-Konzept 9

1.1.5 Das Prion-Protein 11

1.1.6 Funktionen von PrPC 12

1.1.7 Strukturelle und biochemische Eigenschaften von PrPC und PrPSc 13

1.1.8 Replikationsmechanismen und Prionenstämme 15

1.1.9 Therapeutische Ansätze für Prionenerkrankungen 18

1.2 Immunsystem und Antikörper 22

1.2.1 Das Immunsystem 22

1.2.2 Struktur und Isotypen von Maus-Immunglobulinen 23

1.2.3 Antikörpervielfalt durch somatische Rekombination 25

1.2.4 Antigen-Antikörper-Interaktionen 27

1.2.5 Produktion von Antikörpern 28

1.2.6 Therapeutische Anwendung von monoklonalen Antikörpern 30

1.3 Ziel der Arbeit 34

2 Material und Methoden 35

2.1 Material 35

2.1.1 Geräte 35

2.1.2 Chemikalien 36

2.1.3 Zelllinien 36

2.1.4 Lösungen zur Analyse und Klonierung von DNA 36

2.1.5 Standardlösungen 37

2.1.6 Antikörper und Farbstoffe 38

2.1.7 Scrapie-Prionenstamm 38

2.1.8 Plasmide 38

2.1.9 Primer 39

2.1.10 Proteine 40

2.1.11 Versuchstiere 40

2.2 Methoden 40

2.2.1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern 40

INHALTSVERZEICHNIS

ii

2.2.1.1 Immunisierung und Isolierung von Milzzellen 40

2.2.1.2 Kultivierung und Vorbereitung von Myelomzellen 41

2.2.1.3 Fusion der Milzzellen mit Myelomzellen 42

2.2.1.4 Screening der Hybridomzellen 42

2.2.1.5 Klonierung der Hybridomzelllinien und Nomenklatur der Klone 43

2.2.1.6 Produktion der monoklonalen Antikörper 43

2.2.1.7 Aufreinigung der monoklonalen Antikörper mittels Protein G 44

2.2.1.8 Bestimmung der Antikörperklasse und der Isotypen 45

2.2.2 Zellbiologische Methoden 46

2.2.2.1 Allgemeine Kulturbedingungen 46

2.2.2.2 Bestimmung der Zellzahl mit dem Hämazytometer 46

2.2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 47

2.2.2.4 Behandlung von Zellen mit Anti-PrP-Antikörpern 47

2.2.2.4.1 Inhibition der Prionreplikation in ScN2a-Zellen 47

2.2.2.4.2 Analyse der Retention auf ScN2a-Zellen 48

2.2.2.5 MTT-Test 49

2.2.2.6 Transfektion von 293T-Zellen mittels Kalziumphosphat-Präzipitation 49

2.2.3 Proteinbiochemische Methoden 50

2.2.3.1 Herstellung von Zelllysaten 50

2.2.3.2 Herstellung von Gehirnhomogenaten 51

2.2.3.3 Proteinbestimmung nach Bradford 51

2.2.3.4 Proteinase K-Behandlung von Homogenaten 51

2.2.3.5 Immunpräzipitation 52

2.2.3.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 53

2.2.3.7 Western Blot 53

2.2.3.7.1 Blocken und Antikörperinkubation 54

2.2.3.7.2 Chemolumineszenz-Detektion 55

2.2.4 Immunologische Methoden 55

2.2.4.1 Enzym Linked Immunsorbent Assay (ELISA) 55

2.2.4.2 Bestimmung der Avidität von Antikörper 56

2.2.4.3 Bestimmung der Dissoziationskonstanten (KD) mittels ELISA 57

2.2.4.4 Durchflusszytometrische Analyse (FACS) 57

2.2.4.5 Bestimmung der Dissoziationskonstanten (KD) mittels FACS 58

2.2.4.6 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen 58

2.2.5 Tierexperimentelle Methoden 59

2.2.5.1 Betäubung der Mäuse mit Ether 59

2.2.5.2 Blutentnahme und Serumgewinnung 60

INHALTSVERZEICHNIS

iii

2.2.5.3 Herzpunktion und Organentnahme 60

2.2.5.4 Bestimmung der Pharmakokinetik der Anti-PrP-Antikörper 60

2.2.5.5 Bioassay 61

2.2.6 Molekularbiologische Methoden 61

2.2.6.1 Klonierung 61

2.2.6.1.1 Präparative Polymerasekettenreaktion (PCR) 61

2.2.6.1.2 Analytische Polymerasekettenreaktion (PCR) 63

2.2.6.1.3 Restriktionsverdau 64

2.2.6.1.4 Agarose-Gelelektrophorese 65

2.2.6.1.5 Gelextraktion 65

2.2.6.1.6 Dephosphorylierung der 5'-DNA-Enden 66

2.2.6.1.7 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten 66

2.2.6.1.8 Ligation 67

2.2.6.1.9 Transformation von E.coli mit Plasmiden 67

2.2.6.1.10 Plasmidpräparation aus E.coli 68

2.2.6.1.11 Quantifizierung von doppelsträngiger DNA 68

2.2.6.1.12 Sequenzierung von DNA 69

2.2.6.2 Ortsgerichtete Mutagenese 70

3 Ergebnisse 71

3.1 Herstellung und Reinigung von monoklonalen Anti-PrP-Antikörper 71

3.1.1 Antikörpertiter der immunisierten Prnp0/0-Mäuse und Fusionsausbeute 71

3.1.2 Isolierung von monoklonalen Anti-PrP-Antikörpern 73

3.1.3 Antikörperproduktion und -konzentrierung in hoher Reinheit 76

3.2 Charakterisierung der Anti-PrP-Antikörper 77

3.2.1 Klassen und Subklassen der Anti-PrP-Antikörper 77

3.2.2 Epitop-Bestimmung der Anti-PrP-Antikörper 77

3.2.2.1 PrP-Plasmide mit einer N-terminalen und einer internen Deletion 77

3.2.2.2 Bestimmung des Epitops mittels FACS 80

3.2.2.3 Bestimmung des Minimalepitops mittels Alanin-Scanning 82

3.2.3 Avidität der Anti-PrP-Antikörper 84

3.2.4 Dissoziationskonstanten (KD) der Anti-PrP-Antikörper 86

3.3 Hemmung der Prionreplikation durch Anti-PrP-Antikörper in vitro 87

3.3.1 Einfluss der Anti-PrP-Antikörper auf die PrPSc-Akkumulation in

ScN2a-Zellen 87

3.3.2 Untersuchung zur Zytotoxizität der Anti-PrP-Antikörper 88

INHALTSVERZEICHNIS

iv

3.3.3 Bindung der Anti-PrP-Antikörper an PrPSc von ScN2a-Zellen 89

3.3.4 Untersuchungen zur dosisabhängigen Wirkung der Anti-PrP-Antikörper 91

3.3.5 Untersuchungen zur zeitabhängigen Wirkung der Anti-PrP-Antikörper 92

3.3.6 Bestimmung des PrPSc-Gehalts von ScN2a-Zellen nach Beendigung

der Antikörperbehandlung 93

3.3.7 Analyse der Infektiosität von Antikörper-behandelten ScN2a-Zellen 95

3.4 Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus der Anti-PrP-Antikörper 97

3.4.1 Untersuchungen zur inhibitorischen Wirkung eines PrP/Ak-Komplexes 97

3.4.2 Untersuchung des Einflusses der Anti-PrP-Antikörper auf die Retention 99

3.5 Pharmakokinetik der Anti-PrP-Antikörper im in vivo Modell 102

4 Diskussion 106

4.1 Die Herstellung von PrPC- und PrPSc-spezifischen Antikörpern 107

4.2 Inhibition der PrPSc-Akkumulation durch Helix 1-bindende Antikörper 109

4.3 Unterschiede zwischen den Helix 1-bindenden Antikörpern 113

4.4 Hypothesen über den Wirkungsmechanismus der Anti-PrP-Antikörper 115

4.5 Ausblick 118

5 Zusammenfassung 120

5.1 Deutsch 120

5.2 Englisch 122

6 Literaturverzeichnis 124

7 Anhang 143

7.1 Abkürzungsverzeichnis 143

7.2 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 146

7.3 Lebenslauf 148

7.4 Veröffentlichungen und Kongressbeiträge 149

7.5 Erklärung 150

7.6 Danksagung 151

EINLEITUNG

5

1 Einführung und Problemstellung

1.1 Prionen und Prionenerkrankungen

1.1.1 Übertragbare spongiforme Enzephalopathien

Prionenerkrankungen oder übertragbare spongiforme Enzephalopathien (engl.: transmissible

spongiform encephalopathies, TSE) sind letal verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen,

die sowohl bei Tieren als auch beim Menschen auftreten können (Collinge, 2001). Unter Tieren

sind die Traberkrankheit (Scrapie) bei Schafen und Ziegen (McGowan, 1922), die Bovine

Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern (Wells et al., 1987) und die Chronic Wasting

Disease (CWD) bei bestimmten Hirscharten in Nordamerika (Williams und Young, 1980)

bekannt (1.1.2). Die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) (Creutzfeldt, 1920), das Gerstmann-

Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) (Gerstmann et al., 1936), Kuru (Gajdusek und Zigas,

1957) sowie die fatale familiäre Schlaflosigkeit (FFI) (Lugaresi et al., 1986) zählen zu den

humanen Prionenerkrankungen. Die Krankheiten werden durch fortschreitende motorische

Störungen (Myoklonien), Gangunsicherheit (Ataxie) sowie den Verlust kognitiver Fähigkeiten

(Demenz) im terminalen Stadium charakterisiert. Zu den typischen neuropathologischen

Veränderungen gehören schwammartige Veränderungen im Gehirn (Spongiose), die

Aktivierung von Astrozyten und Mikrogliazellen (Astrozytose und Gliose), Neuronenverlust und

extrazelluläre Ablagerungen von amyloiden Aggregaten. Im Gegensatz zu anderen

neurodegenerativen Krankheiten können Prionenerkrankungen nicht nur sporadisch und

genetisch auftreten, sondern auch durch Infektionen erworben werden (Collinge, 1997;

Collinge, 2001; Prusiner, 1998). Während die Anzahl der sporadischen Fälle weltweit mit nur

einem Fall pro einer Million relativ gering ist, führte das Auftreten der BSE-Epidemie in

Großbritannien und die Übertragung der Erkrankung auf den Menschen durch BSE-

kontaminierte Produkte zu einem starken öffentlichen Interesse (1.1.3).

Das Prion-Konzept besagt, dass der infektiöse Erreger aus einem körpereigenen Protein mit

veränderter Gestalt besteht. Gelangt diese Form in einen Organismus, repliziert sie sich, indem

ein endogenes Protein in eine fehlgefaltete Form umgewandelt wird (1.1.4). Hierbei spielt das

zelluläre Prion-Protein (PrPC) eine zentrale Rolle. Seine physiologische Funktion ist noch nicht

genau geklärt (1.1.5-6). PrPC unterscheidet sich strukturell und biochemisch von seiner

fehlgefalteten Form, dem pathologischen Prion-Protein, PrPSc (1.1.7). Der Mechanismus der

Konversion ist noch hypothetisch (1.1.8). Vom Zeitpunkt der Infektion oder der spontanen

Konversion bis zum Auftreten der klinischen Krankheit können mehrere Jahre oder Jahrzehnte

vergehen (Collinge et al., 2006). Gegenwärtig gibt es noch keine Therapie für die tödlich

verlaufenden Krankheiten, jedoch wurden in den letzen Jahrzehnten systematisch verschiedene

therapeutische Ansätze untersucht (1.1.9).

EINLEITUNG

6

1.1.2 Prionenerkrankungen bei Tieren

Die Traberkrankheit (Scrapie) bei Schafen und Ziegen wurde bereits vor 250 Jahren

beschrieben (Parry, 1962). Der Name „Scrapie“ bezieht sich auf die Symptome erkrankter Tiere,

die ihr Fell an Zäunen oder Bäumen abscheuern (engl.: to scrape = abkratzen, schaben). 1936

gelang erstmals die experimentelle Übertragung von Scrapie und somit der Beweis, dass es

sich um eine Infektionskrankheit handelt (Cuillé und Chelle, 1936). Die Bovine Spongiforme

Enzephalopathie (BSE) erlangte besonders hohe Aufmerksamkeit durch ihr epidemieartiges

Auftreten bei Rindern. 1986 traten die ersten BSE-Fälle in Großbritannien auf (Wells et al.,

1987). Seitdem sind mehr als 200.000 Rinder in ganz Europa und Japan erkrankt und

Schätzungen gehen weltweit von bis zu einer Million infizierter Tiere aus (Brown et al., 2001).

Ausgelöst wurde diese Epidemie wahrscheinlich durch die Verfütterung von Prion-

kontaminiertem Tiermehl. Ende der siebziger Jahre erfolgte aus wirtschaftlichen Gründen eine

Verminderung der Inaktivierungstemperatur bei der Herstellung von Tiermehl, so dass eine

vollständige Inaktivierung des Erregers nicht mehr gewährleistet war (Ford, 1996). Nach

Aufkommen der ersten Verdachtsmomente wurde 1988 in Großbritannien die

Tiermehlverfütterung an Wiederkäuer verboten, so dass die Anzahl infizierter Tiere wieder

rückläufig ist. Mittlerweile beweisen zahlreiche Studien, dass in diesem Zeitraum die

Übertragung von BSE auf andere Tiere und sogar den Menschen erfolgte (1.1.3).

Andere bekannte Prionenerkrankungen bei Tieren sind die übertragbare Enzephalopathie bei

Nerzen (engl.: Transmissible Mink Encephalopathy, TME) und die übertragbare Katzen-

Enzephalopathie (engl.: Feline Spongiforme Encephalopathy, FSE). Auch hier gilt die

Verfütterung von infektiösem Futter als Ursache der Übertragung (Hanson et al., 1971; Pearson

et al., 1991). Die Chronic Wasting Disease (CWD) ist die einzige bekannte

Prionenerkrankung, die auch bei frei lebenden Tieren, wie bestimmten Hirscharten der Familie

Cervidae, in Nordamerika und Kanada auftritt (Miller et al., 2000).

1.1.3 Prionenerkrankungen beim Menschen

Gemäß ihrer Ätiologie können Prionenerkrankungen spontan (sporadisch), vererbbar (hereditär)

oder durch Infektion (infektiös) auftreten (Tabelle 1). Das Gen für das humane Prion-Protein

(PRNP) ist auf Chromosom 20 lokalisiert (Sparkes et al., 1986).

EINLEITUNG

7

Tabelle 1: Zusammenfassung humaner Prionenerkrankun gen

Manifestation Erkrankung Übertragungsmechanismus

sporadisch sCJD unbekannt

hereditär fCJD

GSS

FFI

autosomal dominante Mutationen im PRNP-Gen

infektiös Kuru

iCJD

vCJD

Endokannibalismus

iatrogene Übertragung

Konsum von BSE-kontaminierten Fleischprodukten

Die bekannteste und häufigste humane TSE-Erkrankung ist die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

(CJD). Etwa 85% aller CJD-Fälle sind sporadischen Ursprungs (sporadische Creutzfeldt-

Jakob-Krankheit, sCJD ), welche weltweit mit einer konstanten Inzidenz von ~1:1.000.000 pro

Einwohner auftreten. Die Krankheit ist nicht mit einer Mutation im PRNP-Gen assoziiert, so dass

der genaue Ursprung bis heute unbekannt ist. Hypothetische Erklärungen für die Ätiologie von

sCJD gehen davon aus, dass die Konversion von PrPC spontan stattfindet oder durch das

zufällige Auftreten von altersbedingten somatischen Mutationen erleichtert wird (Prusiner et al.,

1998). Die Infektiosität von sCJD konnte 1968 durch die experimentelle Übertragung auf

Schimpansen gezeigt werden (Gibbs et al., 1968).

Zu den hereditär auftretenden Prionenerkrankungen gehören die familiäre Creutzfeldt-Jakob-

Krankheit (fCJD) , das Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) und die fatale

familiäre Schlaflosigkeit (engl.: Fatal Familial Insomnia, FFI). Sie werden durch Mutationen im

PRNP-Gen verursacht, welche autosomal-dominant vererbt werden. Dabei handelt es sich

entweder um Punktmutationen, die zur Substitution einer Aminosäure oder zur Entstehung

eines Stop-Kodons führen, oder um Insertionen im Bereich der N-terminalen Oktarepeat-

Region. Mittlerweile wurden über dreißig verschiedenen Mutationen beschrieben (Abbildung 1).

Bei der fCJD, die ca. 10-15% aller hereditären CJD-Fälle ausmacht, sind Mutationen an Kodon

200 (E200K) oder Kodon 178 (D178N) am häufigsten (Goldfarb et al., 1990a; Goldfarb et al.,

1990b; Kovanen, 1993).

Das Auftreten von GSS kann mit sieben verschiedenen Mutationen assoziiert sein, jedoch tritt in

den meisten betroffenen Familien eine Mutation von Prolin zu Leucin an Kodon 102 auf (Hsiao

et al., 1989). Die FFI ist ebenfalls mit der Mutation an Kodon 178 (D178N) assoziiert, deren

Phänotyp aber nur entsteht, wenn dasselbe Allel an Kodon 129 für Methionin kodiert. Wird

dagegen Valin kodiert, entsteht das Krankheitsbild der fCJD (Goldfarb et al., 1992).

EINLEITUNG

8

Abbildung 1: Pathogene Mutationen und Polymorphisme n des humanen PRNP-Gens. Oberhalb des Prion-Protein Gens sind Mutationen aufgeführt, die vererbbare Prionenerkrankungen verursachen. Polymorphismen, die entweder einen neutralen, protektiven oder krankheitsmodifizierenden Effekt haben können, sind unterhalb des Gens aufgelistet (OPRI = Oktarepeat Insertion; OPRD = Oktarepeat Deletion) (Bild und Quelle aus Mead, 2006).

Zu den infektiös erworbenen Prionenerkrankungen gehört Kuru sowie die neue Variante der

Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) und die iatrogene Form (iatrogene Creutzfeldt-Jakob-

Krankheit, iCJD) . Kuru trat ausschließlich bei einem Volksstamm der Fore in Papua-Neuguinea

auf, was auf eine Infektion bei der Teilnahme an einem endokannibalistischen Ritual

zurückgeführt werden konnte (Gajdusek und Zigas, 1957). Nachdem 1959 das Ritual verboten

wurden, konnte Kuru nur noch selten diagnostiziert werden (Gajdusek, 1996). Das sorgfältige

Monitoring der letzten Kuru-Fälle ermöglichte erstmals einen Einblick in die langen

Inkubationszeiten von bis zu 50 Jahren bei der Übertragung von Prionen von Mensch zu

Mensch (Collinge et al., 2006).

Die bekannteste infektiöse Form der Prionenerkrankungen ist die neue Variante der Creutzfeldt-

Jakob-Krankheit, die zehn Jahre nach dem Höhepunkt der BSE-Epidemie zum ersten Mal

beschrieben wurde (Will et al., 1996). Der experimentelle Beweis, dass zwischen BSE und

vCJD ein Zusammenhang besteht, wurde von mehreren Arbeitsgruppen erbracht: So führte die

Transmission von BSE in Primaten zur Entstehung von floriden Plaques, ein Charakteristikum

von vCJD (Lasmezas et al., 1996). Ebenfalls konnten nach der Inokulation von Mäusen mit

EINLEITUNG

9

BSE- und vCJD-Prionen gleiche Läsionsprofile und Inkubationszeiten bestimmt werden (Bruce

et al., 1997), und das Glykosylierungsmuster von PrPSc ist bei BSE- und vCJD-Prionen

identisch (Collinge et al., 1996b). Die Anfälligkeit gegenüber der neuen Variante von CJD

scheint an einen Polymorphismus von Kodon 129 des PRNP-Gens gekoppelt zu sein. 37% der

Bevölkerung sind an dieser Stelle homozygot für Methionin (Met), 12% sind homozygot für Valin

(Val) und 51% sind Met/Val heterozygot. Alle bisher aufgetretenen vCJD-Fälle sind an diesem

Kodon homozygot für Methionin (Collinge et al., 1996a; Ironside und Head, 2004).

Die iatrogene Form von CJD umfasst etwa 1% aller CJD-Fälle und tritt durch eine

unbeabsichtigte Übertragung von sCJD durch medizinische Eingriffe beim Menschen auf. So

wurden Fälle beschrieben, die nach Hirnhauttransplantationen oder

Augenhornhautverpflanzungen auftraten (Duffy et al., 1974), deren Spender offenbar

asymptomatische Träger von sCJD waren. Zahlreiche Empfänger von humanen

Wachstumshormonen, die aus Leichenhypophysen gewonnen wurden, erkrankten. Die

Übertragung durch CJD-kontaminierte chirurgische Instrumente, wie z.B. Gehirn-Elektroden, ist

ebenfalls dokumentiert (Brown et al., 2000). Auch eine Übertragung von vCJD durch

kontaminierte Bluttransfusionen ist möglich, da deren Empfänger kurze Zeit später an vCJD

erkrankten und starben (Llewelyn et al., 2004; Peden et al., 2004).

1.1.4 Das Prion-Konzept

Die Natur des krankheitserregenden Agens von Prionenerkrankungen konnte aufgrund seiner

außergewöhnlichen Eigenschaften lange Zeit nicht genau aufgeklärt werden. 1936 gelang die

experimentelle Übertragung von Scrapie auf gesunde Schafe und Ziegen durch die Inokulation

von Gehirnhomogenat nach einer sehr langen Inkubationszeit (Cuillé und Chelle, 1936). Infolge

dieser Beobachtungen nahm man zunächst an, dass es sich bei dem Krankheitserreger um

einen „Slow-Virus“ handelte, d.h. um ein sehr langsam replizierendes Virus (Sigurdsson, 1954;

Thormar, 1971). Gegen diese Virus-Hypothese sprach jedoch die Beobachtung, dass die

Infektiosität des Erregers weder durch die Behandlung mit DNA- oder RNA-schädigender

Strahlung noch mit Nukleasen reduziert werden konnte (Alper et al., 1967). Stattdessen führten

Verfahren, die Proteine modifizierten oder hydrolysierten, wie z.B. die Behandlung mit Harnstoff

oder Natriumhydroxid (Alper et al., 1967; Alper et al., 1966; Prusiner, 1982; Prusiner et al.,

1981), zur Inaktivierung des Erregers. Diese Untersuchungen zeigten, dass der Erreger aus

einem nukleinsäurefreien Pathogen bestehen könnte. Griffith postulierte 1967 erstmals die

Hypothese, dass das infektiösen Agens ein Protein ist (Griffith, 1967). Diese „Nur Eiweiss“-

Hypothese konnte 1982 durch die Isolation eines Protease-resistenten Glykoproteins, welches

in hoch aufgereinigten Gehirnproben von infizierten Hamstern mit der Infektiosität assoziiert

war, bestätigt werden. In vitro bildete dieses aufgereinigte Protein ebenfalls schwer lösliche

EINLEITUNG

10

Aggregate, die denen in den Ablagerungen von Prion-infizierten Gehirnen ähnlich waren (Bolton

et al., 1982; McKinley et al., 1983; Prusiner, 1982).

Um diese neue Erregerklasse von konventionellen Pathogenen wie Viren oder Bakterien

abzugrenzen, prägte Stanley Prusiner den Begriff Prion (proteinaceous infectious particle) als

Bezeichnung für infektiöse proteinartige Partikel ohne Nukleinsäuren (Bolton et al., 1982;

Prusiner, 1982).

Nach Bestimmung der N-terminalen Sequenz des infektiösen Prion-Proteins (Prusiner et al.,

1984) gelang mit Hilfe von Gensonden die Klonierung des kodierenden Gens.

Überraschenderweise handelte es sich um ein zelluläres Gen, das sowohl in gesunden als auch

in infizierten Hamstern in gleichen Maßen exprimiert wird (Chesebro et al., 1985; Oesch und

Tempst, 1985). Da in der Primärstruktur des zellulären und pathologischen Proteins keine

Unterschiede festgestellt werden konnten (Basler et al., 1986), wurde angenommen, dass sich

die beiden Formen nur in ihrer Konformation unterscheiden (Pan et al., 1993). Um zwischen

diesen beiden Isoformen zu differenzieren, wurde das normale zelluläre Protein PrPC (cellular

PrP) und die infektiöse pathogene Form PrPSc (PrP scrapie) genannt. Die „Nur Eiweiss“-

Hypothese besagt, dass das infektiöse Agens von Prionenerkrankungen nur aus der

pathogenen Isoform besteht (Prusiner, 1982; Prusiner, 1997; Prusiner, 1998; Prusiner et al.,

1984). Die Replikation erfolgt vermutlich dadurch, dass PrPSc dem endogenen PrPC seine

eigene Konformation aufzwingt und sich somit vermehrt (1.1.8) (Cohen et al., 1994).

Ein bedeutender Hinweis für die Richtigkeit der „Nur Eiweiss“-Hypothese lieferte der Befund,

dass Mäuse ohne PrPC (Prnp0/0-Mäuse) nach Inokulation mit Prionen vollständig resistent

waren und nicht erkrankten (Bueler et al., 1993; Prusiner et al., 1993), die Empfänglichkeit der

Tiere jedoch durch die Einführung des PrP-kodierenden Transgens wieder hergestellt werden

konnte (Whittington et al., 1995).

Obwohl diese Hypothese mittlerweile weitestgehend akzeptiert ist, erklärt sie nicht, wie ein

einzelnes pathogenes Protein stammspezifische Unterschiede kodieren kann, die zu

Variationen in der Inkubationszeit oder der Neuropathologie bei Mäusen führen (Bruce et al.,

1991) (1.1.8).

Eine weitere Unterstützung für die „Nur Eiweiss“-Hypothese wurde durch die de novo

Generation von Proteinase K-resistenten PrPSc erbracht (Mestel, 1996). So gelang die in vitro

Konversion von PrPC in Proteinase K-resistentes PrPSc durch die Koinkubation beider Isoformen

(Kocisko et al., 1994). Ob dabei auch Infektiosität erzeugt wurde, konnte nicht bestimmt werden.

Kürzlich gelang die Herstellung von amyloiden Fibrillen aus rekombinantem PrP, welche nach

Inokulation auf eine transgene Mauslinie nach langer Inkubationszeit zu „Scrapie“-typischen

Symptomen führten (Legname et al., 2004). Da sich jedoch nach Transmission dieser Fibrillen

auf wildtypische Mäuse keine Krankheit entwickelte, ist die Interpretation der Daten, ob wirklich

de novo Infektiosität erzeugt wurde, noch unklar.

EINLEITUNG

11

Signalsequenz 5 Oktarepeats

STE H1 H2 H3NH2- -COOHTM

51 91 95 112 126 144 151

S-S

179 193 200 217

ß1 ß2

N-Glykosylierung180 196

231 254

SignalsequenzSignalsequenz 5 Oktarepeats

STE H1 H2 H3NH2- -COOHTM

51 91 95 112 126 144 151

S-S

179 193 200 217

ß1 ß2

N-Glykosylierung180 196

231 254231 254

Signalsequenz

1.1.5 Das Prion-Protein

Das Prion-Protein ist innerhalb der Säugetiere hoch konserviert (Schatzl et al., 1995; Wopfner

et al., 1999). In Vögeln (Harris et al., 1991), Fischen (Gibbs und Bolis, 1997) und Beuteltieren

(Windl et al., 1995) konnte ebenfalls die Expression eines PrPC-Homologs bestätigt werden.

PrPC wird hauptsächlich in Neuronen (Kretzschmar et al., 1986) und in geringen Mengen auch

in Astrozyten und Oligodendrozyten exprimiert (Moser et al., 1995). Außerhalb des Gehirns

wurde PrPC in der Skelett-Muskulatur (Brown et al., 1998), lymphoiden Geweben (Brown et al.,

1999b; Burthem et al., 2001; Liu et al., 2001) sowie im Darmgewebe nachgewiesen (Morel et

al., 2004).

Das murine Prnp-Gen besteht aus drei Exons und ist auf Chromosom 2 lokalisiert (Sparkes et

al., 1986). Der offene Leserahmen liegt komplett in Exon 3 (Basler et al., 1986). Das

vollständige Translationsprodukt besteht bei der Maus aus 254 Aminosäuren (Abbildung 2).

Abbildung 2: Schematische Darstellung des murinen P rion-Proteins. Das zelluläre Prion-Protein besteht aus einer flexiblen N-terminalen Domäne (Reste 23-121) und einer globulären C-terminalen Domäne. N-terminal sind fünf hochkonservierte Oktarepeat-Regionen (PQGGTWGQ), eine Stopp-Transfer-Effektor-Sequenz (STE) und eine transmembrane Region (TM), die auch hydrophobe Domäne genannt wird, angeordnet. Der globuläre Teil besteht aus drei α-Helices und zwei β-Faltblättern. Die Signalpeptide für den Import ins rER (Reste 1-22) und den GPI-Anker (Reste 231-254) werden abgespalten, so dass das reife PrPC-Molekül aus 209 Aminosäuren besteht.

PrPC wird im rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) synthetisiert und gelangt durch den

Golgi-Apparat über den sekretorischen Weg zur Plasmamembran, mit der es über einen

Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker verknüpft ist (Borchelt et al., 1990; Caughey, 1991;

Taraboulos et al., 1990). Während der Biosynthese von PrPC erfolgen mehrere post-

translationale Modifikationen: Abspaltung der N-terminalen Signalsequenz für den Import in das

rER (Basler et al., 1986; Oesch und Tempst, 1985), N-Glykosylierung der beiden Asparagin-

Reste 180 und 196 (Haraguchi et al., 1989), Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen den

Cystein-Resten 179 und 214 (Hope et al., 1986; Safar et al., 1998) und Abspaltung der

C-terminalen hydrophoben Signalsequenz für die Anheftung des GPI-Ankers (Stahl et al.,

1987).

EINLEITUNG

12

PrPC gelangt im Verlauf seiner Reifung vom ER über den Golgi-Apparat auf die Zelloberfläche

und kann dort entweder mit spezialisierten Mikrodomänen (lipid rafts) (Naslavsky et al., 1997;

Vey et al., 1996), die sich durch einen besonders hohen Gehalt an Cholesterol und

Sphingolipiden auszeichnen (Simons und Ikonen, 1997), oder mit „Clathrin-coated pits“

assoziiert sein (Laine et al., 2001; Madore et al., 1999; Shyng et al., 1994; Sunyach et al.,

2003). Von der Zelloberfläche werden die PrPC-Moleküle kontinuierlich über Endosome

internalisiert. Ein Teil gelangt zurück an die Oberfläche, während ein anderer Teil abgebaut wird

(Shyng et al., 1993). Der Mechanismus der PrPC-Internalisierung wird gegenwärtig kontrovers

diskutiert. Eine Beteiligung von sowohl lipid rafts bzw. raft-ähnlichen Strukturen wie zum

Beispiel Caveolin-1 enthaltende Caveolaes als auch Clathrin-abhängige Mechanismen sind

möglich.

Für eine Clathrin-abhängige Endozytose könnte die Lokalisation von PrPC in Clathrin-Vesikeln

sprechen, jedoch fehlt PrPC eine zytoplasmatischen Domäne, die direkt mit einem

Adapterprotein oder mit Clathrin interagieren könnte. Deswegen wurde ein mutmaßlicher PrP-

Rezeptor postuliert, der die Internalisierung über Clathrin-abhängige Mechanismen vermittelt

(Harris et al., 1996; Shyng et al., 1995). Ein möglicher Kandidat wäre der 37kDa/67kDa

Laminin-Rezeptor, welcher in der Zellkultur für die PrPC-Internalisierung notwendig ist

(Gauczynski et al., 2001). Weitere Daten zeigen, dass die Internalisierung von PrPC offenbar

über mehrere alternative Routen möglich ist (Prado et al., 2004).

1.1.6 Funktionen von PrP C

Die physiologische Funktion von PrPC ist heute noch nicht genau geklärt. Die Generierung von

Prnp0/0-Mäusen sollte erste Hinweise auf die Funktion liefern, jedoch zeigten die Tiere

überraschenderweise keinen ausgeprägten Phänotyp und entwickelten sich normal (Bueler et

al., 1992). Lediglich eine leichte Beeinträchtigung der GABAA-Rezeptor-vermittelten Inhibition

und der Langzeit-Potenzierung (Collinge et al., 1994) sowie geringe Veränderungen im

zirkadianen Rhythmus wurden beobachtet. Diese phänotypischen Veränderungen lassen sich

durch die Expression von PrP-Transgenen wieder aufheben (Tobler et al., 1997; Whittington et

al., 1995).

Mittlerweile werden verschiedene Funktionen für PrPC diskutiert. Einige Untersuchungen deuten

auf eine funktionelle Rolle im Kupfer-Metabolismus hin. Dies basiert auf der Fähigkeit von

PrPC, Cu2+-Ionen zu binden. Diese Bindung kann sowohl über die Histidine in den Oktarepeats

als auch über Histidin 96 und 111 erfolgen (Jackson et al., 2001). Da die Bindung von

Cu2+-Ionen die Clathrin-abhängige Endozytose stimuliert, könnte PrPC eine regulierende

Funktion beim Kupfer-Transport besitzen (Pauly und Harris, 1998). Eine protektive Wirkung von

PrPC als Cu/Zn Superoxiddismutase-1 (SOD-1) wurde ebenfalls beschrieben (Brown et al.,

EINLEITUNG

13

1999a). Diese Funktion, die von der Aufnahme von Kupfer als essentiellem Kofaktor abhängt,

führt zu einem Schutz gegen oxidativen Stress. Da aber keine direkte Korrelation zwischen der

PrPC-Expression und der Kupfer-Konzentration in verschiedenen Mausmodellen beobachtet

wurde und auch die SOD-1-Funktion von anderen Arbeitsgruppen nicht bestätigt wurde, bleibt

die genaue Beteiligung von PrPC an der Kupferhomöostase spekulativ (Hutter et al., 2003;

Waggoner et al., 2000).

Da PrPC als GPI-verankertes Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wird, liegt eine weitere

Funktion in der Signaltransduktion nahe. So wurde z.B. nach Antikörper-vermittelter

Vernetzung von PrPC eine erhöhte Aktivität der Tyrosin-Kinase Fyn beobachtet (Mouillet-

Richard et al., 2000). Die physiologische Bedeutung dieses Befundes ist noch unklar. Ebenfalls

führte die Interaktion von PrPC mit dem neuralen Zelladhäsionsmolekül (NCAM) zu einer

Aktivierung der Fyn-Kinase, die, wie auch die Interaktion mit dem 37kDa/67kDa Laminin-

Rezeptor, das Neuritenwachstum stimulierte (Graner et al., 2000; Rieger et al., 1997;

Santuccione et al., 2005). Ein neuroprotektiver Effekt wurde nach Interaktionsstudien mit dem

Stress-induzierbaren Protein 1 (Zanata et al., 2002) oder dem anti-apoptotischen Faktor Bcl-2

(Kurschner und Morgan, 1995) postuliert. Gegenwärtig sind mehr als 20 Interaktionspartner von

PrPC bekannt, jedoch muss die physiologische Relevanz der Interaktion noch weiter untersucht

werden (Caughey und Baron, 2006).

1.1.7 Strukturelle und biochemische Eigenschaften v on PrP C und PrP Sc

Während PrPC und PrPSc identische Aminosäuresequenzen und gleiche post-translationale

Modifikationen besitzen, unterscheiden sie sich in ihren biochemischen und strukturellen

Eigenschaften (Tabelle 2).

Tabelle 2: Vergleich der Eigenschaften von PrP C, PrPSc und PrP27-30

PrP Isoform PrP C PrPSc PrP27-30

Infektiosität nicht-infektiös infektiös infektiös

Proteasesensitivität sensitiv partiell resistent resistent

Löslichkeit löslich unlöslich unlöslich

Halbwertszeit kurz (2-4h) lang (> 24h) lang (> 24h)

Molekulargewicht 33-35 kDa 27-35 kDa 27-30 kDa

Aggregationsstatus Monomere,

Dimere, Oligomere

Monomere,

Dimere, Aggregate

amyloide Fibrillen

Sekundärstruktur α-Helices (42%)

β-Faltblätter (3%)

α-Helices (30%)


α-Helices (21%)


EINLEITUNG

14

Im Gegensatz zu PrPC besitzt PrPSc eine partielle Resistenz gegenüber Proteinase K, ist in

nicht-ionischen Detergenzien unlöslich und tendiert zur Aggregatbildung (Cohen und Prusiner,

1998). Die Inkubation von murinem PrPSc mit Proteinase K führt zur Abspaltung von ca. 90

Aminosäureresten am N-Terminus (Oesch und Tempst, 1985). Das resultierende Fragment wird

entweder nach seiner Größe PrP27-30 oder nach seiner Protease-resistenten Eigenschaft als

PrPres bezeichnet (Bolton et al., 1982). Im Verlauf der Krankheit kann die Akkumulation von

PrPSc zu Ablagerungen in Form von Amyloid-Plaques führen. Eine biochemische Anreicherung

aus Prion-infizierten Hamstergehirnen führt zur Entstehung von amyloiden Fibrillen („prion

rods”), die ebenfalls in wässrigen und organischen Lösungsmitteln sowie in nicht-ionischen

Detergenzien unlöslich sind (McKinley et al., 1991).

Diese Eigenschaften erschweren bis heute die genaue Bestimmung der Struktur von PrPSc.

Nachdem eine partielle Aufreinigung von nativem PrPC und PrPSc gelang, wurden verschiedene

Verfahren zur Strukturanalysen, wie z.B. die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie und

die Zirkulardichroismus-Spektroskopie, eingesetzt. Bei PrPC beträgt der Anteil an α-helikalen

Bereichen 42%, während nur 3% in einer β-Faltblatt-Struktur vorliegen. Dieses Verhältnis

verschiebt sich bei der Konversion zu PrPSc, wobei mit 45% die β-Faltblätter dominieren und der

α-helikale Anteil nur noch 30% beträgt (Pan et al., 1993).

Abbildung 3: NMR-Struktur von rekombinantem PrP (Re ste 121-231). Die Struktur von PrPC besteht aus drei α-Helices (rot) und zwei anti-parallelen β-Faltbättern (blau) (Bild und Quelle aus Eghiaian, 2005).

Durch die Herstellung von rekombinantem Prion-Protein der Maus (Reste 23-231) in E.coli

wurde die Struktur von PrPC mittels Kernresonanz-Spektroskopie (NMR) aufgeklärt. Die

C-terminale, globuläre Domäne besteht aus drei α-Helices sowie aus zwei antiparallelen

β-Faltblättern, welche die α-Helix 1 flankieren. Für den N-Terminus (Reste 23-120) konnte keine

EINLEITUNG

15

A B CA B C

Struktur bestimmt werden. Man geht davon aus, dass PrPC in diesem Bereich flexibel ist

(Hornemann et al., 1997; Riek et al., 1997) (Abbildung 3). Die Bindung von Cu2+-Ionen im

N-Terminus führt vermutlich zu einer Stabilisierung der flexiblen Struktur (Jones et al., 2004;

Leclerc et al., 2006).

Huang und Kollegen entwickelten für PrPSc ein theoretisches Struktur-Modell, in dem Helix 2

und Helix 3 erhalten bleiben und Helix 1 durch vier β-Faltblätter ersetzt wird (Huang et al.,

1996). Neuere Untersuchungen von 2D-Kristallen, die aus PrP27-30 gewonnen wurden (Wille

et al., 2002), weisen jedoch darauf hin, dass der Bereich der Helix 1 inklusive der beiden

angrenzenden β-Faltblätter (Reste 98-175) in eine linksgängige β-Helix umgewandelt wird

(Abbildung 4). Helix 2 und Helix 3, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind, sowie die

flexible N-terminale Domäne bleiben erhalten. Drei dieser Moleküle lagern sich zu Trimeren

zusammen und bilden eine Einheit der 2D-Kristalle. Dabei liegen die β-Helices der Monomere

im Zentrum und die beiden C-terminalen α-Helices ragen nach außen. Lagern sich mehrere

dieser Trimere übereinander zusammen, bilden sich so genannte „prion rods“ (Govaerts et al.,

2004; Wille et al., 2002).

Abbildung 4: Schematisches Modell der PrP Sc-Konformation und Aggregation. (A) In einem PrPSc-Monomer bildet die Sequenz der Aminosäuren 90 bis 176 eine linksgängige β-Helix (gelb) aus, während die Struktur von Helix 2 und Helix 3, wie bei PrPC, erhalten ist. (B) Trimeres Modell bei der Assoziation von PrPSc-Monomeren. (C) Modell für die Aggregation von PrPSc-Trimeren zu einer PrPSc-Fibrille („prion rod“). Die Zuckerreste sind nicht dargestellt (Govaerts et al., 2004).

1.1.8 Replikationsmechanismen und Prionenstämme

Die Replikation der pathogenen Form spielt die zentrale Rolle in der Prion-Pathogenese. Da bis

heute keine Prion-spezifischen Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren, die groß genug für die

EINLEITUNG

16

Kodierung eines Proteins sind, identifiziert wurden (Kellings et al., 1992; Safar et al., 2005),

nimmt man an, dass PrPSc repliziert, indem es an PrPC bindet und es in seine eigene

Konformation umwandelt (Prusiner, 1991). Die genaue zelluläre Lokalisation der Replikation ist

noch nicht geklärt, aber Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Konversion vermutlich

innerhalb des endosomalen/lysosomalen Kompartiments oder sogar an der Zelloberfläche in

lipid rafts stattfindet (Arnold et al., 1995; Baron und Caughey, 2003; Borchelt et al., 1992; Botto

et al., 2004; Caughey und Raymond, 1991; Mayer et al., 1992).

Für den Replikationsmechanismus von PrPSc werden gegenwärtig zwei Modelle diskutiert: Das

Faltungs- oder Heterodimermodell und das Keimbildungsmodell (Abbildung 5).

Das Faltungs- oder Heterodimermodell geht davon aus, dass die spontane Konversion von

PrPSc zu PrPC durch eine hohe Energiebarriere kontrolliert wird. Exogen eingeführtes PrPSc

kann die Entstehung der stabilen PrPSc-Form favorisieren und somit PrPC in PrPSc umwandeln.

Dabei bindet ein PrPSc-Monomer an ein partiell entfaltetes PrPC-Molekül, wodurch ein

Heterodimer entsteht und dadurch PrPC konvertiert wird. Dieser Komplex zerfällt wiederum in

zwei PrPSc-Monomere, die in einem autokatalytischen Prozess weitere PrPC-Moleküle in PrPSc

konvertieren können (Cohen et al., 1994; Prusiner et al., 1990).

Beim Keimbildungsmodell besteht zwischen PrPC und PrPSc ein thermodynamisch

kontrolliertes Gleichgewicht, d.h. die Umfaltung ist reversibel, jedoch ist die PrPC-Konformation

begünstigt. PrPSc wird nur stabilisiert, wenn sich mehrere PrPSc-Monomere zu einem

kristallähnlichen Keim zusammenlagern. Entsteht so ein „Kristallisationskeim“, lagern sich sehr

schnell weitere PrPC-Monomere an, die konvertieren und Aggregate bilden. Um den

exponentiellen Anstieg von PrPSc im Krankheitsverlauf erklären zu können, müssen diese

Aggregate kontinuierlich fragmentiert werden, um so weitere Anlagerungsflächen liefern zu

können (Jarrett und Lansbury, 1993; Orgel, 1996).

Das Keimbildungsmodell liefert eine hypothetische Erklärung für die Existenz von

verschiedenen Prionenstämmen. Solche Stämme unterscheiden sich sowohl in ihren

biologischen als auch ihren biochemischen Eigenschaften. So wurden nach experimenteller

Inokulation von Prionenstämmen in gleiche Mauslinien Unterschiede in der Inkubationszeit und

der Neuropathologie beobachtet. PrPSc-Moleküle von einzelnen Prionenstämmen können sich

in der Sensitivität gegenüber Proteinase K und in der Anzahl der proteolytisch entfernten

Aminosäuren im N-Terminus unterscheiden, wodurch stammspezifische Profile nach der

SDS-Elektrophorese entstehen können. Die Unterschiede betreffen sowohl die Fragmentgröße

als auch das Verhältnis der di-, mono- und unglykosylierten PrPSc-Formen untereinander

(Bessen und Marsh, 1992; Bruce, 2003; Collinge et al., 1996b; Telling et al., 1996). Die

stammspezifischen Charakteristika bleiben auch nach Passage des Inokulums, unabhängig von

der primären PrPC-Sequenz des Wirts, erhalten (Telling et al., 1996).

EINLEITUNG

17

Im Rahmen des Keimbildungsmodells würde das bedeuten, dass bei der Fragmentierung

unterschiedliche Kristallisationskeime entstehen, welche die Information für die

Stammeigenschaften in ihrer Struktur kodieren. Dies würde für die Existenz mehrerer stabiler

PrPSc-Konformationen sprechen.

Beide Modelle konnten in vivo noch nicht bestätigt werden, aber das Keimbildungsmodell wird

von experimentellen Daten gut unterstützt. Einerseits besteht die Möglichkeit, rekombinantes

PrP in vitro zu konvertieren und dabei die stammspezifischen biochemischen Charakteristika

verschiedener Prionenstämme zu erhalten (Bessen et al., 1995; Kocisko et al., 1995; Vanik et

al., 2004). Andererseits existiert mittlerweile eine Methode (protein misfolding cyclic

amplification, PMCA), mit der es möglich ist, PrPSc-Moleküle zu amplifizieren (Saborio et al.,

2001). Während der ersten Phase der PMCA wird eine geringe Menge von PrPSc in Form von

infektiösem Gehirnhomogenat mit einem großen Überschuss von gesundem Gehirnhomogenat

inkubiert, um das Wachstum von PrPSc-Polymeren zu induzieren. In der zweiten Phase werden

diese Polymere durch die Behandlung mit Ultraschall fragmentiert, wodurch die Anzahl an

konvertierenden Einheiten erhöht wird. Durch das mehrmalige Wiederholen dieser Phasen

können PrPSc-Moleküle exponentiell amplifiziert werden (Saborio et al., 2001).

EINLEITUNG

18

Abbildung 5: Modelle für die Konversion von PrP C zu PrPSc. A Faltungsmodell . Ein Konformationswechsel von PrPC zu PrPSc wird durch eine hohe Energiebarriere verhindert. Interagiert PrPC jedoch mit exogen eingeführtem PrPSc, entsteht ein Heterodimer, welches PrPC in PrPSc konvertiert. Das entstandene PrPSc-Homodimer dissoziiert und beide Monomere können weitere Konversionswechsel katalysieren. B Keimbildungsmodell . Zwischen PrPC und dem unstabilen PrPSc besteht ein thermodynamisch kontrolliertes Gleichgewicht zu Gunsten von PrPC. Zu einer Stabilisierung und Akkumulation von PrPSc kommt es nur nach Bildung eines Kristallisationskeims, der durch die Anlagerung weiterer PrPSc-Moleküle schnell wächst. Durch die Fragmentierung dieses Keims kommt es zu einer exponentiellen Konversionsrate (Bild und Quelle aus Aguzzi und Sigurdson, 2004).

Es gibt Hinweise darauf, dass neben der direkten Interaktion zwischen den beiden Isoformen

ein weiterer Faktor für die Konversion von PrPC zu PrPSc notwendig ist. So wurde gezeigt, dass

transgene Mäuse, die humanes PrPC exprimieren, nicht mit CJD infiziert werden können,

während Mäuse, die ein chimäres Mensch/Maus-PrP exprimieren, die Krankheit entwickeln

(Telling et al., 1994). Daraus folgerte man, dass ein endogener Faktor, der als Faktor X

bezeichnet wurde, für die Konversion notwendig ist. Indem Faktor X mit einer höheren Affinität

an PrP der eigenen Spezies bindet, könnte er die Konversion des transgenen PrPC einer

anderen Spezies inhibieren (Telling et al., 1995). Ob es sich hierbei um ein molekulares

Chaperon handelt, ist noch unklar. Mittlerweile wurde eine mögliche Bindestelle des Faktor X in

der C-terminalen Domäne des Prion-Proteins identifiziert (Kaneko et al., 1997).

1.1.9 Therapeutische Ansätze für Prionenerkrankunge n

Das Interesse an Prionenerkrankungen nahm durch den Ausbruch der BSE-Epidemie und dem

damit verbundenen Auftreten von vCJD stark zu. Seit 1995 sind weltweit über 180 Menschen

an vCJD verstorben (Hilton, 2006). Aufgrund der langen Inkubationszeiten wird in den nächsten

Jahren mit weiteren Krankheitsfällen gerechnet. Eine genaue Vorhersage über die Anzahl der

erwarteten Fälle wird durch fehlende Angaben über Faktoren, welche die Inkubationszeit

beeinflussen, wie z.B. die Infektionsroute, die Inokulum-Menge oder die genetische

Prädisposition, erschwert (Wisniewski und Sigurdsson, 2007). Zudem besteht das Risiko einer

iatrogenen Infektion, da bereits Fälle einer Übertragung von vCJD durch Bluttransfusionen von

Spendern bekannt sind, welche bereits mit vCJD infiziert, aber noch nicht erkrankt waren

(Llewelyn et al., 2004; Peden et al., 2004) (1.1.3). Diese Beobachtungen sprechen für die

Notwendigkeit, eine effektive Therapie für Prionenerkrankungen zu entwickeln.

EINLEITUNG

19

amyloid

PrPC

PrPScSYNTHESE

ZELLOBERFLÄCHE

ABBAU6

FAKTOR X ?

1

25

3

4

amyloid

PrPC

PrPScPrPScSYNTHESE

ZELLOBERFLÄCHE

ABBAU6

FAKTOR X ?

1

25

3

4

Sowohl die Synthese von PrPC als auch der Konversionsprozess liefern mehrere Ansatzpunkte,

an denen Therapeutika effektiv eingreifen könnten (Abbildung 6):

(1) Hemmung der PrPC-Synthese

(2) Blockierung des PrPC-Transports zur Zelloberfläche

(3) Stabilisierung der PrPC-Konformation

(4) Hemmung der Interaktion von PrPC und PrPSc

(5) Hemmung der Bindung von Faktor X

(6) Stimulierung der Degradation von PrPSc bzw. des Abbaus der PrPSc-Aggregate

Abbildung 6: Potentielle Angriffspunkte für therape utische Interventionen bei Prionen-erkrankungen am Beispiel des Faltungsmodells. Die möglichen Ansatzpunkte sind durch Zahlen gekennzeichnet und werden im Text erklärt. Diese Ansätze können auch auf das Keimbildungsmodell übertragen werden.

Durch die Generierung von Prnp0/0-Mäusen wurde bereits früh gezeigt, dass das endogene

PrPC für eine Infektion essentiell ist. Nach Inokulation replizierten diese Mäuse keine Prionen

und entwickelten keine Pathologie (Bueler et al., 1993; Bueler et al., 1992). Somit bietet sich die

Reduktion bzw. Beseitigung von PrPC als therapeutischer Interventionspunkt an (Abbildung 6

(1)). Dies kann entweder durch RNA-Interferenzen (RNAi) auf Ebene der mRNA von PrPC

(Daude et al., 2003; Tilly et al., 2003) oder auf Ebene des Gens erfolgen. Seit der BSE-Krise

wurde verstärkt an der Generierung von PrP-defizienten Rindern gearbeitet. Da Prnp0/0-Mäuse

nicht mit Prionen infiziert werden können, geht man davon aus, dass dies auch bei PrP-

defizienten Rindern nicht möglich ist, wodurch die Gefahr, die von BSE-kontaminierten

EINLEITUNG

20

Produkten ausgeht, vollständig eliminiert wäre. Kürzlich gelang die erfolgreiche Herstellung von

PrPC-defizienten Rindern (Richt et al., 2007). Bisher wurden in den 20 Monaten

Beobachtungszeitraum keine phänotypischen Auffälligkeiten beobachtet (Richt et al., 2007).

Auch die Hemmung der Genexpression nach erfolgter Infektion erscheint vielversprechend.

Durch einen Knock-out der neuralen PrP-Expression in acht Wochen alten Mäusen, die bereits

infiziert waren und erste neurodegenerative Veränderungen zeigten, konnte sogar die

spongiforme Pathologie im Gehirn wieder aufgehoben werden, und die Tiere blieben trotz

fortschreitender Gliose und extraneuraler PrPSc-Akkumulation asymptomatisch (Mallucci et al.,

2003).

Eine Blockade des Transports von PrPC zu den Kompartimenten, in denen die Konversion

stattfindet (Abbildung 6 (2)), konnte nach Behandlung mit Suramin und den beiden Statinen

Lovastatin und Squalestatin beobachtet werden. Während Suramin zu einer PrPC-Aggregation

im Trans-Golgi-Netzwerk mit anschließender lysosomaler Degradation führt, hemmen die

Statine die Cholesterol-Biosynthese und beeinflussen so die Organisation der lipidhaltigen

Raftmikrodomänen (1.1.5) (Bate et al., 2004; Gilch et al., 2001; Taraboulos et al., 1995). Zu

einer Stabilisierung der PrPC-Konformation können molekulare Chaperone, wie z.B. DMSO oder

Kongo Rot beitragen (Head und Ironside, 2000; Tatzelt et al., 1996) (Abbildung 6 (3)).

Ein anderer Ansatzpunkt ist die Inhibition des Kontakts zwischen PrPC und PrPSc, der für die

Konversion notwendig ist (Abbildung 6 (4)). Durch die Bindung von PrP-Aptameren (Proske et

al., 2002), „Beta-sheet breaker“-Peptiden (Chabry et al., 1999; Soto et al., 2000) oder Anti-PrP-

Antikörpern könnte die Bindestelle maskiert werden (Enari et al., 2001; Peretz et al., 2001). In

transgenen Mäusen, die ein Fusionsprotein bestehend aus zwei murinen PrP-Molekülen

exprimierten, welche über einen Fc-Teil (1.2.2) verbunden waren (PrP-Fc2), wurde eine

Hemmung der Prionreplikation beobachtet. Diese PrP-Fc2-Moleküle waren nicht in PrPSc

konvertierbar, so dass vermutet wurde, dass die gebundenen PrPSc-Moleküle dem

Konversionsprozess entzogen werden (Meier et al., 2003). Ein weiterer Ansatzpunkt zur

Hemmung der Konversion ist die Blockade des postulierten Faktor X (Prusiner, 1998; Telling et

al., 1995) (Abbildung 6 (5)). Die vermutete Bindestelle dieses Faktors beinhaltet im murinen PrP

die Reste Q167, Q171, T214 und Q218 (Kaneko et al., 1997). In Prion-infizierten Zellen führte

die Expression solcher PrP-Mutanten zu einer Reduktion des PrPSc-Gehalts und zu der

Annahme, dass diese Mutanten einen dominant-negativen Effekt auf die Prionreplikation

besitzen. Indem sie an den Faktor X binden, machen sie ihn unzugänglich für den

Konversionprozess (Crozet et al., 2004; Kaneko et al., 1997; Kishida et al., 2004).

Substanzen, welche den Abbau von PrPSc fördern, können ebenfalls für therapeutische Zwecke

eingesetzt werden (Abbildung 6 (6)). Ein Beispiel für so eine Substanz ist der Tyrosin-Kinase-

Inhibitor STI571 (Gleevec®), der zwar nicht die de novo Synthese von PrPSc verhindert, aber

den Abbau von bereits vorhandenem PrPSc verstärkt (Ertmer et al., 2004). Dieser Effekt konnte

EINLEITUNG

21

ebenfalls mit verzweigten Polyaminen beobachtet werden (Supattapone et al., 1999;

Supattapone et al., 2001; Winklhofer und Tatzelt, 2000).

Nachteile vieler der vorgestellten Substanzen sind ihre Toxizität in hohen Dosen und ihre

Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, womit meistens nur eine Hemmung der

Prionreplikation in der Peripherie möglich ist und kein therapeutischer Effekt im Gehirn erzielt

werden kann. Zurzeit werden drei Substanzen in klinischen Studien getestet: das Anti-Malaria-

Mittel Quinacrine (Barret et al., 2003; Korth et al., 2001; Nakajima et al., 2004),

Pentosanpolysulfat (PPS) (Todd et al., 2005; Whittle et al., 2006) und Flupirtine (Otto et al.,

2004). Keines der Medikamente führte bisher zu einer signifikanten Beeinflussung des

Krankheitsverlaufs von CJD-Patienten (Haik et al., 2004; Whittle et al., 2006). Nach der

Behandlung mit Flupirtinen wurde lediglich eine leichte Verbesserung der kognitiven

Fähigkeiten beobachtet (Otto et al., 2004). In einem Einzelfall von vCJD führte die

intraventrikuläre Applikation von PPS zu einer Verlängerung der Inkubationszeit (Parry et al.,

2007). Der Einsatz dieser Medikamente wird zusätzlich durch den Beginn der Behandlung

eingeschränkt, der erst nach der Diagnose erfolgen kann und somit zu einem Zeitpunkt, an dem

bereits neuropathologische Veränderungen vorliegen. Die Entwicklung einer

Krankheitsprophylaxe im Sinne einer Impfung wäre somit wünschenswert.

Zahlreiche Studien demonstrierten bereits die erfolgreiche Hemmung der Prionreplikation durch

Anti-PrP-Antikörper in in vitro Zellsystemen (Beringue et al., 2004; Enari et al., 2001; Feraudet

et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; Peretz et al.,

2001). Da PrPC jedoch ubiquitär exprimiert wird, besitzt der Organismus gegenüber PrPC eine

Autotoleranz (1.2.1) und baut keine Immunantwort auf. Somit führen aktive Immunisierungen

mit rekombinantem murinem PrP oder PrP-Peptiden nur zu schwachen Antikörpertitern und

lediglich zu einer moderaten Verlängerung der Inkubationszeit (Magri et al., 2005; Schwarz et

al., 2003; Sigurdsson et al., 2002). Um dieses Problem zu umgehen, wurde in einem

Mausmodell ein definierter Anti-PrP-Antikörper als Transgen exprimiert. Es wurden hohe Titer

des transgenen Antikörpers nachgewiesen, der eine Erkrankung nach peripherer Infektion mit

Prionen verhinderte (Heppner et al., 2001). Auch passive Immunisierungsversuche wurden

durchgeführt, die nach intraperitonealer Inokulation von wildtypischen Mäusen zu einem

deutlich reduzierten PrPSc-Level in der Milz sowie zu einer signifikanten Verlängerung der

Inkubationszeit führten (White et al., 2003).

Eine andere Möglichkeit zur Überwindung der Toleranz ist der Einsatz von

immunstimulatorischen Komponenten wie z.B. CpGs. CpGs sind unmethylierte Cytosin-

Guanosin-Nukleotid-Motive aus Bakterien, welche die angeborene Immunantwort direkt

aktivieren (Krieg et al., 1995; Lipford et al., 1998). In einer Pilotstudie führte die Applikation von

CpGs zwar zu einer vollständigen Hemmung der Prionreplikation, jedoch wurde dadurch

EINLEITUNG

22

gleichzeitig die Milz-Architektur pathologisch verändert (Heikenwalder et al., 2004; Sethi et al.,

2002).

Die Evaluierung solcher therapeutischen Ansätze sollte gleichzeitig mit der Entwicklung von

präklinischen Diagnose-Tests einhergehen, da bis dato Prionenerkrankungen nur post mortem

eindeutig diagnostiziert werden können. Die Chancen einer erfolgreichen Therapie könnten

durch einen möglichst frühzeitigen Beginn der Behandlung, am besten noch in der präklinischen

Phase, gesteigert werden.

1.2 Immunsystem und Antikörper

1.2.1 Das Immunsystem

Das Immunsystem vermittelt dem Organismus einen Schutz gegenüber Pathogenen wie

Bakterien, Parasiten oder Viren. Hierzu ist die Unterscheidung zwischen körperfremden und

körpereigenen Antigenen notwendig, um nur bei körperfremden Antigenen mit der

entsprechenden Immunantwort zu reagieren und bei körpereigenen Antigenen tolerant zu

reagieren (Toleranz).

Die Immunantwort von Vertebraten ist in zwei Phasen unterteilt: Pathogene werden zunächst

unspezifisch erkannt, wobei kein Schutz gegen eine erneute Infektion mit dem gleichen Erreger

entwickelt wird. Diese sogenannte angeborene Immunantwort besteht sowohl aus einfachen

physikalischen Barrieren als auch aus humoralen Faktoren und verschiedenen Zelltypen.

Hierbei interagieren Zellen wie Makrophagen, Granulozyten, dendritische Zellen (DC) und

natürliche Killerzellen (NK-Zellen) mit zahlreichen humoralen Faktoren wie Komponenten des

Komplementsystems, verschiedenen Chemokinen, Zytokinen oder anderen chemischen

Mediatoren. Erst wenn die unspezifische Immunantwort eine Infektion nicht mehr kontrollieren

kann, beginnt die zweite Phase, in der Makrophagen und DCs als antigenpräsentierende Zellen

(APC) das spezifische oder auch adaptive Immunsystem aktivieren. Es besteht aus zellulären

und humoralen Komponenten, welche hauptsächlich über Lymphozyten wie T-Zellen oder

B-Zellen vermittelt werden. In dieser Phase werden Antigene spezifisch erkannt und ein

immunologisches Gedächtnis aufgebaut, so dass bei erneutem Kontakt die Immunantwort

schneller und effizienter ausfällt. T-Zellen erkennen über ihren T-Zell-Rezeptoren die

zellgebundenen Antigene auf der Oberfläche von APCs und differenzieren entweder in

zytotoxische T-Zellen, die dann in APCs Apoptose induzieren, oder in T-Helferzellen, die

B-Zellen aktivieren können. Nach der Antigen-spezifischen Aktivierung von B-Zellen entstehen

Plasma- und Gedächniszellen. Plasmazellen sezernieren in großen Mengen Antikörper

(Immunglobuline, Ig), welche dann an spezifische Antigene des Pathogens binden und somit

deren Inaktivierung vermitteln können (1.2.2).

EINLEITUNG

23

Eine wichige Voraussetzung für die effektive Erkennung von körperfremden Antigenen durch

ausgereifte T-Zellen besteht darin, dass während der Zellreifung alle T-Zellen entfernt werden

können, deren T-Zell-Rezeptoren körpereigene Antigene binden können. Dazu finden

verschiedene Selektionen statt: Einerseits werden im Thymus, dem Reifungsort der T-Zellen,

alle T-Vorläuferzellen, welche körpereigene Antigene erkennen können, durch Induktion von

Apoptose entfernt. Somit wird gewährleistet, dass nur T-Zellen, die nicht gegen die im Thymus

exprimierten körpereigenen Antigene gerichtet sind, ausreifen und als funktionsfähige T-Zellen

in die Peripherie auswandern (zentrale Toleranz). Andererseits werden aber nicht alle

Selbstantigene im Thymus exprimiert, so dass ein Teil der autoreaktiven T-Zellen in die

Peripherie gelangt. Bei fehlender Kostimulation gehen diese T-Zellen in einen anergen Zustand

über, d.h. sie werden funktionell inaktiviert. Die wiederholte Begegnung einer autoreaktiven

T-Zelle mit peripheren Antigenen führt ebenfalls zu Apoptose. Darüber hinaus halten

regulatorische T-Zellen die periphere Toleranz aufrecht (Referenzen in Janeway et al., 2005).

1.2.2 Struktur und Isotypen von Maus-Immunglobuline n

Antikörper spielen eine wichtige Rolle beim Schutz des Organismus gegen eindringende

Krankheitserreger. Zum einen können sie Pathogene durch ihre Bindung neutralisieren, zum

anderen durch Opsonierung die Antikörper- bzw. Komplement-abhängige zellvermittelte

Zytotoxizität (ADCC bzw. CDCC) vermitteln.

Unabhängig von ihrem Isotypen besitzen alle Immunglobuline eine gemeinsame Struktur. Sie

bestehen aus vier Polypeptidketten, die nach ihrem Molekulargewicht in je zwei identische

leichte (je 25 kDa) und zwei schwere Ketten (je 50-70 kDa) unterschieden werden. Die vier

Ketten sind über mehrere Disulfidbrücken miteinander verbunden und bilden so eine

charakteristische Y-Struktur. Die Gelenkregion, d.h. der Bereich, in dem die beiden schweren

Ketten durch Disulfidbrücken verbunden sind, vermittelt dem Antikörper die notwendige

Flexibilität. Die leichten Ketten bestehen aus jeweils einer variablen und einer konstanten

Domäne (VL und CL), während die schweren Ketten aus einer variablen Domäne (VH) und drei

konstanten Domänen (CH1, CH2, CH3) gebildet werden. Das Antigen-bindende Fragment (Fab-

Fragment), das oberhalb der Gelenkregion liegt, enthält die beiden identischen Antigen-

bindenden Domänen, welche aus den beiden variablen Domänen der leichten und schweren

Ketten gebildet werden. Unterhalb der Gelenkregion befindet sich das FC-Fragment (engl.:

fragment crystallizable) (Abbildung 7A), welches die wichtigen Effektorfunktionen (ADCC,

CDCC) vermittelt.

Die Primärstruktur der konstanten Domäne eines Isotyps ist weitgehend konserviert, während

die variablen Regionen zur Bildung der Antigenbindungsstelle große Sequenzunterschiede

aufweisen müssen. Diese Sequenzvariationen konzentrieren sich auf drei hypervariable

EINLEITUNG

24

A B

L1

L3L2 H3 H1 H2

variable Region derleichtenKette

variable Region derschwerenKette

Antigenbindungs-regionFab

Fc

A B

L1

L3L2 H3 H1 H2

variable Region derleichtenKette

variable Region derschwerenKette

Antigenbindungs-regionFab

Fc

Regionen (CDR), die von weniger variablen Gerüstregionen (FR) umgeben sind. Beim

gefalteten Antikörpermolekül ragen die jeweils drei CDRs der leichten und schweren Kette als

Schleifen aus den β-Faltblättern der restlichen Antikörperstruktur heraus und bilden so die

Antigenbindungsstelle (Abbildung 7B). Durch sie wird die Spezifität des Antikörpers bestimmt.

Abbildung 7: Modell eines IgG-Antikörpers und Struk tur der Antigenbindungsstelle. A) Der IgG-Antikörper besteht aus zwei schweren Ketten (blau) und zwei leichten Ketten (lila), die über Disulfidbrücken (-) miteinander verbunden sind. B) Die Struktur der Immunglobulin-Domänen wird von den β-Faltblatt-Bereichen (grün) der FR-Regionen bestimmt, während die Antigenbindungsstelle aus sechs Schleifen der CDRs (H1-H3, L1-L3) gebildet wird (Bild und Quelle aus Schmiedl und Dübel, 2004).

Es existieren fünf Typen von schweren Ketten (γ, α, µ, δ und ε), welche die Zugehörigkeit zu

einer der Hauptklassen bzw. Isotypen der sezernierten Antikörper definieren (IgG, IgA, IgM, IgD

und IgE). Bei der Maus wird der Isotyp IgG aufgrund von leichten Sequenzunterschieden in vier

weitere Unterklassen (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) unterteilt. Diese Isotypen werden zu

verschiedenen Zeitpunkten der Immunantwort gebildet und vermitteln unterschiedliche

Effektorfunktionen (Tabelle 3).

Die beiden Isotypen der leichten Kette, κ und λ, weisen keine funktionellen Unterschiede auf.

Eine Antikörper-produzierende Zelle exprimiert Antikörper entweder mit κ- oder λ-Leichtketten.

Das Verhältnis von κ- zu λ-Ketten beträgt bei der Maus 20:1 (Janeway et al., 2005).

EINLEITUNG

25

Tabelle 3: Eigenschaften muriner Immunglobuline

IgG IgM IgA IgD IgE

schwere Kette γ µ α δ ε

leichte Kette κ oder λ κ oder λ κ oder λ κ oder λ κ oder λ

Valenz 2 10 2, 4 oder 6 2 2

Struktur

Molekular- gewicht (kDa)

150 900 160-320 180 200

Funktion sekundäre

Immunantwort

primäre

Immunantwort

Schutz von

mukosen

Membranen

unbekannt Schutz

gegen

Parasiten

Innerhalb der B-Zell-Zellentwicklung können verschiedene schwere Ketten exprimiert werden.

Am Ende der Reifung steht die Bildung eines funktionierenden B-Zell-Rezeptors (BCR), der von

einem membrangebundenen Antikörper gebildet wird. Beim Übergang von primärer zu

sekundärer Immunantwort erfolgt ein Isotypenwechsel von IgM- zu IgG-Immunglobulinen mit

gleicher Spezifität („class switch“).

1.2.3 Antikörpervielfalt durch somatische Rekombina tion

Das große Antikörperrepertoire wird durch somatische Rekombination innerhalb einer kleinen

Gruppe von Gensegmenten ermöglicht, welche die V-Domänen kodieren (Immunglobulin-

Rearrangement).

Die V-Domäne der leichten Kette wird von V- und J (engl.: joining)-Gensegmenten kodiert,

während die V-Domäne der schweren Kette zusätzlich ein drittes D (engl.: diversity)-

Gensegment zur Steigerung der kombinatorischen Vielfalt enthält. Bei der somatischen

Rekombination der leichten Kette erfolgt zuerst eine Verknüpfung zwischen einem V- und

einem J-Segment. Bei der schweren Kette wird zunächst ein DJ-Segment generiert, das dann

mit dem V-Segment verknüpft wird. Beide Ketten werden abschließend mit einem C-Segment,

das die konstante Domäne kodiert, kombiniert. Diese Reihenfolge des Rearrangements wird

durch die 12/23-Regel gewährleistet. Die kodierenden Sequenzen der einzelnen Segmente

werden durch direkt angrenzende nicht-kodierende Signalsequenzen markiert (RSS), die aus

einer konservierten Reihenfolge von sieben (Heptamer) oder neun (Nonamer) Nukleotiden

EINLEITUNG

26

L L

V V

D

H1 H135

H1

Cµ

JH4

DH11

DH13

JH1

L L

V

D

H1

H1

Cµ

JH4

L L

VH1 Cµ

JH4

L

Cµ

JH4

AAAAA

L

VH135 Cµ

JH2

DH11

AAAAA

VH135

VH135

JH2

DH11

VH135

JH2

DH11

JH2

DH11

primäre RNA

mRNA

gDNA

umgelagerte DNA

umgelagerte DNA V-J-D-Rekombination

Transkription

RNA-Prozessierung

Translation

J-D-Rekombination

bestehen. Zwischen diesen Regionen liegt eine unkonservierte Region, die immer aus 12 oder

23 Basenpaaren besteht (Spacer). Durch die Bindung der beiden Rekombinasen RAG-1 und

RAG-2 an die RSS werden die Gensegmente so verknüpft, dass ein Gensegment, das von

einem 12-bp-Spacer flankiert wird, nur mit einem Gensegment verknüpft werden kann, das

durch eine RSS mit einem 23-bp-Spacer markiert ist (12/23-Regel) (Abbildung 8).

Abbildung 8: Schematische Darstellung der somatisch en Rekombination am Beispiel der schweren Kette. Die Umlagerung der genomischen DNA findet zunächst auf Keimbahnebene statt. Bei der schweren Kette erfolgt zuerst eine DJ-Verknüpfung und anschließend eine Kombination des DJ-Segments mit dem V-Segment. Anschließend wird die DNA in primäre RNA transkribiert, Introns und überzählige Gensegmente werden durch RNA-Prozessierung entfernt und die mRNA wird in ein Protein translatiert. Da Immunglobuline extrazelluläre Proteine sind, befindet sich vor jedem V-Segment eine kurze Signalsequenz (L), die den Antikörper in den sekretorischen Weg dirigiert (modifiziert nach Janeway et al., 2005). Die Gencluster der einzelnen Ketten, die bei der Maus auf Chromosom 2 (κ), 22 (λ) und 14 (H)

liegen, unterscheiden sich in ihrem Aufbau und in der Anzahl der einzelnen V-, J-, D- und

EINLEITUNG

27

C-Segmente. Während der Lokus der κ-Kette nur ein einzelnes Cκ-Segment beinhaltet,

existieren im Gencluster der λ-Kette vier Cλ-Segmente, von denen jedes mit einem der vier

Jλ-Segmente verbunden ist. Entsprechend der fünf Isotypen und vier Subtypen existieren für die

murine schwere Kette acht CH-Gensegmente. Die Anzahl der V-Segmente reicht von nur zwei

Segmenten bei der κ-Kette über 85 Vλ-Gensegmenten bis zu einer Anzahl von 135 bei der

schweren Kette. Dadurch entstehen bis zu 1,8 x 107 Kombinationsmöglichkeiten. Da aber nicht

jede dieser Kombination zu einem stabilen Antikörpermolekül führt und auch nicht jedes

Gensegment mit der gleichen Häufigkeit kombiniert wird, wird die Quantität des

Antikörperrepertoires zusätzlich durch Nukleotid-Addition sowie somatische Hypermutation

erhöht (Referenzen in Janeway et al., 2005).

1.2.4 Antigen-Antikörper-Interaktionen

Die Erkennung und Bindung eines Antigens durch einen Antikörper muss nicht immer eine

Immunantwort auslösen. Haptene, d.h. Substanzen mit einer relativ kleinen Molekülmasse

(< 4000 Da), binden zwar an Antikörper, führen jedoch nur zu einer immunologischen Reaktion,

wenn sie an größere Carrier-Moleküle (z.B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)) gekoppelt sind.

Dagegen führen als Antigen bezeichnete Substanzen durch die Bindung an einen Antikörper

zur Aktivierung des Immunsystems. Die Antigenität dieser Substanzen wird unter anderem von

ihrer chemischen Struktur und der Molekülgröße beeinflusst. Proteine, die einen hohen Anteil

an aromatischen Aminosäuren (z.B. Tyrosin) besitzen, sind häufig besonders immunogen.

Antikörper binden nur an einen definierten Bereich des Antigens, der als Epitop bezeichnet

wird. Epitope, die aus hintereinander liegenden Aminosäuren bestehen, bezeichnet man als

linear oder kontinuierlich, während ein Konformationsepitop (diskontinuierliches Epitop) durch

die Faltung des Proteins entsteht und unabhängig von der Sequenz der Primärstruktur ist

(Atassi und Smith, 1978).

Antikörper erkennen Antigene über ihren Fab-Molekülteil, dessen Spezifität durch die insgesamt

sechs hypervariablen CDRs bestimmt wird (Abbildung 7B). Innerhalb der CDRs sind bestimmte

Aminosäuren wie Asparagin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin (Kabat et al., 1977; Mian et al.,

1991; Padlan, 1990) besonders häufig. Die Bindung zwischen Antigen und Antikörper ist

reversibel und basiert auf nicht-kovalenten Bindungen wie Wasserstoffbrückenbindungen,

Van-der-Waals-Kräften sowie hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen

den Aminosäuren des Antikörpers und dem Epitop. Die Komplementarität zwischen Epitop und

Antikörper ermöglicht eine räumliche Nähe, so dass diese relativ schwachen Kräfte zu einer

starken Bindung führen können. Dabei wird die Bindungsstärke zwischen einem Antikörper und

einem einzelnen Epitop als Affinität bezeichnet. Niedrig-affine Antikörper binden nur sehr

schwach an das Antigen, und der gebildete Komplex dissoziiert sehr schnell, während hoch-

EINLEITUNG

28

affine Antikörper zu einer lang anhaltenden starken Bindung führen. Ein Maß für die Affinität

eines Antikörpers ist die Dissoziationskonstante (KD-Konstante). Die Affinität reflektiert aber

nicht immer die wirkliche Stärke einer Antigen-Antikörper-Interaktion, da sowohl Antikörper als

auch Antigen multivalent sein können. Die Gesamtstärke aller Bindungen zwischen Antikörper

und Antigen wird als Avidität bezeichnet und ist abhängig von der Affinität des Antikörpers

sowie von der Multivalenz und der geometrischen Struktur von Antikörper und Antigen. Hohe

Avidität kann die niedrige Affinität eines Antikörpers kompensieren und zu einer Stabilisierung

des Antigen-Antikörper-Komplexes führen. Ein Beispiel hierfür ist die Tatsache, dass während

der primären Immunantwort hauptsächlich niedrig-affine, dafür aber hoch-avide IgM-Moleküle

sezerniert werden. Erst nach erneutem Antigenkontakt bei der sekundären Immunantwort

werden überwiegend IgG-Antikörper mit einer hohen Affinität gebildet (1.2.2). Diese

Affinitätsreifung basiert hauptsächlich auf somatischen Hypermutationen innerhalb der CDRs

und klonaler Deletion von weniger affinen Antikörpern.

1.2.5 Produktion von Antikörpern

Bereits 1890 zeigten Emil von Behring und Shibasabo Kitasato, dass das Serum von Tieren,

denen zuvor das Diphterietoxin injiziert wurde, Antitoxine enthält, die beim Menschen zu einer

passiven Immunität führen (Behring und Kitasato, 1890). Dies schuf die Grundlage der

„Serumtherapie“, die auf der Anwendung von polyklonalen Antikörperseren, die aus vielen

Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten und Affinitäten für ein bestimmtes Antigen

bestehen, basierte.

Polyklonale Antikörperseren werden durch die wiederholte Immunisierung von Versuchstieren

(Kaninchen, Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen, Ziege, Schaf, Huhn) mit einem

bestimmten Antigen hergestellt (Hanly et al., 1995). Zur Verstärkung der Antigenität wird

gleichzeitig ein immunstimulatorisches Adjuvans injiziert. Das bekannteste Adjuvans ist das

komplette Freund-Adjuvans (CFA), das aus einer Emulsion aus hitzeinaktiviertem

Mycobacterium tuberculosis und Paraffinöl besteht. Durch seine entzündungsfördernde

Eigenschaft führt es zu starken Nebeneffekten (Abszesse, Granulome, Peritonitis), so dass es

nur bei der ersten Immunisierung verwendet werden kann. Bei den anschließenden Booster-

Injektionen wird inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA) eingesetzt, das auf den Zusatz der

Mykobakterien verzichtet. Alternative Adjuvantien sind Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid

oder bakterielle CpGs. Obwohl polyklonale Antikörperseren relativ schnell produziert werden

können (4 bis 8 Wochen) und erfolgreich für diagnostische und therapeutische Zwecke

eingesetzt werden, sind sie mit einigen Nachteilen behaftet. Zum einen ist die Produktion

abhängig von der Größe und Lebensspanne des verwendeten Tiers und zum anderen

entstehen immer unterschiedliche Antiseren, auch, wenn gleiche Immunisierungsschemata bei

EINLEITUNG

29

genetisch identischen Tieren durchgeführt werden. Zudem kommt es häufig zu

Kreuzreaktivitäten, da die Seren auch nach Aufreinigung durch Affinitätschromatografie noch

mit minimalen Mengen unerwünschter Antikörper verunreinigt sein können.

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Herstellu ng von monoklonalen Antikörpern. Nach der Immunisierung einer Maus werden die B-Zellen aus der Milz isoliert und mit immortalisierten Myelomzellen zu Hybridomzellen fusioniert. Aufgrund eines Stoffwechseldefekts können nur fusionierte Hybridomzellen im HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Medium überleben. Positive Klone, die den gewünschten monoklonalen Antikörper sezernieren, werden dann durch spezielle Selektionsverfahren identifiziert. 1975 führten Georg Köhler und César Milstein die „Hybridom“-Technik ein (Kohler und Milstein,

1975). Diese Methode ermöglichte es, eine B-Zelle aus der Milz einer immunisierten Maus mit

einer Myelomzelle zu fusionieren und dadurch zu immortalisieren (Hybridomzelle). Somit

konnten monoklonale Antikörper mit einer bestimmten Spezifität in beliebigen Mengen

produziert werden (Abbildung 9). Da die Myelomzellen keine eigenen Immunglobulinketten

exprimieren, ist gewährleistet, dass der fusionierte Hybridomklon nur den Antikörper der B-Zelle

EINLEITUNG

30

sezernieren kann. Um den gewünschten Hybridomklon zu selektionieren, erfolgt nach der

Fusion die Kultivierung in einem Selektionsmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und

Thymidin (HAT-Medium) enthält (Littlefield, 1964). Aminopterin hemmt die de novo-Biosynthese

von Nukleotiden. Da B-Zellen über alternative Stoffwechselwege verfügen, die entsprechende

Nukleotide aus Hypoxanthin und Thymidin produzieren können, wachsen fusionierte B-Zellen

weiter. Nicht-fusionierte Myelomzellen, welche diesen Stoffwechselweg nicht besitzen, sterben

ab und die Lebensdauer von nicht-fusionierten B-Zellen ist limitiert. Somit können nur die

entstandenen Hybridomzellen im HAT-Medium weiter kultiviert werden. Durch immunologische

Nachweisverfahren kann dann der Klon ermittelt werden, der den monoklonalen Antikörper mit

der gewünschten Spezifität sezerniert.

1.2.6 Therapeutische Anwendung von monoklonalen Ant ikörpern

Die unbegrenzte Verfügbarkeit von Hybridomzellen zur Produktion von monoklonalen

Antikörpern mit einer gewünschten Spezifität eröffnet ein breites Spektrum neuer

Einsatzmöglichkeiten für Therapie und Diagnostik. Therapeutische Anwendungen von murinen

monoklonalen Antikörpern beim Menschen sind jedoch begrenzt, da sie aufgrund ihrer hohen

Immunogenität zur Bildung von humanen Anti-Maus-Antikörpern (HAMA) führen,

Effektorfunktionen nur ineffizient vermitteln können und eine verkürzte Halbwertszeit im

Vergleich mit humanen Antikörpern besitzen. Mittels gentechnischer Methoden ist es

mittlerweile möglich, diese Nachteile durch die Generierung von chimären oder humanisierten

Antikörpern zu reduzieren. Bei der Chimärisierung eines murinen Antikörpers wird die konstante

Domäne durch die äquivalente humane Antikörperdomäne ersetzt (Boulianne et al., 1984). Bei

humanisierten Antikörpern werden zusätzlich auch die FR-Domänen substituiert (Jones et al.,

1986). Somit wird der murine Anteil bei chimären Antikörpern auf ~25% und bei humanisierten

Antikörpern auf ~5% reduziert (Stern und Herrmann, 2005), was zu einer deutlichen

Herabsetzung der Immunogenität bei gleichzeitiger Erhaltung der Spezifität führt. Doch auch

diese Antikörper lösen eine geringe Immunantwort aus, so dass die Herstellung von vollständig

humanen Antikörpern die beste Lösung bedeuten würde. Eine Strategie verwendete dazu das

Phagen-Display-System (McCafferty et al., 1990; Smith, 1985), in dem Bibliotheken von

humanen cDNAs, die für die variablen Regionen der Antikörper kodieren, exprimiert werden.

Jeder Phage dieser Bibliothek exprimiert auf seiner Oberfläche eine Kombination aus VH und VL

in Form eines single-chain-Fragments (scFv) (Abbildung 10). Nach Isolierung eines

gewünschten Phagenklons können E.coli-Zellen infiziert werden, welche das humane scFv-

Fragment dann sezernieren (McCafferty et al., 1990; Smith, 1985).

Eine andere Strategie beinhaltet die Generierung von transgenen Mäusen, die ausschließlich

Immunglobulin Gen-Cluster vom Menschen in ihrer Keimbahn tragen. Durch die Verwendung

EINLEITUNG

31

CH1

CH2

CH3

IgG F(ab´) 2 Minibody Fab scFv DiabodyVL

VH

CH1

CH2

CH3

IgG F(ab´) 2 Minibody Fab scFv DiabodyVL

VH

von Yeast artificial chromosome (YAC)-Vektoren gelang die Herstellung der XenoMouse®, die

einen Großteil des humanen VLκ- und VHκ-Repertoires trägt. Nach Immunisierung dieser Mäuse

können durch die Fusion mit humanen Myelomzellen monoklonale Antikörper mittels

„Hybridom“-Technik hergestellt werden. Ein Beispiel für die erfolgreiche Nutzung dieser

Strategie ist der IgG2κ-Antikörper Vectibix®, der zur Behandlung des Kolonkarzinoms eingesetzt

werden soll und derzeit in Phase III Studien getestet wird (Green et al., 1994; Yang et al.,

2001).

Je nach therapeutischer Anwendung bietet sich auch die Verwendung von kleineren Antikörper-

fragmenten an (Abbildung 10). Durch eine proteolytische Behandlung von Antikörpern mit der

Thiolprotease Papain oder der Carboxypeptidase Pepsin können entweder zwei Fab-

Fragmente oder ein F(ab`)2-Fragment hergestellt werden. Rekombinante Antikörper-abgeleitete

Moleküle wie z.B. scFvs oder Minibodies welche nur die Antigenbindungsstelle des parentalen

Antikörpers enthalten, können durch die Expression in Bakterien oder eukaryontischen Zellen

generiert werden. Die Größe des Antikörperformats beeinflusst verschiedene Eigenschaften wie

Avidität, Pharmakokinetik, die Fähigkeit zur Gewebepenetration sowie die Ausschleusung durch

die Niere (Clearance). Fab-Fragmente, scFv, Diabodies und Minibodies eignen sich aufgrund

ihrer besseren Clearance und Gewebepenetration z.B. eher für radiodiagnostische Methoden.

Dagegen haben vollständige Antikörpermoleküle eine längere Halbwertszeit

(~ 3 Wochen) und können Effektorfunktionen über das FC-Fragment vermitteln.

Abbildung 10: Darstellung von verschiedenen Antikör performaten. Die abgebildeten Formate besitzen ein Molekulargewicht von 27 bis 150 kDa. Die konstanten Domänen sind in lila dargestellt, die variable Domäne der leichten Kette in orange und der schweren Kette in grün. Diabodies bestehen aus zwei scFv, die über ein kurzes Peptid verbunden sind. Minibodies bestehen ebenfalls aus zwei scFv, werden aber über die Gelenkregion und die CH3-Domäne verbunden (Fab = Fragment antigen binding, scFv = single chain fragment variable) (Bild und Quelle aus Carter, 2006).

EINLEITUNG

32

In Deutschland sind zurzeit sechzehn gentechnisch hergestellte Antikörper zur Behandlung

verschiedener humaner Krankheiten zugelassen (Tabelle 4).

Tabelle 4: Klinisch zugelassene Antikörper in Deuts chland Name Zielstruktur Typ Indikation Zulassung

Avastin ® vaskulärer endothelialer

Wachstumsfaktor

humanisiert,

IgG1

Krebs 01/2005

Erbitux® epidermaler Wachstums-

faktor-Rezeptor

chimär, IgG1 Darmkrebs 06/2004

Herceptin humaner epidermaler

Wachstumsfaktor-

Rezeptor 2

humanisiert,

IgG1

Brustkrebs 08/2000

Lucentis® vaskulärer endothelialer

Wachstumsfaktor

humanisiert,

Fab

altersbedingte

Makuladegeneration

01/2007

MabCampath® CD52-Antigen humanisiert,

IgG1

Leukämie 07/2001

Mabthera® CD20-Antigen chimär, IgG1 Non-Hodgkin´s-

Lymphom

06/1996

Orencia® CD80-Antigen human, IgG1 Rheumatoide Arthritis 05/2007

Raptiva® CD11a-Antigen humanisiert,

IgG1

Schuppenflechte 09/2004

ReoPro® GPIIb/IIIa chimär, Fab Antithrombotikum 05/1995

Simulect® CD25-Antigen chimär, IgG1 Immunsuppressivum 10/1998

Synagis® humanes Respiratori-

sches Synzytial-Virus

humanisiert,

IgG1

Atemwegsinfektionen 08/1999

Trudexa® Tumor-Nekrosefaktor human, IgG1 Rheumatoide Arthritis 09/2003

Tysabri® CD49d-Antigen

(α4-Integrin)

humanisiert,

IgG4

Multiple Sklerose 06/2006

Xolair® IgE (FC-Teil) humanisiert,

IgG1

Asthma 10/2005

Zenapax® CD25-Antigen humanisiert,

IgG1

Immunsuppressivum 02/1999

Zevalin® CD20-Antigen murin, IgG1,

radiomarkiert

Non-Hodgkin´s-

Lymphom

01/2004

Stand: Juni 2007, Quelle: Paul-Ehrlich-Institut, Bundesamt für Sera und Impfstoffe

EINLEITUNG

33

Einer der zugelassenen Antikörper ist Natalizumab (Tysabri®), der bei der Behandlung der

neurodegenerativen Krankheit Multiple Sklerose eingesetzt wird. Indem der Antikörper durch

die Bindung an α4-Integrin auf aktivierten T-Zellen und Monozyten den Eintritt dieser Zellen über

VCAM-1 (engl.: vascular cell adhesion molecul-1) ins Gehirn verhindert, kann die

inflammatorische Symptomatik reduziert werden (Polman et al., 2006). Auch wenn im Vorfeld

potentielle Risiken der monoklonalen Antikörper im Tiermodell evaluiert und minimiert werden,

können unerwartete Nebenwirkungen bei der Übertragung auf den Menschen nicht vollständig

ausgeschlossen werden, wie die kürzlich durchgeführte Phase I Studie mit dem Anti-CD28-

Antikörper TGN1412 zeigte. Dieser Antikörper, der als Immunsuppressivum bei

Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden sollte, führte bei den sechs Probanden der Studie zu

multiplem Organversagen (Suntharalingam et al., 2006; Weerasekera und Hudson, 2007).

Bei der Alzheimerschen Erkrankung (AD), die wie Prionenerkrankungen durch die Akkumulation

eines falsch gefalteten Proteins ausgelöst wird, werden ebenfalls monoklonale Antikörper für

therapeutische Zwecke eingesetzt. Diese Krankheit zeichnet sich durch Ablagerungen eines

amyloiden Peptids (Aβ40/42) aus, das durch die proteolytische Spaltung von einer β- und

γ-Sekretase aus dem endogenen Amyloid-Precursor-Protein (APP) entsteht. Passive

Immunisierungen mit Antikörpern gegen das Amyloid-β-Peptid führten in einem transgenen AD-

Mausmodell zu einer deutlichen Reduktion der Aβ-Plaques im Gehirn (Bard et al., 2000;

DeMattos et al., 2001; Lee et al., 2006; McLaurin et al., 2002). Man nimmt an, dass die

Antikörper entweder direkt an das Aβ-Peptid binden und so zur Auflösung der Plaques führen,

welche über eine FCR-vermittelte Phagozytose durch Mikrogliazellen möglich wäre, oder, dass

die monoklonalen Antikörper im Blut eine Reduktion des freien Aβ-Gehalts bewirken und so

einen Rückfluss von Aβ aus dem Gehirn ins Plasma induzieren („peripheral sink hypothesis“)

(DeMattos et al., 2001; Schenk et al., 1999). Zurzeit wird die passive Immunisierung mit einem

humanisiertem Anti-Aβ-Antikörper (AAB-001) in einer Phase II Studie untersucht. Auch aktive

Immunisierungen mit einem fibrillärem Aβ1-42-Peptid (AN1792) wurden bereits in einer Phase II

Studie durchgeführt. Da jedoch 6% der Probanden eine Meningoenzephalitis entwickelten,

musste die Studie vorzeitig abgebrochen werden. Trotzdem konnten bei einem Teil der

Patienten verbesserte kognitive Leistungen beobachtet werden, und post mortem Sektionen

zeigten eine deutlich reduzierte Ablagerung von amyloiden Plaques im Gehirn (Gilman et al.,

2005; Hock et al., 2003; Masliah et al., 2005). Mittlerweile nimmt man an, dass die

Meningoenzephalitis durch ein bisher unbekanntes T-Zell-Epitop innerhalb des Aβ-Peptids

verursacht wurde und eine Immunisierung mit ausgewählten B-Zell-Epitopen des Aβ-Peptids die

Nebenwirkungen minimieren könnte (Monsonego und Weiner, 2003; Monsonego et al., 2003).

Der erfolgreiche Einsatz von monoklonalen Antikörpern bei der Behandlung der

Alzheimerschen Erkrankung führte zu der Annahme, dass humanisierte Antikörper gegen das

Prion-Protein bei humanen Prionenerkrankungen zu ähnlichen Erfolgen führen können.

EINLEITUNG

34

1.3 Ziel der Arbeit

Prionenerkrankungen wie die Creutzfeldt-Jakob Krankheit beim Menschen oder die Bovine

Spongiforme Enzephalopathie beim Rind sind letal verlaufende, neurodegenerative

Erkrankungen. Der Erreger dieser Krankheiten ist das infektiöse Prion-Protein PrPSc, bei dem

es sich um ein pathogenes Konformationsisomer des zellulären Prion-Proteins PrPC handelt

und welches PrPC seine Konformation aufzwingen kann.

Zurzeit existieren keine Medikamente, welche den Krankheitsverlauf beim Menschen signifikant

beeinflussen können (Prusiner, 1998). Bei einer anderen neurodegenerativen Erkrankung, der

Alzheimerschen Krankheit, wurden im Tiermodell gute Erfolge mit aktiven und passiven

Immunisierungsstrategien erzielt (Janus et al., 2000; Schenk et al., 1999; Sigurdsson et al.,

2001). Der Erfolg von aktiven Immunisierungsstrategien bei Prionenerkrankungen wird jedoch

durch die körpereigene Toleranz gegenüber dem Prion-Protein erschwert. Nach passiver

Immunisierung von wildtypischen Mäusen wurden hingegen signifikante Erfolge beobachtet

(White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Herstellung von neuen Anti-

PrP-Antikörpern mittels „Hybridom“-Technik, welche für diagnostische und therapeutische

Zwecke genutzt werden können. Insgesamt sollten folgende Fragestellungen untersucht

werden:

• Wie unterscheiden sich die Anti-PrP-Antikörper bezüglich des

Epitops, der Avidität und Affinität?

• Hemmen die Anti-PrP-Antikörper die PrPSc-Akkumulation in Prion-

infizierten Zellen und wenn ja, ist dieser Effekt dosis- und

zeitabhängig?

• Beeinflussen die Anti-PrP-Antikörper auch die Infektiosität von Prion-

infizierten Zellen?

• Welchen Wirkungsmechanismus nutzen die Anti-PrP-Antikörper, um

die PrPSc-Akkumulation in vitro zu inhibieren?

MATERIAL UND METHODEN

35

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Autoklav Münchner Medizin GmbH

Bakterienkulturschüttler Braun AG (Certomat)

Bio-Imager Fuji GmbH (FLA 3000-2R, Image Reader V1.8E),

Digitale Kamera Diagnostic Instruments, Inc.

Eismaschine Scotsman

Elektrophoresekammern Hauswerkstatt

ELISA-Reader Molecular Devices, Inc. (Vmax® kinetic)

FACS Becton Dickinson GmbH (FACS Calibur)

Fein- und Laborwaage Sartorius AG

Fluoreszenzmikroskop Leica GmbH

Gefrierschränke Bosch GmbH

Großzentrifuge Sorvall GmbH(SLC-6000, SLC-3000, SLC-1500)

Heizblock Eppendorf AG

Image Reader Fuji GmbH (LAS-3000 Version 2.0)

Inkubatoren Heraeus GmbH

Kapillarsequenzierer Perkin Elmer, Inc. (ABI Prism 310)

PE Applied Biosystems GmbH (ABI Prism 3100)

Kühlschränke Bosch GmbH

Küvetten Eppendorf AG

Magnetrührer Ika® Werke GmbH (Ikamag®RH)

Mikrowellenherd Severin GmbH

PC Mac OS X; Windows XP

pH-Meter Denver Instrument GmbH

Pipetten Gilson, Inc., Eppendorf AG

Pipettierhilfe Gilson, Inc.

Sonifier (Ultraschall) Branson, Inc.

Spektralphotometer Pharmacia Corp. (Ultrospec III)

Sterilbank Nuaire, Inc.

Thermocycler Eppendorf AG

Tisch-Wippe Heidolph GmbH & Co. KG

Tischzentrifuge Eppendorf AG

UV-Handlampe Vilber Lourmat, Inc.


36

UV-Leuchttisch/Videodrucker MWG AG, Mitsubishi Corp.

Vortexer Heidolph GmbH & Co. KG

Wasserbäder GFL GmbH

Zellkulturzentrifuge Hettich GmbH & Co. KG

Zentrifugen Kendro Corp.

2.1.2 Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien wurden bei den Firmen AppliChem GmbH, USB Europe GmbH,

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Serva GmbH, Carl Roth GmbH & Co. KG und Merck Chemicals

Ltd. bestellt. Verbrauchsmaterialien wie Reaktionsgefäße, Handschuhe oder Pipettenspitzen

wurden bei der Firma Hartenstein Laborbedarf GmbH erworben. Materialien für die Zellkultur

stammten von der Firma Nunc GmbH & Co. KG.

2.1.3 Zelllinien

HEK 293T humane embryonale Nierenzelllinie,

immortalisiert mit dem Ad5-E1A/B-Protein

und dem SV-40-T-Antigen

(Graham et al., 1977)

N2a murine Neuroblastoma-Zelllinie (Olmsted et al., 1970)

ScN2a Scrapie-infizierte N2a-Zelllinie (Butler et al., 1988)

cuScN2a ScN2a-Zellen, die nach Behandlung mit

Pentosanpolysulfat (Caughey und Raymond,

1993) kein PrPSc tragen

J. Springer (AG Klein)

SP2/0-AG14 Hybrid aus Milz- und Myelomzellen der Maus (Shulman et al., 1978)

2.1.4 Lösungen zur Analyse und Klonierung von DNA

50x TAE Tris pH 8,0

Konz. Essigsäure

EDTA-Na2 pH 8,0

2 M

5,7% (v/v)

0,05 M

6x DNA-Probenpuffer Bromphenolblau

Xylencyanol

Glycerin

0,25% (w/v)

0,25% (w/v)

30%

3 M Natriumacetat, pH 5,2 Natriumacetat

pH mit konz. Essigsäure einstellen

3 M


37

Plasmidpräparation

Qiagen-Puffer P1

(Resuspensionspuffer)

Tris-HCl pH 8,0

EDTA

RNase A

0,05 M

0,01 M

100 µg/ml

Plasmidpräparation

Qiagen-Puffer P2

(Lyse-Puffer)

NaOH

SDS

0,2 M

1% (w/v)

Plasmidpräparation

Qiagen-Puffer P3

(Neutralisationspuffer)

Kaliumacetat pH 5,5 3 M

Plasmidpräparation

Qiagen-Puffer QBT

(Äquilibrierungspuffer)

NaCl

MOPS pH 7,0

Isopropanol

Triton X 100

0,75 M

0,05 M

15% (v/v)

0,15% (v/v)

Plasmidpräparation

Qiagen-Puffer QC

(Waschpuffer)

NaCl

MOPS pH 7,0

Isopropanol

1 M

0,05 M

15% (v/v)

Plasmidpräparation

Qiagen-Puffer QF

(Elutionspuffer)

NaCl

Tris-HCl pH 8,5

Isopropanol

1,25 M

0,05 M

15% (v/v)

1 M KOH KOH 1 M

1 M Tris-HCl pH 7,5 Tris

pH mit konzentrierter HCl einstellen

1 M

2.1.5 Standardlösungen

PBS NaCl

KCl

Na2HPO4

KH2PO2

CaCl2

MgCl2

0,137 M

0,0027 M

0,0043 M

0,0014 M

0,0015 M

0,001 M

PBS- NaCl

KCl

Na2HPO4

KH2PO2

0,137 M

0,0027 M

0,0043 M

0,0014 M


38

2.1.6 Antikörper und Farbstoffe

Antikörper Spezies Isotyp Konjugat Hersteller

N-CAM (CD 56) Maus IgG2a / BD GmbH

Mouse IgG1, к Maus Ascites / Sigma GmbH

Mouse IgG2a, к Maus Ascites / Sigma GmbH

α-mouse-IgG (H+L) Kaninchen / ALEXA

Fluor® 488

Molecular Probes, Inc.

α-mouse-IgG1 Kaninchen / HRP Zymed GmbH

α-mouse-IgG2a Kaninchen / HRP Zymed GmbH

α-mouse-Ig Ziege pAk HRP Dako GmbH

α-rabbit-IgG (H+L) Ziege / HRP Zymed GmbH

α-mouse-IgG (H+L) Ziege / FITC Dianova GmbH

α-mouse-IgM Ziege / HRP Zymed GmbH

α-PrP (SA2124) Kaninchen pAk / AG Klein

α-PrP (ICSM18) Maus IgG1 / D-Gen Ltd.

α-PrP (ICSM35) Maus IgG2b / D-Gen Ltd.

α-PrP (6H4) Maus IgG1 / Prionics AG

Farbstoff Konjugat Hersteller

Cholera Toxin Subunit B ALEXA Fluor® 549 Molecular Probes, Inc.

2.1.7 Scrapie-Prionenstamm

Für die Inokulationsstudien wurde der RML (Rocky Mountain Laboratories)-Prionenstamm

eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein Maus-adaptiertes Scrapie-Isolat (Chandler, 1961),

das in CD-1 Mäusen passagiert wurde. Das isolierte Gehirn wurde gewogen und in neun

Volumen 0,32 M Sucrose aufgenommen. Um das Zellmaterial zu homogenisieren, wurde es

durch unterschiedlich große Kanülen (G18-G21) gezogen. Nach Zentrifugation (2000 rpm,

20 min) erfolgte die Aufbewahrung des Überstandes als 10%iges-Homogenat bei -20°C.

2.1.8 Plasmide

Plasmid Herkunft

pBluescript II SK(+) Stratagene GmbH

pAd-CMV-PrP ∆32-93 E.Flechsig

pAd-CMV-PrP ∆32-106 E.Flechsig


39

pAd-CMV-PrP ∆32-93 & ∆141-176 E.Flechsig

Während dieser Arbeit hergestellte Konstrukte:

pAd-CMV-PrP ∆32-93 & ∆142-157

pAd-CMV-PrP ∆32-93 & ∆158-171

pAd-CMV-PrP ∆32-93 & Y148A

pAd-CMV-PrP ∆32-93 & E151A

pAd-CMV-PrP ∆32-93 & H176A

2.1.9 Primer

Primer Sequenz (5´ →→→→ 3´)

Klonierung

BS_MCS-NotI for GTG GCG GCC GCT CTA GAA CTA GTG G

SAP_PrP_MfeI rev TAG CCT ATG GGG GAC ACA GAG AAG C

PrP ∆157for TGT ACC GCT CTT CTA ACC AAG TGT ACT ACA GGC CAG TGG

PrP ∆142rev CGG TCC GCT CTT CCG TTG CCA AAA TTG ATC ATG GGC CTG C

PrP ∆171for AGT ACA GCT CTT CGA ACA ACT TCG TGC ACG ACT GC

PrP ∆158rev CTG TAG GCT CTT CGG TTA GGG TAG CGG TAC ATG TTT TCA CG

Ortsgerichtete Mutagenese

E151A for CCG CTA CTA CCG TGC CAA CAT GTA CCG CTA CC

E151A rev GGT AGC GGT AGA TGT TGG CAC GGT AGT AGC GG

Y148A for GGA GGA CCG CGC CTA CCG TGC TAA CAT GTA CC

Y148A rev GGT ACA TGT TAG CAC GGT AGG CGC GGT CCT CC

M153A for GCC TAC CGT GCT AAC GCC TAC CGC TAC CCT AAC C

M153A rev GGT TAG GGT AGC GGT AGG CGT TAG CAC GGT AGG C

H176A for CAG AAC AAC TTC GTG GCC GAC TGC GTC AAT ATC ACC

H176A rev GGT GAT ATT CAC GCA GTC GGC GAC GAA GTT GTT CTG

Screening und Sequenzierung

M13 for GGA AAC AGC TAT GAC CAT G

M13 rev GTA AAA CGA CGG CCA GT

Sig1 for TAT GTG GAC TGA TGT CGG CC

3-NC rev CCC TCC CCC AGC CTA GAC CAC GA

Mut217 rev CCT GGG ACT CCT TCT GGT ACC GGG TGA CGC


40

2.1.10 Proteine

rekombinantes Maus-PrP (23-231) Thorsten Lührs (Zahn et al., 1997)

rekombinantes Maus-PrP (23-231), fibrillär Thorsten Lührs (Luhrs et al., 2006)

2.1.11 Versuchstiere

Tiere Bezeichnung Quelle

C57BL/6 Prnp+/+ (Wildtyp PrPC) Jackson Laboratories

Prnp0/0 Knockout des Prnp Gens (kein PrPC) (Bueler et al., 1992)

Tga20 Prnp0/0 mit PrPC-Transgen (Fischer et al., 1996)

2.2 Methoden

2.2.1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern

2.2.1.1 Immunisierung und Isolierung von Milzzellen


rekombinantes Maus-PrP (23-231),

fibrillär

Thorsten Lührs (Luhrs et al., 2006)

CpG 1668 MWG AG

komplettes Freund-Adjuvans Sigma GmbH

inkomplettes Freund-Adjuvans Sigma GmbH

serumfreies Medium RPMI 1640mit Glutamin(Gibco Ltd.)

100x Pyruvat (Sigma GmbH) 1% (v/v)

100x Aminosäuren (Sigma GmbH) 1% (v/v)

NH4Cl/HEPES 0,83% (w/v)

Im Abstand von vier Wochen wurden die Prnp0/0-Mäuse immunisiert. Jeweils eine Woche nach

der Immunisierung wurden die Antikörpertiter der einzelnen Tiere mittels ELISA (2.2.4.1)

bestimmt. Als Negativkontrolle wurde das Serum einer nicht-immunisierten Prnp0/0-Maus

verwendet. Die Immunisierung für die erste Fusion erfolgte mit rekombinantem Maus-PrP,

während für die zweite Fusion eine fibrilläre Form des rekombinanten Maus-PrP (Luhrs et al.,

2006) verwendet wurde. Für beide Fusionen wurden jeweils 50 µg PrP in einem

Volumenverhältnis von 1:1 mit komplettem Freund-Adjuvans gemischt und intraperitoneal

injiziert. Für die anschließenden Booster-Injektionen wurde jeweils die gleiche Proteinmenge im

gleichen Verhältnis mit inkomplettem Freund-Adjuvans gemischt und ebenfalls intraperitoneal

appliziert. Die erste bzw. zweite Fusion erfolgte nach der vierten bzw. dritten Boosterung. Für

die dritte Fusion erfolgte eine subkutane Immunisierung mit 10 µg rekombinantem Maus-PrP im


41

Gemisch mit 10 µg CpG 1668 als Adjuvans. Nach zweimaliger Booster-Injektion mit gleichen

Antigenmengen und gleicher Applikationsroute erfolgte die dritte Fusion.

Drei Tage nach der letzen Immunisierung wurde die Maus getötet und die entnommene Milz für

die Fusion verwendet. Hierzu wurde die Bauchseite mit 70% Ethanol desinfiziert und das Fell

entfernt. Nach Öffnung der Bauchdecke wurde die Milz vorsichtig mit einer Pinzette angehoben

und mit einer Schere vom Bindegewebe abgeschnitten. Abschließend wurde die Milz in eine mit

10 ml vorgewärmtem und serumfreiem Medium befüllte Petrischale überführt.

Zur Herstellung einer Einzelzellsuspension wurde die Milz in kleine Stücke geschnitten und

durch ein steriles Zellsieb gedrückt bis die Milzzellen einzeln im Medium vorlagen. Nach

mehrmaligem Spülen des Zellsiebs wurden alle Fraktionen gesammelt, in ein

Zentrifugenröhrchen überführt und ca. zwei Minuten stehen gelassen, damit sich gröbere

Partikel absetzen konnten. Der Überstand wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen transferiert

und die enthaltenen Zellen dreimal in serumfreiem Medium gewaschen (6 min, 1100 rpm, 4°C).

Zur Bestimmung der Zellzahl (2.2.2.2) wurde die Suspension zuvor mit 0,83% NH4Cl (1:10)

verdünnt, um die Erythrozyten zu lysieren. Die so präparierten Milzzellen wurden für die Fusion

eingesetzt.

2.2.1.2 Kultivierung und Vorbereitung von Myelomzel len

RPMI 1640 + Glutamax FCS (PAA GmbH)

Pyruvat (Gibco Ltd.)

50x 8-Azaguanin (Sigma GmbH)

10% (v/v)

1% (v/v)

2% (w/v)

Für alle Fusionen wurde die murine Myelomzelllinie SP2/0 verwendet (Shulman et al., 1978).

Dieser Myelomzelllinie fehlt das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase

(HGPRT) für die alternative Biosynthese von Nukleotiden, wodurch die Zellen nur nach einer

Fusion in Gegenwart von Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin im Medium (HAT-Medium)

überleben können. Sie sezerniert keine Immunglobulinketten. Die Kultivierung der SP2/0-Zellen

erfolgte in 500 ml Zellkulturflaschen unter Standardbedingungen bei 37°C in Gegenwart von

5% CO2. Um eine genetische Reversion des Selektionsmarkers zu verhindern, wurden die

Myelomzellen etwa vier Wochen vor der geplanten Fusion für acht Tage in 8-Azaguanin

kultiviert, so dass alle Zellen mit einer intakten alternativen Biosynthese für Nukleotide eliminiert

wurden. Einen Tag vor der Fusion wurden die SP2/0-Zellen in neue Kulturflaschen überführt

und die Zellzahl auf 5 x 105 Zellen pro ml eingestellt.


42

2.2.1.3 Fusion der Milzzellen mit Myelomzellen

PEG 1500 50% in Hepes Roche Diagnostics GmbH

Hybridoma Fusion und Cloning

Supplement (HFCS)

Roche Diagnostics GmbH

Medium A RPMI 1640mit Glutamin (Gibco Ltd. )

100x Pyruvat (Sigma GmbH)

100x Aminosäuren (Sigma GmbH)

1% (v/v)

1% (v/v)

Medium B Medium A

FCS (PAA GmbH)

10% (v/v)

HAT-Medium Medium B

50x HAT (Sigma GmbH)

2% (v/v)

HT-Medium Medium B

50x HT (Sigma GmbH)

2% (v/v)

Für die Fusion wurden Milz- und Myelomzellen in einem 3:1-Verhältnis kombiniert. Nach

Zentrifugation (6 min, 1100 rpm, 4°C) und Entfernun g des Mediums wurde über einen Zeitraum

von einer Minute 1 ml vorgewärmtes PEG 1500 mit leicht rotierender Pipette auf das Zellpellet

getropft. Das Zellgemisch wurde dann für 90 s sanft im Wasserbad (37°C) geschwenkt. Um die

Fusion zu stoppen wurde zuerst 1 ml Medium A (1 min), dann 2 ml Medium A (1 min), dann

4 ml Medium A (2 min) und abschließend 8 ml Medium A (2 min) mit leicht rotierender

Handbewegung zum Pellet dazu gegeben. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt (6 min,

1100 rpm) wurde die Zellzahl der fusionierten Zellen mit HAT-Medium auf 2 x 106/ml eingestellt

und pro 24-Loch-Platte jeweils 0,5 ml der Zellsuspension ausplattiert. Pro Loch wurden zuvor

0,5 ml HAT-Medium vorgelegt. Sobald das Medium eine gelbliche Verfärbung aufwies, wurde

es durch neues HAT-Medium ersetzt, und das entfernte Medium wurde für das Screening nach

Antikörper-produzierenden Klonen eingesetzt (2.2.1.4). Nach 14 Tagen wurde auf HT-Medium

umgestellt, und nach weiteren sieben Tagen wurden die Hybridomzellen in einem Standard-

Medium kultiviert (2.2.2.1).

Während bei der ersten und dritten Fusion fötales Kälberserum als Mediumszusatz verwendet

wurde, wurde für die zweite Fusion HFCS eingesetzt.

2.2.1.4 Screening der Hybridomzellen

Für das Screening von Klonen, die spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein sezernieren,

wurde das Medium nach mehreren Tagen Kultur verwendet (2.2.1.3). Das Screening erfolgte

mittels ELISA für die Bindung an rekombinantes Maus-PrP (2.2.4.1), durch FACS-Analyse für

die Bindung an PrPC auf der Oberfläche von N2A-Zellen (2.2.4.4) und durch Western Blot-


43

Analyse für die Erkennung von PrPC und PrPSc in Gehirnhomogenaten der Maus (2.2.3). Nur

Hybridomzellen, die in allen drei Methoden ein positives Signal lieferten, wurden für

Zellklonierungen weiter verwendet.

2.2.1.5 Klonierung der Hybridomzelllinien und Nomen klatur der Klone

Interleukin-6 Sigma GmbH

Nach dem Screening lagen die Antikörper-produzierenden Hybridome in einem polyklonalen

Zustand vor. Die Klonierung dieser Hybridomzellen sollte schnell erfolgen, da die Gefahr

besteht, dass der produzierende Klon von anderen Zellen überwachsen wird. Dazu wurden die

Hybridomzellen so verdünnt, dass sich nach der Aussaat maximal eine, zwei oder fünf Zellen

pro Loch befanden (Coller und Coller, 1983). Von jeder Zellkonzentration wurde eine 96-Loch-

Platte angelegt. Um die Wachstumsbedingungen zu verbessern, wurden zusätzlich 5 x 105

Prnp0/0-Milzzellen pro Loch ausgesät, die zuvor 20 min mit 35 Gy bestrahlt wurden. Die

mikroskopische Kontrolle der Monoklonalität fand nach einer Woche statt. Die

Zellkulturüberstände von vereinzelten Klonen wurden einem zweiten Screening unterzogen, um

zu gewährleisten, dass auch der Antikörper-produzierende Klon weiter kultiviert wurde (2.2.1.4).

Die Zellklonierung musste ein- bis zweimal wiederholt werden. Über die Häufigkeit dieser

Subklonierungen gibt die Nomenklatur der Antikörper Auskunft. Beispielsweise wurde der Klon

„7-12-5“ zweimal subkloniert, wobei sich der selektierte Klon direkt nach der Fusion in Loch Nr.

7 befand und nach der ersten bzw. der zweiten Subklonierung in Loch Nr. 12 bzw. Loch Nr. 5.

Die positiven Klone wurden schrittweise in 24-Loch-Platten, 6-Loch-Platten und abschließend in

Zellkulturflaschen umgesetzt. Klone, die schlecht wuchsen, wurden zusätzlich mit Interleukin-6

behandelt (0,05 ng/ml Medium).

2.2.1.6 Produktion der monoklonalen Antikörper

Integra CELLine CL350/ CL 1000 INTEGRA Biosciences AG, Schweitz

Hybridomed DIF 1000 Biochrom AG

Zur Produktion von großen Mengen monoklonaler Antikörper wurden Zwei-Kompartiment-

Bioreaktoren eingesetzt. Diese Bioreaktoren zeichnen sich durch die Trennung in ein

Versorgungs- und ein Kultivierungskompartiment aus. Separiert werden die beiden

Kompartimente durch eine 10 kDa semipermeable Zellulose-Acetat Membran, welche den

Nährstoffaustausch garantiert, jedoch die Hybridomzellen sowie die sezernierten Antikörper im

Kultivierungskompartiment zurückhält. Dadurch entsteht in diesem Kompartiment eine hohe

Anreicherung von Hybridomzellen und Antikörpern.


44

Die Bioreaktoren wurden mit Zellsuspensionen der entsprechenden Hybridomzelllinie beimpft.

Die optimale Zellkonzentration wurde mit 8 x 106 Zellen/8 ml für den CL350-Bioreaktor und mit

25 x 106 Zellen/15 ml für den CL1000-Bioreaktor vom Hersteller angegeben. Das

Versorgungskompartiment wurde entsprechend der Größe des verwendeten Bioreaktors mit

350 bzw. 1000 ml Hybridomed-Medium befüllt. Dieses serumfreie Medium wurde für die

Hybridomkultivierung entwickelt, um eine Kontamination mit Immunglobulinen des Serums

auszuschließen. Die Wachstumsraten der Zellen unter diesen Bedingungen waren vergleichbar

mit denen in serumhaltigem Medium. Nach sieben Tagen wurde das Medium entfernt und die

Zellen im Kultivierungsraum geerntet. Die Hybridomzellen und der mit Antikörpern

angereicherte Überstand wurden durch Zentrifugation (1400 rpm, 10 min) separiert. Nach der

Zählung der Zellen (2.2.2.2) wurden die Reaktoren erneut mit 8 bzw. 25 x 106 Zellen beimpft.

Danach wurden die Zellen im 4-Tagesrhythmus weiter kultiviert.

2.2.1.7 Aufreinigung der monoklonalen Antikörper mi ttels Protein G

HiTrap TM Protein G HP, 1ml Amersham Biosciences GmbH

Peristaltische Pumpe P1 Pharmacia Corp., Schweden

Slide-A-Lyzer® Dialysis Cassette Perbio Science Ltd., USA

Steril-Filter (0,22 µm, 4 mm) Millipore GmbH

Dialysepuffer PBS

Bindungspuffer Natriumphosphat-Puffer, pH 7 0,02 M

Elutionspuffer Glycin, pH 2,5 0,1 M

Neutralisationspuffer Tris, pH 9 1 M

Ethanol 20% (v/v)

Die Antikörper aus den Zellkulturüberständen der Bioreaktoren wurden über eine Protein-G-

Säule aufgereinigt. Protein-G ist ein Protein aus der bakteriellen Zellwand von Streptococcus

sp., das eine hohe Affinität zur FC-Region von Immunglobuline besitzt. Der Überstand wurde

dazu mit Bindungspuffer verdünnt (1:3). Die Laufgeschwindigkeit, mit welcher der Überstand

über die Säule lief, wurde auf einen Milliliter pro Minute eingestellt. Nach Ende des Durchlaufs

wurden weitere 20 ml Bindungspuffer über die Säule gepumpt, um die restlichen Komponenten

des Mediums zu entfernen, die bei der photometrischen Bestimmung des Proteingehalts stören

könnten. Danach wurde Elutionspuffer über die Säule gepumpt und in jeweils 0,5 ml Fraktionen

aufgefangen. Durch die sofortige Zugabe von 23 µl Neutralisationspuffer wurde der pH-Wert der

Eluate wieder auf pH 7 eingestellt. Der Antikörper befand sich in den Fraktionen fünf bis acht

von insgesamt zehn gesammelten Fraktionen. Die Säule wurde durch 20 ml Bindungspuffer

regeneriert und abschließend in 20 % Ethanol bei 4°C aufbewahrt. Pro Antikörper wurde jeweils


45

eine Protein-G-Säule verwendet, um Kontaminationen der Antkörper untereinander zu

vermeiden.

Die Antikörper-enthaltenden Eluate wurden in Dialyse-Kassetten überführt und in einem

1 l Becherglas dialysiert. Der Wechsel des Dialysepuffers, von dem das 300fache Volumen der

Probe eingesetzt wurde, erfolgte jeweils zweimal nach zwei Stunden bei RT und ein drittes Mal

für einen letzten Dialyseschritt, der über Nacht bei 4°C stattfand. Der aufgereinigte Antikörper

wurde abschließend steril filtriert, und die Konzentration wurde photometrisch nach folgender

Formel bestimmt:

Protein 1,35 OD280nm = 1 mg IgG/ml

Die Aufbewahrung erfolgte bei 4°C.

2.2.1.8 Bestimmung der Antikörperklasse und der Iso typen

Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit Serotec GmbH

Clonotyping TM System/HRP Southern Biotech. Associates, USA

Die Identifizierung der Klasse und des Isotyps der monoklonalen Antikörper erfolgte mit Hilfe

des Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kits. Dafür wurde Antikörper-angereichertes

Medium 1:100 mit PBS verdünnt. Von dieser Verdünnung wurden 0,15 ml in das

Entwicklerröhrchen pipettiert und für 30 s inkubiert. Anschließend wurde der Inhalt des

Röhrchens durchmischt, um die mit Antikörper beschichteten farbigen Latexkugeln zu

suspendieren. In diese Suspension wurde der Entwicklerstreifen eingetaucht und das Ergebnis

nach 5 min abgelesen. Mit dem ClonotypingTM System/HRP wurden die Isotypen der

aufgereinigten Antikörper bestätigt. Die HRP-gekoppelten Antikörper aus diesem Kit wurden als

sekundäre Antikörper (1:5000) für einen ELISA gegen rekombinantes Maus-PrP eingesetzt

(2.2.4.1). Als primäre Antikörper wurden Verdünnungsreihen der Anti-PrP-Antikörper verwendet.

Bei beiden Tests wurde der monoklonale Anti-PrP-Antikörper 6H4 (2.1.6) als Positivkontrolle

eingesetzt.


46

2.2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.2.1 Allgemeine Kulturbedingungen

MEM + L-Glutamin

(Gibco Ltd.)

FCS (Gibco Ltd.)

10x Penicillin/Streptomycin/Glutamin

(Gibco Ltd.)

10% (v/v)

1% (v/v)

ScN2a

Trypsin-EDTA

(Gibco Ltd.)

OPTI-MEM

(Gibco Ltd.)

FCS (Biochrom AG)

10x Penicillin/Streptomycin (120 mg/ml)

10% (v/v)

0,1% (v/v)

N2a

ATV NaCl

KCl

D-Glukose

NaHCO3

Trypsin (Difco Ltd.)

Versen

0,8% (w/v)

0,04% (w/v)

0,1% (w/v)

0,58% (w/v)

0,05% (w/v)

0,02% (w/v)

Hybri-

dom

RPMI 1640

(Gibco Ltd.)

FCS (PAA GmbH)

100 mM Natrium Pyruvat (Gibco Ltd.)

100x nicht-essentielle Aminosäuren

(Gibco Ltd.)

10% (v/v)

1% (v/v)

1% (v/v)

SP2/0-

AG14

RPMI 1640 +

Glutamax (Gibco

Ltd.)

FCS (PAA GmbH)

Pyruvat (Gibco Ltd.)

50x 8-Azaguanin (Sigma GmbH)

10% (v/v)

1% (v/v)

2% (v/v)

Die Kultivierung aller Zelllinien erfolgte im Zellkulturschrank bei 37°C und 5% CO 2-Begasung.

Die Passagierung erfolgte in Abhängigkeit von der Konfluenz bzw. Dichte der Zellen alle fünf bis

sieben Tage in einem Verhältnis von 1:5 bis 1:10. Nach Entfernung des Mediums sowie einem

Waschschritt mit sterilem PBS erfolgte die Ablösung des adhärenten Zellrasens durch die

Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA bzw. ATV für 5 min bei 37°C. Die Trypsinwirkung wurde durch

die Zugabe des im Medium enthaltenen Serums gestoppt.

Nicht-adhärente Zellen wurden pelletiert (1400 rpm, 5 min) und in frischem Medium

aufgenommen. Nach Zählung der Zellen wurde die gewünschte Zellzahl weiterkultiviert.

2.2.2.2 Bestimmung der Zellzahl mit dem Hämazytomet er

Neubauer Zählkammer Marienfeld GmbH

Trypan Blau Sigma GmbH


47

Für die Zählung der Zellen wurde eine Neubauer Zählkammer eingesetzt. Um nur die lebenden

Zellen zu zählen, wurde die Zellsuspension mit dem sauren Farbstoff Trypanblau verdünnt

(1:2). Das Trypanblau dringt durch defekte Zellmembranen toter Zellen in das Cytosol ein und

färbt diese Zellen tiefblau. Lebende Zellen erscheinen unter dem Mikroskop dagegen leuchtend

grün. Die Zellen wurden in allen vier Großquadraten des Hämazytometers ausgezählt. Zur

Berechnung der Zellzahl pro ml Suspension wurde folgende Formel verwendet:

Zellzahl pro ml = Zellzahl/4 x Verdünnungsfaktor x 104

2.2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Einfriermedium DMSO (Sigma GmbH)

FCS (PAA GmbH)

10% (v/v)

90% (v/v)

Einfrierboxen Cryo 1°C Freezing Container, Nalgene TM, UK

Kryoröhrchen Greiner AG

Von allen Antikörper-produzierenden Hybridomzelllinien wurden Aliquots in flüssigem Stickstoff

eingefroren. Dazu wurde die gewünschte Zellzahl 10 min bei 1300 rpm und 4°C sedimentiert

und anschließend in kaltem Einfriermedium aufgenommen (2 x 106 Zellen/ml). Dieses

Einfriermedium enthält Dimethylsulfoxid (DMSO), das beim Gefriervorgang die Bildung von

Eiskristallen verhindert. In jedes Kryoröhrchen wurde 1 ml pipettiert und direkt in eine

vorgekühlte Einfrierbox (-20°C) überführt. Die Box wurde zunächst für zwei Stunden bei -20°C

aufbewahrt und anschließend für mindestens vier Stunden bei -80°C. Die Langzeitlagerung

erfolgte in der Gasphase über flüssigem Stickstoff (-196°C). Durch diesen Prozess findet die

Abnahme der Temperatur in einer optimalen Geschwindigkeit statt (1°C pro Stunde) und

gewährleistet somit das langsame Eindringen des DMSO in die Zellen.

Um die Zellen aufzutauen, wurden die Kryoröhrchen so lange im Wasserbad (37°C)

geschwenkt, bis nur noch ein kleiner Eiskristall sichtbar war. Die aufgetauten Zellen wurden in

20 ml Kultivierungsmedium überführt und zweimal mit Medium gewaschen (1400 rpm, 5 min).

Da DMSO zytotoxisch ist, müssen beide Methoden zügig durchgeführt werden. Diese Methoden

wurden für alle Zelllinien angewendet.

2.2.2.4 Behandlung von Zellen mit Anti-PrP-Antikörp ern

2.2.2.4.1 Inhibition der Prionreplikation in ScN2a- Zellen

Um den Effekt der aufgereinigten Anti-PrP-Antikörper auf die Prionreplikation in Zellkultur zu

bestimmen, wurden ScN2a-Zellen verwendet. Für den Standardassay wurden jeweils 105 Zellen

in 6-Loch-Platten eingesät, das Medium (1 ml) am nächsten Tag erneuert und mit 10 µg


48

Antikörper versetzt. Nach fünf Tagen wurde der Gehalt von PrPSc in den behandelten Zellen

mittels Western Blot bestimmt (2.2.3). Zur Bestimmung des IC50-Werts eines Antikörpers

erfolgte die Behandlung mit abnehmenden Antikörperkonzentrationen von 10, 5, 2,5 bis

0,0006 µg/ml. Zur Bestimmung eines möglichen Langzeiteffekts der Antikörper wurden

105 ScN2a-Zellen mit 10 µg Ak/ml behandelt und die Behandlung im 6-Tagesrhythmus

fortgeführt. Nach den angegebenen Behandlungsintervallen erfolgte dann eine Bestimmung von

PrPSc mittels Western Blot (2.2.3) oder der Infektiosität mittels Bioassay (2.2.5.5). Um zu

bestimmen, ob der Antikörpereffekt auf die Prionreplikation transient oder dauerhaft ist, wurden

die Zellen nach Beendigung der Langzeitbehandlung für weitere 36 Tage in Abwesenheit der

Antikörper kultiviert. Dazu wurde der PrPSc-Gehalt ebenfalls im 6-Tagesrhythmus mittels

Western Blot (2.2.3) überprüft.

Als Kontrollen für die Behandlungen dienten entweder Antikörper gegen PrP (6H4 und ICSM18)

oder Antikörper gegen nicht-PrP Epitope (NCAM, Anti-IgG1) (2.1.6).

Um zu bestimmen, ob der freie Anti-PrP-Antikörper oder ein PrP/Anti-PrP-Antikörper-Komplex

einen inhibitorischen Effekt auf die Prionreplikation hat, wurde der Standardassay modifiziert.

Die Behandlung mit freiem Antikörper erfolgte mit abnehmenden Konzentrationen (1,5, 0,75,

0,37, …, 0 µg/ml). Für die Komplexbildung wurden direkt vor der Behandlung die angegebenen

Antikörperkonzentrationen mit rekombinantem PrP (1 µg) 30 min bei RT inkubiert und dann zu

den Zellen gegeben. Als Negativkontrolle wurden weitere Zellen nur mit rekombinantem PrP

(1 µg) kultiviert. Nach Beendigung der Behandlung wurde der PrPSc-Gehalt der Zellen mittels

Western Blot (2.2.3) bestimmt und der PrP/Antikörper-Komplex im Medium mittels

Immunpräzipitation (2.2.3.5) nachgewiesen.

2.2.2.4.2 Analyse der Retention auf ScN2a-Zellen

Um zu bestimmen, wie lange PrP auf der Zelloberfläche von ScN2a-Zellen durch die Bindung

der Anti-PrP-Antikörper gehalten wird (Retention), wurde eine FACS-Analyse durchgeführt.

Dazu wurden am ersten Tag 2 x 105 ScN2a-Zellen in eine 6-Loch-Platte eingesät. Am nächsten

Tag erfolgte eine einstündige Inkubation bei 37°C m it den Anti-PrP-Antikörpern. Damit die

Fluoreszenzsignale nicht im gesättigten Bereich liegen, wurden dazu Antikörperkonzentrationen

eingesetzt, die den KD-Werten entsprachen (2.2.4.5). Nach Entfernung des Antikörpers erfolgte

die weitere Inkubation für unterschiedlich lange Zeitintervalle (0, 1, 2, 3, und 4 Stunden) bei

37°C. Danach wurden die Zellen mit 0,5 ml 50 mM EDT A/PBS abgelöst (5 min, 37°C), in 1,5 ml

PBS aufgenommen und im Durchflusszytometer analysiert (2.2.4.4).


49

2.2.2.5 MTT-Test

Cell Titer 96® non-Radioactive Cell Proliferation A ssay Promega GmbH

96-Loch-Platten Greiner AG

Zur Bestimmung des zytotoxischen Effekts der Antikörper auf ScN2a-Zellen wurde ein MTT-

Test durchgeführt. Dieser quantitativ colorimetrische Test basiert auf der Ringspaltung des

wasserlöslichen, schwach gelben Tetrazoliumsalzes (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazoliumbromid (MTT)) durch mitochondriale Dehydrogenasen lebender Zellen zu

dem wasserunlöslichen dunkelblauen Formazan. Das Formazan wird mit organischen

Lösungsmitteln wie Isopropanol wieder in Lösung gebracht, und die Absorption kann

photometrisch ermittelt werden. Die Absorption des Formazans ist direkt proportional zur Zahl

der lebenden Zellen.

Dazu wurden 3,3 x 103 Zellen in 96-Loch-Platten ausgesät und mit einer

Antikörperkonzentration von 10 µg/ml versetzt. Das Gesamtvolumen betrug 0,1 ml. Nach einer

Inkubationszeit von fünf Tagen bei 37°C und 5% CO 2-Gehalt wurden in jedes 96-Loch 15 µl Dye

Solution pipettiert. Die Reaktion wurde nach vier Stunden bei 37°C durch die Zugabe von 0,1 ml

Solubilization Solution/Stop Mix beendet. Um eine vollständige Lyse der Zellen und

Solubilisierung des gebildeten Formazans zu gewährleisten, wurden die Platten 24 Stunden in

einer feuchten Kammer bei RT gehalten. Danach wurde mit einem ELISA-Reader die optische

Dichte bei einer Wellenlänge von 570 nm (Referenzwellenlänge 695 nm) ermittelt.

2.2.2.6 Transfektion von 293T-Zellen mittels Kalziu mphosphat-Präzipitation

2x HEBS-Puffer

0,05 M Hepes

0,28 M NaCl

1,5 ml Na2HPO4

3 Aliqots mit pH 7, 7,05 und 7,1 herstellen, 0,2 µm

steril filtrieren (-20°C), Effizienz testen

Kalziumchlorid (CaCl 2) 2,5 M

0,2 µm steril filtrieren (-20°C)

100x Phosphatpuffer

(Na2HPO4)

0,15 M

autoklavieren, RT

Natrium-Butyrat/PBS 0,5 M

0,2 µm steril filtrieren (4°C)

Sigma GmbH

Plasmide 2.1.8


50

Für die transiente Transfektion von 293T-Zellen wurde die klassische Methode der

Kalziumphosphat-Präzipitation verwendet (Wigler et al., 1978).

Einen Tag vor der Transfektion wurden 5 x 106 Zellen in 10 cm Kulturschalen ausgesät und

über Nacht bei 37°C und 5% CO 2-Gehalt inkubiert. Eine halbe bis zwei Stunden vor Beginn der

Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel mit equilibriertem Medium. Danach wurde das

Kalziumphosphat-DNA-Präzipitat hergestellt. Dazu wurden 10 µg des jeweiligen Plasmids mit

Fresenius-Wasser auf ein Endvolumen von 0,45 ml eingestellt und mit 50 µl CaCl2 versetzt.

Dieses Gemisch wurde unter kontinuierlichem Einblasen von steriler Luft mit 0,5 ml 2x HEBS-

Puffer vermischt und für 30 min bei RT inkubiert. In dieser Zeit bildete sich ein feines Präzipitat

aus DNA und Kalziumphosphat, das tropfenweise zur Zellkultur zugegeben wurde. Während

der anschließenden fünfstündigen Inkubationszeit bildeten sich Kristalle, welche die Aufnahme

der DNA in die Zelle über einen endozytotischen Prozess erleichtern und somit die

Transfektionsrate erhöhen. Danach erfolgte für acht bis zwölf Stunden eine Induktion durch

0,2 ml Natriumbutyrat, um den CMV-Promoter zu stimulieren und so die Expressionsrate des

Proteins zu erhöhen. Abschließend wurden die Zellen gezählt, jeweils 1 x 105 Zellen pro FACS-

Röhrchen ausgesät und die Bindung der Anti-PrP-Antikörper an die transfizierten Zellen im

Durchflusszytometer analysiert (2.2.4.4).

2.2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.2.3.1 Herstellung von Zelllysaten

Lyse-Puffer

0,05 M Tris, pH 7,5

0,1 M NaCl

0,5% (v/v) Igepal (NP-40)

0,5% (w/v) Natrium Deoxycholat Monohydrat

Zellschaber, 13mm Hartenstein Laborbedarf GmbH

Zur Herstellung von Zelllysaten wurde das Medium entfernt und die Zellen mit eiskaltem PBS

gewaschen. Der Zellrasen wurde mit 60 bis 70 µl Lyse-Puffer bedeckt und für mindestens 5 min

auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen mit einem Zellschaber abgelöst, in ein

Reaktionsgefäß überführt und 3 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde bis zur

weiteren Bearbeitung bei -20°C gelagert.


51

2.2.3.2 Herstellung von Gehirnhomogenaten

Lyse-Puffer

0,5% (v/v) Igepal (NP-40)

0,5% (w/v) Natrium Deoxycholat Monohydrat

PBS

Kanülen (G18-G21) Braun AG

Die gefrorenen Maus-Gehirne wurden gewogen und mit neun Volumen des Lyse-Puffers

versetzt (10% Gehirnhomogenat). Indem das Zellmaterial mehrmals durch unterschiedlich

große Kanülen (G18-G21) gezogen wurde, wurde die Zellmasse homogenisiert. Nach

Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) erfolgte die Lagerung der Überstände bei -20°C. Zuvor wurde

die Proteinkonzentration dieser Homogenate bestimmt, die zwischen 8 bis 10 mg/ml lag

(2.2.3.3).

2.2.3.3 Proteinbestimmung nach Bradford

Bradfordreagenz Bio-Rad GmbH

bovines Serumalbumin (BSA)

Die quantitative Bestimmung der gelösten Proteine in den Zelllysaten wurde photometrisch

mittels Bradford-Test vorgenommen. Hierbei bildet der Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blau einen

Komplex mit den gelösten Proteinen, durch den es zu einer Verschiebung des

Absorptionsmaximums von 470 nm zu 595 nm kommt. Die Zunahme der Absorption bei 595 nm

kann somit als Maß für die Proteinkonzentration einer Lösung genommen werden (Bradford,

1976). Die jeweiligen Zelllysate wurden in drei unterschiedlichen Verdünnungen gemessen. Mit

Hilfe einer Eichgeraden, die mit verschiedenen BSA-Konzentrationen erstellt wurde, konnte die

Proteinkonzentration genau bestimmt werden.

2.2.3.4 Proteinase K-Behandlung von Homogenaten

Proteinase K, rekombinant, PCR Grade Roche Diagnostics GmbH

ββββ-Mercapto-Ethanol 9,5% (v/v)

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 0,075 M (AppliChem GmbH)

5x SDS Probenpuffer SDS

Glycerol

Tris-HCl, pH 6,8

Bromphenolblau

2% (w/v)

25% (v/v)

0,06 M

0,05% (w/v)


52

Zum spezifischen Nachweis des PrPSc-Gehalts wurden 200 µg Zell- bzw. 100 µg 10%iges

Gehirnhomogenat für 30 min bei 37°C mit 20 µg/mg Pr oteinase K inkubiert. Die Behandlung

wurde durch die Zugabe von 5x SDS-Probenpuffer gestoppt, der den Protease-Inhibitor PMSF

und β-Mercapto-Ethanol enthielt. Durch ein 10-minütiges Aufkochen bei 95°C, der Reduktion

der Disulfidbrücken durch β-Mercapto-Ethanol sowie der Anlagerung von SDS an die Proteine

erfolgte die Denaturierung. Danach wurden die Proben kurz zentrifugiert und konnten

abschließend in der SDS-PAGE analysiert werden (2.2.3.6).

2.2.3.5 Immunpräzipitation

Protein G-Agarose Roche Diagnostics GmbH

Waschpuffer 1 Tris, pH 7,5

NaCl

Igepal (NP-40)

0,05 M

0,15 M

1% (v/v)


NaCl

Igepal (NP-40)

Na-Deoxycholat

0,05 M

0,5 M

1% (v/v)

0,05% (w/v)


Igepal (NP-40)

Na-Deoxycholat

0,05 M

0,1% (v/v)

0,05% (w/v)

Um den PrP/Antikörper-Komplex im Überstand von ScN2a-Zellen nach beendeter Behandlung

nachzuweisen (2.2.2.4), wurde eine Protein G-Immunpräzipitation vorgenommen.

Jeweils 1,5 ml Medium wurden mit 50 µl Protein G-Agarose versetzt und über Nacht auf dem

Schüttler inkubiert (4°C). Anschließend folgten nac heinander jeweils zwei Waschschritte in den

gekühlten Waschpuffern 1, 2 und 3 (1 ml, 20 min, 4°C). Nach jedem Waschschritt wurde das

Pellet zentrifugiert (20.000 rpm, 30 s) und der Überstand verworfen. Abschließend wurde die

pelletierte Protein G-Agarose in 30 µl 1x SDS-Probenpuffer (2.2.3.4) aufgenommen und für

10 min bei 95°C erhitzt, wodurch der gebundene Komp lex von der Protein G-Agarose

dissoziierte. Nach einem letzten Zentrifugationsschritt (20.000 rpm, 2 min) wurde der Überstand

in der SDS-PAGE und im Western Blot analysiert (2.2.3.6 & 2.2.3.7).


53

2.2.3.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAG E)

Tris-Glycin Gel (12%) Biozym GmbH

Western Blot-Gelkammeraparatur Biozym GmbH

1x SDS-Laufpuffer (1l) SDS

Tris

Glycin

1% (w/v)

0,25 M

2 M

MagicMark TM Standard Invitrogen Ltd.

Die SDS-PAGE erlaubt die Auftrennung von Proteinen abhängig von ihrer relativen

Molekülmasse unter denaturierenden Bedingungen (Laemmli, 1970). Diese Methode basiert auf

der durch hydrophobe Wechselwirkungen bedingten Bindung des negativ geladenen Detergens

Natriumdodecylsulfat (SDS) an denaturierte Proteine.

Auf das Gel wurden 5 µl des Größenstandards sowie 150 bis 200 µg der Proteinproben

aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 110 V im Sammelgel (ca. 10 min) und 150 V im

Trenngel (ca. 1 Stunde). Die Gelelektrophorese wurde beendet, sobald die Lauffront des

Bromphenolblaus das untere Ende des Gels erreicht hatte.

MagicMarkTM Größenstandard (kDa)

220, 120, 100, 80, 60, 50, 40, 30, 20

2.2.3.7 Western Blot

Polyvinyldifluorid (PVDF)-Membran Roth GmbH & Co. KG

Whatman Schleicher & Schuell ®-Filter Sigma GmbH

Methanol

1 x Transferpuffer (1l) SDS

Tris

Glycin

Methanol

0,75% (w/v)

0,25 M

2 M

20% (v/v)

Nach Auftrennung durch die SDS-PAGE wurden die Proteine mittels Tank-Blot-Technik

elektrophoretisch auf eine PVDF-Membran transferiert (Towbin et al., 1979). Zuvor wurde die

PVDF-Membran in Methanol aktiviert (2 min) und in Transferpuffer equilibriert (10 min). Danach

wurde das Gel luftblasenfrei auf die Membran gelegt. Auf beiden Seiten wurden jeweils ein

Whatman-Filter und eine Schwammstoffmatte platziert, die vorab in Transferpuffer getränkt

wurden. Die PVDF-Membran zeigte bei dieser Anordnung in Richtung Anode. Der Transfer


54

erfolgte vertikal zwischen zwei Kunststoffgittern in der Western-Blot-Gelkammeraparatur

(90 min, 350 mA).

2.2.3.7.1 Blocken und Antikörperinkubation

10 x TBST Puffer (1l) Tris-HCl, pH 7,5

NaCl

Tween 20

0,1 M

1,5 M

1% (v/v)

Milchpulver (Blotting Grade Blocker) Bio-Rad GmbH

Nach dem Transfer wurden die Proteinbanden auf der Membran mit Hilfe von spezifischen

Antikörpern detektiert. Alle Inkubationen erfolgten auf einem Schüttler oder in einem 15 ml

Falconröhrchen auf einem Rollinkubator. Um unspezifische Bindungen zu blockieren, wurden

die Membranen über Nacht bei 4°C in 5% (w/v) Milchp ulver in TBST inkubiert. Nach

Verdünnung der angegebenen primären Antikörper (Tabelle 5) in TBST wurden die Membranen

eine Stunde bei RT mit der Antikörperlösung inkubiert und anschließend jeweils zweimal für

zehn Minuten in TBST gewaschen. Die Applikation des Meerrettichperoxidase (HRP)-

gekoppelten sekundären Antikörpers erfolgte wieder für eine Stunde in 5% (w/v) Milchpulver mit

TBST. Nach vier 10-minütigen Waschschritten wurden die Membranen mittels

Chemolumineszenz analysiert.

Tabelle 5: Verdünnungen der im Western Blot verwend eten Antikörper

primäre Antikörper

Verdünnung

Western Blot

Verdünnung

Immunpräzipitation

Kultivierungsmedium 1:10 /

α-PrP SA2124 1:5000 /

α-PrP 6H4 1:10.000 1:5000

sekundäre Antikörper

α-Maus-Ig-HRP 1:10.000 /

α-Kaninchen-IgG1-HRP 1:10.000 /

α-Maus-IgG1-HRP 1:20.000 1:10.000


55

2.2.3.7.2 Chemolumineszenz-Detektion

ECL-Detektion-Kit (SuperSignal ® West Pico

Chemoluminescent Substrate)

Pierce Ltd., Rockford, USA

Röntgenfilme

Amersham Biosciences GmbH

Autoradiographiekassette/Hyperkassette TM Amersham Biosciences GmbH

Die Visualisierung der markierten Proteine erfolgte mittels ECL-Kit. Hierbei katalysiert die an

den sekundären Antikörper gebundene Peroxidase eine Luminol-Wasserstoffperoxid-Reaktion.

Luminol wird oxidiert und emittiert dadurch Lichtquanten, die auf einem Röntgenfilm zur

Schwärzung führen.

Die gewaschenen PVDF-Membranen wurden in einer 1:1-Mischung der Detektionsreagenzien

für eine Minute inkubiert. Nachdem die überschüssige ECL-Lösung mit einem Whatman-Filter

entfernt wurde, erfolgte direkt die Exponierung der Röntgenfilme in einer

Autoradiographiekassette (30 s bis 15 min). Die Entwicklung und Fixierung der Röntgenfilme

wurde in einer Dunkelkammer manuell durchgeführt. Abschließend wurden die Filme unter

fließendem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.

Zur Quantifizierung von Signalintensitäten wurden die Membranen in einem Image Reader

entwickelt und anschließend mit der AIDA Software, Version 3.20.116 (raytest

Isotopenmessgeräte GmbH) analysiert. Für die Auswertung des IC50-Werts wurde eine

sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt.

2.2.4 Immunologische Methoden

2.2.4.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Waschpuffer (PBST) Tween 20

PBS

0,1% (v/v)

Blockpuffer Milchpulver

PBST

5% (w/v)

Assay-Lösung BSA

PBST

1% (w/v)

96-Loch-Maxisorb-Flachbodenplatten Nunc GmbH & Co. KG

TMB-Substrat BD Biosciences GmbH

H2SO4 1 M



56

Beim ELISA-Verfahren werden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen durch eine enzymatische

Farbreaktion nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde ein indirekter ELISA eingesetzt.

Zur Immobilisierung des Antigens wurden 96-Loch-Platten mit rekombinantem PrP

(50 ng/0,1 ml PBS/Loch) beschichtet, über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend dreimal

mit 0,3 ml PBST gewaschen. Die unbesetzten Bindestellen wurden durch die Zugabe von

0,1 ml Blockpuffer für zwei Stunden bei 37°C abgesä ttigt, und danach wurden die Platten erneut

dreimal mit PBST gewaschen. Die Lagerung der Platten erfolgte für maximal einen Monat bei -

20°C.

Vor Beginn des ELISAs wurden die Platten 30 min bei RT gelagert. Alle anschließenden

Schritte wurden ebenfalls bei RT durchgeführt. Die Primärantikörper wurden verdünnt

(2.2.4.2-3), pro Loch wurden jeweils 0,1 ml Antikörperlösung pipettiert und für zwei Stunden

inkubiert. Nach jeweils sechs Waschschritten mit 0,3 ml PBST wurde der zweite Peroxidase-

gekoppelte Antikörper (1:10.000) für zwei Stunden aufgetragen. Sowohl Primär- als auch

Sekundärantikörper wurden in Assay-Lösung verdünnt. Nach sechs weiteren Waschschritten

erfolgte die Visualisierung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch TMB als Peroxidase-

Substrat. Diese Farbreaktion wurde nach zehn Minuten durch die Zugabe von 50 µl H2SO4

gestoppt und abschließend bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenzwellenlänge 560 nm)

photometrisch gemessen. Die Messungen wurden immer in Duplikaten durchgeführt.

2.2.4.2 Bestimmung der Avidität von Antikörpern

Ammoniumthiozyanat (NH 4SCN) Sigma GmbH

Die Bestimmung der Avidität der Anti-PrP-Antikörper erfolgte mittels ELISA (2.2.4.1). Zur

Standardisierung der optischen Dichte (OD) wurden zuvor Verdünnungen der primären

Antikörper bestimmt, bei denen die OD zwischen 0,9 und 1,3 lag. Nach zweistündiger

Inkubation der Platten mit der Primärantikörperlösung erfolgten zwei Waschschritte.

Anschließend wurden die einzelnen Löcher 15 min bei RT mit verschiedenen NH4SCN-

Molaritäten (0 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 2,5 / 3 / 3,5 M) inkubiert. Dieses chaotrophe Salz hebt die

Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Antigen und Antikörper auf. Für die Lösung hoch

avider Bindungen ist eine höher-molare NH4SCN-Lösung notwendig als für Bindungen mit

niedriger Avidität (Pullen et al., 1986). Die Avidität wird hier als Aviditätsindex (AI) angegeben,

welcher der Molarität von NH4SCN entspricht, bei der 50% des Antikörpers eluiert wurden.

Nach erneutem sechsmaligem Waschen wurde das ELISA-Standardprotokoll durchgeführt

(2.2.4.1).


57

2.2.4.3 Bestimmung der Dissoziationskonstanten (K D) mittels ELISA

Die KD-Konstante wurde auf rekombinantem Maus-PrP mittels ELISA bestimmt (2.2.4.1). Die

Anti-PrP-Antikörper wurden in verschiedenen Molaritäten (0,0016 bis 0,06 pmol) eingesetzt.

Danach erfolgte die Bestimmung der KD-Konstante mittels Sättigungskurve und Scatchard-

Diagramm (PRISM®, Version 4.0, GraphPad Software, Inc.). Es wurden nur Sättigungskurven

zur Auswertung verwendet, deren Korrelationskoeffizient R2 größer als 0,98 war.

2.2.4.4 Durchflusszytometrische Analyse (FACS)

FACS-Puffer

2% (v/v) FCS (Biochrom AG)

0,01 M EDTA, pH 8

0,1% (w/v) Natriumazid

PBS, 1l

EDTA/PBS 0,02 M

FACS-Röhrchen

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie (Fluorescence-Activated-Cell-Sorting; FACS) können

Fluoreszenz-markierte Antigene auf der Oberfläche von Zellen nachgewiesen werden. Hierzu

wurde das Durchflusszytometer FACS-Calibur (Becton Dickinson GmbH) eingesetzt und die

erhaltenen Daten mit der Software Cell Quest (Becton Dickinson GmbH) ausgewertet.

Diese Methode wurde für das Screening nach Antikörper-sezernierenden Hybridomklonen

(2.2.1.4), die Bindung der Anti-PrP-Antikörper an transfizierte 293T-Zellen (2.2.2.6), sowie

Bindungs- und Retentionsanalysen der Anti-PrP-Antikörper auf ScN2a-Zellen (2.2.4.5,

2.2.2.4.2) eingesetzt.

Je nach Anwendung wurden entweder alle behandelten Zellen aus einem 6-Loch in ein FACS-

Röhrchen überführt oder die Zellen wurden nach einem PBS-Waschschritt durch Inkubation mit

EDTA/PBS (5 min, 37°C) abgelöst und gezählt. Danach wurden jeweils 1 x 105 Zellen in ein

FACS-Röhrchen transferiert. Die Antikörper wurden in FACS-Puffer verdünnt (Tabelle 6) und

die Inkubation von sowohl Primär- als auch Sekundärantikörper fand für eine Stunde auf Eis

statt. Die Inkubation mit dem zweiten Antikörper erfolgte in Dunkelheit. Zellen aus der

Retentions- und Bindungsanalyse wurden zuvor mit dem Primärantikörper behandelt, so dass

diese Zellen nur noch mit dem Sekundärantikörper inkubiert wurden. Bei allen Anwendungen

erfolgten vor und nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper jeweils zwei Waschschritte

mit 3 ml FACS-Puffer (1250 rpm, 5 min). Abschließend wurden die Proben im

Durchflusszytometer analysiert. Für die Einstellungen am FACS-Gerät wurden ungefärbte

Zellen verwendet, und als Negativkontrolle dienten Zellen, die nur mit dem sekundären

Antikörper inkubiert wurden.


58

Tabelle 6: Verdünnungen der im Durchflusszytomter v erwendeten Antikörper.

Anwendung primärer Antikörper Verdünnung

Screening Kultivierungsmedium 1:3

Transfektion Anti-PrP-Antikörper 1 µg/Röhrchen

Bindungsanalyse Anti-PrP-Antikörper 2.2.4.5

Retentionsanalyse Anti-PrP-Antikörper 2.2.2.4.2

Für alle Experimente wurde ein Ziege-α-Maus-IgG (H+L) mit FITC-

Konjugat als sekundärer Antikörper verwendet, der 1:100 in FACS-

Puffer verdünnt wurde.

2.2.4.5 Bestimmung der Dissoziationskonstanten (K D) mittels FACS

Zur Bestimmung der KD-Konstante wurden 2 x 105 ScN2a-Zellen in 6-Loch-Platten eingesät. Am

nächsten Tag erfolgte eine einstündige Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-

PrP-Antikörpern bei 37°C (5 / 2,5 / 1,25, …, 0,0006 µg/ml). Anschließend wurden die Zellen mit

0,5 ml 20 mM EDTA/PBS (5 min, 37°C) abgelöst und de m Standardprotokoll entsprechend im

FACS analysiert (2.2.4.4). Zur Ermittlung des KD-Werts wurden eine Sättigungskurve und ein

Scatchard-Diagramm erstellt (PRISM®, Version 4.0, GraphPad Software, Inc.). Nur Analysen,

bei denen der Korrelationskoeffizient R2 größer als 0,98 war, wurden verwendet.

2.2.4.6 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen

Paraformaldehyd (PFA) 4% (w/v) in 4% Sucrose (v/v)

NH4Cl 0,05 M

Triton-X/PBS 0,1% (v/v)

Guanidiniumthiozyanat

(GnSCN)

3 M

Kaninchenserum 10% (v/v)

30 min bei 56°C inaktiviert

Eindeckmedium Cyto Fluor Mounting Solution (Dako GmbH)

PBS-

MEM + L-Glutamin

(Gibco Ltd.)

FCS (Gibco Ltd.) 10% (v/v)

10x Penicillin/Streptomycin/Glutamin (Gibco Ltd.) 1% (v/v)

Objektträger Lab-Tek™ Chamber Slide™ (Nunc GmbH & Co. KG)

Deckgläschen 10 mm, rund


59

Mit Hilfe von Immunfluoreszenzanalysen wurde ermittelt, ob die Anti-PrP-Antikörper an PrPSc

von ScN2a-Zellen binden.

Dazu wurden 4 x 104 ScN2a-Zellen auf speziellen Objektträgern in Kammern ausgesät und

zwei Tage in MEM-Medium bei 37°C und 5% CO 2 kultiviert. Am dritten Tag wurden die Zellen

mit 4% PFA fixiert und anschließend mit NH4Cl und Triton-X permeabilisiert. Die Denaturierung

von PrPC erfolgte durch die Behandlung mit Guanidiniumthiozyanat. Durch die Inkubation mit

Kaninchenserum wurden die unspezifischen Bindestellen abgesättigt. Danach wurden die

Zellen mit einer Lösung, bestehend aus Anti-PrP-Antikörper (1,5 µg/ml) und ALEXA Fluor® 549

gekoppelter Cholera-Toxin Untereinheit B (1:800), versetzt. Als Sekundärantikörper wurde ein

ALEXA Fluor® 488-gekoppelter IgG-Antikörper (1:1.000) verwendet. Die Antikörper wurden in

jeweils 1%igem Kaninchenserum verdünnt. Alle Schritte wurden bei RT durchgeführt. Der

Zellrasen wurde abschließend mit Eindeckmedium überschichtet, mit einem Deckgläschen

bedeckt und für zwei Stunden bei 4°C getrocknet. Al s Kontrolle wurden ScN2a-Zellen

verwendet, die nach der Behandlung mit Pentosanpolysulfat (Caughey und Raymond, 1993)

kein PrPSc mehr trugen (cuScN2a-Zellen). Die Präparate wurden mittels konfokaler

Laserscanning-Mikroskopie (Axiovert 200M, Zeiss AG) analysiert.

Das genaue Protokoll ist nachfolgend aufgeführt:

1) Fixierung PFA, 5 min Lösung entfernen PFA, 15 min 3 x mit PBS waschen 2) Permeabilisierung NH4Cl, 15 min 3 x mit PBS waschen Triton X, 5 min 2 x mit PBS waschen 3) Denaturierung GnSCN, 5 min 2 x mit PBS waschen 4) Blockierung Kaninchen-Serum, 30 min 5) Färbung 1. Antikörper, 1 h 3 x mit PBS waschen 2. Antikörper, 1 h, Dunkelheit 3 x mit PBS waschen 2 x mit Aqua bidest. waschen

2.2.5 Tierexperimentelle Methoden

2.2.5.1 Betäubung der Mäuse mit Ether

Diethylether Roth GmbH & Co. KG


60

Für Immunisierungen, Inokulationen und Blutentnahmen wurden die Mäuse mit Ether

narkotisiert. Sobald die Mäuse eine flache Atmung aufwiesen und keinen „Pinch-Reflex“ mehr

zeigten, erfolgte der Eingriff.

2.2.5.2 Blutentnahme und Serumgewinnung

Mikro-Hämatokritkapillaren, heparinisiert Assistent ®

Serum separator tubes (Mikrotainer) Becton Dickinson GmbH

Bei narkotisierten Tieren erfolgte die Blutentnahme durch Punktierung des retroorbitalen

Venenplexus. Dazu wurde eine Kapillare über den medialen Augenwinkel am Augapfel entlang

zum Augenhintergrund eingeführt. Mit einer drehenden Bewegung wurde der retrobulbuläre

Plexus eröffnet (Herbert und Kristensen, 1986) und das entnommene Blut direkt in spezielle

Sammelröhrchen überführt. Durch Zentrifugation der Sammelröhrchen (5 min, 6000 rpm)

erfolgte eine Separation in Blutplasma und -serum. Die Lagerung des gewonnenen Blutserums

fand bei -20°C statt.

2.2.5.3 Herzpunktion und Organentnahme

Insulinspritze Becton Dickinson GmbH

Tissue-Tek® Sakura Finetek, Niederlande

4% Paraformaldehyd (PFA), pH 7,2

Die terminale Herzblutentnahme erfolgte an euthanisierten Mäusen. Nach Eröffnung des

Thorax wurde eine Insulinspritze (G26) in den rechten Herzventrikel eingeführt und das Blut

entnommen. Abschließend wurden Milz und Gehirn entfernt und entweder in 4% PFA oder

Tissue-Tek eingebettet. Die Aufbewahrung der PFA-Proben erfolgte bei RT, während die

Tissue-Tek-Proben bei -20°C gelagert wurden.

2.2.5.4 Bestimmung der Pharmakokinetik der Anti-PrP -Antikörper

Für die Bestimmung der Pharmakokinetik der Anti-PrP-Antikörper wurden fünf Gruppen,

bestehend aus jeweils sechs wildtypischen Mäusen, mit 0,1 ml 1% RML-Inokulum

intraperitoneal (i.p.) inokuliert. Nach 63 Tagen erfolgte die erste i.p. Injektion von 1 mg

Antikörper. Eine und vier Stunden später wurde den Mäusen Blut entnommen. Im

3-Tagesrhythmus wurden zwei weitere Injektionen der Anti-PrP-Antikörper vorgenommen. Nach

drei weiteren Tagen wurde die Untersuchung beendet und die Tiere mittels zervikaler

Dislokation getötet. Vor jeder Applikation sowie bei Beendigung des Experiments wurde den


61

Tieren erneut Blut abgenommen (2.2.5.2-3). Nach Bestimmung der Antikörpertiter im Serum der

Mäuse mittels ELISA (2.2.4.1) wurde die Pharmakokinetik der Anti-PrP-Antikörper berechnet.

2.2.5.5 Bioassay

Kanülen Braun AG

EDTA/PBS 0,02 M, pH 7,3

PBS-

Zur Bestimmung der Infektiosität von unbehandelten und Antikörper-behandelten ScN2a-Zellen

(2.2.2.4.1) wurden Zellhomogenate hergestellt und intrazerebral in Tga20-Indikatormäuse

injiziert. Dazu wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und danach durch die Inkubation

mit 0,5 ml EDTA/PBS (5 min, 37°C) abgelöst. Anschli eßend wurden die Zellen in 10 ml PBS

aufgenommen und für 10 min bei 2000 rpm zentrifugiert. Die Zellzahl wurde bestimmt (2.2.2.2)

und auf 104 bzw. 106 Zellen pro 30 µl PBS eingestellt. Die Lagerung der Zelllysate fand bei

-80°C statt. Am Tag der Inokulation wurden die Prob en aufgetaut und durch das Ziehen durch

unterschiedlich große Kanülen (G18, G21, G23) homogenisiert. Jeweils 30 µl des

Zellhomogenats wurden in die Indikatormäuse injiziert. Die Prüfung der Mäuse auf

Krankheitssymptome wie Ataxie, Kyphose und Gewichtsverlust begann 40 Tage nach der

Inokulation und wurde dreimal pro Woche vorgenommen. Im terminalen Stadium der

Erkrankung erfolgte der Abbruch des Experiments. Die Mäuse wurden durch zervikale

Dislokation getötet und Hirn und Milz wurden entnommen (2.2.5.3).

2.2.6 Molekularbiologische Methoden

2.2.6.1 Klonierung

2.2.6.1.1 Präparative Polymerasekettenreaktion (PCR )

MgCl 2 (1,5 mM) Promega GmbH

ddNTPs (0,25 mM) Promega GmbH

reverse und forward Primer (50 pmol/µl) 2.1.9

10x Polymerase-Puffer Promega GmbH/ Stratagene GmbH

Pfu-DNA-Polymerase Stratagene GmbH

ddH 2O

DNA-Matrize


62

Mit Hilfe der PCR lassen sich definierte Bereiche einer beliebigen DNA-Sequenz gezielt

amplifizieren (Mullis et al., 1986). Für die Klonierung der PrP-Deletionsmutanten war es

notwendig, insgesamt vier Fragmente aus dem Plasmid pAd-CMV-PrP ∆ 32-93 zu amplifizieren.

Um das PCR-Fragment anschließend in den Plasmid-Vektor gerichtet klonieren zu können,

wurden in das DNA-Fragment durch die Primersequenzen Restriktionsschnittstellen eingebaut.

Der 50 µl PCR-Ansatz enthielt folgende Komponenten:

pAd-CMV-PrP ∆32-93 (10 ng/µl) 5 µl

MgCl2 (1,5 mM) 3 µl

10x Puffer 5 µl

Primer for (50 pmol/µl) 0,6 µl

Primer rev (50 pmol/µl) 0,6 µl

ddNTPs (0,25 mM) 10 µl

Pfu-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) 0,5 µl

ddH2O 25,3 µl

PCR-Programm

Anzahl der Zyklen Temp. (°C) Zeit (s) Phase

1x 95 120 (Denaturierung)

16x 95

79-82

68

30

60

420

(Denaturierung)

(Hybridisierung)

(Extension)

1x 68 120 (Extension)

Anschließend wurden die PCR-Produkte in einem Agarose-Gel (2.2.6.1.4) aufgetrennt und die

Banden, welche die richtige Größe aufwiesen, mittels Gel Extraktions Kit eluiert (2.2.6.1.5).


63

2.2.6.1.2 Analytische Polymerasekettenreaktion (PCR )

LB-Medium 20 mg Luria Broth

1000 ml Millipore H2O

Lösung autoklavieren und bei 4°C aufbewahren

LB amp-Medium (1l) LB-Medium

1 mg Ampicillin

MgCl 2 (1,5 mM) Promega GmbH

ddNTPs (0,25 mM) Promega GmbH

reverse und forward Primer (50 pmol/µl) 2.1.9

10x Polymerase-Puffer Promega GmbH/ Stratagene GmbH

Taq-DNA-Polymerase Stratagene GmbH

ddH 2O

DNA-Matrize

Um zu überprüfen, ob nach der Transformation (2.2.6.1.9) in einer E.coli-Bakterienkolonie das

gewünschte Plasmid vorhanden ist, wurde eine analytische PCR durchgeführt.

Dazu wurden einzelne Bakterienkolonien in 12 µl LBamp-Medium überführt und 1 bis 2 Stunden

im Heizschüttler inkubiert (37°C). Von diesem Ansat z wurden 3 µl bei der PCR-Reaktion

eingesetzt. Für jeden Test wurden eine Negativkontrolle (ddH2O) und eine Positivkontrolle

(bekanntes Plasmid) eingesetzt. Der 25 µl PCR-Ansatz enthielt folgende Komponenten:

Bakteriensuspension 3 µl

MgCl2 (1,5 mM) 1,5 µl

10x Puffer 2,5 µl

Primer for (50 pmol/µl) 0,5 µl

Primer rev (50 pmol/µl) 0,5 µl

ddNTPs (0,25 mM) 5 µl

Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) 0,5 µl

ddH2O 11,8 µl

PCR-Programm

Anzahl der Zyklen Temp. (°C) Zeit (s) Phase

1x 95 300 (Denaturierung)

35x 95

55

72

30

30

60

(Denaturierung)

(Hybridisierung)

(Extension)

1x 72 300 (Extension)


64

Abschließend wurde die amplifizierte DNA in einem Agarosegel aufgetrennt (2.2.6.1.4) und

ausgewertet.

2.2.6.1.3 Restriktionsverdau

Restriktionsenzyme New England Biolabs GmbH

MBI Fermentas GmbH

Restriktionsenzym-spezifische Puffer New England Biolabs GmbH

MBI Fermentas GmbH

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen GmbH

Plasmid-DNA/PCR-Produkte

ddH 2O

Um sowohl die Richtigkeit der amplifizierten PCR-Fragmente zu überprüfen als auch zur

Herstellung der passenden Ligationsstellen für die Klonierung der PrP-Deletionsmutanten

wurden Restriktionsverdaue nach den Angaben der Firmen New England Biolabs GmbH oder

MBI Fermentas GmbH durchgeführt. Es wurden 3 Units pro µg DNA eingesetzt, wobei das

Volumen des Enzyms 10% des Endvolumens nicht überschreiten durfte. Der Restriktionsansatz

wurde für 1 bis 2 Stunden oder über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die verdaute

DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit aufgereinigt und in 30 µl Elutionspuffer

aufgenommen. Beim Verdau mit zwei Enzymen, die unterschiedliche Puffer erforderten, wurden

die Enzyme nacheinander eingesetzt und ein Aufreinigungsschritt zwischengeschaltet. Der

25 µl Ansatz enthielt folgende Komponenten:

DNA 5 µl

Mastermix: 20 µl

2,5 µl 10x Puffer

17,5 µl ddH2O – x µl Restriktionsenzym

Abschließend erfolgte die elektrophoretische Auftrennung der verschiedenen DNA-Fragmente

(2.2.6.1.4). Als Kontrollen wurden unbehandelte DNA bzw. DNA, die nur mit einem Enzym

behandelt wurde, mitgeführt.


65

2.2.6.1.4 Agarose-Gelelektrophorese

Agarose Standard AppliChem GmbH

1 kb DNA-Marker MBI Fermentas GmbH

Ethidiumbromid Roth GmbH & Co. KG

6x Probenpuffer MBI Fermentas GmbH

Gelelektrophoresekammer Hauswerkstatt

Gelschlitten Hauswerkstatt

1xTAE (Tris-Acetat-EDTA )Puffer, pH 8,0

Die Auftrennung und der Nachweis von DNA-Fragmenten zu analytischen und präparativen

Zwecken erfolgte mit Hilfe der Elektrophorese in 1x TAE-Puffer. Je nach Größe der

aufzutrennenden DNA wurden Gele von 0,8% bis 1,0% (w/v) Agarose verwendet.

Die entsprechende Menge Agarose wurde abgewogen, in TAE gelöst und in der Mikrowelle

aufgekocht. Nach Abkühlung wurde die lauwarme Agarose in einen Gelschlitten mit

Probentaschenkamm zum Polymerisieren gegossen. Das ausgehärtete Agarosegel wurde in

die mit TAE gefüllte Elektrophoresekammer gelegt, der Kamm wurde entfernt, und

anschließend wurden die Taschen mit 6x Probenpuffer-versetzten Proben und dem 1 kb DNA-

Marker (6 µl) befüllt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte für analytische Zwecke bei

180 V und für präparative Analysen bei 80 V. Nach Trennung der Fragmente wurde das Gel 15

min in einem TAE-Ethidiumbromid-Bad (0,0001% Ethidiumbromid (10 mg/ml Stammlösung))

gefärbt, zehn Minuten in TAE gewaschen und unter der UV-Lampe (366 nm) analysiert. Danach

wurde das Ergebnis entweder fotografisch dokumentiert oder die DNA wurde aus dem Agarose-

Gel eluiert (2.2.6.1.5).

2.2.6.1.5 Gelextraktion

UV-Lampe Vilber Lourmat, Inc.

Gel Extraction Kit Qiagen GmbH

Für die Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gelen wurden die PCR-Fragmente (2.2.6.1.1) oder

Verdauansätze (2.2.6.1.3) in einem 1%igem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

Anschließend wurde die gesuchte Bande unter UV-Licht bestimmt, aus dem Gel ausgeschnitten

und in ein Reaktionsgefäß überführt. Diese Proben wurden entsprechend den Angaben des

Herstellers mittels Gel Extraktions Kit eluiert.


66

2.2.6.1.6 Dephosphorylierung der 5'-DNA-Enden

Shrimp alkaline phosphatase (SAP) New England Biolabs GmbH

SAP-Puffer New England Biolabs GmbH

Plasmid-DNA

ddH2O

Um eine Religation der linearisierten Plasmidvektoren zu verhindern, wurden die 5'-Enden der

DNA durch alkalische Phosphatase (Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)) dephosphoryliert. Der

50 µl umfassende Ansatz enthielt folgende Komponenten:

Vektor 23 µl

SAP 1 µl

SAP-Puffer 5 µl

ddH2O 21 µl

Dieser Ansatz wurde für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch eine

Hitzeinaktivierung (10 min, 75°C) gestoppt.

2.2.6.1.7 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten

ATP New England Biolabs GmbH

PEG 4000 New England Biolabs GmbH

Puffer A New England Biolabs GmbH

T4-Polynukleotidkinase (T4-PNK) New England Biolabs GmbH

DNA-Fragmente

ddH 2O

Um die Effizienz der Ligation zu erhöhen, wurde mit Hilfe der T4-Polynukleotidkinase eine

Phosphatgruppe von ATP auf die 5'-terminale Hydroxylgruppe der PCR-Produkte übertragen.

Der 20 µl umfassende Ansatz enthielt folgende Komponenten:

DNA 10 µl

T4-PNK 1 µl

ATP 2 µl

PEG 4000 2 µl

Puffer A 2 µl

ddH2O 3 µl


67

Dieser Ansatz wurde für 30 min bei 37°C inkubiert. Abschließend erfolgte ein Pufferwechsel

mittels QIAquick PCR Purification Kit.

2.2.6.1.8 Ligation

T4-DNA-Ligase MBI Fermentas GmbH oder NEB GmbH

10x T4-Ligationspuffer MBI Fermentas GmbH oder NEB GmbH

Plasmid-DNA

PCR-Produkte

ddH 2O

Bei der Ligation werden linearisierte Plasmid-DNA und das geschnittene PCR-Produkt mit Hilfe

der T4-DNA-Ligase miteinander ligiert. Für die 3-Weg-Ligation wurde ein Molekülverhältnis

Plasmid-DNA:PCR-Fragment von 1:4:4 gewählt. Als Negativkontrolle wurde die Religation der

Plasmid-DNA verglichen. Der 20 µl umfassende Ligationsansatz enthielt folgende

Komponenten:

Vektor 2 µl

PCR-Produkt 1 8 µl

PCR-Produkt 2 8 µl

10x Puffer 2 µl

T4-DNA-Ligase 1 µl

ddH2O 1 µl

Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 16°C inkubiert. Abschließend erfolgte eine

Hitzeinaktivierung für 10 min bei 65°C.

2.2.6.1.9 Transformation von E.coli mit Plasmiden

XL 10-Gold Ultrakompetente Zellen Stratagene GmbH

LB-Medium 20 mg Luria Broth


Lösung autoklavieren und bei 4°C aufbewahren

LB amp-Agarplatten 35 mg Luria Broth Agar

1 ml Ampicillin (100µg/ml)


Lösung autoklavieren, bei einer Temperatur von ca.

60°C das Antibiotikum zugeben und auf Petri-

schalen verteilen


68

Die Transformation von E.coli erfolgte mittels Hitzeschock. Dazu wurden 0,1 ml kompetente

Bakterien zu 10 µl des inaktivierten Ligationsansatzes hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für

30 min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte für 90 s bei 42°C, gefolgt von einer

zweiminütigen Inkubation auf Eis. Nach der Zugabe von 0,9 ml LB-Medium wurde die

Suspension für eine Stunde bei 37°C auf dem Schüttl er inkubiert. Abschließend erfolgte eine

Zentrifugation (10 min, 6000 rpm). Das Pellet wurde in 0,1 ml Medium resuspendiert, auf

Agarplatten, welche das entsprechende Antibiotikum enthielten, ausplattiert und über Nacht mit

der Agarschicht nach oben bei 37°C im Brutschrank i nkubiert. Danach erfolgte die

Aufbewahrung der Agarplatten bei 4°C.

2.2.6.1.10 Plasmidpräparation aus E.coli

LB amp-Medium 2.2.2.1.8

Plasmid Mini Kit Qiagen GmbH

Plasmid Midi Kit Qiagen GmbH

Bakterien-Übernachtkulturen

Zur Erzeugung größerer Mengen an Plasmid-DNA wurden E.coli-Flüssigkulturen angelegt.

Dazu wurde LBamp-Medium mit einem Bakterienklon beimpft und über Nacht bei 37°C im

Inkubator geschüttelt. Für das Screening nach positiven Klonen wurde eine 2 ml

Übernachtkultur abzentrifugiert (6000 rpm, 8 min) und die DNA abschließend aus den Bakterien

mittels Plasmid Mini Kit extrahiert. Für die DNA-Extraktion aus 100 ml Übernachtkulturen wurde

das Plasmid Midi Kit verwendet. Diese Kulturen wurden für Plasmide verwendet, die in einer

Transfektion eingesetzt werden sollten. Die Durchführung der DNA-Extraktion fand

entsprechend der Angaben des Herstellers statt. Abschließend wurde die gewonnene DNA in

25 bis 200 µl sterilem Wasser aufgenommen und die Konzentration photometrisch bestimmt

(2.2.6.1.11). Je nach verwendetem Kit lag die Ausbeute zwischen 20 µg und 100 µg DNA.

2.2.6.1.11 Quantifizierung von doppelsträngiger DNA

UVette® Eppendorf AG

Spektralphotometer Eppendorf AG

Die Konzentrationsbestimmung von doppelsträngiger DNA wurde photometrisch in sterilem

Wasser durchgeführt. Die Messung der Absorption erfolgte zwischen 260 und 280 nm.

Nukleinsäuren besitzen ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, da jedoch auch Phenol und

Aminosäuren in der Probe vorliegen, wird ebenfalls bei 280 nm gemessen. Die OD260 gibt


69

Auskunft über die DNA-Konzentration und der Quotient OD260/OD280 über den Reinheitsgrad der

Präparation. Liegt dieser Quotient zwischen 1,7 und 2,0 beträgt die Reinheit der DNA 70-95%.

doppelsträngige DNA 1 OD260nm = 50 µg DNA/ml

2.2.6.1.12 Sequenzierung von DNA

Primer (5 pmol/µl) 2.1.9

BDT-Puffer (BigDye) V.1.1 Applied Biosystems GmbH

2,5x Puffer 200 mM Tris-HCl, pH 9,0

500 mM MgCl2

Plasmid-DNA (50 ng/µl)

steriles ddH 2O

Die Sequenzierung der DNA wurde in modifizierter Form nach der Kettenabbruchmethode

(Sanger et al., 1977) durchgeführt. Die Reaktion wird durch die AmpliTaq FS-Polymerase

katalysiert. Der 5 µl umfassende Sequenzierungsansatz enthielt folgende Komponenten:

DNA 2 µl

2,5x Puffer 1 µl

Primer (5 pmol/µl) 1 µl

BDT-Puffer 1 µl

Der Ansatz wurde in einen Thermozykler gestellt, und das folgende Programm wurde gestartet:

Denaturierung 96°C 30 s

Annealing 50°C 15 s

Elongation 60°C 4 min → 25 Zyklen

Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben mit dem Qiagen Dye Ex Kit über eine

chromatographische Säule aufgereinigt, mit 2 Volumen Hi-Di-Formamid versetzt und bis zur

Sequenzanalyse bei 4°C aufbewahrt.


70

2.2.6.2 Ortsgerichtete Mutagenese

QuickChange® Site-directed Mutagenesis Kit Stratagene GmbH

Dpn I Restriktionsenzym (10 U/µl) Stratagene GmbH

pAd-CMV-PrP ∆32-93 (12 ng/µl)

XL 10-Gold Ultrakompetente Zellen

Um in dem Plasmid pAd-CMV-PrP ∆32-93 definierte Punktmutationen zu erzeugen, wurde das

Quick Change® Site-directed Mutagenesis Kit verwendet. Für die PCR-Reaktion wurden zwei

Primer eingesetzt, welche in ihrer Sequenz die gewünschte Mutation beinhalten. Die

Pfu-Polymerase wird für die Erzeugung der der entsprechenden Mutation benötigt. Der

Mutagenese-Ansatz enthielt folgende Komponenten:

pAd-CMV-PrP ∆32-93 4 µl

10x Puffer 5 µl

Primer for (25 ng/µl) 5 µl

Primer rev (25 ng/µl) 5 µl

ddNTPs 5 µl

ddH2O 26 µl

PfuTurbo® DNA-Polymerase (2,5 U/µl) 1 µl

Der Ansatz wurde in einen Thermozykler gestellt und folgendes Programm wurde gestartet:

Denaturierung 95°C 30 s

Annealing 79-82°C 15 s

Elongation 60°C 7 min → 16 Zyklen

Die PCR-Produkte wurden abschließend mit der Restriktionsendonuklease DpnI (10 U/µl) für

eine Stunde bei 37°C behandelt. Dieses Enzym erkenn t und schneidet ausschließlich

methylierte DNA. Da eine Methylierung nur in Bakterien erfolgt, wird ausschließlich die nicht

mutierte DNA verdaut. Die neu generierte mutierte Plasmid-DNA wird während der PCR nicht

methyliert und bleibt somit erhalten. Anschließend wurde die DNA in superkompetente E.coli

XL1-blue Zellen transformiert und analysiert (2.2.6.1.9 - 2.2.6.1.12).

ERGEBNISSE

71

3 Ergebnisse

Monoklonale Antikörper gegen PrP haben in den letzten Jahren eine zunehmende Bedeutung

für diagnostische und therapeutische Anwendungen in der Prionenforschung bekommen. Ziel

der vorliegenden Arbeit war die Herstellung von neuen monoklonalen Antikörpern gegen

murines PrP und ihre Charakterisierung für diagnostische und therapeutische Fragestellungen.

Durch die Immunisierung von Prnp0/0-Mäusen mit rekombinantem PrP der Maus wurden sieben

neue monoklonale Antikörper isoliert. Drei verschiedene Immunisierungsprotokolle führten

jeweils zu hohen Antikörpertitern, so dass pro Set die Milz einer Maus entnommen wurde und

die B-Zellen jeweils für eine Fusion verwendet wurden. Die Antikörpertiter der immunisierten

Mäuse und die Anzahl der potentiellen Klone pro Fusion sind in Abschnitt 3.1 beschrieben. Ein

dreistufiges Screeningverfahren ermöglichte die Isolierung der sieben Klone. Die

Antikörpermenge in den Überständen wurde nach Kultivierung in Zwei-Kompartiment-

Bioreaktoren bestimmt und die monoklonalen Antikörper durch Säulenchromatographie in hoher

Reinheit gewonnen. Die Charakterisierung der aufgereinigten Anti-PrP-Antikörper ist im zweiten

Abschnitt (3.2) beschrieben. Dabei wurden die Epitope, die Aviditäten und

Dissoziationskonstanten der monoklonalen Antikörper bestimmt. Anschließend wurden die Anti-

PrP-Antikörper auf ihr therapeutisches Potential, die Prionreplikation in Zellkultur zu hemmen,

untersucht (3.3). Vier der sieben Antikörper konnten die Prionreplikation hemmen. Eine

vollständige Hemmung der PrPSc-Akkumulation und komplette Inaktivierung der Prionreplikation

in den Zellen wurde jedoch nur durch eine Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 erreicht.

Um den Wirkungsmechanismus der Antikörper-vermittelten Hemmung der Prionreplikation zu

untersuchen, wurden zwei Hypothesen experimentell getestet (3.4). Im Hinblick auf eine

therapeutische Anwendung des Antikörpers B2-43-133 wurde abschließend die

Pharmakokinetik in Prionen-infizierten Mäusen untersucht (3.5).

3.1 Herstellung und Reinigung von monoklonalen Anti -PrP-Antikörpern

3.1.1 Antikörpertiter der immunisierten Prnp0/0-Mäuse und Fusionsausbeute

Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen murines PrP wurden drei Gruppen von

Prnp0/0-Mäusen mit verschiedenen Protokollen immunisiert (Abbildung 11). Als Antigen diente

jeweils rekombinantes PrP der Maus, welches entweder in seiner nativ gefalteten Form in Set I

und III (Zahn et al., 1997) oder in einer fibrillären Form (Luhrs et al., 2006) in Set II appliziert

wurde. Die fibrilläre Form besitzt einen hohen β-Faltblattanteil und kann leicht in amyloide

Fibrillen aggregieren, so dass seine physiko-chemischen Eigenschaften denen von PrPSc

ähnlich sind, ohne aber selbst infektiös zu sein (Luhrs et al., 2006). Für Set I und II wurde das

Antigen mit Freund-Adjuvans gemischt und die Antikörpertiter im Serum der Mäuse mittels

ERGEBNISSE

72

1. Boost 2. Boost 3. Bo ost 4. BoostMonate

Immunisierung

50 µg rek.PrP+ CFA (1:1)

50 µg fib.PrP+ CFA (1:1)

10 µg fib.PrP10 µg CpG 1668

+

50 µg rek.PrP+ IFA (1:1)

50 µg rek.PrP+ IFA (1:1) X X X FUSION

X X FUSION

X X FUSION

Set I (i.p.)

Set III (i.c.)

Set II (i.p.)


Immunisierung


Immunisierung

50 µg rek.PrP+ CFA (1:1)

50 µg fib.PrP+ CFA (1:1)

10 µg fib.PrP10 µg CpG 1668

+

50 µg rek.PrP+ IFA (1:1)

50 µg rek.PrP+ IFA (1:1) X X X FUSION

X X FUSION

X X FUSION

Set I (i.p.)

Set III (i.c.)

Set II (i.p.)

ELISA bei einer Verdünnung von 1:20.000 bestimmt. Während in Set I bereits drei Tage nach

der ersten Immunisierung alle vier Tiere hohe Antikörpertiter (OD um 1,5) zeigten, konnte in Set

II nur in zwei von vier Tieren vergleichbar hohe Titer bestimmt werden. Nach der zweiten

Immunisierung zeigten jedoch alle Tiere in beiden Gruppen ähnlich hohe Titer (OD um 2), die

auch nach weiteren Immunisierungen auf einem konstanten Wert blieben. Ein Unterschied in

der Antigenität zwischen der nativ gefalteten und der fibrillären Form von PrP konnte aus dieser

Beobachtung nicht geschlossen werden. In Set III wurde die Immunisierung ebenfalls mit der

nativ gefalteten Form durchgeführt, wobei jedoch eine subkutane Antigengabe in Gegenwart

von CpGs 1668 als Adjuvans erfolgte (Abbildung 11).

Pro Immunisierungsset wurde jeweils das Tier mit dem höchsten Titer zu dem angegebenen

Zeitpunkt für die Entnahme der Milz ausgewählt und für die Fusion verwendet (Abbildung 11).

Während die Titer der ausgewählten Tiere aus Set I und II eine OD von über zwei zeigten, war

der Titer des Tieres aus Set III bei gleicher Verdünnung deutlich tiefer (Tabelle 7). Da Set III für

ein anderes Projekt etabliert wurde, stand für die Titerbestimmung und Fusion nur eine Maus

zur Verfügung. Ob der Titer in diesem Tier im Vergleich zu Set I und II wirklich tiefer war, konnte

nicht geklärt werden, da die Bestimmung auf einer ELISA-Platte erfolgte, auf der ebenfalls der

interne Standard niedrigere Werte zeigte (Tabelle 7).

Abbildung 11: Immunisierungsschema der Prnp0/0-Mäuse und Zeitpunkte der Fusion. Die Tiere wurden in 4-Wochenabständen entweder intraperitoneal (i.p.) oder subkutan (s.c.) mit rekombinantem PrP (rek. PrP) oder seiner fibrillären Form (fib. PrP) immunisiert. Als Adjuvans wurde entweder komplettes (CFA) und inkomplettes (IFA) Freund-Adjuvans oder CpGs 1668 verwendet. Drei Tage nach den Immunisierungen wurden die Antikörpertiter im Serum der Mäuse mittels ELISA bestimmt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde in jeder Gruppe die Milz der Maus mit dem höchsten Titer entnommen und für die Fusion verwendet.

Die Milzen aller drei Mäuse, die für die Fusionen ausgewählt wurden, waren von normaler

Größe und wiesen keine besonderen Auffälligkeiten auf. Aus den drei Fusionen resultierten

durchschnittlich 135 potentielle Hybridomklone pro 108 Milzzellen (Tabelle 7). Von allen Klonen,

ERGEBNISSE

73

die nach der Selektion in HAT-Medium sehr gut proliferierten, wurden die Überstände

gesammelt und die Anti-PrP-Antikörper-produzierenden Klone nach einem dreistufigen

Screeningverfahren isoliert (3.1.2).

Tabelle 7: Ausgewählte Parameter der Fusionen

OD der Anzahl der

Set Seren der einge-

setzten Tiere 1

Positivkontrolle

6H41

Milz-

zellen 2

Hybridom-

klone

Effizienz

der

Fusion 3

I 2,108 2,404 1,1 x 108 150 136

II 2,369 2,355 4,1 x 107 56 137

III 1,26 1,492 9 x 107 120 133 1 Die OD der Proben wurde im ELISA bei einer 1:20.000-Verdünnung bestimmt, die einer Antikörper- konzentration von ca. 0,4 ng/ml für den Antikörper 6H4 entspricht. 2 Die angegebene Zahl der Milzzellen wurde im Verhältnis von 3:1 mit Myelomzellen fusioniert. 3 Die Effizienz der Fusion ist als Anzahl der potentiellen Klone pro 108 Milzzellen angegeben.

3.1.2 Isolierung von monoklonalen Anti-PrP-Antikörp ern

Die Isolierung von Anti-PrP-Antikörper-exprimierenden Hybridomen erfolgte in einem

dreistufigen Screeningverfahren. Zuerst wurden die in den Überständen enthaltenden

Antikörper auf ihre Bindung an rekombinantes Maus-PrP mittels ELISA getestet. Positive

Proben wurden im zweiten Schritt auf die Erkennung von PrPC auf der Oberfläche von N2a-

Zellen mittels Durchflusszytometrie gescreent und anschließend wurde ihre Spezifität für PrPC

und PrPSc in murinen Gehirnhomogenaten im Western Blot bestimmt. Nur Antikörper, die in

allen drei Assays spezifisch PrP erkannten, wurden weiterkultiviert und aufgereinigt (3.1.3).

Abbildung 12 zeigt am Beispiel des Antikörpers B2-43-133 aus Set II die Ergebnisse des

dreistufigen Screeningverfahrens der Hybridomüberstände.

Der Überstand des potentiellen Antikörpers B2-43-133 erkannte rekombinantes PrP im ELISA

bis zu einer Endverdünnung von 1:640.000. Im Vergleich konnte der Referenzantikörper 6H4

(1 mg/ml) noch bis zu einer Verdünnung von 1:2.560.000 detektiert werden, welche einer

Antikörpermenge von ca. 0,003 ng/ml entspricht. Während des Screenings erfolgte keine

quantitative Bestimmung der Antikörpermenge in den Überständen, da die Sekretionsrate der

einzelnen Klone stark variieren kann. Als Ausschlusskriterium wurden Überstände mit einer OD

von kleiner als 0,5 (Standardverdünnung 1:20.000) nicht weiter verwendet. Dieser Wert

entspricht einer Konzentration von ca. 0,1 ng 6H4/ml. Aus den Fusionen I, II und III wurden

jeweils 15, 9 und 24 positive Klone erhalten und für das weitere Screening verwendet.

ERGEBNISSE

74

C)

B)A) 6H4

B2-43-133

nur 2.Ak

kDa:

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

1:20

000

1:40

000

1:80

000

1:160

000

1:32

0000

1:640

000

1:12

8000

0

1:256

0000

Verdünnung

OD

B2-43-133

6H4

B2-43-133 6H4

C)

B)A) 6H4

B2-43-133

nur 2.Ak

kDa:

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

1:20

000

1:40

000

1:80

000

1:160

000

1:32

0000

1:640

000

1:12

8000

0

1:256

0000

Verdünnung

OD

B2-43-133

6H4

B2-43-133 6H4

C)

B)A) 6H4

B2-43-133

nur 2.Ak

kDa:

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

1:20

000

1:40

000

1:80

000

1:160

000

1:32

0000

1:640

000

1:12

8000

0

1:256

0000

Verdünnung

OD

B2-43-133

6H4

B2-43-133 6H4

Abbildung 12: Dreistufiges Screeningverfahren zur I solierung des potentiellen Anti-PrP-Antikörper-produzierenden Klons B2-43-133. Der Zellkulturüberstand des potentiellen Klons B2-43-133 erkennt sowohl rekombinantes murines PrP im ELISA (A) als auch natives PrPC auf N2a-Zellen in der FACS-Analyse (B). Im Western Blot detektieren die Antikörper im Überstand denaturiertes PrPC und PrPSc in Gehirnhomogenaten von Prionen-infizierten (RML) und nicht-infizierten wildtypischen Mäusen (Prnp+/+) vergleichbar mit dem typischen Bandenmuster, welches der Referenzantikörper 6H4 erkennt (C). Als Negativkontrollen wurden beim ELISA Medium, bei der FACS-Analyse N2a-Zellen, die nur mit dem sekundären Antikörper inkubiert wurden und beim Western Blot Gehirnhomogenate von Prnp0/0-Mäusen, die kein PrPC exprimieren, verwendet.

Im zweiten Screeningschritt wurde die Spezifität des Antikörpers im Überstand durch die

Bindung an zelluläres PrPC auf der Oberfläche von N2a-Zellen mittels FACS-Analyse

untersucht. Der Überstand des potentiellen Antikörpers B2-43-133 zeigte einen

charakteristischen Fluoreszenzpeak, wie der Referenzantikörper 6H4 (Abbildung 12B). Die

geringere Signalintensität kann auf der geringeren Antikörpermenge im Überstand vom Klon

B2-43-133 beruhen, welche sich bei der Endverdünnung im ELISA zeigte (Abbildung 12A). Es

wurden nur Antikörper weiterkultiviert, deren Fluoreszenzpeak und -intensität ähnlich wie die

des Referenzantikörpers 6H4 waren. Aus diesem Schritt resultierten jeweils acht, sechs und

zwölf positive Klone aus den Sets I, II und III.

ERGEBNISSE

75

Im dritten Schritt erfolgte das Screening im Western Blot, um die Spezifität für PrPC und PrPSc in

Gehirnhomogenaten zu bestimmen. Hierzu wurden wildtypische Mäuse (Prnp+/+) verwendet, die

entweder nicht infiziert waren oder nach Infektion mit RML-Prionen im terminalen Stadium

genommen wurden. Der Überstand des potentiellen Antikörpers B2-43-133 erkannte das

typische Bandenmuster für PrPC bestehend aus der nicht-glykosylierten, der einfach- und

zweifach-glykosylierten Form (Abbildung 12C). Ebenfalls wird das charakteristische

Bandenmuster für PrPSc erkannt, in welchem die drei Formen mit einem geringeren

Molekulargewicht auftreten, welches aus der partiellen Resistenz von PrPSc gegenüber der

Behandlung mit Proteinase K (PK) resultiert. Während hierbei PrPC vollständig verdaut wird,

erfolgt bei PrPSc nur eine N-terminale Abspaltung von wenigen Aminosäuren (McKinley et al.,

1983). Der Überstand des potentiellen Antikörpers B2-43-133 erkennt spezifisch das

Bandenmuster von PrPC und PrPSc wie der Referenzantikörper 6H4, jedoch keine

unspezifischen Banden im Gehirnhomogenat einer Maus, die kein PrPC exprimiert (Prnp0/0)

(Abbildung 12C). Überstände von Klonen, die denaturiertes PrPC und PrPSc im Western Blot

unspezifisch erkannten, wurden verworfen.

Aus diesem dreistufigen Screeningverfahren wurden jeweils vier, fünf und zehn positive Klone

aus den Sets I, II und III isoliert und durch eine limitierende Verdünnung subkloniert, um

monoklonale Antikörper zu erhalten. Die Subklonierung erfolgte entweder ein- oder zweimal

(Tabelle 8). Nach der Subklonierung der Klone wurde die Spezifität der monoklonalen

Antikörper erneut mit den drei ausgewählten Methoden des Screeningverfahrens bestätigt

(Daten nicht gezeigt). Somit konnten aus den 19 Anti-PrP-Hybridomklonen insgesamt sieben

stabile Hybridomzelllinien etabliert werden (Tabelle 8).

Tabelle 8: Übersicht der neuen monoklonalen Anti-Pr P-Antikörper

Set Antigen 1 Anzahl mAk (Klone) Name mAk 2

I nativ gefaltetes PrP 1 103-8

II fibrilläres PrP 2 B2-31-166

B2-43-133

III nativ gefaltetes PrP 4 7-12-5

12-29

48-11-5

110-10 1 Als Antigen wurde rekombinantes Maus-PrP verwendet, welches entweder in seiner nativ gefalteten oder in einer fibrillären Form verwendet wurde. 2 Der Name des monoklonalen Antikörpers (Anzahl der Zahlen) gibt die Anzahl der Subklonierungen an, die entweder einmal (z.B. 103-8) oder zweimal (z.B. 48-11-5) erfolgten.

ERGEBNISSE

76

Nach Abschluss der Subklonierung proliferierte der Klon B2-31-166 nur schlecht. Um die

Wachstumsbedingungen zu verbessern, wurden der Klon bis zu zwei Monate mit Interleukin-6

(IL-6) behandelt. IL-6 ist ein proinflammatorisches Interleukin, das als B-Zell-stimulierender

Faktor bereits aktivierte B-Zellen zur Ausdifferenzierung und Antikörpersekretion anregt

(Hansson, 1990). Nach der Behandlung wuchs auch dieser Klon in einem regelmäßigen

Rhythmus. Die anderen Hybridomzelllinien wurden problemlos kultiviert.

3.1.3 Antikörperproduktion und -konzentrierung in h oher Reinheit

Um für weitere Studien aufgereinigte Antikörper unter standardisierten Bedingungen verwenden

zu können, wurden die Antikörper aus den Überständen nach Kultivierung der Klone in Zwei-

Kompartiment-Bioreaktoren mittels Protein G-Säulen in hoher Reinheit isoliert, konzentriert und

deren Konzentration bestimmt. Hierbei zeigten die Klone vergleichbare Wachstumsraten,

jedoch unterschieden sich die Mengen der sezernierten Antikörper erheblich und lagen

zwischen 0,004 und 1,4 mg pro ml Überstand (Tabelle 9). Da sowohl einzelne Klone aus Set II

(12-29) und Set III (B2-31-166, B2-43-133) nur geringe Antikörpermengen sezernierten

(< 0,06 mg/ml), konnte kein spezifischer Effekt des Antigens festgestellt werden.

Die Reinheit der aufgereinigten Antikörper wurde mittels Silbergel und isolelektrischer

Fokussierung überprüft und war mit der des kommerziellen Antikörpers 6H4 vergleichbar (Daten

nicht gezeigt). Von allen sieben etablierten Hybridomzelllinien konnten ausreichende Mengen

an aufgereinigten Antikörpern für die Charakterisierung (3.2) gewonnen werden.

Im Gegensatz zu den anderen Klonen stoppte die Hybridomzellinie B2-31-166 trotz normaler

Proliferation in einem synthetischen Medium bereits nach kurzer Zeit die Sezernierung von

Antikörpern, so dass diese Zellen für die Produktion nach wenigen Passagen durch neue

Hybridomzellen ersetzt werden mussten. Dieses Phänomen wurde bereits in einer früheren

Studie beobachtet, in der als mögliche Ursache für die kurzen Sezernierungszeiträume eine

Interaktion des Antikörpers mit intra- oder extrazellulärem PrPC angenommen wurde

(Williamson et al., 1996).

ERGEBNISSE

77

Tabelle 9: Durchschnittliche Mengen an sezernierten Antikörpern im Medium

Set Ak Produktionsrate (mg/ml) 1

I 103-8 0,1 ± 0,03

II B2-31-166 0,03 ± 0,01

B2-43-133 0,06 ± 0,02

III 7-12-5 0,7 ± 0,23

12-29 0,004 ± 0,002

48-11-5 0,5 ± 0,33

110-10 1,4 ± 0,06 1 Durchschnittliche Antikörpermengen pro ml Zellkulturüberstand

nach Kultivierung der Zellen in einem Zwei-Kompartiment-Bioreaktor und Reinigung über Protein G-Säulen (n = 3-6).

3.2 Charakterisierung der Anti-PrP-Antikörper

3.2.1 Klassen und Subklassen der Anti-PrP-Antikörpe r

Für die Antikörper 7-12-5, 12-29, 110-10 und B2-31-166 wurde mittels ELISA-Kit (Clonotyping

System) die schwere Kette der IgG2a-Subklasse nachgewiesen, während die Antikörper

48-11-5, 103-8 und B2-43-133 zur IgG1-Unterklasse gehörten. Da die Fusionen nach

mehrfacher Immunisierung der Mäuse erfolgten, war zu erwarten, dass bereits ein „class

switch“ (1.2.2) stattgefunden hatte und die sezernierten Antikörper der IgG-Klasse angehören.

Die leichte Kette aller Antikörper war vom κ-Typ. Die κ-Kette wird in Mäusen 20 Mal häufiger

rekombiniert als die λ-Kette (Janeway et al., 2005).

3.2.2 Epitop-Bestimmung der Anti-PrP-Antikörper

Für die Bestimmung des Epitops der Anti-PrP-Antikörper wurde die Bindung an verschiedene

PrP-Deletionsmutanten mittels Durchflusszytometrie analysiert, die von 293T-Zellen, die kein

endogenes PrPC tragen, exprimiert wurden (3.2.2.2). Dazu wurden PrP-Plasmide hergestellt,

die sowohl eine N-terminale als auch eine interne Deletion besaßen (3.2.2.1)

3.2.2.1 PrP-Plasmide mit einer N-terminalen und ein er internen Deletion

In einem Vorexperiment zeigte sich, dass sechs der sieben Antikörper an PrP mit einer

N-terminalen Deletion (Reste 32-93) und einer internen Deletion (Reste 141-176) nicht binden

konnten. Da diese Antikörper jedoch PrP∆32-93 erkannten (3.2.2.2), wurde das Epitop im

Bereich der internen Deletion vermutet. Um die wahrscheinliche Bindungsregion zwischen den

Resten 141 und 176 näher zu charakterisieren, wurden zwei PrP-Moleküle hergestellt, welche

ERGEBNISSE

78

171

15832 93PrP ∆32-93

∆158-171

157PrP ∆32-93

∆142-157

sSPrP

32 93 142

STE TM H1 H3H2

OKTAREPEATS ß2ß1

innerhalb dieser Sequenz kleinere Deletionen enthielten. Dazu wurden mittels 3-Weg-Ligation

die Aminosäuren 141 und 158 sowie 157 und 172 aneinander fusioniert (Abbildung 13).

Abbildung 13: Schematische Darstellung der Struktur von Maus-PrP und der klonierten Mutanten mit N-terminaler ( ∆∆∆∆32-93) sowie interner Deletion ( ∆∆∆∆142-157 oder ∆∆∆∆158-171). Die drei α-Helices (H1-3), die beiden β-Faltblattstrukturen (β1, β2) sowie die Stopp-Transfer-Effektor-Sequenz (STE), die putative Transmembrandomäne (TM) und der GPI-Anker sind dargestellt.

Als Ausgangsplasmid für die Klonierung wurde das adenovirale Transferplasmid

pAd-CMV-PrP∆32-93 benutzt, welches bereits die N-terminale Deletion der Aminosäuren 32 bis

93 im offenen Leserahmen der murinen PrP-Sequenz unter der Kontrolle eines CMV-Promoters

enthält. Für die Klonierung wurde die Sequenz des mutierten PrP (ca. 830 bp) durch einen

Verdau mit den beiden Enzymen BamHI und MfeI aus dem pAd-CMV-PrP∆32-93-Plasmid

entfernt. Danach wurden für die beiden gewünschten Deletionen jeweils zwei PCR-Produkte

erzeugt und durch eine 3-Weg-Ligation mittels BamHI und MfeI in den verbleibenden Vektor

(6,1 kb) kloniert (Abbildung 14).

Die nahtlose Fusion der beiden PCR-Fragmente wurde durch den Einbau einer

Restriktionsschnittstelle an die zu fusionierenden PCR-Enden mittels PCR-Primern ermöglicht.

Hierbei wurde das Restriktionsenzym der Klasse II SapI verwendet, bei dem die spezifische

Erkennungssequenz außerhalb der Schnittstelle liegt (Padgett und Sorge, 1996). Da die

Kapazität von SapI direkt an den Enden der PCR-Produkte zu schneiden limitiert ist, wurden die

Fragmente zunächst ohne Verdau in den pBluescript II SK(+) Vektor über eine EcoRV-

Schnittstelle subkloniert. Alle subklonierten Fragmente wurden dann mittels M13-Primerset

herausamplifiziert, wodurch an die ursprünglichen PCR-Fragmente zusätzlich 72 bp an das

5'-Ende und 113 bp an das 3'-Ende angehängt wurden. Die zusätzlichen Basenpaare

ermöglichten einen analytischen Restriktionsverdau, um die Orientierung der Fragmente und

das Schneiden der eingeführten Schnittstellen kontrollieren zu können. Die verifizierten DNA-

Fragmente wurden isoliert und für die 3-Weg-Ligation verwendet, aus der die beiden

gewünschten Deletionen (PrP∆32-93 & ∆142-157 und PrP∆32-93 & ∆158-171) resultierten

(Abbildung 14).

ERGEBNISSE

79

SalI

1

pAd-CMV-PrP ∆∆∆∆ 32-93

~7000 bp

CMV

254

BS_MCS_NotIBamHI

PrP del 142 (rev) (1)


SalI

1


~7000 bp

CMV

254

SAP_PrP_Mfe1BamHI

PrP del 157 (for) (3)


BamHI SapI SapI MfeIEcoRV linearisiert

Dephosphorylierung der DNA Termini

SapI629

M13 rev

pBluescript II SK (+)

2961 bp

T7 T3

791

M13 for

Phosphorylierung der DNA Termini Ligation

SapI629

M13 rev


2961 bp

T7 T3

791

M13 for

DNA-Fragment

BamHI SapI

(1) 444 bp

BamHI/ SapI- bzw. SapI/ MfeI-Verdau

Ligation

SalI

1

pAd-CMV-PrP ∆∆∆∆ 32-93 & ∆∆∆∆ 142-157

CMV

254

BamHIMfeI

1


CMV

254

BamHI

SalI

SapI MfeI(3) 431 bp

(1) 629 bp (3) 616 bp

(3) 370 bp

BamHI SapI

(2) 492 bp

SapIMfeI

(4) 389 bp

MCS

EcoRV EcoRVX X

BamHI SapI SapI MfeI(2) 677 bp (4) 574 bp

SalI

1

pAd-CMV-PrP ∆∆∆∆ 32-93 & ∆∆∆∆ 158-171

CMV

254

BamHI

(4) 328 bp

(1) 403 bp

(2) 451 bp

SalI

1


~7000 bp

CMV

254

BS_MCS_NotIBamHI



SalI

1


~7000 bp

CMV

254

SAP_PrP_Mfe1BamHI



BamHI SapI SapI MfeIEcoRV linearisiert

Dephosphorylierung der DNA Termini

SapI629

M13 rev


2961 bp

T7 T3

791

M13 for

Phosphorylierung der DNA Termini Ligation

SapI629

M13 rev


2961 bp

T7 T3

791

M13 for

DNA-Fragment

BamHI SapI

(1) 444 bp

BamHI/ SapI- bzw. SapI/ MfeI-Verdau

Ligation

SalI

1

pAd-CMV-PrP ∆∆∆∆ 32-93 & ∆∆∆∆ 142-157

CMV

254

BamHIMfeI

1


CMV

254

BamHI

SalI

SapI MfeI(3) 431 bp

(1) 629 bp (3) 616 bp

(3) 370 bp

BamHI SapI

(2) 492 bp

SapIMfeI

(4) 389 bp

MCS

EcoRV EcoRVX X

BamHI SapI SapI MfeI(2) 677 bp (4) 574 bp

SalI

1

pAd-CMV-PrP ∆∆∆∆ 32-93 & ∆∆∆∆ 158-171

CMV

254

BamHI

(4) 328 bp

(1) 403 bp

(2) 451 bp

Abbildung 14: 3-Weg-Ligation zur Deletion der Reste 142 bis 157 bzw. 158 bis 171 in PrP ∆∆∆∆32-93. Die Deletion der Reste erfolgte durch eine PCR-Klonierungsstrategie, welche durch den Einbau einer artifiziellen SapI-Schnittstelle eine nahtlose Ligation der jeweiligen Fragmente miteinander erlaubte. Die Klonierungseffizienz wurde durch einen Subklonierungsschritt in den pBluescript II SK(+) Vektor erhöht. Durch diesen Schritt wurden zusätzliche Basenpaare an das ursprüngliche PCR-Fragment angehängt, welche ein vollständiges Schneiden der generierten Schnittstellen erleichterten. Eine Ligation der Fragmente 1 und 3 bzw. 2 und 4 führte zu den Vektoren pAd-CMV-PrP∆32-93 & ∆142-157 und pAd-CMV-PrP∆32-93 & ∆158-171. Die verwendeten Primer und Schnittstellen sind eingezeichnet (MCS = Multiple Cloning Site; T7 = Promoter; T3 = Promoter).

ERGEBNISSE

80

Die Sequenzanalyse des Plasmids pAd-CMV-PrP∆32-93 & ∆142-157 zeigte einen

unerwünschten Aminosäureaustausch des Rests 139 (Histidin→ Asparaginsäure). Da diese

PrP-Mutante nach transienter Expression korrekt auf der Oberfläche von 293T-Zellen exprimiert

wurde (Abbildung 15), wurde dieses Plasmid für die Epitop-Bestimmung verwendet (3.2.2.2).

Obwohl die Sequenzanalyse des zweiten Konstrukts pAd-CMV-PrP∆32-93 & ∆158-171 keine

Mutation zeigte, konnte PrP nicht auf der Oberfläche von 293T-Zellen nachgewiesen werden.

Ob dies aus einer Instabilität der PrP-Mutante nach Entfernung des zweiten β-Faltblatts

resultierte, wurde nicht weiter untersucht.

3.2.2.2 Bestimmung des Epitops mittels FACS

Für die Bestimmung des Epitops der aufgereinigten Anti-PrP-Antikörper wurden humane

293T-Zellen mit verschiedenen PrP-Deletionsmutanten (Abbildung 15B) transient transfiziert.

Die Expression aller PrP-Deletionsmutanten wurde mit einem polyklonalen Kaninchenserum

bestätigt (Daten nicht gezeigt). Da diese Zellen kein PrPC exprimieren, kann die Bindung des

Antikörpers an das entsprechende PrP-Molekül mittels FACS-Analyse direkt bestimmt werden

(Abbildung 15A).

Die N-terminale Deletionsmutante PrP∆32-93 enthält keine Oktarepeatsequenz und wird von

allen sieben Antikörpern mit vergleichbarer Fluoreszenzintensität erkannt, die auch der

Referenzantikörper 6H4 zeigt, dessen Epitop zwischen den Aminosäuren 144 bis 151 liegt

(Korth et al., 1997). Die nächstgrößere Deletion PrP∆32-106, in der neben der

Oktarepeatsequenz auch die Stopp-Transfer-Effektor-Sequenz (STE) deletiert ist, wurde mit

Ausnahme des Antikörpers B2-31-166 von allen sechs Antikörpern erkannt. Somit liegt das

Epitop des Antikörpers B2-31-166 innerhalb der Sequenz der Reste 93 bis 106 von Maus-PrP

(Abbildung 16). Da die PrP-Mutante mit einer N-terminalen (PrP∆32-93) und einer internen

Deletion (PrP∆141-176) nur von dem Antikörper B2-31-166 erkannt wird, wurde das Epitop der

verbleibenden Antikörper im Bereich der Reste 141 und 176 lokalisiert. Wird die interne

Deletion auf die Reste 142 bis 157 (Helix 1) reduziert (3.2.2.1), können die Antikörper 7-12-5,

12-29 und 48-11-5 wieder binden (Abbildung 15A). Somit liegt das Epitop dieser drei Antikörper

vermutlich in der Region um das β-Faltblatt 2 (Reste 158 bis 176) (Abbildung 16). Da die drei

Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 ebenso wie der Referenzantikörper 6H4 an diese

Mutante nicht binden können, sind deren Epitope im Bereich der Helix 1 (Reste 142-157)

lokalisiert. Dieses Ergebnis stimmt mit dem bekannten Epitop des Antikörpers 6H4 überein

(Korth et al., 1997). Abbildung 16 zeigt eine Zusammenfassung der Epitope der sieben

Antikörper.

ERGEBNISSE

81

B

103-8 110-10 B2-31-166

B2-43-133 6H4 Anti-IgG-FITC

7-12-5 12-29 48-11-5A

32 106

PrP ∆32-106 H1 H2 H3

PrP ∆32-93 H1 H232 93

H3

157

PrP ∆32-93∆142-157

PrP ∆32-93∆141-176

32 141

176

32 93 142

93

H2

H2

H3

H3

B

103-8 110-10 B2-31-166103-8103-8 110-10 B2-31-166

B2-43-133 6H4 Anti-IgG-FITC

7-12-5 12-29 48-11-5A 7-12-5 12-29 48-11-5A

32 106

PrP ∆32-106 H1 H2 H3

PrP ∆32-93 H1 H232 93

H3

157

PrP ∆32-93∆142-157

PrP ∆32-93∆141-176

32 141

176

32 93 142

93

H2

H2

H3

H3

Abbildung 15: Epitop-Bestimmung der Anti-PrP-Antikö rper mittels Expressions- und FACS-Analyse von PrP-Deletionsmutanten. Die Histogramme zeigen die Bindung der Anti-PrP-Antikörper an die 293T-Zellen (A), welche die angegebenen PrP-Deletionsmutanten transient exprimierten (B). Die Bindung des Referenzantikörpers 6H4 diente als Positivkontrolle für das Epitop der Helix 1 (142-157). Als Negativkontrolle sind transfizierte 293T-Zellen gezeigt, die nur mit dem FITC-gekoppelten Anti-IgG-Antikörper behandelt wurden. Die Farben der einzelnen Fluoreszenzpeaks in den Histogrammen entsprechen denen der angegebenen PrP-Mutanten.

ERGEBNISSE

82

7-12-5

N C

GPI

93-106 142-157 158-176

S-S

STE TM H1 H2 H3ββββ1 ββββ2Oktarepeats

23 95-112

112-126

128-131

161-164

144-151

179-193

200-217

23151-91

12-29

103-8

B2-31-166

48-11-5

B2-43-133

110-10

7-12-5

N C

GPI

93-106 142-157 158-176

S-S


23 95-112

112-126

128-131

161-164

144-151

179-193

200-217

23151-91

12-29

103-8

B2-31-166

48-11-5

B2-43-133

110-10

Eine weitere Einteilung der sieben Antikörper ist entsprechend der lokalisierten Epitope

möglich, so dass Helix 1-bindendende Antikörper (103-8, 110-10 und B2-43-133),

β-Faltblatt 2-bindendende Antikörper (7-12-5, 12-29 und 48-11-5) und ein Stopp-Transfer-

Effektor-Sequenz (STE)-bindender Antikörper (B2-31-166) unterschieden werden können.

Abbildung 16: Schematische Darstellung der Struktur von Maus-PrP und Lokalisierung der Epitope der Anti-PrP-Antikörper. Als Orientierung wurden sowohl die Aminosäurereste als auch die drei α-Helices (H1-3), die beiden β-Faltblattstrukturen (β1, β2), die Stopp-Transfer-Effektor-Sequenz (STE), die putative Transmembrandomäne (TM) und der GPI-Anker dargestellt (S-S = Disulfidbrücke).

3.2.2.3 Bestimmung des Minimalepitops mittels Alani n-Scanning

Da einige Antikörper mit inhibitorischem Effekt auf die PrPSc-Akkumulation in Zellkultur PrPC im

Bereich der Helix 1 (Reste 143-153) binden (Tabelle 18), sollte im nächsten Schritt das Epitop

der drei Helix 1-bindenden Antikörper (103-8, 110-10 und B2-43-133) genauer charakterisiert

werden. Dazu wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese ein Alanin-Scanning von einzelnen

Resten im Bereich der Helix 1 vorgenommen. Um die Helix 1 dabei nicht zu destabilisieren,

wurden die stabilisierenden Salzbrücken erhalten (Abbildung 17) (Norstrom und Mastrianni,

2006). Innerhalb der Helix 1 (Reste 143-153) wurden die beiden Aminosäuren Tyrosin 148 und

Glutaminsäure 151 ausgewählt. Zusätzlich wurde die Aminosäure Histidin 176 in der Nähe der

Helix 2 (Reste 179-192) gegen ein Alanin ausgetauscht (Abbildung 18).

ERGEBNISSE

83

Abbildung 17: Schematische Darstellung der geladene n Reste innerhalb der αααα-Helix 1 von Maus-PrPC. Die α-Helix 1 beinhaltet sechs geladene Reste. Die basischen Reste sind blau und die sauren Reste in rot dargestellt (Norstrom und Mastrianni, 2006).

Als Ausgangsplasmid wurde der pAd-CMV-PrP∆32-93 Vektor verwendet und die erfolgte

Mutagenese durch Sequenzanalyse überprüft. Neben dem gewünschten Austausch Y148A

enthielt das Plasmid pAd-CMV-PrP∆32-93 & Y148A die weitere Mutation E151A. Die

Sequenzen der beiden Plasmide pAd-CMV-PrP∆32-93 & E151A und pAd-CMV-PrP∆32-93 &

H176A bestätigten die gewünschten Mutationen. Alle drei PrP-Mutanten wurden nach der

Transfektion von 293T-Zellen exprimiert (Daten nicht gezeigt). Die durchflusszytometrische

Analyse zeigte, dass Alanin in den Positionen 148, 151 und 176 weder die Bindung der

Helix 1-bindenden noch die Bindung der β-Faltblatt 2-bindenden Antikörper beeinflusste (Daten

nicht gezeigt), so dass das Minimalepitop der Antikörper nicht näher bestimmt werden konnte.

ERGEBNISSE

84

oktarepeats GPIß1 ß2

N C

GPIS-S


23 231

Y148A H176A

E151A

oktarepeats GPIß1 ß2

N C

GPIS-S


23 231

Y148A H176A

E151A

Abbildung 18: Schematische Darstellung von Maus-PrP C und der drei Substitutionen für die Bestimmung des Minimalepitops. Bei den ersten beiden Konstrukten wurde jeweils eine Aminosäure im Bereich der Helix 1 (Reste 143-153) durch ein Alanin ausgetauscht (pAd-CMV-PrP∆32-93 & Y148A und pAd-CMV-PrP∆32-93 & E151A). Eine weitere Aminosäure an Position 176, kurz vor der Helix 2 (Reste 179-193), wurde ebenfalls in ein Alanin mutiert (pAd-CMV-PrP∆32-93 & H176A) (H1-3 = α-Helix 1-3, β1-2 = β-Faltblatt 1-2, STE = Stopp-Transfer-Effektor-Sequenz, TM = Transmembrandomäne, S-S = Disulfidbrücke, GPI = Glycosylphosphatidylinositol-Anker).

3.2.3 Avidität der Anti-PrP-Antikörper

Die Avidität ist ein Maß für die Gesamtstärke aller Antigen-Antikörper-Bindungen und ist

abhängig von der Valenz des Antikörpers und des Antigens. Zur Bestimmung der Avidität wurde

ein indirekter ELISA gegen rekombinantes PrP durchgeführt und ein Ammoniumthiocyanat

(NH4SCN)-Elutionsschritt zwischengeschaltet. Je avider ein Antikörper ist, desto höhere

Molaritäten von NH4SCN waren notwendig, um die Antigen-Antikörper-Interaktionen zu lösen

(Abbildung 19). Der Aviditätsindex (AI) wurde als Molarität von NH4SCN angegeben, bei der

das Signal um 50% reduziert wurde (Tabelle 10).

Die höchsten Aviditätsindizes wurden für die Gruppe der Helix 1-bindenden Antikörper

bestimmt. Beim Antikörper 103-8 war für eine 50%ige Reduktion der Absorption eine

1,37 molare NH4SCN-Lösung notwendig und bei den Antikörpern 110-10 und B2-43-133 eine

Molarität von 0,67 und 0,57. Der Referenzantikörper ICSM18 (Beringue et al., 2004) zeigte mit

2,45 M den höchsten Aviditätsindex, während bei einer NH4SCN-Molarität von 0,94 50% der

Interaktionen mit dem Referenzantikörper 6H4 aufgehoben wurden. Die Bindungen der

β-Faltblatt 2- und STE-bindenden Antikörper waren dagegen weniger avid. Bei diesen

Antikörpern, zu denen auch der Referenzantikörper ICSM35 (Beringue et al., 2004) gehörte,

waren bereits Molaritäten kleiner als 0,5 M ausreichend, um 50% der Interaktionen aufzuheben.

Die Helix 1-bindenden Antikörper besitzen somit in der vorgenommenen Untersuchung die

höchste Avidität.

ERGEBNISSE

85

1

10

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

NH SCN (M)

Abs

orpt

ion

(%)

7-12-5 12-29 48-11-5 103-8 110-10 B2-31-166

B2-43-133 6H4 ICSM 18 ICSM 35 50%

4

1

10

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

NH SCN (M)

Abs

orpt

ion

(%)

7-12-5 12-29 48-11-5 103-8 110-10 B2-31-166

B2-43-133 6H4 ICSM 18 ICSM 35 50%

4

Abbildung 19: Bestimmung der Avidität der Anti-PrP- Antikörper. Die im ELISA ermittelte Absorption der Antikörper ohne den Zusatz von NH4SCN wurde als 100% Kontrolle gesetzt. Die restlichen Absorptionen wurden dazu in Relation gesetzt und gegen die Molarität von NH4SCN aufgetragen. Der Aviditätsindex der Helix 1- (schwarz), β-Faltblatt 2- (rot) sowie der STE-bindenden Antikörper (blau) entspricht der Molarität von NH4SCN, welche zu einer 50%igen Reduktion der Absorption führt.

Tabelle 10: Aviditätsindizes (AI) der Anti-PrP-Anti körper

Antikörper AI(M)

H1-bindende Ak

103-8 1,37

110-10 0,67

B2-43-133 0,57

Kontrollen:

ICSM 18 2,45

6H4 0,94

β2-bindende Ak

12-29 0,3

48-11-5 0,22

7-12-5 0,11

STE-bindende Ak

B2-31-166 0,11

Kontrolle:

ICSM 35 0,44

Der Aviditätsindex (AI) ist angegeben als Mola-rität (M) der Ammoniumthiozyanatlösung, bei der die Absorption um 50% reduziert ist.

ERGEBNISSE

86

3.2.4 Dissoziationskonstanten (K D) der Anti-PrP-Antikörper

Die Affinität ist im Gegensatz zur Avidität ein Maß für die Stärke einer monovalenten Bindung

zwischen Antikörper und Antigen. Über die Affinität eines Antikörpers gibt die

Dissoziationskonstante KD Auskunft. Dabei gilt: Je höher die Affinität eines Antikörpers zu

seinem Antigen ist, desto niedriger ist die KD-Konstante. In der vorliegenden Arbeit wurden die

KD-Konstanten auf zwei unterschiedlichen Substraten mit zwei verschiedenen Methoden

bestimmt. Für beide Bestimmungen wurde die KD-Konstante aus einer Sättigungskurve und

einem Scatchard-Diagramm mittels PRISM®- Software ermittelt. In Tabelle 11 sind die

KD-Konstanten als Mittelwerte mit Standardabweichungen von drei Versuchen

zusammengefasst.

Alle Anti-PrP-Antikörper zeigen eine ähnliche Affinität zu rekombinantem PrP, die mit den

beiden Referenzantikörpern 6H4 und ICSM18 vergleichbar ist. Es wurde kein signifikanter

Unterschied zwischen Helix 1- und β-Faltblatt 2-bindenden Antikörpern festgestellt. Im Vergleich

zum Antikörper 6H4, welcher die niedrigste KD-Konstante besitzt (0,001 pmol), ist die Bindung

des Antikörpers B2-43-133 an rekombinantes PrP 16-fach weniger affin (0,0158 pmol), jedoch

liegen beide Dissoziationskonstanten im pikomolaren Bereich.

Tabelle 11: K D-Konstanten der Anti-PrP-Antikörper

KD (pmol)

Methode ELISA FACS

Substrat rek. PrP natives PrP Sc

H1-bindende Ak

103-8 0,0067 ± 0,0006 4,9 ± 0,125

110-10 0,0032 ± 0,0002 /

B2-43-133 0,0158 ± 0,0018 0,49 ± 0,055

Kontrollen

6H4 0,001 ± 0,0006 0,049 ± 0,004

ICSM 18 0,0053 ± 0,0005 0,7 ± 0,14

ββββ2-bindende Ak

7-12-5 0,0035 ± 0,0004 /

48-11-5 0,0039 ± 0,0003 1,7 ± 0,27

Die KD-Konstanten, die auf nativem PrP von ScN2a-Zellen mittels FACS-Analyse ermittelt

wurden, sind dagegen 50- bis 300-fach höher. Dieser Unterschied kann auf methodische

Ursachen oder ein verändertes Bindeverhalten der Antikörper an PrPC auf der Oberfläche von

Zellen zurückgeführt werden. Auch bei dieser Bestimmung besitzt der Referenzantikörper 6H4

ERGEBNISSE

87

die kleinste KD-Konstante (0,049 pmol). Im Vergleich dazu ist die Affinität der Antikörper

B2-43-133 und 103-8 10-bzw. 100-fach geringer. Mit einer KD-Konstante von 1,7 pmol ist die

Bindung des β-Faltblatt 2-bindenden Antikörpers 48-11-5 deutlich affiner als die des Antikörpers

103-8, jedoch auch weniger affin als die des Antikörpers B2-43-133.

Die Affinität aller Anti-PrP-Antikörper zu rekombinantem PrP ist somit relativ einheitlich,

während sich auf ScN2a-Zellen bis zu 100-fache Unterschiede zeigen.

3.3 Hemmung der Prionreplikation durch Anti-PrP-Ant ikörper in vitro

Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Anti-PrP-Antikörpern mit

therapeutischem Potential, die Prionreplikation in Zellkultur zu hemmen.

3.3.1 Einfluss der Anti-PrP-Antikörper auf die PrP Sc-Akkumulation in ScN2a-Zellen

Um den Einfluss der Anti-PrP-Antikörper auf die PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen zu

untersuchen, wurde nach einer fünftägigen Behandlung der Zellen mit den monoklonalen

Antikörpern (10 µg/ml) der PrPSc-Gehalt bestimmt. Die in Abbildung 20 dargestellten Resultate

wurden mehrfach reproduziert. Nach Behandlung mit den Helix 1-bindenden Antikörpern 103-8,

110-10 und B2-43-133 erfolgte eine vollständige Reduktion des PrPSc-Gehalts, die ebenfalls für

den Referenzantikörper 6H4 detektiert wurde. Der β-Faltblatt 2-bindende Antikörper 48-11-5

zeigte nur einen unvollständigen inhibitorischen Effekt, während die beiden β-Faltblatt 2-

bindenden Antikörper 7-12-5 und 12-29 sowie der STE-bindende Antikörper B2-31-166 die

PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen nicht beeinflussten. Eine Behandlung mit dem Anti-NCAM

Antikörper wirkte sich ebenfalls nicht auf den PrPSc-Gehalt der ScN2a-Zellen aus, da dieser

Antikörper nicht an PrPC bindet, sondern an das neurale Zelladhäsionsmolekül (NCAM), das

hauptsächlich im zentralen und peripheren Nervensystem exprimiert wird (Abbildung 20).

Um den Effekt zu quantifizieren, wurde die Intensität der PrPSc-Signale densitometrisch

bestimmt. Die Signalintensität der unbehandelten Zellen (MOCK) wurde als 100%-Wert gesetzt.

Nach der Behandlung mit den Antikörpern 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde der PrPSc-

Gehalt der Zellen um 95%, 93% und 99% reduziert. Diese Werte sind mit dem

Referenzantikörper 6H4 vergleichbar, dessen inhibitorische Wirkung bereits demonstriert wurde

(Enari et al., 2001; Heppner et al., 2001) und der in der vorliegenden Arbeit den PrPSc-Gehalt

um 97% reduzierte (Abbildung 20). Die unvollständig inhibitorische Wirkung des Antikörpers 48-

11-5 führte zu einer Reduktion von 73% des PrPSc-Gehalts. In ScN2a-Zellen, die mit den

Antikörpern 7-12-5, 12-29 und B2-31-166 behandelt wurden, konnte noch ein PrPSc-Gehalt von

74%, 74% und 56% detektiert werden.

ERGEBNISSE

88

20

30

PK: + + + + + + + + + +

48-1

1-5

103-

811

0-10

B2-43

-133

7-12

-56H

4MOCK

12-2

9NCAM

B2-31

-166

kDa:

20

30

PK: + + + + + + + + + +

48-1

1-5

103-

811

0-10

B2-43

-133

7-12

-56H

4MOCK

12-2

9NCAM

B2-31

-166

kDa:

Die Ergebnisse zeigen, dass die Helix 1-bindenden Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133

einen starken inhibitorischen Effekt besitzen, während die anderen Antikörper die

PrPSc-Akkumulation nicht oder unvollständig beeinflussen.

Abbildung 20: Reduktion des PrP Sc-Gehalts von ScN2a-Zellen durch Anti-PrP-Antikörper . Die ScN2a-Zellen wurden fünf Tage mit 10 µg mAk/ml behandelt. Als Positivkontrolle wurde der Antikörper 6H4 verwendet und als Negativkontrolle ein Anti-NCAM-Antikörper sowie unbehandelte Zellen (MOCK). Zur Detektion des PrPSc-Gehalts wurden die Zellen lysiert und die Lysate mit Proteinase K (PK) behandelt. Anschließend erfolgte die Analyse im Western Blot. Pro Reihe wurden 0,2 mg Protein aufgetragen und mit dem polyklonalen Antikörper SA2124 analysiert.

3.3.2 Untersuchung zur Zytotoxizität der Anti-PrP-A ntikörper

Um auszuschließen, dass die Reduktion des PrPSc-Gehalts der ScN2a-Zellen aus einem

zytotoxischen Effekt der Anti-PrP-Antikörper resultierte, wurde der Einfluss der Antikörper auf

die Vitalität der ScN2a-Zellen mittels MTT-Test analysiert. Dazu wurden Versuchsbedingungen

gewählt, die mit den unter 3.3.1 gewählten Konditionen identisch waren.

Für die Auswertung wurde die Absorption von unbehandelten ScN2a-Zellen (MOCK) als 100%-

Wert gesetzt und die restlichen Zell-Sets wurden dazu in Relation gesetzt (Abbildung 21). Im

Vergleich zur MOCK-Kontrolle hatten weder Anti-PrP-Antikörper mit einem vollständig

inhibitorischen Effekt auf die PrPSc-Akkumulation (103-8, 110-10 und B2-43-133) noch

Antikörper mit einem unvollständigen (48-11-5) oder keinem Effekt (7-12-5, 12-29 und B2-31-

166) einen zytotoxischen Einfluss auf die ScN2a-Zellen. Dies konnte auch für die

Referenzantikörper (6H4, ICSM18 und ICSM35) sowie für Antikörper, die gegen nicht-PrP-

Epitope gerichtet sind (IgG1, IgG2a), beobachtet werden. Zum Teil scheinen die Antikörper

sogar einen schwachen stimulierenden Effekt auf die Proliferation der ScN2a-Zellen zu besitzen

(z.B. B2-43-133, ICSM18, IgG1).

Unter den gewählten Versuchsbedingungen wurde kein zytotoxischer Effekt der Anti-PrP-

Antikörper auf ScN2a-Zellen beobachtet. Somit könnte die Reduktion des

ERGEBNISSE

89

0

20

40

60

80

100

120

7-12

-512

-29

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

B2-31

-166

MOCK6H

4

ICSM

18

ICSM

35Ig

G1Ig

G2a

Übe

rlebe

nde

Zelle

n in

%

103 ±±±± 5 103 ±±±± 5 100 ±±±± 7 100 ±±±± 6 99 ±±±± 5 104 ±±±± 5 103 ±±±± 6 100 101 ±±±± 7 103 ±±±± 1 97 ±±±± 1 106 ±±±± 5 104 ±±±± 4

Übe

rlebe

nde

Zel

len

in %

0

20

40

60

80

100

120

7-12

-512

-29

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

B2-31

-166

MOCK6H

4

ICSM

18

ICSM

35Ig

G1Ig

G2a

Übe

rlebe

nde

Zelle

n in

%

103 ±±±± 5 103 ±±±± 5 100 ±±±± 7 100 ±±±± 6 99 ±±±± 5 104 ±±±± 5 103 ±±±± 6 100 101 ±±±± 7 103 ±±±± 1 97 ±±±± 1 106 ±±±± 5 104 ±±±± 4

Übe

rlebe

nde

Zel

len

in %

PrPSc-Gehalts (3.2.1) aus einer spezifischen Interaktion der Anti-PrP-Antikörper mit PrP

resultieren.

Abbildung 21: Untersuchung zum zytotoxischen Effekt der Anti-PrP-Antikörper auf ScN2a-Zellen. Die ScN2a-Zellen wurden mit den Anti-PrP-Antikörper behandelt (5 Tage, 10 µg Ak/ml) und anschließend wurde die Anzahl lebender Zellen mittels MTT-Test bestimmt. Als Kontrolle wurden drei kommerzielle Anti-PrP-Antikörper (dunkelgrau) und zwei unspezifische Antikörper (hellgrau) mitgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte des prozentualen Anteils der lebenden Zellen und die dazugehörigen Standardabweichungen in Relation zu den unbehandelten Zellen (schwarz) (n=3).

3.3.3 Bindung der Anti-PrP-Antikörper an PrP Sc von ScN2a-Zellen

Um zu bestimmen, ob der inhibitorische Effekt der Anti-PrP-Antikörper mit einer spezifischen

Bindung an PrPSc korreliert, wurde die Bindung der Antikörper an PrPSc auf ScN2a-Zellen

mittels Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Dazu wurde PrPC mittels Guanidiniumthiozyanat

(GnSCN) vollständig zerstört. Die Ergebnisse sind in Abbildung 22 beispielhaft für den

β-Faltblatt 2-bindenden Antikörper 7-12-5, den Helix 1-bindenden Antikörper B2-43-133 und den

Referenzantikörper 6H4 dargestellt, konnten jedoch für alle Antikörper beobachtet werden.

In der oberen Reihe ist eine deutliche Bindung aller drei Antikörper an PrPSc von ScN2a-Zellen

anhand der grünen Fluoreszenz zu erkennen. Im Gegensatz dazu ist bei den cuScN2a-Zellen

kein Signal detektierbar. Diese Zellen tragen durch die Behandlung mit Pentosanpolysulfat

(Birkett et al., 2001) kein PrPSc mehr und durch die Behandlung mit GnSCN ist PrPC vollständig

zerstört. Das Fehlen eines Signals bei den cuScN2a-Zellen bestätigt das vollständige Fehlen

von PrPC durch die Behandlung mit GnSCN und somit die PrPSc-Spezifität der Bindung auf

ScN2a-Zellen.

ERGEBNISSE

90

7-12-5 B2-43-133 6H4 6H4

cuScN2aScN2a

αα αα-P

rPC

TB

-Ale

xa54

9O

verla

y

7-12-5 B2-43-133 6H4 6H4

cuScN2aScN2a

αα αα-P

rPC

TB

-Ale

xa54

9O

verla

y

Durch eine Doppelfärbung mit der nicht-toxischen Cholera Toxin Untereinheit B (CTB) wurde

gleichzeitig die Lokalisierung der Anti-PrP-Antikörper innerhalb von spezialisierten

Mikrodomänen (lipid rafts) überprüft, da CTB selektiv an den spezifischen Mikrodomänen-

Marker Gangliosid GM1 bindet (Hao und Maxfield, 2000).

Die mittlere Reihe in Abbildung 22 zeigt die Organisation der Mikrodomänen auf der

Zelloberfläche von ScN2a- und cuScN2a-Zellen. In der untersten Reihe ist das Overlay aus

beiden Färbungen dargestellt. Eine partielle Kolokalisierung der Anti-PrP-Antikörper mit den

Mikrodomänen ist erkennbar.

Abbildung 22: Bindung der Anti-PrP-Antikörper an Pr PSc auf ScN2a- und cuScN2a-Zellen. Die Zellen wurden drei Tage auf speziellen Objektträgern kultiviert. Nach Fixierung, Permeabilisierung und Denaturierung erfolgte die Inkubation der Zellen mit einem Gemisch aus Anti-PrP-Antikörper und ALEXA®Fluor 549-Cholera Toxin Untereinheit B (CTB). Als Negativkontrolle wurden cuScN2a-Zellen verwendet, deren PrPSc-Gehalt durch die Behandlung mit Pentosanpolysulfat eliminiert wurde. Der Antikörper 6H4 diente als Referenz. Die Auswertung erfolgte mittels konfokaler Laser-Mikroskopie.

ERGEBNISSE

91

20

30

PK: + + + + + + + + + +

0,04

0,02

0,01

00,18

0,375

1,5 0,09

0,75

0,006

kDa:

µg Ak/ml:

20

30

PK: + + + + + + + + + +

0,04

0,02

0,01

00,18

0,375

1,5 0,09

0,75

0,006

kDa:

µg Ak/ml:

Diese Ergebnisse zeigen repräsentativ, dass sowohl wirksame als auch nicht-wirksame Anti-

PrP-Antikörper spezifisch an PrPSc auf ScN2a-Zellen binden. Der inhibitorische Effekt der

Antikörper 48-11-5, 103-8, 110-10 und B2-43-133 kann somit aus einer spezifischen Interaktion

mit PrPSc resultieren. Zusätzlich wurde eine partielle Kolokalisierung mit CTB-positiven

Mikrodomänen detektiert.

3.3.4 Untersuchungen zur dosisabhängigen Wirkung de r Anti-PrP-Antikörper

Um zu ermitteln, ob der Effekt der Anti-PrP-Antikörper dosisabhängig ist, wurde der IC50-Wert

bestimmt, d.h. die Antikörperkonzentration, bei welcher der PrPSc-Gehalt von ScN2a-Zellen um

50% reduziert ist. Dazu wurden ScN2a-Zellen für fünf Tage mit unterschiedlichen

Antikörperkonzentrationen (0,006 bis 10 µg mAk/ml) behandelt. Die anschließende Entwicklung

der Western Blots im Bio-Imager ermöglichte eine densitometrische Analyse im nicht-

sättigenden Bereich. Anhand einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurve wurde dann der

IC50-Wert bestimmt. Aufgrund der hohen Standardabweichungen bei den Quantifizierungen

wurden die IC50-Wert nur für den Helix 1-bindenden Antikörper B2-43-133 sowie für die beiden

Referenzantikörper 6H4 und ICSM18, die ebenfalls an die Helix 1 von PrPC binden, eindeutig

bestimmt (Tabelle 12). Abbildung 23 zeigt beispielhaft den Western Blot einer IC50-Wert-

Bestimmung für den Antikörper B2-43-133.

Abbildung 23: Dosisabhängige Reduktion des PrP Sc-Gehalts von ScN2a-Zellen am Beispiel B2-43-133. Die Zellen wurden fünf Tage mit den angegebenen Antikörperkonzentrationen behandelt und nach Proteinase K (PK)-Verdau im Western Blot mit dem polyklonalen Antikörper SA2124 analysiert. Der abgebildete Western Blot wurde nicht für die Bestimmung des IC50-Werts verwendet, da die Signalintensitäten bereits im sättigenden Bereich liegen.

Der Helix 1-bindende Antikörper B2-43-133 reduzierte das PrPSc-Signal bei einer Konzentration

von 0,04 µg/ml (0,31 nM) um 50% (Tabelle 12). Für den gleichen Effekt war von den beiden

Referenzantikörpern 6H4 und ICSM18 eine neunfach (0,34 µg/ml; 2,36 nM) beziehungsweise

ERGEBNISSE

92

zweifach (0,09 µg/ml; 0,625 nM) höhere Konzentration notwendig. Obwohl keine quantitative

Bestimmung der IC50-Werte der Antikörper 103-8 und 110-10 erfolgte, lässt sich aus den

erhaltenen Ergebnissen ableiten, dass für eine 50%ige Reduktion des PrPSc-Signals eine

höhere Konzentration als 0,34 µg/ml notwendig war (Daten nicht gezeigt).

Tabelle 12: IC 50-Werte der Anti-PrP-Antikörper

mAk IC 50-Wert (µg/ml) 1 IC50-Wert (nM)

B2-43-133 0,04±0,01 0,31±0,07

6H4

ICSM 18

0,34±0,14

0,09±0,02

2,36±0,97

0,63±0,14 1 Die IC50-Werte wurden aus drei unabhängig voneinander durchge- führten Experimenten ermittelt.

Somit ist in dieser Untersuchung für eine 50%ige Reduktion des PrPSc-Gehalts von dem Helix

1-bindenden Antikörper B2-43-133 im Vergleich zu den anderen untersuchten Antikörpern die

geringste Konzentration notwendig.

3.3.5 Untersuchungen zur zeitabhängigen Wirkung der Anti-PrP-Antikörper

Da in den zuvor beschriebenen Experimenten die Behandlungsdauer auf fünf Tage beschränkt

war, sollte im nächsten Schritt untersucht werden, ob die Verlängerung des

Behandlungszeitraums auf 30 Tage den Effekt der Anti-PrP-Antikörper verstärkt. Diese

Untersuchung ist besonders interessant im Hinblick auf den Antikörper 48-11-5, der nach fünf

Tagen Applikation die PrPSc-Akkumulation nur unvollständig inhibierte.

Der PrPSc-Gehalt der unbehandelten ScN2a-Zellen (MOCK) und der Zellen, die mit einem

Kontrollantikörper behandelt wurden (IgG1), blieb über den gesamten Behandlungszeitraum

konstant bei 100% (Abbildung 24 und 25). Im Vergleich dazu reduzierte der Anti-PrP-Antikörper

48-11-5 nach fünf Tagen den PrPSc-Gehalt um ca. 80% (Abbildung 24). Diese Reduktion wurde

auch durch 24 weitere Behandlungstage nicht verstärkt, so dass nach 30 Tagen immer noch

20% des PrPSc-Gehalts detektiert wurden. Somit ist die Wirkung des Antikörpers 48-11-5 bei

einer konstanten Antikörperkonzentration nicht zeitabhängig.

Bei Abschluss der Behandlung der ScN2a-Zellen mit den Helix 1-bindenden Antikörpern wurde

kein PrPSc detektiert (Abbildung 25).

ERGEBNISSE

93

PK: + + + + + + +M

OCK

IgG

1

6H4

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

40

20

30

40

20

30

40

20

30

kDa: 5d

11d

24d

PK: + + + + + + +M

OCK

IgG

1

6H4

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

40

20

30

40

20

30

40

20

30

kDa: 5d

11d

24d

Abbildung 24: PrP Sc-Gehalt von ScN2a-Zellen nach Langzeitbehandlung mi t den Anti-PrP-Antikörpern. Die Zellen wurden insgesamt 30 Tage mit den Antikörpern behandelt (10 µg/ml). Im 6-Tagesrhythmus wurden die Zellen gesplittet und erneut mit Antikörper versetzt oder lysiert und der PrPSc-Gehalt wurde nach Proteinase K (PK)-Behandlung im Western Blot mit dem polyklonalen Antikörper SA2124 detektiert. Zusätzlich wurden ScN2a-Zellen, die mit dem Referenzantikörper 6H4 und dem unspezifischen Anti-IgG1-Antikörper behandelt wurden sowie unbehandelte Zellen (MOCK) mitgeführt.

3.3.6 Bestimmung des PrP Sc-Gehalts von ScN2a-Zellen nach Beendigung der Antikörperbehandlung

Zuvor wurde gezeigt, dass die PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen nach einer 30-tägigen

Behandlung (10 µg Ak/ml) mit den Helix 1-bindenden Antikörpern 103-8, 110-10 und B2-43-133

sowie mit dem Referenzantikörper 6H4 vollständig inhibiert ist (Abbildung 25). Um zu

untersuchen, ob diese Inhibition auch nach Beendigung der Antikörperbehandlung bestehen

ERGEBNISSE

94

30d + AkPK: + + + + + + +

MOCK

IgG1

6H4

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

40

20

30

kDa:

5d

40

20

30

6d - Ak

36d - Ak

40

20

30

30d + AkPK: + + + + + + +

MOCK

IgG1

6H4

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

40

20

30

kDa:

5d

40

20

30

6d - Ak

36d - Ak

40

20

30

30d + AkPK: + + + + + + +

MOCK

IgG1

6H4

48-1

1-5

103-

8

110-

10

B2-43

-133

40

20

30

kDa:

5d

40

20

30

6d - Ak

36d - Ak

40

20

30

bleibt oder ob es sich um einen temporär begrenzten Effekt handelt, wurden die ScN2a-Zellen

für weitere 36 Tage in Abwesenheit der Antikörper kultiviert. Im 6-Tagesrhythmus wurde der

PrPSc-Gehalt der ScN2a-Zellen nach Proteinase K-Verdau im Western Blot analysiert

(Abbildung 25).

Abbildung 25: PrP Sc-Gehalt von ScN2a-Zellen nach Beendigung der Langze itbehandlung mit den Anti-PrP-Antikörpern. Die ScN2a-Zellen wurden für 30 Tage mit den Antikörpern behandelt (30d + Ak). Danach wurden die Zellen für weitere 36 Tage in Abwesenheit der mAk kultiviert. In Zeitintervallen von sechs Tagen wurden Zelllysate hergestellt, zur Detektion der PrPSc-Menge mit Proteinase K (PK) verdaut und im Western Blot mit dem polyklonalen Antikörper SA2124 analysiert.

Der PrPSc-Gehalt der unbehandelten Zellen (MOCK) und der Zellen, die zuvor mit dem

Kontrollantikörper (IgG1) behandelt wurden, blieb während der 36 Tage Kultivierung konstant

(Abbildung 25). In ScN2a-Zellen, die mit dem Antikörper 48-11-5 behandelt wurden, stieg der

PrPSc-Gehalt direkt nach Beendigung der Behandlung wieder an und entsprach nach 12 Tagen

ERGEBNISSE

95

der PrPSc-Menge in unbehandelten ScN2a-Zellen (Daten nicht gezeigt). In ScN2a-Zellen, in

denen zuvor die PrPSc-Akkumulation durch die Behandlung mit dem Helix 1-bindenden

Antikörper 110-10 vollständig inhibiert wurde, konnte nach sechs Tagen eine Zunahme des

PrPSc-Gehalts von ca. 20% detektiert werden, der nach weiteren 30 Tagen auf fast 100%

anstieg. Im Gegensatz dazu wurde in ScN2a-Zellen, die mit dem Antikörper 103-8 behandelt

wurden, erst nach 36 Tagen eine schwache Zunahme des PrPSc-Gehalts von 6% detektiert. Zu

diesem Zeitpunkt wurde in ScN2a-Zellen, die mit dem Antikörper B2-43-133 behandelt wurden,

weiterhin kein PrPSc detektiert. Dies wurde ebenfalls für den Referenzantikörper 6H4

beobachtet (Abbildung 25).

Diese Ergebnisse zeigen, dass innerhalb der Gruppe der Helix 1-bindenden Antikörper die

Antikörper 103-8 und 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen scheinbar

vollständig inhibieren, jedoch beginnt die Akkumulation in Abwesenheit der Antikörper erneut,

so dass diese Antikörper nur einen temporär begrenzten inhibitorischen Effekt besitzen. Im

Gegensatz dazu führt eine Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 oder dem

Referenzantikörper 6H4 zu einer vollständigen Hemmung der Prionreplikation, da auch nach

36 Tagen ohne Behandlung kein PrPSc in den Zellen nachweisbar ist.

3.3.7 Analyse der Infektiosität von Antikörper-beha ndelten ScN2a-Zellen

Da es sich bei PrPSc nur um einen Surrogat-Marker handelt, besteht die Möglichkeit, dass

Antikörper-behandelte ScN2a-Zellen trotz nicht detektierbarem PrPSc-Gehalts weiterhin infektiös

sind. Um die Infektiosität von ScN2a-Zellen, die zuvor 30 Tage mit den Anti-PrP-Antikörpern

behandelt wurden (3.3.4), zu überprüfen, wurden Lysate aus 106 ScN2a-Zellen intrazerebral in

Tga20-Indikatormäuse (Fischer et al., 1996) inokuliert (Bioassay). In Abbildung 26 ist die

prozentuale Überlebensrate der verschiedenen Versuchsgruppen als Kaplan-Meyer-Kurve

dargestellt.

Bei ScN2a-Zellen handelt es sich um RML-infizierte N2a-Zellen. Um zellspezifische Einflüsse

auszuschließen, wurde einer Gruppe ein Lysat aus 106 uninfizierten N2a-Zellen injiziert. Von

diesen fünf Mäusen waren bei Versuchende noch vier Tiere gesund, während eine Maus nach

292 Tagen an einer unspezifischen Ursache verstarb. Somit können zellspezifische Ursachen

für die Mortalität der Mäuse ausgeschlossen werden.

Die durchschnittliche Inkubationszeit von Mäusen, denen 106 unbehandelten ScN2a-Zellen

injiziert wurden, lag bei 81±10 Tagen. Im Vergleich dazu beeinflusste die vorhergegangene

Behandlung der ScN2a-Zellen mit dem unvollständig wirksamen Antikörper 48-11-5 und dem

wirksamen Antikörper 110-10 die Inkubationszeiten der Tga20-Mäuse nicht (73±13 Tage und

84±7 Tage, Tabelle 13) und zeigte somit keinen signifikanten Einfluss auf die Infektiosität.

Dagegen verlängerte sich die Inkubationszeit der Mäuse nach Inokulation von nur

104 unbehandelten ScN2a-Zellen um ca. 30 Tage (110±7 Tage, P=0,0284; Log-Rank-Test)

ERGEBNISSE

96

0 100 200 300 4000

25

50

75

100

Mock 10 4

Mock 10 6

48-11-5

103-8

110-10

B2-43-133

6H4

Inkubationszeit (Tage)

% Ü

berle

bens

rate

(Abbildung 26, Tabelle 13). Diese signifikante Verlängerung wurde auch bei Mäusen

beobachtet, denen ScN2a-Zellen injiziert wurde, die zuvor mit dem wirksamen Antikörper 103-8

behandelt wurden, so dass dieser Antikörper die Infektiosität der Zellen reduzierte (106±13

Tage, P=0,0142; Log-Rank-Test).

Abbildung 26: Inkubationszeiten der Indikatormäuse nach intrazerebraler Inokulation von Anti-PrP-Antikörper-behandelten ScN2a-Zellen. Die ScN2a-Zellen wurden 30 Tage mit den verschiedenen Antikörpern behandelt und jeweils 106 Zellen wurden intrazerebral in Tga20-Indikatormäuse injiziert. Als Kontrolle (grau) wurden 104 und 106 unbehandelte ScN2a-Zellen (MOCK) oder Zellen, die mit dem Referenzantikörper 6H4 behandelt wurden, inokuliert. Die prozentuale Überlebensrate der Gruppen wurde als Kaplan-Meyer-Kurve dargestellt.

Mäuse, denen ScN2a-Zellen injiziert wurden, die mit dem wirksamen Antikörper B2-43-133

behandelt wurden, zeigten während des ganzen Beobachtungszeitraums (372 Tage) keine

Scrapie-Symptome (Tabelle 13). Lediglich eine von fünf Mäusen verstarb an Tag 198. Da

jedoch der Endpunkt des Bioassays, an dem die Todesursache eindeutig auf Scrapie

zurückgeführt werden kann, zwischen Tag 120 und 140 nach der Infektion liegt (Fischer et al.,

1996), ist eine Scrapie-spezifische Todesursache trotz ähnlicher Symptome unwahrscheinlich.

Eine biochemische oder histologische Überprüfung konnte aufgrund der schlecht konservierten

Gehirn-Probe nicht vorgenommen werden. Somit korreliert die stark verlängerte Inkubationszeit

mit einer vollständigen Elimierung der Infektiosität der ScN2a-Zellen durch die Behandlung mit

dem Antikörper B2-43-133. Dies wurde auch für Mäuse beobachtet, denen Zellen injiziert

wurden, die mit dem Referenzantikörper 6H4 behandelt wurde. Bei Versuchsende lebten noch

zwei Tiere, während ein Tier an Tag 191 an einer unspezifischen Ursache verstarb (Tabelle 13).

ERGEBNISSE

97

Tabelle 13: Bioassay für die Bestimmung der Infekti osität von ScN2a-Zellen nach der

Behandlung mit Anti-PrP-Antikörpern

Inokulum

Zellzahl mAk

Mortalität der

Mäuse #

durchschnittliche

Inkubationszeit

(Tage post

Inokulation)

Signifikanz

(Log-Rank-Test)

Kontrollen

3/3 110 ± 7 P = 0,0284

5/5 81 ± 10 /

1*1/3 > 372 P = 0,0018§

104 ScN2a

106 ScN2a

106 ScN2a

106 N2a

/

/

6H4

/ 1*2/5 > 372 /

Helix 1-bindende Ak

5/5 106 ± 13 P = 0,0142

4/4 84 ± 7 nicht signifikant

106 ScN2a

106 ScN2a

106 ScN2a

103-8

110-10

B2-43-133 1*3/5 > 372 P = 0,0046§

ββββ-Faltblatt 2-bindender Ak

106 ScN2a 48-11-5 4/4 73 ± 13 nicht signifikant # n/n0 = Anzahl der an Scrapie verstorbenen Mäuse/Anzahl der inokulierten Mäuse. * = Mäuse, die an einer Scrapie-unabhängigen Ursache an Tag 191 (1), Tag 292 (2) und Tag 198 (3) verstarben. § = Der Bioassay wurde nach 372 Tage nach der Inokulation beendet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von ScN2a-Zellen mit dem wirksamen

Antikörper 110-10 die Infektiosität der Zellen nicht beeinflusste, während der ebenfalls

wirksame Antikörper 103-8 die Infektiosität reduzierte. Nur der Antikörper B2-43-133 sowie der

der Referenzantikörper 6H4 hemmten die PrPSc-Akkumulation vollständig und eliminierten die

Infektiosität von ScN2a-Zellen komplett.

3.4 Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus der Anti -PrP-Antikörper

Da bis heute unbekannt ist, welchen Mechanismus Anti-PrP-Antikörper für die Hemmung der

PrPSc-Akkumulation nutzen, wurden zwei Hypothesen bezüglich des Wirkungsmechanismusses

der Antikörper untersucht.

3.4.1 Untersuchungen zur inhibitorischen Wirkung ei nes PrP/Ak-Komplexes

Um zu untersuchen, ob der eigentliche inhibitorische Effekt der Anti-PrP-Antikörper durch eine

Komplexbildung mit freiem PrP vermittelt wird (Feraudet et al., 2005a), wurden ScN2a-Zellen

fünf Tage lang mit einem Komplex aus Antikörper und rekombinantem PrP (1 µg) behandelt.

Für die Untersuchung wurde der Helix 1-bindende Antikörper B2-43-133 ausgewählt, da er die

stärkste inhibitorische Wirkung zeigt (3.3) und den niedrigsten IC50-Wert besitzt (Tabelle 12).

ERGEBNISSE

98

Indem der Komplex mit verschiedenen Konzentrationen des Antikörpers im Bereich des

IC50-Werts gebildet wurde, konnte gleichzeitig eine mögliche dosisabhängige Wirkung des

Komplexes untersucht werden. Zum Vergleich wurden ScN2a-Zellen mit den identischen

Konzentrationen an freien Antikörpern behandelt. Die Bestimmung des PrPSc-Gehalts erfolgte

nach Proteinase K-Verdau der Lysate im Western Blot. Zusätzlich wurde der PrP/Antikörper-

Komplex nach Abschluss der Behandlung mittels Immunpräzipitation aus den Überständen

isoliert.

Ein direkter Einfluss von rekombinantem PrP auf den PrPSc-Gehalt von ScN2a-Zellen wurde

ausgeschlossen, da das PrPSc-Signal dieser Zellen der Intensität von unbehandelten Zellen

entsprach (Daten nicht gezeigt). Die Behandlung mit 0,18 µg B2-43-133/ml führte, wie bereits in

Abbildung 20 gezeigt, zu einer vollständigen Löschung des PrPSc-Signals (Abbildung 27A). Bei

ScN2a-Zellen, die mit dem PrP/Antikörper-Komplex behandelt wurden, konnte dieser Effekt erst

bei einer etwa achtfach höheren Antikörperkonzentration beobachtet werden (Abbildung 27A).

Erfolgte die Komplexbildung mit einer geringeren Menge von rekombinantem PrP (0,1 µg), war

für die vollständige Löschung des PrPSc-Signals eine Antikörperkonzentration von 0,37 µg/ml

ausreichend (Daten nicht gezeigt).

Nach Abschluss der Behandlung wurde der PrP/Antikörper-Komplex aus den Überständen der

ScN2a-Zellen isoliert, die mit den drei höchsten Konzentrationen des PrP/Antikörper-Komplexes

behandelt wurden (Abbildung 27B). Die 50 kDa-Bande repräsentiert die schwere Kette des

Antikörpers und die 20 kDa-Bande das rekombinante PrP, dessen Signalintensität proportional

zur verwendeten Antikörpermenge abnimmt. Die leichte Kette des Antikörpers (~25 kDa) konnte

aufgrund des verwendeten sekundären Antikörpers nicht detektiert werden. Da rekombinantes

PrP ohne vorhergegangene Komplexbildung nicht präzipitiert werden konnte (Abbildung 27B),

lag das rekombinante PrP in den untersuchten Überständen auch noch nach fünf Tagen als

stabiler Komplex vor.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit

rekombinantem PrP zu einer Reduktion der inhibitorischen Wirkung führt. Die Stabilität des

Komplexes über fünf Tage wurde mittels Immunpräzipitation bestätigt. Unter den gewählten

Versuchsbedigungen ist auszuschließen, dass die inhibitorische Wirkung der Anti-PrP-

Antikörper durch eine Komplexbildung vermittelt wird. Die Wirkung eines Komplexes aus

Antikörper und endogenem PrPC wurde nicht untersucht.

ERGEBNISSE

99

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l0,

18 µ

g/m

l0,

09 µ

g/m

l0,

045

µg/m

l0

µg/m

l

-

+

+ + + + + + +

rek. PrP:

rek. PrP:

PK:30kDa

20kDa

30kDa

20kDa

B2-43-133:

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l75

0 ng

0 µg

/ml

0 µg

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l

- + 200 ng

- - - - - - - - -

30kDa

50kDa40kDa

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l0,

18 µ

g/m

l0,

09 µ

g/m

l0,

045

µg/m

l0

µg/m

l

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l0,

18 µ

g/m

l0,

09 µ

g/m

l0,

045

µg/m

l0

µg/m

l

-

+

+ + + + + + +

rek. PrP:

rek. PrP:

PK:30kDa

20kDa

30kDa

20kDa

B2-43-133:

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l75

0 ng

0 µg

/ml

0 µg

1,5

µg/m

l0,

75 µ

g/m

l0,

37 µ

g/m

l

- + 200 ng

- - - - - - - - -

30kDa

50kDa40kDa

Abbildung 27: Hemmung der PrP Sc-Akkumulation in ScN2a-Zellen durch die Behandlung mit freiem B2-43-133 und einem PrP/B2-43-133-Komplex. A ) Vor der Behandlung wurden die angezeigten Antikörperkonzentrationen mit 1 µg rekombinantem PrP (rek. PrP) inkubiert. Danach wurden die ScN2a-Zellen fünf Tage mit freiem Antikörper (-) oder einem PrP/Ak-Komplex (+) behandelt. Die Analyse der Zelllysate erfolgte nach dem Standardprotokoll. B) Nach Beendigung der Behandlung wurden die Überstände gesammelt und mittels Protein G erfolgte eine Immunpräzipitation des freien Antikörper bzw. des Komplexes. Als Kontrollen wurden zusätzlich 750 ng B2-43-133 und 200 ng rek. PrP aufgetragen. Die Analyse im Western Blot erfolgte mit dem monoklonalen Antikörper 6H4.

3.4.2 Untersuchung des Einflusses der Anti-PrP-Anti körper auf die Retention

Eine weitere Hypothese besagt, dass die Anti-PrP-Antikörper die PrPSc-Akkumulation hemmen,

indem sie Oberflächen-PrP binden und dadurch die Verweildauer auf der Zelloberfläche

(Retention) vor der nächsten Internalisierung verlängern (Kim et al., 2004).

Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ScN2a-Zellen für eine Stunde mit den Anti-PrP-

Antikörpern inkubiert. Danach wurde der Antikörper entfernt, die Zellen für unterschiedlich lange

Zeitintervalle ohne Antikörper kultiviert und abschließend die Menge des Antikörper-

gebundenen PrPs auf der Zelloberfläche durchflusszytometrisch bestimmt (Abbildung 28). So

konnte der prozentuale PrP-Anteil bestimmt werden, der in der untersuchten Zeitspanne

internalisiert wurde. Zellen, welche direkt nach dem primären Antikörper mit dem sekundären

Antikörper inkubiert wurden, wurden als 100% gesetzt.

Für diese Analyse musste eine Antikörperkonzentration eingesetzt werden, die nicht zu einer

Sättigung des Fluoreszenzsignals führte, sondern im linearen Bereich lag, so dass im Vorfeld

die Bindung der Antikörper an ScN2a-Zellen untersucht wurde.

ERGEBNISSE

100

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10

µg mAk/ml

rela

tive

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

48-11-5 103-8 B2-43-133 6H4 110-10 ICSM 18

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10

µg mAk/ml

rela

tive

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

48-11-5 103-8 B2-43-133 6H4 110-10 ICSM 18

1 2 3 4 5 6 7 h

1. Ak Kultivierung der Zellen ohne Ak 2. Ak

FACS-Analyse

1 2 3 4 5 6 7 h


1 2 3 4 5 6 7 h


FACS-Analyse

Abbildung 28: Prinzip der Analyse des Einflusses de r Anti-PrP-Antikörper auf die Retention.

Für die Analyse der Bindung der Anti-PrP-Antikörper an ScN2a-Zellen wurden diese mit

unterschiedlichen Konzentrationen der Antikörper für eine Stunde inkubiert und abschließend

im FACS analysiert. Bei der Auswertung wurde die relative Fluoreszenzintensität mit den dazu

gehörigen Standardabweichungen aus drei unabhängigen Analysen gegen die

Antikörperkonzentration aufgetragen (Abbildung 29).

Abbildung 29: Bindung der Anti-PrP-Antikörper an Ob erflächen-PrP auf ScN2a-Zellen. Für die FACS-Analyse wurden die ScN2a-Zellen eine Stunde mit den angegebenen Antikörperkonzentrationen inkubiert. Es wurden sowohl Helix 1-bindende Antikörper (schwarz) als auch ein β-Faltblatt 2-bindender Antikörper (rot) untersucht. Als Referenzantikörper wurden die Antikörper 6H4 und ICSM18 verwendet (blau). Dargestellt sind die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten mit Standardabweichungen in Abhängigkeit von der Antikörperkonzentration (n = 3).

ERGEBNISSE

101

0

20

40

60

80

100

120

140

0 30 60 90 120 150 180 210 240

Zeit (min)

rela

tive

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t (%

)

6H4 B2-43-133 48-11-5 103-8 ICSM 18 50%

0

20

40

60

80

100

120

140

0 30 60 90 120 150 180 210 240

Zeit (min)

rela

tive

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t (%

)

6H4 B2-43-133 48-11-5 103-8 ICSM 18 50%

Bei allen Antikörpern nahm die relative Fluoreszenzintensität mit zunehmender Konzentration

zu. Während die Fluoreszenzintensität bei dem β-Faltblatt 2-bindenden Antikörper 48-11-5 und

dem Helix 1-bindenden Antikörper B2-43-133 sowie den Referenzantikörpern 6H4 und ICSM18

relativ steil zunahm, verlief die Steigung der Fluoreszenz auf ScN2a-Zellen, die mit den

Helix 1-bindendenden Antikörpern 103-8 und 110-10 inkubiert wurden, relativ flach (Abbildung

29). Anhand dieser Bindungsanalyse war es möglich, eine Sättigungskurve und ein Scatchard-

Diagramm zu erstellen und die Dissoziationskonstanten (KD-Werte) zu ermitteln (3.2.4), die im

linearen Bereich lagen und somit für die Untersuchung der Retention eingesetzt wurden. Für

den Antikörper 110-10 konnte aufgrund der geringen Steigung trotz zunehmender

Antikörperkonzentration der KD-Wert nicht bestimmt werden, so dass dieser Antikörper für die

Untersuchung nicht verwendet wurde.

Der Einfluss der Antikörper wurde in drei voneinander unabhängigen Ansätzen bestimmt. Als

Maß für die Retention wurde der Zeitpunkt bestimmt, zu dem 50% des Antikörper-gebundenen

PrPs internalisiert wurden. In Abbildung 30 sind die prozentualen Mittelwerte und die

entsprechenden Standardabweichungen aus drei unabhängigen Messungen dargestellt.

Abbildung 30: Einfluss der Anti-PrP-Antikörper auf die Retention von Oberflächen-PrP auf ScN2a-Zellen. Die ScN2a-Zellen wurden für eine Stunde mit den unter 3.2.4 bestimmten Werten der KD-Konstante des jeweiligen Antikörpers inkubiert. Nach Entfernung des Antikörpers wurden die Zellen für die angezeigten Zeitperioden in Abwesenheit der monoklonalen Antikörper weiterkultiviert. Abschließend wurden die Zellen mit einem FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper gefärbt und im FACS analysiert. Die Fluoreszenzintensitäten wurden in Prozent umgerechnet und mit den zugehörigen Standardabweichungen dargestellt (n = 3).

ERGEBNISSE

102

Nach Inkubation mit dem β-Faltblatt 2-bindenden Antikörper 48-11-5, dem Helix 1-bindenden

Antikörper 103-8 sowie mit dem Referenzantikörper 6H4 wurden 50% des Antikörper-

gebundenen PrPs bereits innerhalb der ersten Stunde nach Entfernung des Antikörpers

internalisiert. Im Vergleich dazu verlängerte die Bindung des Antikörpers B2-43-133 die

Retention von PrP deutlich, da nach vier Stunden immer noch mehr als 50% des Oberflächen-

PrPs detektiert wurden. Dies wurde ebenfalls für ScN2a-Zellen beobachtet, die mit dem

Referenzantikörper ICSM18 inkubiert wurden und auf denen nach vier Stunden noch ca. 55%

Antikörper-gebundenes PrP nachgewiesen wurde (Abbildung 30).

Diese Ergebnisse zeigen, dass von den untersuchten Antikörpern lediglich der Helix 1-bindende

Antikörper B2-43-133 sowie der Referenzantikörper ICSM18 fähig sind, die Internalisierung von

PrP zu verzögern und so die Retention von PrP auf der Zelloberfläche zu verlängern. Da aber

zu den Antikörpern, welche die Retention von PrP nicht verlängern können, auch der

Referenzantikörper 6H4 gehört, der mit 0,34 µg/ml ebenfalls einen sehr niedrigen IC50-Wert

besitzt (Tabelle 12), ist es unwahrscheinlich, dass die Verlängerung der Retention von PrP der

Wirkungsmechanismus ist. Jedoch kann die Möglichkeit, dass die Anti-PrP-Antikörper

verschiedene Mechanismen nutzen, durch diese Untersuchung nicht ausgeschlossen werden.

3.5 Pharmakokinetik der Anti-PrP-Antikörper im in vivo Modell

Da der Antikörper B2-43-133 sowohl die PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen inhibiert als auch

deren Infektiosität eliminiert (3.3), handelt es sich bei diesem Antikörper um einen potentiellen

Kandidaten für passive Immunisierungen von RML-infizierten wildtypischen Mäusen. Im Hinblick

auf solche Immunisierungsexperimente, für die ein Antikörper mit langer Halbwertszeit

wünschenswert ist, wurde die Pharmakokinetik untersucht, welche den Einfluss des

Organismusses auf einen applizierten Antikörper bezüglich seiner Resorption, Distribution und

Elimination beschreibt. Dazu wurden wildtypische Mäuse intraperitoneal mit RML-Prionen

inokuliert. 63 Tage nach der Inokulation erhielten diese Mäuse im Abstand von drei Tagen drei

intraperitoneale Antikörperinjektionen (1 mg). Für die Untersuchung der Pharmakokinetik wurde

den Mäusen eine Stunde und vier Stunden nach der ersten Antikörperapplikation sowie kurz vor

jeder weiteren Injektion und am Ende des Versuches Blut abgenommen. Die Antikörpermengen

wurden dann im Serum mittels ELISA bestimmt (Abbildung 31).

ERGEBNISSE

103

1 63 66 69 72 dpi 1 mg mAk 1mg mAk 1 mg mAk VE

0,1 ml RML 5 (i.p)(1% Gehirnhomogenat)

Blut 1h Blut Blut BlutBlut 4h

1 63 66 69 72 dpi 1 mg mAk 1mg mAk 1 mg mAk VE

0,1 ml RML 5 (i.p)(1% Gehirnhomogenat)

Blut 1h Blut Blut BlutBlut 4h

Abbildung 31: Immunisierungsschema von RML-infizier ten C57BL/6-Mäusen für die Analyse der Pharmakokinetik. Fünf Gruppen, bestehend aus jeweils sechs Tieren, wurden mit den monoklonalen Antikörpern (mAk) 7-12-5, 48-11-5, 103-8, 110-10 und B2-43-133 nach dem abgebildeten Schema intraperitoneal (i.p.) immunisiert (dpi = days post inoculation). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde den Mäusen Blut entnommen und die Antikörpermenge im Serum mittels ELISA zur Analyse der Pharmakokinetik bestimmt (VE = Versuchsende).

Da die Wirkung der Antikörper in Zellkultur nicht mit der Wirkung in vivo korrelieren muss, wurde

zusätzlich die Pharmakokinetik des nicht wirksamen Antikörpers 7-12-5, des unvollständig

wirksamen Antikörpers 48-11-5 sowie der beiden wirksamen Antikörper 103-8 und 110-10

untersucht. In Abbildung 32 sind die durchschnittlich ermittelten Antikörpermengen mit

Standardabweichungen pro Gruppe (n = 6) zu den untersuchten Zeitpunkten dargestellt.

Eine Stunde nach der ersten Antikörperapplikation wurden 36 ± 11% der ursprünglich

applizierten Menge des Antikörpers B2-43-133 im Serum der Mäuse nachgewiesen (Tabelle

14). Im Vergleich dazu wurde von den beiden Antikörpern 7-12-5 und 48-11-5 eine geringere

Menge detektiert. Drei Stunden später stieg die Menge des Antikörpers B2-43-133 auf 46 ± 8%

an. Ein ähnlicher Anstieg ist in allen Versuchsgruppen zu beobachten und resultiert daraus,

dass die Antikörper nach der intraperitonealen Applikation vom Blut aufgenommen werden

müssen (Resorption). Da dieser Prozess zeitabhängig ist, kommt es vier Stunden nach der

Applikation zu einer Zunahme der detektierbaren Antikörpermenge im Vergleich zu einer

Stunde nach der Injektion. Vier Stunden nach der ersten Antikörperapplikation wurden in allen

Gruppen die höchsten Antikörpermengen nachgewiesen (Tabelle 14).

Drei Tage nach der ersten Antikörperapplikation (Tag 3) wurden vom Antikörper B2-43-133 nur

noch 11 ± 22% im Serum nachgewiesen. Auch die nachweisbare Menge der anderen

Antikörper war zu diesem Zeitpunkt geringer, jedoch wurden von diesen Antikörpern im

Vergleich zum Antikörper B2-43-133 zwischen 17% und 26% detektiert (Tabelle 14). Die

Abnahme der Antikörpermengen zu diesem Zeitpunkt ist darauf zurückzuführen, dass die

Antikörper innerhalb der drei Tage nach Antikörperinjektion ins Gewebe diffundiert sind und

zum Teil degradiert wurden.

Drei Tage nach der zweiten Antikörperapplikation (Tag 6) wurden mit 23 bis 57% insgesamt

wieder höhere Antikörpermengen im Serum aller Gruppen detektiert als an Tag 3, während an

ERGEBNISSE

104

0

100

200

300

400

500

600

700

800

7-12-5 48-11-5 103-8 110-10 B2-43-133

µg m

Ak/

Mau

s

1h 4h Tag 3 Tag 6 Tag 9 (VE)

Tag 9 mit 5 bis 24% die geringsten Antikörpermengen nachgewiesen wurden (Tabelle 14). Da

jeweils die gleiche Menge Antikörper injiziert wurde und die Abstände zwischen den

Applikationen identisch waren, hätte man erwarten können, dass auch die detektierbaren

Antikörpermengen im Serum der Mäuse ähnlich sind. Die Ursache für diese Schwankungen

wurde jedoch nicht untersucht.

Abbildung 32: Analyse der Pharmakokinetik der Anti- PrP-Antikörper. Die C57BL/6-Mäuse wurden mit 0,1 ml eines 1%igen RML 5-Gehirnhomogenats intraperitoneal (i.p.) inokuliert. Nach 63 Tagen erfolgte die erste von insgesamt drei Antikörperinjektionen (1 mg, i.p.). Nach drei und sechs Tagen folgten zwei weitere Applikationen. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde den Mäusen Blut entnommen und die Antikörpermengen im Serum mittels ELISA bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte der detektierten Antikörpermenge im Serum der Mäuse einer Gruppe (n = 6) mit den entsprechenden Standardabweichungen (VE = Versuchsende).

Tabelle 14: Prozentualer Anteil der Antikörper im S erum der Mäuse

Antikörpermenge, die im Serum der Mäuse detektiert wurde (%)

Zeitpunkt # 7-12-5 48-11-5 103-8 110-10 B2-43-133

1 Stunde 21±5 22±12 38±8 38±15 36±11

4 Stunden 52±11 38±18 55±13 49±9 46±8

Tag 3 17±20 18±22 26±11 21±18 11±22

Tag 6 36±18 22±19 57±7 41±24 23±17

Tag 9 16±17 10±21 15±3 24±8 5±5 # Zeitpunkt der Blutentnahme nach der ersten Antikörperapplikation

ERGEBNISSE

105

Der Verlauf der Pharmakokinetik aller untersuchten Anti-PrP-Antikörper war ähnlich, jedoch

wurden vom Antikörper B2-43-133 insgesamt geringere Mengen im Serum der Mäuse

detektiert. Dies deutet auf eine geringe Halbwertszeit des Antikörpers hin, die jedoch durch

weitere Untersuchungen genau bestimmt werden müsste.

DISKUSSION

106

4 Diskussion

Für die Therapie von humanen Prionenerkrankungen existieren zurzeit keine Substanzen,

welche die Inkubationszeit signifikant beeinflussen (1.1.9).

Bereits Ende der achtziger Jahre konnte gezeigt werden, dass die Inkubation von infektiösem

Hamster-Gehirnhomogenat mit Anti-PrP-Antiseren vor der Inokulation in Indikatortiere zu einer

deutlichen Reduktion der Infektiosität führte (Gabizon et al., 1988). Zusammen mit der

Beobachtung, dass Anti-PrP-Antikörper die Konversion von PrPC zu PrPSc in einem zellfreien

System inhibierten (Horiuchi und Caughey, 1999), deuteten diese beide Experimente auf das

therapeutische Potential von Anti-PrP-Seren bzw. -Antikörpern hin.

Der Erfolg von aktiven Immunisierungsstrategien ist bei Prionenerkrankungen durch die

körpereigene Toleranz gegenüber dem Prion-Protein limitiert. Obwohl Untersuchungen darauf

hindeuten, dass zumindest die B-Zell-Toleranz nur partiell ist (Heppner et al., 2001), induzierten

Immunisierungen von wildtypischen Mäusen mit verschiedenen PrP-spezifischen Peptiden

(Arbel et al., 2003; Polymenidou et al., 2004; Rosset et al., 2004; Schwarz et al., 2003), PrP-

Dimeren (Gilch et al., 2003) sowie mit rekombinantem PrP (Arbel et al., 2003; Polymenidou et

al., 2004; Rosset et al., 2004; Schwarz et al., 2003; Sigurdsson et al., 2002; Wisniewski und

Sigurdsson, 2002) nur moderate Antikörpertiter, welche nicht zu einer signifikanten

Beeinflussung der Inkubationszeit führten. Auch die Erhöhung der Immunogenität von PrP

durch die Verwendung von unterschiedlichen Adjuvantien (Freund-Adjuvans, Titermax®,

filamentöse Phagen, CpG-ODN) oder die Kopplung an immunstimulatorische Proteine

(Heat-shock Proteine, Keyhole limpet Hämocyanin) verstärkte den therapeutischen Effekt nicht.

Aktive DNA-Immunisierungsversuche mit retroviralen PrP-exprimierenden Partikeln (Nikles et

al., 2005) oder PrP-kodierenden Plasmiden, die zusätzlich ein toleranzbrechendes Tetanus

Toxin-Epitop exprimierten (Nitschke et al., 2007), führten ebenfalls nur zu marginalen Erfolgen.

Lediglich nach einer mukosalen Immunisierung mit einer abgeschwächte Maus-PrP-

exprimierenden Salmonella Vakzine, die vor der Prioninfektion erfolgte, verlängerte sich die

Inkubationszeit von wildtypischen Mäusen signifikant (Goni et al., 2005).

Der Einsatz von monoklonalen Anti-PrP-Antikörpern erscheint dagegen erfolgversprechender,

da zum einen die PrPSc-Akkumulation in verschiedenen Prion-infizierten Zelllinien durch die

Behandlung mit Anti-PrP-Antikörpern gehemmt wurde (Enari et al., 2001; Feraudet et al.,

2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006), und zum anderen die

passive Immunisierung von wildtypischen Mäusen mit bereits fortgeschrittener Prioninfektion zu

einer signifikanten Verlängerung der Inkubationszeit führte (White et al., 2003). Jedoch

scheinen nur bestimmte Anti-PrP-Antikörper auch eine inhibitorische Wirkung auf die

Prionreplikation zu besitzen.

DISKUSSION

107

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit monoklonale Antikörper gegen das Prion-Protein

herzustellen und diese bezüglich ihrer Eigenschaften und ihrer inhibitorischen Wirkung in vitro

zu analysieren. Zusätzlich sollte der Mechanismus, den Anti-PrP-Antikörper bei der Hemmung

der Prionreplikation nutzen, näher untersucht werden.

4.1 Die Herstellung von PrP C- und PrP Sc-spezifischen Antikörpern

Die ersten polyklonalen Antikörper gegen das Prion-Protein wurden durch Immunisierungen von

Kaninchen mit Spezies-fremdem PrP hergestellt. Als Antigene wurden entweder filamentöse

amyloide PrPSc-Ablagerungen (scrapie-associated fibrils (SAF)) oder PrP27-30 aus

Gehirnhomogenaten von Prion-infizierten Hamstern verwendet. Die geringen Abweichungen in

der Primärsequenz des Antigens führten zur Erhöhung der Antigenität in der heterologen

Spezies, so dass die Herstellung von polyklonalen Antiseren gelang. 1987 wurde nach der

Immunisierung einer wildtypischen Maus mit Hamster-SAFs der PrP-spezifische Antikörper 3F4

isoliert, der Hamster- und Mensch-PrP detektierte, jedoch nicht Maus-PrP (Kascsak et al.,

1987). Diese Spezifität resultierte aus zwei abweichenden Aminosäuren an den Positionen 109

und 112 im Epitop von Maus-PrP (Bolton et al., 1991; Lund et al., 2007). Da das Mausmodell

jedoch für die Untersuchung von Prionenerkrankungen besonders geeignet ist, war es

notwendig, monoklonale Antikörper gegen Maus-PrP zu generieren.

Erst die Herstellung von PrPC-defizienten Mäusen, die auf die Immunisierung mit Maus-PrP mit

einer starken humoralen Antwort reagierten (Bueler et al., 1992; Prusiner et al., 1993),

ermöglichte die Generierung von murinen Anti-PrP-Antikörpern mittels Hybridom-Technik.

Mittlerweile existieren zahlreiche monoklonale PrPC-spezifische Antikörper (Tabelle 15), die

sowohl die zelluläre als auch die pathogene Form des Prion-Proteins detektieren. Antikörper,

die nur PrPSc detektieren, sind hingegen sehr selten (Moroncini et al., 2004). PrPSc-spezifische

Antikörper können von großem diagnostischem Nutzen sein, da sie zum einen das

Detektionslimit von präzipitiertem PrPSc in peripheren Geweben, in denen der PrPSc-Gehalt nur

gering ist, herabsetzen, und zum anderen PrPSc ohne Proteinase K-Verdau detektiert werden

kann. Zusätzlich könnten die Antikörper helfen, die pathogene Isoform näher zu

charakterisieren.

In der vorliegenden Arbeit wurden Prnp0/0-Mäuse mit einer fibrillären Form von rekombinantem

PrP immunisiert, welche durch die Behandlung mit bizellulären Lösungen einen höheren

β-Faltblatt-Gehalt besitzt und somit der Konformation von PrPSc ähnelt (Luhrs et al., 2006).

Durch die Verwendung von diesem Antigen sollte die Wahrscheinlichkeit erhöht werden, einen

PrPSc-spezifischen Antikörper zu generieren. Die beiden Antikörper, B2-31-166 und B2-43-133,

die nach der Fusion isoliert wurden, detektierten jedoch sowohl PrPC als auch PrPSc (Abbildung

12A). Auch die fünf Antikörper, 7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10, die nach der Fusion

DISKUSSION

108

mit rekombinantem PrP-immunisierten Milzzellen selektiert wurden, diskriminierten nicht

zwischen den beiden Isoformen.

Der erste beschriebene PrPSc-spezifische Antikörper 15B3 entstand zufällig durch die

Immunisierung von Prnp0/0-Mäusen mit bovinem rekombinanten PrP. Dieser Antikörper, ein

IgM-Immunglobulin, präzipitierte selektiv bovines, humanes und murines PrPSc aus Prion-

infizierten Gehirnhomogenaten (Korth et al., 1997). Die gezielte Herstellung solcher Antikörper

ist erschwert, da man davon ausgeht, dass PrPSc-spezifische Antikörper an ein

diskontinuierliches Epitop binden, wie es zum Beispiel für den Antikörper 15B3 bestätigt wurde

(Korth et al., 1997). Somit mussten für die gezielte Herstellung von PrPSc-spezifischen

Antikörpern spezielle Strategien angewendet werden.

Durch den Austausch der CDR3-Region der schweren Kette eines Gerüst-Antikörpers durch

Epitop-Sequenzen von PrPC-spezifischen Antikörpern, die in einer in vitro Studie einen hohen

inhibitorischen Effekt auf die Prionreplikation zeigten, gelang die Herstellung eines Antikörpers,

der in biochemischen und immunhistologischen Experimenten spezifisch PrPSc erkannte

(Moroncini et al., 2004; Moroncini et al., 2006). 2003 führte die Arbeitsgruppe um Neil

Cashmann Immunisierungen mit KLH-gekoppelten PrP-Peptiden durch, welche die Sequenz

YYRRYYRYY repräsentierten (Paramithiotis et al., 2003). Dieses Peptid-Motiv wurde

ausgewählt, weil die Behandlung von rekombinantem PrP mit niedrigen pH-Werten dazu führte,

dass Tyrosin (Y)-Seitenketten, die im zellulären PrP verdeckt sind, exponiert werden. Da die

pH-Behandlung mit einer Erhöhung des β-Faltblatt-Gehalts und einer erhöhten Tendenz zur

Aggregation einhergeht, wurde angenommen, dass dieser Prozess den Konformationswechsel

von PrPC zu PrPSc unter physiologischen Bedingungen reflektieren könnte. Somit sollten die

Tyrosin-Motive PrPSc-spezifische Epitope repräsentieren. Die generierten polyklonalen

Kaninchenseren sowie die murinen monoklonalen Antikörper bestätigten diese Hypothese, da

sie PrPSc mehrerer Spezies selektiv präzipitierten (Paramithiotis et al., 2003).

Eine eindeutige Demonstration der inhibitorischen Wirkung von PrPSc-spezifischen Antikörpern

auf die Prionreplikation steht noch aus. Die transgene Expression der schweren Kette des

15B3-Antikörpers in einem Mausmodell führte weder zu einem detektierbaren Antikörpertiter

noch zur Beeinflussung der Inkubationszeit. Als möglicher Grund hierfür wurde eine veränderte

Spezifität des Antikörpers angenommen, ausgelöst durch die Verwendung einer anderen

Leichtkette (Heppner et al., 2001). Nach Behandlung von ScN2a-Zellen mit den

YYR-spezifischen Antikörpern wurde lediglich eine unvollständige Reduktion des PrPSc-Gehalts

detektiert, so dass die Autoren vermuteten, dass die Konversion zum Teil in Kompartimenten

stattfinden muss, welche für die Antikörper unzugänglich sind (Lehto et al., 2004).

DISKUSSION

109

4.2 Inhibition der PrP Sc-Akkumulation durch Helix 1-bindende Antikörper

Mittlerweile wurde in zahlreichen in vitro-Studien die inhibitorische Wirkung von Anti-PrP-

Antikörpern auf die PrPSc-Akkumulation bestätigt. Eine Auswahl von inhibitorisch wirksamen

Antikörpern ist in Tabelle 15 zusammengefasst.

In der vorliegenden Arbeit wurden drei Anti-PrP-Antikörper, 7-12-5, 12-29 und B2-31-166,

identifiziert, welche die PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen nicht hemmten und ein Antikörper,

48-11-5, der zu einer unvollständigen Hemmung führte (Abbildung 20). Auch die Verlängerung

der Behandlungsdauer mit dem Antikörper 48-11-5 verstärkte diesen Effekt nicht (Abbildung

24). Dagegen reduzierten die drei Helix 1-bindenden Antikörper, 103-8, 110-10 und B2-43-133,

ähnlich wie der Referenzantikörper 6H4, den PrPSc-Gehalt von ScN2a-Zellen vollständig

(Abbildung 20). Es konnte ausgeschlossen werden, dass diese PrPSc-Reduktion auf einen

zytotoxischen Effekt der Anti-PrP-Antikörper zurückzuführen ist (Abbildung 21). Der Effekt

basiert wahrscheinlich auf einer spezifischen Interaktion der Antikörper mit PrP (Abbildung 22).

Der inhibitorische Effekt aller bisher untersuchten Anti-PrP-Antikörper zeigte eine

Dosisabhängigkeit. In der Studie von Feraudet lagen die Konzentrationen, bei denen die

37 inhibitorisch wirksamen Antikörper 50% des PrPSc-Signals reduzierten (IC50-Wert), zwischen

0,1 und 7 µg/ml (Feraudet et al., 2005a). In anderen Veröffentlichungen, in denen eine kleinere

Anzahl von Antikörpern untersucht wurde, waren Konzentrationen kleiner als 1 µg/ml

ausreichend (Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; Peretz et al.,

2001; Perrier et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit wurde für den wirksamen Antikörper

B2-43-133 ein IC50-Wert von 0,044 ± 0,01 µg/ml bestimmt. Für die ebenfalls inhibitorisch

wirksamen Antikörper 103-8 und 110-10 konnte der IC50-Wert aufgrund der hohen

Standardabweichungen nicht präzise bestimmt werden. Jedoch kann von den erhaltenen

Analysen abgeleitet werden, dass deutlich höhere Konzentrationen für eine 50%ige Reduktion

des PrPSc-Gehalts notwendig waren als von dem Antikörper B2-43-133 (Daten nicht gezeigt).

Im Vergleich mit bisher publizierten IC50-Werten besitzt der Antikörper B2-43-133 einen sehr

niedrigen IC50-Wert (Tabelle 15). Für die beiden Referenzantikörper 6H4 und ICSM18 wurden

die IC50-Werte 0,34 ± 0,14 µg/ml und 0,09 ± 0,02 µg/ml bestimmt. In einer anderen Studie, die

auf einer epithelialen Kaninchen-Zelllinie (ScRov-Zellen) durchgeführt wurde, lag der IC50-Wert

des Antikörpers ICSM18 dagegen bei 5 µg/ml. Für den Antikörper ICSM35 wurde in der

gleichen Studie ein IC50-Wert von 0,004 µg/ml bestimmt (Beringue et al., 2004). Auch dieser

Wert konnte auf ScN2a-Zellen nicht reproduziert werden, da selbst eine Konzentration von 5 µg

ICSM35/ml nur zu einer schwachen Verringerung des PrPSc-Gehalts von ScN2a-Zellen führte

(Daten nicht gezeigt). Die Ursachen für diese kontroverse Beobachtung liegen wahrscheinlich in

den unterschiedlichen Behandlungszeiträumen, den gewählten Antikörperkonzentrationen oder

den verwendeten Zelllinien. Bei ScN2a-Zellen handelt es sich um die murine

Neuroblastomazelllinie N2a, die durch die Kokultivierung mit infektiösem Maus-

DISKUSSION

110

Gehirnhomogenat infiziert wurde und deren empfänglichster Zellklon abschließend mittels

Subklonierung isoliert und kultiviert wurde (Butler et al., 1988; Enari et al., 2001). Im Gegensatz

dazu kann in ScRov-Zellen die Überexpression von ovinem PrPC durch Doxyzyklin induziert

werden und die Zellen sind mit Schaf-Prionen infizierbar (Vilette et al., 2001). Die verwendeten

Zelllinien haben somit nicht nur einen unterschiedlichen Spezies-Ursprung, sondern

exprimieren PrPC auch in unterschiedlichen Mengen.

Miyamoto und Kollegen berichteten, dass nach einer 8-tägigen Behandlung von N2a/22L-Zellen

mit dem Antikörper 3S9 (10 µg/ml) selbst nach einer einjährigen Weiterkultivierung ohne

Antikörper kein erneuter PrPSc-Gehalt detektiert wurde (Miyamoto et al., 2005). In der

vorliegenden Arbeit konnte nach einer 30-tägigen Behandlung mit den Antikörpern 110-10 und

103-8 lediglich ein transienter Effekt beobachtet werden, da nach Beendigung der Behandlung

PrPSc nach 6 bzw. 36 Tagen in den Zellen wieder nachgewiesen wurde (Abbildung 25).

Dagegen wurde in ScN2a-Zellen, die mit den beiden Helix 1-bindenden Antikörpern 6H4 und

B2-43-133 behandelt wurden, auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper kein PrPSc

detektiert.

Um zu überprüfen, ob die Antikörper, neben dem PrPSc-Gehalt, auch die Infektiosität der

ScN2a-Zellen beeinflussen, wurde ein Bioassay durchgeführt (Abbildung 26, Tabelle 13). Die

Inkubationszeiten von Mäusen, denen ScN2a-Zellen inokuliert wurden, die mit dem Antikörper

110-10 behandelt wurden, zeigten keinen signifikanten Unterschied zu der gleichen Zellzahl von

unbehandelten Zellen (81 ± 10 Tage) und verstarben 84 ± 7 Tage nach der Inokulation an

Scrapie. Dies belegt, dass der Antikörper 110-10 zwar den PrPSc-Gehalt nach einer 30-tägigen

Behandlung vollständig reduzierte, jedoch die Infektiosität der Zellen nicht beeinflusste. Diese

Schlussfolgerung wird durch die Beobachtung gestützt, dass nach Beendigung der Behandlung

das PrPSc-Signal sofort wieder detektierbar war (Abbildung 25). Dagegen führte die Behandlung

mit dem Antikörper 103-8 zu einer signifikanten Reduktion der Infektiosität der Zellen. Die

Inkubationszeit dieser Tiere ist vergleichbar mit der Gruppe, denen nur 104 unbehandelte

ScN2a-Zellen inokuliert wurden (108 ± 13 dpi, P=0,0142; Log-Rank-Test). Da bei diesen

ScN2a-Zellen erst nach 36 Tagen ein schwaches PrPSc-Signal detektiert wurde (Abbildung 25),

spricht dies dafür, dass eine verzögerte Rückkehr des PrPSc-Signals nach Beendigung der

Antikörperbehandlung mit einer Reduktion der Infektiosität einhergeht. Diese Beobachtung

wurde durch die beiden Antikörper 6H4 und B2-43-133 unterstützt. Bei beiden Antikörpern

wurde 36 Tage nach Beendigung der Behandlung kein PrPSc in ScN2a-Zellen detektiert

(Abbildung 25). Zudem lebten nach Abschluss des Bioassays (372 Tage) aus beiden Gruppen

noch Tiere. Der Endpunkt des Bioassays in Tga20-Mäusen liegt bei 120 bis maximal 140 Tagen

(Fischer et al., 1996). Um eine Verschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve zu beobachten, wurden

die Tiere dieser Gruppen jedoch über einen längeren Zeitraum beobachtet. Bei der verlängerten

Beobachtungsperiode verstarb jeweils ein Tier aus beiden Gruppen (B2-43-133 = 198dpi;

DISKUSSION

111

6H4 = 191dpi) an einer unspezifischen Ursache. Scrapie konnte weder biochemisch noch

histologisch bei beiden Tieren beobachtet werden. Somit reduziert der Helix 1-bindende

Antikörper B2-43-133, ähnlich wie der Referenzantikörper 6H4, sowohl den PrPSc-Gehalt als

auch die Infektiosität von ScN2a-Zellen vollständig.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-

Antikörpern der Helix 1-bindende Antikörper B2-43-133 den stärksten inhibitorischen Effekt

besitzt. Diese Einschätzung basiert auf dem sehr niedrigen IC50-Wert, der dauerhaften

Hemmung der PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen und der Löschung der Infektiosität von

ScN2a-Zellen nach einer Langzeitbehandlung.

White und Kollegen konnten 2003 zeigen, dass Antikörper, welche die PrPSc-Akkumulation in

vitro inhibieren, auch in vivo eine inhibitorische Wirkung besitzen. Die Behandlung von

intraperitoneal (i.p.) RML-infizierten wildtypischen Mäusen mit den beiden Antikörpern ICSM18

und ICSM35 reduzierte das PrPSc-Level in der Milz und verlängerte die Inkubationszeit um

150%. Dies wurde ebenfalls beobachtet, wenn die Antikörperbehandlung erst dreißig Tage

nach der Inokulation begann, also zu einem Zeitpunkt, an dem die PrPSc-Akkumulation in der

Milz nach einer i.p.-Infektion bereits eine Plateau-Phase erreicht hat (White et al., 2003). Auch

die einmalige Injektion der Antikörper 8H4 und 8B4 direkt nach einer i.p. Inokulation führte zu

einer signifikanten Verlängerung der Inkubationszeit (Sigurdsson et al., 2003). Dieser Effekt ist

jedoch wahrscheinlich auf eine Neutralisierung des Inokulums zurückzuführen, da zwischen der

Inokulation und Antikörperapplikation nur ein geringer zeitlicher Abstand lag.

Beide Studien untersuchten die Pharmakokinetik der applizierten Antikörper, da für

therapeutische Anwendungen von Antikörpern eine lange Halbwertszeit wünschenswert ist. Vier

Tage nach der letzten Injektion der beiden Antikörper ICSM18 und ICSM35 (2 mg pro Injektion)

zirkulierten noch ca. 20% im Serum (White et al., 2003). Die Antikörper 8H4 und 8B4

(0,05 mg Ak) konnten bereits vier Stunden nach der Applikation nicht mehr nachgewiesen

werden (Sigurdsson et al., 2003). In einer anderen Untersuchung wurden drei Tage nach einer

einzelnen Injektion des Antikörpers BAR236 (1 mg Ak), der zu einer signifikanten Verlängerung

der Inkubationszeit führte (P<0,001), ca. 15% detektiert, während von einem nicht-wirksamen

Antikörper noch 30% im Serum nachgewiesen wurden (Feraudet et al., 2005a). In der

vorliegenden Arbeit wurde von dem wirksamen Antikörper B2-43-133 zu diesem Zeitpunkt

zwischen 5% und 23% der ursprünglich applizierten Antikörpermenge (1 mg) im Serum

nachgewiesen (Tabelle 14). Im Vergleich dazu wurden von den anderen untersuchten

Antikörpern (7-12-5, 48-11-5, 103-8 und 110-10) höhere Mengen detektiert. Ein direkter

Vergleich mit den beiden ersten Studien ist aufgrund der unterschiedlichen Antikörpermengen

und Zeiträume nicht möglich.

Die Ergebnisse deuten auf eine geringe Halbwertszeit des Antikörpers B2-43-133 hin, so dass

dieser Antikörper für passive Immunisierungen wahrscheinlich nicht optimal geeignet ist.

DISKUSSION

112

Antikörper Antigen Epitop Effekt K IC Referenz(µg/ml(nM))

6H4 rek.boPrP 144-152 + Korth, 1997(µg/ml(nM))

D13 HaPrP27-30 95-104 0,16 (3,3) 0,6 (12)D18 HaPrP27-30 132-156 + 0,07 (1,6) 0,45 (9)R1 HaPrP27-30 200-231 + 0,09 (1,7) 2,5 (50)

R2 HaPrP27-30 225-231 +/- 0,11 (2,2) 2 (40)

8B4 rek.PrP 35-45 + (0,09/6,5/0,05)

8F9 rek.PrP 220-231 (0,7/43/2,1)

8H4 rek.PrP 175-185 + (0,07/0,09/0,04)

ICSM18 α-rek.huPrP 146-159 + 5 (45,5)ICSM19 β-rek.huPrP K + 0,36 (3,3)

ICSM35 β-rek.huPrP 91-110 + 0,004 (0,03)Sha31 Ha SAF* 145-152 + 0,1 (0,7)

BAR236 rek.ovPrP ? + 0,1 (0,7)

SAF83 Ha SAF* 126-141 + 0,25 (1,7) & 161-164

BAR214 rek.ovPrP ? + 0,25 (1,7)

BAR221 rek.ovPrP 141-151 + 0, 6 (4)

SAF34 HaSAF** 59-89(4x) + 1 (6,7)

SAF61 HaSAF** 142-153 + 2,5 (16,7)BAR224 rek.ovPrP 141-151

βH3 β-rek.PrP ?

31C6 rek.PrP 143-149 + 0,1 (0,7) Kim, 2004110 Maus-PrP 59-65 + 0,2 (1,2)

& 83-8944B1 rek.PrP 89-231 + 0,3 (1,7)72 Maus-PrP + 0,6 (4,1)

3S9 rek.huPrP 141-161 + 0,08 (0,6)2H9 rek.huPrP 151-221 + 1,2 (8,4)

6D11 ? 93-109 + (0,085/0,15) 0,07(0,47) Pankiewitcz, 2006

9H7 rek.PrP 143-231 (0,103)7D9 ? ? (0,82)

7H6 ? 130-140 + (0,22) 0,16 (1,07)

8H4 rek.PrP 175-185 + (0,38)

8B4 rek.PrP 35-45 + (0,24)

8F9 rek.PrP 220-231 (10,6)

SAF34 HaSAF** 59-89(4x) + 1,3 (8,7) Perrier, 2004

SAF61 HaSAF** 142-153 + 0,8 (5,3)

D 50

Sc

Sc

-

-

-

-

-

-

KK

+ Peretz, 2001

Sigurdsson, 2003

Beringue, 2004

Feraudet, 2004

Miyamoto, 2005

Tabelle 15: Auswahl von Anti-PrP-Antikörpern

Bei den Antikörpern 8B4, 8F9 und 8H4 beziehen sich die KD-Werte auf rekombinantes PrP (rek. PrP), Maus-PrPC und Maus-PrPSc. Der KD-Wert des Antikörpers 6D11 wurde auf rek. PrP und auf PrP93-122 bestimmt. * Proteinase K (PK)-behandelte, nicht-denaturierte SAF vom Hamster, ** PK-behandelte, Ameisensäure-denaturierte SAF vom Hamster, K Konformationsepitop

DISKUSSION

113

4.3 Unterschiede zwischen den Helix 1-bindenden Ant i-PrP-Antikörpern

Von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antikörpern führten nur die drei Helix 1-bindenden

Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 zu einer vollständigen Inhibition der PrPSc-

Akkumulation in ScN2a-Zellen (Abbildung 20). Der Einfluss auf die Infektiosität der behandelten

ScN2a-Zellen war jedoch unterschiedlich, da der Antikörper 110-10 keinen Effekt zeigte, der

Antikörper 103-8 die Infektiosität reduzierte und der Antikörper B2-43-133 die Infektiosität der

behandelten ScN2a-Zellen vollständig löschte (Tabelle 13). Um Unterschiede in dieser Gruppe

von Helix 1-bindenden Antikörpern zu identifizieren, wurde ihre Charakterisierung im Hinblick

auf die inhibitorische Effizienz analysiert.

Obwohl das Epitop von allen drei Antikörpern innerhalb der Aminosäuresequenz 142-157 von

PrPC lokalisiert wurde, deutet die Analyse der Speziesreaktivität darauf hin, dass zumindest der

Antikörper 103-8 innerhalb dieser Sequenz ein anders definiertes Epitop als die Antikörper

110-10 und B2-43-133 erkennt (Daten nicht gezeigt).

Bei der Bindung der Antikörper an ScN2a-Zellen wurden ebenfalls Unterschiede zwischen den

Helix 1-bindenden Antikörper bestimmt (Abbildung 29). Im Vergleich zum Antikörper 110-10 und

103-8 erkannte der Antikörper B2-43-133 PrPC und PrPSc mit einer höheren

Fluoreszenzintensität. Da jedoch auch nach der Bindung des unvollständig wirksamen

Antikörpers 48-11-5 an native ScN2a-Zellen eine stärkere Fluoreszenzintensität als mit den

wirksamen Antikörpern 110-10 und 103-8 detektiert wurde, ist es unwahrscheinlich, dass diese

Fähigkeit ausschlaggebend für den inhibitorischen Effekt der Antikörper ist.

Die Affinität der Antikörper zu rekombinantem PrP war hingegen sehr ähnlich (Tabelle 11). Trotz

der minimalen Unterschiede innerhalb der Gruppe der Helix 1-bindenden Antikörper und im

Vergleich zu den β-Faltblatt 2- und STE-bindenden Antikörpern lagen alle bestimmten

KD-Konstanten im pikomolaren Bereich und waren niedriger als viele der zuvor bestimmten

KD-Konstanten (Tabelle 15). Somit kann über die KD-Konstante kein Rückschluß auf das

inhibitorische Potential eines Antikörpers gezogen werden.

Zusätzlich wurde die Avidität der Antigen-Antikörper-Interaktion analysiert. Im Vergleich zu den

β-Faltblatt 2- und STE-bindenden Antikörpern waren die Aviditätsindizes der Helix 1-bindenden

Antikörper größer als 0,5 M. Die stärkste Bindung innerhalb dieser Gruppe zeigte der Antikörper

103-8 (1,37 M), während die beiden Antikörper 110-10 und B2-43-133 relativ ähnliche

Aviditätsindizes zeigten (~0,6 M). Würde jedoch die Avidität die Eigenschaft der Antikörper sein,

welche den inhibitorischen Effekt bestimmt, so sollte der Antikörper B2-43-133, und ebenso der

wirksame Referenzantikörper 6H4 (0,94 M), einen höheren Aviditätsindex als der Antikörper

103-8 besitzen.

In einer anderen Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass Antikörper, die ausschließlich

PrPC binden weniger effizient sind als Antikörper, die an beide PrP-Isoformen binden (Beringue

et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit waren alle Antikörper fähig, neben PrPC, spezifisch

DISKUSSION

114

N C

GPI

93-106 142-157 158-171

S-S


23 95-112

112-126

128-131

161-164

144-151

179-193

200-217

23151-91

Antigen: rek. PrP

Antigen: fib. PrP

7-12-5

12-29

48-11-5

103-8

110-10

B2-43-133

B2-31-166

Inhibition von PrP Sc

(10 µg/ml)Avidität

(M)KD (M)rek. PrP

KD (M)natives PrP

--

+

+

+

+/-

+/-

0,11

0,3

0,22

1,37

0,57

0,67

0,11

3,5x10-14

1,7x10-12

4,9x10-12

6,7x10-14

3,2x10-14

1,6x10-13 4,9x10-13

/

/ /

/

/

/

3,9x10-14

N C

GPI

93-106 142-157 158-171

S-S


23 95-112

112-126

128-131

161-164

144-151

179-193

200-217

23151-91

N C

GPI

93-106 142-157 158-171

S-S


23 95-112

112-126

128-131

161-164

144-151

179-193

200-217

23151-91

Antigen: rek. PrP

Antigen: fib. PrP

7-12-5

12-29

48-11-5

103-8

110-10

B2-43-133

B2-31-166

Inhibition von PrP Sc

(10 µg/ml)Avidität

(M)KD (M)rek. PrP

KD (M)natives PrP

--

+

+

+

+/-

+/-

0,11

0,3

0,22

1,37

0,57

0,67

0,11

3,5x10-14

1,7x10-12

4,9x10-12

6,7x10-14

3,2x10-14

1,6x10-13 4,9x10-13

/

/ /

/

/

/

3,9x10-14

PrPSc von ScN2a-Zellen zu detektieren (Abbildung 22). Die Bindungsanalyse der Antikörper an

PrP von ScN2a-Zellen zeigte jedoch, dass die Affinitäten der einzelnen Antikörper

unterschiedlich waren (Abbildung 29). Interessanterweise war die Affinität des Antikörpers

110-10, der Antikörper aus der Helix 1-bindenden Gruppe mit dem schwächsten inhibitorischen

Effekt, so gering, dass die Dissoziationskonstante auf diesem Substrat nicht bestimmt werden

konnte. Hingegen wurden für die drei Antikörper 6H4, ICSM18 und B2-43-133, diejenigen

Antikörper mit dem stärksten inhibitorischen Effekt, die kleinsten KD-Konstanten ermittelt und

somit die höchste Affinitäten (Tabelle 11). Da jedoch die KD-Konstante des β-Faltblatt

2-bindenden Antikörpers 48-11-5 auf ScN2a-Zellen, welcher nur unvollständig inhibitorisch

wirkt, deutlich geringer ist, als die des Antikörpers 103-8, spricht dies ebenfalls gegen eine

direkte Korrelation von Affinität und inhibitorischer Wirkung. Auch andere Studien konnten keine

Korrelation zwischen der Immunreaktivität gegenüber PrPSc und dem inhibitorischen Effekt der

Antikörper finden (Feraudet et al., 2005b).

Tabelle 16: Charakterisierung der neuen Anti-PrP-An tikörper

H1-3 = α-Helix 1-3, ββββ1-2 = β-Faltblatt 1-2, STE = Stopp-Transfer-Effektor-Sequenz, TM = Transmembran-domäne, S-S = Disulfidbrücke, GPI = Glycosylphosphatidylinositol-Anker, M = Molarität, fib. PrP = fibrilläres rekombinantes PrP, rek. PrP = rekombinantes PrP

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass innerhalb der Gruppe der Helix 1-bindenden

Antikörper sowohl Unterschiede im Epitop als auch in den Bindungen an PrPC und PrPSc

DISKUSSION

115

bestehen (Tabelle 16). Bezieht man jedoch die Ergebnisse der β-Faltblatt 2-bindenden

Antikörper in die Analyse mit ein, kann kein direkter Zusammenhang zwischen den

untersuchten Eigenschaften und dem inhibitorischen Effekt der Antikörper bestimmt werden.

4.4 Hypothesen über den Wirkungsmechanismus der Ant i-PrP-Antikörper

Die inhibitorische Wirkung von Anti-PrP-Antikörpern auf die PrPSc-Akkumulation in

verschiedenen Zelllinien wurde bereits mehrfach demonstriert (Beringue et al., 2004; Enari et

al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al.,

2006). Der Wirkungsmechanismus, den die Antikörper nutzen, um den Konformationswechsel

von PrPC zu PrPSc zu verhindern, ist jedoch bis heute unbekannt. Ausgehend von dem Wissen,

dass der Konformationswechsel entweder auf der Zelloberfläche oder in endozytotischen

Kompartimenten stattfindet (Arnold et al., 1995; Borchelt et al., 1992; Caughey und Raymond,

1991; Mayer et al., 1992) und eine direkte Interaktion zwischen PrPC und PrPSc notwendig ist,

an der eventuell Hilfsmoleküle beteiligt sind (Deleault et al., 2003; Telling et al., 1995), wurden

verschiedene Hypothesen über den Wirkungsmechanismus formuliert (Abbildung 33).

Viele der wirksamen Anti-PrP-Antikörper (Tabelle 15) binden PrPC innerhalb der Helix 1 (Reste

143-151) (Beringue et al., 2004; Enari et al., 2001; Miyamoto et al., 2005; Peretz et al., 2001;

Perrier et al., 2004; White et al., 2003). Auch das Epitop der drei inhibitorisch wirksamen

Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde in dieser Region lokalisiert (Reste 142-157)

(Abbildung 16). Beim Konformationswechsel wird dieser Bereich und die N-terminale Domäne

in eine β-helikale Struktur umgewandelt (Eghiaian et al., 2004; Govaerts et al., 2004). Dies legt

die Vermutung nahe, dass die Antikörperbindung an PrPC zu einer sterischen Blockade des

Konformationswechsels führt.

Die Bindung könnte aber auch die Interaktion von PrPC mit PrPSc inhibieren. PrPSc bindet mit

einer hohen Affinität an die Aminosäuresequenzen 23-33, 98-110 und 136-158 von PrPC

(Solforosi et al., 2007). Die Epitope aller Antikörper, die einen inhibitorischen Effekt zeigten,

beschränken sich auf vier Regionen (Reste 59-89, 90-109, 144-156 und 225-231) (Tabelle 15),

von denen zwei mit den PrPSc-affinen Epitopen übereinstimmen. Somit könnten die Antikörper,

welche an diese Epitope binden, direkt die Interaktion zwischen PrPC und PrPSc inhibieren

(Abbildung 33B). Die Studie zeigte jedoch auch, dass die Sequenzen 29-49, 110-136 und

158-231 keine intrinsische Affinität für PrPSc besitzen (Solforosi et al., 2007). Trotzdem

existieren Antikörper, wie zum Beispiel die Antikörper 8H4 und 8F9 oder die Fab-Fragmente R1

und R2, deren Epitope zwischen den Aminosäuren 175 bis 231 lokalisiert sind und welche die

PrPSc-Akkumulation inhibieren (Tabelle 15). Auch in der vorliegenden Studie wurde ein

Antikörper generiert, 48-11-5, welcher an die Sequenz 158 bis 176 bindet und zu einer

unvollständigen Inhibition der Prionreplikation führt. Dies lässt vermuten, dass, neben der oben

DISKUSSION

116

genannten direkten Störung der PrPC-PrPSc-Interaktion, den Antikörpern auch andere

Mechanismen zur Verfügung stehen müssen.

Abbildung 33: Schematische Darstellung der Mechanis men antikörpervermittelter Prioninaktivierung. A) Prionreplikation in einer infizierten Zelle. B) Der Antikörper bindet an PrPSc und/oder PrPC und verhindern so die PrPSc-PrPC-Interaktion. Die Bindung der PrPC-spezifischen Antikörper kann zusätzlich dazu führen, dass der PrPC-Metabolismus gestört wird und die Verfügbarkeit von PrPC als Substrat für die Konversion limitiert wird. C) Der Antikörper induziert eine erhöhte Konzentration von freiem PrPC. Dieses bildet einen Komplex mit freiem Antikörper (1) und sequestriert PrPSc, so dass diese Moleküle für den Konversionsprozess unzugänglich sind (2). D) Der Antikörper interferiert mit der Interaktion von PrPC und einem zellulären Rezeptor und löst dadurch die Degradation von PrPC aus.

Die Bindung des Antikörpers könnte auch eine Störung des regulären PrPC-Metabolismus

auslösen. Die Entfernung von PrPC von der Zelloberfläche, zum Beispiel durch die

Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (PIPLC) oder Intrabodies, die den Transport

von reifem PrPC zur Zelloberfläche durch eine ER-spezifische Signalsequenz verhindern, führte

zu einer PrPSc-Reduktion (Cardinale et al., 2005; Enari et al., 2001; Vetrugno et al., 2005). In

DISKUSSION

117

einer in vitro Studie wurde beobachtet, dass durch die Antikörperbehandlung die Halbwertszeit

von PrPC auf der Zelloberfläche reduziert wird, indem die PrPC-Degradation verstärkt wird (Gilch

et al., 2003; Perrier et al., 2004). Es wurde vermutet, dass die Degradation durch eine Störung

der Interaktion von PrP mit dem Laminin-Rezeptor (LRP/LR) ausgelöst wurde (Perrier et al.,

2004), der für die Internalisierung von PrP notwendig ist (Gauczynski et al., 2001; Morel et al.,

2005) (Abbildung 33D).

Gleichzeitig könnten Anti-PrP-Antikörper aber auch einen stabilisierenden Effekt auf PrPC

besitzen, indem sie die Internalisierung von PrPC verhindern und somit auch die Konversion in

den subzellulären Kompartimenten (Abbildung 33B). Einige inhibitorische Antikörper, wie zum

Beispiel SAF34 und 110 (Tabelle 15), binden an die Oktarepeats der N-terminalen Domäne.

Diese Domäne ist zwar für die Replikation nicht essentiell (Flechsig et al., 2000; Rogers et al.,

1993), jedoch für den subzellulären Transport und für die Endozytose von PrPC (Nunziante et

al., 2003; Shyng et al., 1995), so dass diese Antikörper zu einer verringerten Endozytoserate

führen könnten.

Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass Antikörper den PrPC-Gehalt auf der Zelloberfläche

Epitop-unabhängig stabilisieren. Die Bindung des Helix 1-bindenden Antikörpers 31C6

verlängerte die Halbwertszeit von PrPC auf der Zelloberfläche (Retention) und verhinderte so

die PrPC-Internalisierung und die Konversion zu PrPSc (Kim et al., 2004). Dies wurde in der

vorliegenden Arbeit auf ScN2a-Zellen für den Antikörper B2-43-133 und den Referenzantikörper

ICSM18 beobachtet (Abbildung 30). Bei den wirksamen Antikörpern 103-8 und 110-10 sowie

bei dem Referenzantikörper 6H4 verlängerte die Bindung jedoch nicht die Retention von PrPC.

Das gebundene PrPC wurde innerhalb eines ähnlich kurzen Zeitraums wie bei dem

unvollständig wirksamen Antikörpern 48-11-5 internalisiert.

Eine andere Hypothese geht davon aus, dass die Inhibition der Prionreplikation nicht durch

einen freien Antikörper, sondern durch einen freien PrP/Antikörper-Komplex vermittelt wird

(Feraudet et al., 2005a). Dies wurde von den Beobachtungen abgeleitet, dass eine einzelne

Anti-PrP-Antikörperinjektion in wildtypische Mäuse zu einem Anstieg von freiem PrPC im Blut

führte und gleichzeitig ein PrPC/Ak-Komplex mit einer langen Halbwertszeit nachgewiesen

wurde, während der freie Antikörper nur eine relativ kurze Halbwertszeit im Blut besaß. Bindet

dieser PrP/Ak-Komplex an PrPC oder PrPSc, kann er entweder die Interaktion zwischen den

beiden Isoformen verhindern oder er neutralisiert bereits existierendes PrPSc (Feraudet et al.,

2005a) (Abbildung 33C). In der vorliegenden Arbeit reduzierte die Komplexbildung mit

rekombinantem PrP den inhibitorischen Effekt des Antikörpers B2-43-133, obwohl ein stabiler

Komplex auch noch nach fünf Tagen im Medium nachgewiesen wurde (Abbildung 27). Zwar

wurde auch eine vollständige Reduktion des PrPSc-Signals nach der Behandlung mit dem

Komplex beobachtet, jedoch war eine ca. achtfach höhere Antikörperkonzentration im Vergleich

zu freiem Antikörper notwendig. Da der IC50-Wert des Antikörpers B2-43-133 sehr niedrig ist

DISKUSSION

118

(0,044 µg/ml), legt dies die Vermutung nah, dass der Effekt auf freien Antikörper

zurückzuführen ist, der durch die unspezifische Spaltung eines kleinen Teils des Komplexes

entstanden ist.

Ob diese Modellvorstellungen auch auf die in vivo-Situation übertragbar sind, ist noch unklar.

Der Antikörper 7D9, der in Zellkulturversuchen keinen inhibitorischen Effekt zeigte, reduzierte

die Infektiosität eines Inokulums durch Präinkubation und verlängerte nach einer einmaligen

Injektion die Inkubationszeit von infizierten Mäusen signifikant (Pankiewicz et al., 2006).

Die Überprüfung mehrere Hypothesen bezüglich des Wirkungsmechanismusses von Anti-PrP-

Antikörpern lieferte kein eindeutiges Ergebnis. Alle wirksamen Antikörper (103-8, 110-10,

B2-43-133) können theoretisch aufgrund ihres Epitopes mit der PrPC-PrPSc-Interaktion

interferieren. Zusätzlich verlängerte der Antikörper B2-43-133 die Retention von PrP auf der

Zelloberfläche. Da dies aber für den Referenzantikörper 6H4, der einen ähnlich starken

inhibitorschen Effekt wie der Antikörper B2-43-133 zeigte, nicht beobachtet wurde, ist es

unwahrscheinlich, dass die Retention von PrP der Wirkungsmechanismus ist. Jedoch muss in

Betracht gezogen werden, dass verschiedene Antikörper verschiedene Mechanismen nutzen

könnten und dass sich einzelne Mechanismen nicht gegenseitig ausschließen, sondern auch

durch ihre Kombination die inhibitorische Effizienz erhöhen könnten.

4.5 Ausblick

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper B2-43-133 ein idealer Kandidat für

weiterführende Untersuchungen bezüglich möglicher therapeutischer Implikationen ist. Die

kontinuierliche Applikation eines Antikörpers, der gegen ein körpereigenes Protein gerichtet ist,

birgt jedoch mehrere Risiken. Zum einen besteht die Gefahr, dass die Toleranz gegen das

Protein überwunden wird und es zur Entwicklung von Autoimmunkrankheiten kommt, zum

anderen könnten die Antikörper die Funktion von PrPC beeinflussen. Bei wildtypischen Mäusen,

die für 53 Wochen zweimal wöchentlich mit hohen Dosen Anti-PrP-Antikörpern behandelt

wurden, wurden keine unerwünschten Nebeneffekte beobachtet (White et al., 2003).

Ein weiteres Problem bei der Behandlung von Prionenerkrankungen ist, dass es nach einer

peripheren Infektion mit Prionen, die in der Regel bei Scrapie, BSE und vCJD vorliegt, nach

einer Replikationsphase in den sekundären lymphoiden Organen zu einer Prioneninvasion ins

ZNS kommt (Neuroinvasion). Obwohl die Antikörper in den vorgestellten Studien die

Prionpathogenese nach intraperitonealer Infektion signifikant beeinflussten, konnte nach

intrazerebraler Infektion weder die Applikation von Antikörpern noch die kontinuierliche

Expression einer Anti-PrP-µ-Kette die Entwicklung einer vollständigen Scrapie-Pathogenese

stoppen (Heppner et al., 2001; White et al., 2003). Da die Antikörper die Blut-Hirn-Schranke

nicht effizient passieren können, ist ihre Verfügbarkeit im Gehirn limitiert. Wird jedoch die

DISKUSSION

119

Prionenerkrankung erst nach der Neuroinvasion diagnostiziert, ist es notwendig, dass effektive

Immuntherapeutika auch ins ZNS eindringen können.

Eine Möglichkeit, um die Bioverfügbarkeit der Antikörper im Gehirn zu maximieren, ist die

direkte intrazerebrale Applikation. In einer Pilotstudie führte jedoch die direkte Injektion von

Anti-PrP-Antikörpern, die an die Sequenz 95-105 binden, in den Hippocampus wildtypischer

Mäuse zu neuronaler Apoptose. Da die Applikation der korrespondierenden Fab-Fragmente

keine Apoptose induzierte, wurde ein Komplement-vermittelter Effekt über den FC-Teil

ausgeschlossen. Die Autoren folgerten vielmehr, dass durch die Dimerisierung von

extrazellulärem PrPC über ein bestimmtes Epitop eine Signalkaskade ausgelöst wurde

(Solforosi et al., 2004).

Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass passive Immunisierungsstrategien mit

humanisierten Antikörpern eher zur Postexpositionsprophylaxe geeignet sind, d.h. wenn PrP für

die im Blut zirkulierenden Antikörpern noch zugänglich ist. Im Falle von asymptomatischen

Trägern pathogener PRNP-Mutationen oder bestimmten Risikogruppen wie z.B. Empfänger von

vCJD-kontaminiertem Blut könnte eine postprophylaktische Behandlung mit Anti-PrP-

Antikörpern zu therapeutischen Erfolgen führen.

Gentherapeutische Strategien bieten eine Möglichkeit, um die oben genannten Limitationen zu

umgehen. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine humane Zelllinie, die kontinuierlich scFv des

monoklonalen Antikörpers 6H4 sezernierte, nach Kokultivierung mit ScN2a-Zellen zu einer

parakrinen Hemmung der Prionenpropagation führte (Donofrio et al., 2005). Solche genetisch

veränderten Zellen bieten den Vorteil, dass sie in die Nähe der Zielstruktur implantiert werden

können und dort über einen längeren Zeitraum kontinuierlich Antikörper bzw.

Antikörperfragmente sezernieren.

Um diese Zellen vor dem Immunsystem des Empfängers zu schützen, können sie zusätzlich in

polykationische Kapseln eingeschlossen werden. Eine semipermeable Membran gewährleistet

dann, dass die Zellen mit Nährstoffen versorgt werden und die sezernierten Antikörper in den

Metabolismus gelangen (Orive et al., 2003). Diese Technologie wurde bereits für die Krankheit

Chorea Huntington in einer Phase I Studie untersucht (Bachoud-Levi et al., 2000; Bloch et al.,

2004).

Im Hinblick auf diese Untersuchungen soll in zukünftigen Experimenten der Anti-PrP-Antikörper

B2-43-133 kloniert werden und eine Zelllinie etabliert werden, welche diesen Antikörper

kontinuierlich sezerniert und für therapeutische Zwecke einsetzbar ist.

ZUSAMMENFASSUNG

120

5 Zusammenfassung

5.1 Deutsch

Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten

Isoform des zellulären Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infektiöse Isoform, die PrPSc

genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc

übernimmt. Die Konversion des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform

PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale

von Prionenerkrankungen und bieten mögliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den

letzten Jahren haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in

vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen können und so die PrPSc-Akkumulation

inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005;

Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die

Generation neuer Anti-PrP-Antikörper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen können

und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antikörpern für therapeutische und diagnostische Zwecke zu

erweitern.

Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antikörper mittels „Hybridom“-Technik hergestellt. Zwei der

Antikörper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-

Mäusen, die zuvor mit fibrillärem PrP immunisiert wurden. Bei fünf Antikörpern (7-12-5, 12-29,

48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde für die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet.

Alle Antikörper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc.

Die bestimmten Aviditäten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante)

waren mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar. Das Epitop des Antikörpers

B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), während

die Antikörper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globulären C-Terminus binden (Reste 158-

176). Das Epitop der Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus

bestimmt (Reste 142-157). Diese Antikörper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-

152), einem Epitop, das bereits häufiger für inhibitorisch wirksame Antikörper bestimmt wurde.

Drei der sieben Anti-PrP-Antikörper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die

PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antikörper 48-11-5

führte zu einer unvollständigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die

Verlängerung des Applikationszeitraums nicht verstärken ließ. Dagegen inhibierten die

Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollständig. Dieser Effekt

wurde auf eine spezifische Interaktion der Antikörper mit PrP zurückgeführt, da ein

zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch hätte verringern können, nicht

beobachtet wurde.

ZUSAMMENFASSUNG

121

Bei der Analyse der Infektiosität von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antikörper

110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosität der Zellen nicht reduzieren

konnte. Die Behandlung mit dem Antikörper 103-8 reduzierte die Infektiosität der ScN2a-Zellen

zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation

in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 die

Infektiosität der ScN2a-Zellen vollständig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach

36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke

inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers wird zusätzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert

(0,31 nM) unterstützt, der mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar ist.

Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass von den sieben neu generierten

Anti-PrP-Antikörpern der Antikörper B2-43-133 ein Kandidat für weiterführende Experimente mit

therapeutischem Hintergrund ist.

Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antikörper für die Inhibition nutzen, konnte nicht geklärt

werden. Obwohl der Antikörper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfläche

(Retention) verlängerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Moleküle der

PrPSc-Konversion entzogen werden können, wurde dies für einen Referenzantikörper, welcher

einen ähnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder dafür,

dass die Verlängerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antikörper ist und

ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder dafür, dass verschiedene Antikörper verschiedene

Mechanismen nutzen können. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des

Antikörpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht bestätigt werden,

da eine stabile Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer

Erhöhung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antikörper führte.

ZUSAMMENFASSUNG

122

5.2 Englisch

The development of prion diseases is characterized by accumulation of an abnormal folded

isoform of the cellular prion protein (PrPC). This infectious isoform, called PrPSc, emerges

through interaction with PrPC adopting the conformation of PrPSc. Thus, conversion of PrPC to its

pathogenic isoform and the resulting PrPSc accumulation are substantial hallmarks of prion

diseases that provide possible therapeutical intervention points. Recent studies have shown

that antibodies recognizing PrPC and/or PrPSc interfere with the conversion process in vitro and

in vivo and inhibit PrPSc accumulation (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al.,

2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003).

This study was initiated to generate new anti-PrP antibodies that could efficiently inhibit the

PrPSc conversion and thereby extend the repertoire of monoclonal antibodies (mAbs) for

therapeutic and diagnostic use. Altogether, seven antibodies could be established by

hybridoma-technique: two mAbs from immunisation of Prnp0/0 mice with fibrillar PrP (B2-31-166

and B2-43-133) and the remainder (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) by using

recombinant PrP as immunogen.

All antibodies were able to detect recombinant PrP as well as native and denaturated PrPC and

PrPSc. The avidities and similar dissociation constants were comparable to commercial

reference antibodies. The epitope of mAb B2-31-166 was determined in the unstructured N-

terminal domain (residues 96-110), whereas mAbs 7-12-5, 12-29 and 48-115 detected an

epitope in the C-terminal globular domain (residues 158-176). The epitopes of mAbs 103-8,

110-10 and B2-43-133 are located in the C-terminus (residues 142-157) as well and correspond

to the α-helix 1 of PrPC (residues 144-152). This region was already determined as a potential

epitope for other inhibitory effective antibodies.

Three antibodies (7-12-5, 12-29 and B2-31-166) did not inhibit PrPSc accumulation in prion-

infected cells (ScN2a cells). MAb 48-11-5 only led to an incomplete reduction of the PrPSc

content. This effect could not be strengthened through extending the treatment period. In

contrast, mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 were able to completely inhibit the PrPSc

accumulation in ScN2a cells. This effect was attributed to a specific interaction between

antibodies and PrP as no cytotoxic effect was detectable that could lead to an unspecific

reduction of the PrPSc content.

Interestingly, analysis of the infectivity of antibody-treated ScN2a cells showed that mAb 110-10

was indeed able to inhibit PrPSc accumulation, although it did not affect the infectivity of ScN2a

cells. MAb 103-8 reduced the infectivity level, but new PrPSc accumulation could be detected in

ScN2a cells 30 days after the treatment had been finished. Only treatment with mAb B2-43-133

completely eliminated the infectivity of ScN2a cells and no PrPSc could be detected in ScN2a

cells even 36 days after treatment. The strong inhibitory effect of this antibody is supported by a

very low IC50 value (0,31 nM) which is also comparable with commercial anti-PrP antibodies. In

ZUSAMMENFASSUNG

123

summary, these results indicate that anti-PrP antibody B2-43-133 represents a good candidate

for future immunotherapeutic approaches.

Furthermore, it was impossible to clearly identify the underlying mechanisms of the antibodies

for the inhibition of PrPSc accumulation. Although mAb B2-43-133 prolonged the retention of

PrPC on the cell surface, whereby the bound PrPC molecules could hypothetical withdraw the

PrPSc conversion, this could not be observed for commercial antibodies with similar inhibitory

effect. These data imply that the prolongation of the PrP retention is only one feature of mAb

B2-43-133. However, it is possible that different antibodies use different mechanisms to inhibit

PrPSc conversion and that the retention is one of them. In addition, the inhibition of PrPSc

accumulation is probably not mediated by the formation of an antibody-protein complex since

the treatment of ScN2a cells with a stable complex consisting of B2-43-133 and recombinant

PrP complex decreased the inhibitory effect compared to free antibody.

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

143

7 Anhang

7.1 Abkürzungsverzeichnis

Über die gebräuchlichen SI- und IUPAC-Einheiten hinausgehend wurden die folgenden Abkürzungen verwendet: A Alanin Aβ Amyloid-β A.dest. destilliertes Wasser AD Alzheimer-Krankheit AI Aviditätsindex Ak Antikörper amp Ampicillin APC Antigen-präsentierende Zelle APP Amyloid-Precursor-Protein AS Aminosäure boPrP bovines PrP bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie bzw. beziehungsweise CD Lymphozyten-Differenzierungsmarker cDNA complementary DNA CDR complementary determining region CFA Komplettes Freund-Adjuvans CH konstante Domäne der schweren Kette CJD Creutzfeldt-Jakob-Krankheit CL konstante Domäne der leichten Kette CMV Cytomegalievirus CO2 Kohlendioxid CpG Cytosin-Guanosin-Dinukleotide CTB Cholera Toxin Untereinheit B Cu Kupfer CWD Chronic Wasting Disease D Asparaginsäure DC dendritische Zellen ddH2O doppelt destilliertes Wasser ddNTP Didesoxyribonukleotid-Triphosphat D-Gensement Diversity-Gensegement DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dpi days post inoculation E Glutaminsäure E.coli Escherichia coli ECL Enhanced Chemiluminescense EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme-linked-immunosorbent-assay et al. et altera Fab Fragment antigen binding FACS Fluorescence-activated-cell-sorting


144

FC Fragment crystallizable fCJD familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheit FCS fötales Kälberserum FDC follikulär dendritische Zellen FFI Fatal Familiäre Insomnie fib.PrP fibrilläres PrP FITC Fluoresceinisothiocyanat FR framework region FSE Feline Spongiforme Enzephalopathie GABA γ-Aminobuttersäure GPI Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol-Gruppe GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom H Histidin HAMA humaner Anti-Maus-Antikörper HaPrP Hamster-PrP HAT-Medium Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium H-Kette heavy chain HRP Horseraddish Peroxidase i.c. intrazerebral i.p. intraperitoneal iCJD iatrogene Creutzfeldt-Jakob-Krankheit IFA inkomplettes Freund-Adjuvants Ig Immunglobulin IL Interleukin in vitro in Zellkultur/Reagenzglas in vivo am Lebenden J-Gensegment Joining-Gensegement K Lysin kb Kilobasenpaar KD Dissoziationskonstante kDa Kilodalton KLH Keyhole limpet Hämocyanin LB Luria Broth (Medium) L-Kette light chain mAk monoklonaler Antikörper Met Methionin MHC Haupthistokompatibilitätskomplex MOCK unbehandelt N Asparagin NCAM neurales Zellenadhäsionsmolekül NH4SCN Ammoniumthiocyanat NMR Kernresonanz-Spektroskopie OD Optische Dichte ODN Oligodinukleotid(e) ovPrP ovines PrP PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese pAK polyklonaler Antikörper PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerasekettenreaktion PEG Polyethylenglykol pH negativer dekadischer Logarithmus der Hydroniumionenkonzentration PK Proteinase K PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid


145

PPS Pentosanpolyphosphat PRNP Genlocus des humanen Prion-Proteins Prnp0/0 PrP-defiziente Mäuse (Knockout) PrPC zelluläres Prion-Protein PrPSc pathologische Form des Prion-Proteins PVDF Polyvinylidene Fluoride Q Glutamin R Arginin RAG Rekombination-aktivierendes Gen rek. PrP rekombinantes Maus-PrP rER raues endoplasmatisches Retikulum RML Rocky-Mountain-Laboratory RNA Ribonukleinsäure rpm Runden pro Minute RSS Rekombination-Signal-Sequenz RT Raumtemperatur SAF Scrapie-assoziierte Fibrillen scFv single chain fragment variable sCJD sporadische Creutzfeldt-Jakob-Krankheit SDS Natriumdodecylsulfat SOD-1 Superoxiddismutase-1 STE Stop-Transfer-Effektor-Seite T Threonin TAE Tris-Essigsäure-EDTA-Puffer TBST Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween 20 Temp. Temperatur TM transmembrane Region TME Transmissible Mink Encephalopathy TSE transmissible spongiforme Enzephalopathien U unit (Enzymaktivitätseinheit) V Volt Val Valin vCJD variante Form der Creutzfeldt-Jakob-Disease VH variable Domäne der schweren Kette

VL variable Domäne der leichten Kette Y Tyrosin z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil Zn Zink ZNS zentrales Nervensystem

TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS

146

7.2 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis

Tabelle 1: Zusammenfassung humaner Prionenerkrankungen. 7

Tabelle 2: Vergleich der Eigenschaften von PrPC, PrPSc und PrP27-30. 13

Tabelle 3: Eigenschaften muriner Immunglobuline. 25

Tabelle 4: Klinisch zugelassene Antikörper in Deutschland. . 32

Tabelle 5: Verdünnungen der im Western Blot verwendeten Antikörper. 54

Tabelle 6: Verdünnungen der im Durchflusszytometer verwendeten Antikörper. 58

Tabelle 7: Ausgewählte Parameter der Fusionen. 73

Tabelle 8: Übersicht der neuen monoklonalen Anti-PrP-Antikörper. 75

Tabelle 9: Durchschnittliche Mengen an sezernierten Antikörpern im Medium. 77

Tabelle 10: Aviditätsindizes (AI) der Anti-PrP-Antikörper. 85

Tabelle 11: KD-Konstanten der Anti-PrP-Antikörper. 86

Tabelle 12: IC50-Werte der Anti-PrP-Antikörper. 92

Tabelle 13: Bioassay für die Bestimmung der Infektiosität von ScN2a-Zellen nach

der Behandlung mit Anti-PrP-Antikörpern. 97

Tabelle 14: Prozentualer Anteil der Antikörper im Serum der Mäuse. 104

Tabelle 15: Auswahl von Anti-PrP-Antikörpern. 112

Tabelle 16: Charakterisierung der neuen Anti-PrP-Antikörper. 114

Abb. 1: Pathogene Mutationen und Polymorphismen des humanen PRNP-Gens. 8

Abb. 2: Schematische Darstellung des murinen Prion-Proteins. 11

Abb. 3: NMR-Struktur von rekombinantem PrP (Reste 121-231). 14

Abb. 4: Schematisches Modell der PrPSc-Konformation und Aggregation. 15

Abb. 5: Modelle für die Konversion von PrPC zu PrPSc. 17

Abb. 6: Potentielle Angriffspunkte für therapeutische Interventionen bei Prionen-

erkrankungen am Beispiel des Faltungsmodells. 19

Abb. 7: Modell eines IgG-Antikörpers und Struktur der Antigenbindungsstelle. 24

Abb. 8: Schematische Darstellung der somatischen Rekombination am Beispiel der

schweren Kette. 26

Abb. 9: Schematische Darstellung der Herstellung von monoklonalen Antikörpern. 29

Abb. 10: Darstellung von verschiedenen Antikörperformaten. 31

Abb. 11: Immunisierungsschema der Prnp0/0-Mäuse und Zeitpunkte der Fusion. 72

Abb. 12: Dreistufiges Screeningverfahren zur Isolierung des potentiellen Anti-PrP-

Antikörper-produzierenden Klons B2-43-133. 74

Abb. 13: Schematische Darstellung der Struktur von Maus-PrP und der klonierten

TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS

147

Mutanten mit N-terminaler (∆32-93) sowie interner Deletion (∆142-157

oder ∆158-171). 78

Abb. 14: 3-Weg-Ligation zur Deletion der Reste 142 bis 157 bzw. 158 bis 171

in PrP ∆32-93. 79

Abb. 15: Epitop-Bestimmung der Anti-PrP-Antikörper mittels Expressions- und

FACS-Analyse von PrP-Deletionsmutanten. 81

Abb. 16: Schematische Darstellung der Struktur von Maus-PrP und Lokalisierung der

Epitope der Anti-PrP-Antikörper. 82

Abb. 17:Schematische Darstellung der geladenen Reste innerhalb der α-Helix 1

von Maus-PrPC. 83

Abb. 18: Schematische Darstellung von Maus-PrPC und der drei Substitutionen für

die Bestimmung des Minimalepitops. 84

Abb. 19: Bestimmung der Avidität der Anti-PrP-Antikörper. 85

Abb. 20: Reduktion des PrPSc-Gehalts von ScN2a-Zellen durch Anti-PrP-Antikörper. 88

Abb. 21: Untersuchung zum zytotoxischen Effekt der Anti-PrP-Antikörper auf

ScN2a-Zellen. 89

Abb. 22: Bindung der Anti-PrP-Antikörper an PrPSc auf ScN2a- und cuScN2a-Zellen. 90

Abb. 23: Dosisabhängige Reduktion des PrPSc-Gehalts von ScN2a-Zellen am

Beispiel B2-43-133. 91

Abb. 24: PrPSc-Gehalt von ScN2a-Zellen nach Langzeitbehandlung mit den

Anti-PrP-Antikörpern. 93

Abb. 25: PrPSc-Gehalt von ScN2a-Zellen nach Beendigung der Langzeitbehandlung

mit den Anti-PrP-Antikörpern. 94

Abb. 26: Inkubationszeiten der Indikatormäuse nach intrazerebraler Inokulation von

Anti-PrP-Antikörper-behandelten ScN2a-Zellen. 96

Abb. 27: Hemmung der PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen durch die Behandlung

mit freiem B2-43-133 und einem PrP/B2-43-133-Komplex. 99

Abb. 28: Prinzip der Analyse des Einflusses der Anti-PrP-Antikörper auf die Retention. 100

Abb. 29: Bindung der Anti-PrP-Antikörper an Oberflächen-PrP auf ScN2a-Zellen. 100

Abb. 30: Einfluss der Anti-PrP-Antikörper auf die Retention von Oberflächen-PrP

auf ScN2a-Zellen. 101

Abb. 31: Immunisierungsschema von RML-infizierten C57BL/6-Mäusen für die Analyse

der Pharmakokinetik. 103

Abb. 32: Analyse der Pharmakokinetik der Anti-PrP-Antikörper. 104

Abb. 33: Schematische Darstellung der Mechanismen antikörpervermittelter

Prioninaktivierung. 116

LEBENSLAUF

148

7.3 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Tanja Hoffmann

Geburtsdatum, -ort 26.11.1976, Datteln

Familienstand ledig, keine Kinder

Schulabschluss

1996 Abitur, Theodor Heuss-Gymnasium, Waltrop (Note: gut)

Studium

1996 – 2002 Diplom-Biologiestudium, Ruhr-Universität Bochum (Note: sehr gut)

2001 – 2002

Thema:

Diplomarbeit in der AG Spezielle Zoologie, Ruhr-Universität Bochum

(Prof. Dr. G. A. Schaub)

„Untersuchungen zur bakteriellen Darmflora von Panstrongylus

megistus, Triatoma klugi und Triatoma brasiliensis und Identifizierung

symbiontischer Aktinomyceten“ (Note: sehr gut)

Promotion

seit 04/2003

Thema:

Promotionsstudium, Bayerischen Julius-Maximilians-Universität

Würzburg, Institut für Virologie und Immunbiologie

(Prof. Dr. M. A. Klein)

„Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das Prion-

Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in

Zellkultur“

Würzburg, 01.07.2008

Tanja Hoffmann

VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONGRESSBEITRÄGE

149

7.4 Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

Veröffentlichungen

Christine von Poser-Klein, Eckhard Flechsig, Tanja Hoffmann, Petra Schwarz, Harry Harms,

Raymond Bujdoso, Adriano Aguzzi and Michael A. Klein „Alteration of B cell subsets enhance

neuroinvasion in mouse scrapie.“

J Virol. 2008 Jan 16

Tanja Hoffmann, Julia Merk, Nele Lindner, Thorsten Lührs, Michael A. Klein and Eckhard

Flechsig „Characterization of novel monoclonal antibodies against PrP.”

in progress

Kongressbeiträge in Form einer Posterpräsentation

07/2004

10/2004

03/2005

07/2005

10/2005

05/2006

05/2007

Tanja Hoffmann, Nele Ruoff, Julia Günter, Michael A. Klein, Eckhard

Flechsig “Characterization of novel monoclonal antibodies against PrP for

diagnostic and therapeutic approaches.”

• Treffen des Bayrischen Forschungsverbundes Prionen (ForPrion),

Würzburg

• Nationale TSE-Forschungsplattform, Düsseldorf

Tanja Hoffmann, Nele Ruoff, Julia Günter, Michael A. Klein, Eckhard

Flechsig “Characterization of novel monoclonal antibodies against PrP.”

• Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover

Tanja Hoffmann, Nele Lindner, Julia Günter, Michael A. Klein, Eckhard

Flechsig “Cell-surface retention of PrPC by novel anti-PrP antibodies

correlates with inhibition of PrPSc accumulation in cultured cells.”


Hohenkammer

• International Conference, Prion 2005: Between fundamentals and

society's needs, Düsseldorf


München


München

ERKLÄRUNG

150

7.5 Erklärung

Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich diese Dissertation selbständig angefertigt und keine

anderen als die von mir angegebenen Hilfsmittel und Quellen benutzt habe.

Zudem erkläre ich, dass diese Dissertation weder in gleicher noch in anderer Form bereits in

einem Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

Ich habe früher, außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlichen Graden, keine weiteren

akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.

Würzburg, 01.07.2008

Tanja Hoffmann

DANKSAGUNG

151

7.6 Danksagung

Mein Dank gilt Prof. Dr. Michael Klein für die Vergabe des interessanten Themas, die

hervorragende Betreuung sowie für die Unterstützung und Förderung während der gesamten

Arbeit.

Ich danke Prof. Dr. Dr. Jörg Hacker für die Bereitschaft, die Zweitkorrektur zu übernehmen und

für sein Interesse am Fortschritt der Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt Julia Günter und Nele Lindner. Die Bewältigung von so vielen

„Mamas“ und „Babys“ war nur mit drei Paar tatkräftigen Händen möglich (…und bald gibt es

echte Babys, juchuh!).

Ganz herzlich möchte ich mich auch bei den restlichen Mitgliedern der AG Klein/Flechsig –

Angela Bahlo, Vladimir Ermolayev, Katja Hochgräfe, Patrick Porps, Jan Springer – und allen

ehemaligen Mitgliedern – besonders bei Cindy Nitschke – bedanken. Ohne sie wäre diese

Arbeit nur mit halb so viel Spaß verbunden gewesen. Danke für die vielen lustigen Keks-

Pausen, die zahlreichen Gespräche über Gott und die Welt und den Spaß, den wir vor allen

Dingen auch außerhalb des Labors hatten.

Bedanken möchte ich mich noch herzlicher bei Familie Porps – Patrick, Corinna und Daria –,

die mir während meiner Zeit in Würzburg sehr ans Herz gewachsen sind.

Nicht zuletzt danke ich meinen Waltroper Mädels – Gesche, Ilka, Jessi, Moni, Rebecca und

Wibke (Dir gilt ein zusätzliches Danke für das Einfügen vieler englischer Artikel, Bindestriche

und Zeilenumbrüche) –, die auch aus der Ferne immer ein offenes Ohr für meine Probleme

hatten und mich in jeglicher Hinsicht uneingeschränkt unterstützt und motiviert haben.

Zu guter Letzt bedanke ich mich von ganzem Herzen bei meinen Eltern und meiner Tante dafür,

dass sie immer an mich geglaubt haben.

DANKE ☺

Documents

Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen ... · Das Prion-Konzept besagt, dass der infektiöse Erreger aus einem körpereigenen Protein mit veränderter Gestalt besteht