Herstellung von Spinnenseidenproteinen in Tabaksamen

Dissertation

Herstellung von Spinnenseidenproteinen in Tabaksamen

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Biowissenschaften

der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Dipl-Biotechnol. Kai Schallau

geb. am 20.07.1977 in Marburg

Gutachter: 1. PD Dr. Udo Conrad

2. Prof. Dr. Werner Roos

3. Prof. Dr. Jürgen Scheller

eingereicht: 13.03.2008

Datum der Promotion: 11.09.2008

urn:nbn:de:gbv:3-000014379[http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000014379]

Danksagung

Ich danke allen, die mich bei der Bearbeitung dieser Arbeit unterstützt haben. Dabei ist

zunächst die hervorragende technische Unterstützung bei der Regeneration und Analyse der

transgenen Pflanzen durch Christine Helmold, Anita Winger und Rotraud Losse zu nennen.

Auch die Hilfe meiner wissenschaftlichen Kollegen der Gruppe „Phytoantikörper“ hat,

innerhalb wie außerhalb des Labors, wesentlich zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen.

Ihnen allen sei an dieser Stelle gedankt. Ich bedanke mich bei Dr. Helmut Bäumlein und

Dr. Andreas Houben für ihre hilfreichen Anregungen bei der schriftlichen Verfassung meiner

Arbeit.

Auch meinen Mentoren Dr. Jens Tiedemann und Dr. Uwe Spohn gilt mein Dank für ihre

Hilfe.

Prof. Dr. Ulrich Wobus danke ich für die Möglichkeit meine Arbeit am Leibniz-Institut für

Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung in Gatersleben durchzuführen.

Ein besonderer Dank gebührt Dr. habil. Udo Conrad für die Möglichkeit dieses

hochinteressante Thema zu bearbeiten und für seine kompetente und ehrliche Unterstützung.

Abschließend möchte ich mich für die Unterstützung meiner Familie bedanken, ohne die

nichts eine Bedeutung hätte.

Ich hoffe, dass ich alle Beteiligten in genügendem Umfang für ihre Hilfe gewürdigt habe.

Sollte dem nicht so sein, bedenkt folgendes:

"Begegnet uns jemand, der uns Dank schuldig ist, gleich fällt es uns ein. Wie oft können wir

jemandem begegnen, dem wir Dank schuldig sind, ohne daran zu denken!"

Johann Wolfgang von Goethe, Maximen und Reflexionen

Abkürzungsverzeichnis

+K Positivkontrolle °C Grad Celsius

9E10 Anti-c-myc-Antikörper 9E10 (Evan et al., 1985)

A Ampere A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Abb. Abbildung

AcSp Spinnenseidenprotein der traubenförmigen Drüse

ADF Aranaeus diadematus Fibroin BAP 6-Benzylaminopurin bp Basenpaare

BSA "bovine serum albumine“, Rinderserumalbumin

CaMV „cauliflower mosaic virus“, Blumenkohl Mosaikvirus

cDNA „complementary DNA“, komplementäre Desoxyribonukleinsäure

C-Terminus

carboxyterminaler Teil eines Proteins

Da Dalton

ddH2O zweifach destilliertes Wasser

DEPC Diethylpyrocarbonat DNS Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli

ECL enzymatische Chemolumineszenz

ECP "egg case protein", Protein des Spinnenkokons

EDTA "ethylenediaminetetraacetic acid", Ethylendiamintetra- essigsäure

ELP "elastin like polypeptide", Elastin ähnliches Polypeptid

ER endoplasmatisches Retikulum

F Farad

Flag Spinnenseidenprotein der geißelförmigen Drüse

g Gramm bzw. relative Erdbeschleunigung

Gly Glycin His-Tag Polyhistidinmotiv Ig Immunglobulin

IPK Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben

ITC Inverse Transition Cycling J Joule k Kilo 103

Kanr Kanamyzin resistent

KDEL Lysin-Asparaginsäure- Glutaminsäure-Leucin- Peptid

l Liter LB-Medium

"lysogeny broth", komplexes Bakterienmedium

m Meter, milli 10-3 M Mol/Liter

MaSp Spinnenseidenprotein der großen ampullenförmigen Drüse

MES Morpholinethansulfonsäure

MiSp Spinnenseidenprotein der kleinen ampullenförmigen Drüse

MS-Medium

Medium nach Murashige und Skoog

N Newton n Nano 10-9 N. tabacum Nicotiana tabacum

N. benthamiana

Nicotiana benthamiana

NES α-Naphtylessigsäure N-Terminus

aminoterminaler Teil eines Proteins

OD optische Dichte PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PBS „phosphate-buffered saline“, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung

PCR „polymerase chain reaction“, Polymerasekettenreaktion

PHB Polyhydroxybuttersäure Pro Prolin

rcf „Relative centrifugal force“, relative Zentrifugationskraft (=g)

rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur

scFv „single-chain Fv“, Einzelketten-Antikörperfragmente

SDS „sodium dodecyl sulfate“, Natriumdodecylsulfat

SNN Nicotiana tabacum, Varietät Samsun NN (Wildtyp)

SOB-Medium

komplexes Bakterienmedium

SOC-Medium

komplexes Bakterienmedium

spp. Mehrere Spezies einer Gattung

Tab. Tabelle TGase Transglutaminase TRIS Trishydroxymethylaminomethan

TSP Gesamtmenge an löslichem Protein

TuSp Spinnenseidenprotein der röhrenförmigen Drüse

ÜN Über Nacht V Volt Val Valin

WT Wildtyp, hier: Nicotiana tabacum Varietät Samsun NN

µ Mikro 10-6

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung - 1 -

1.1 Spinnenseide - 1 -

1.2 Pflanzen als Produktionsplattform für transgene Proteine - 10 -

1.3 Elastin ähnliche Polypeptide (Elastin-like-polypeptides) - 12 -

1.4 Proteinmodifikation - 14 -

1.5 Zielsetzung - 16 -

2 Material und Methoden - 18 -

2.1 Material - 18 -

2.1.1 Bakterienstämme - 18 -

2.1.2 Vektoren - 18 -

2.1.3 Pflanzenmaterial - 18 -

2.1.4 Oligonukleotide, Primer - 19 -

2.1.5 Medien - 19 -

2.1.5.1 Pflanzenmedien - 19 -

2.1.5.2 Bakterienmedien - 20 -

2.1.6 Puffer - 20 -

2.1.7 Enzyme - 21 -

2.1.8 Antibiotika - 21 -

2.1.9 Antikörper - 21 -

2.1.10 Pflanzenhormone - 21 -

2.1.11 Chemikalien, Reagenzien und Kits - 22 -

2.1.12 Software - 22 -

2.1.13 Laborgeräte - 23 -

2.1.14 Verbrauchsmaterial - 23 -

2.2 Methoden - 24 -

2.2.1 Klonierung - 24 -

2.2.2 Bakterienkultivierung - 24 -

2.2.3 Transformation mittels Elektroporation - 25 -

2.2.3.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen (XL1Blue) - 25 -

2.2.3.2 Transformation - 25 -

2.2.4 Pflanzenanzucht - 25 -

2.2.5 Stabile Tabaktransformation - 26 -

2.2.6 Transiente Tabaktransformation - 26 -

2.2.6.1 Spritzeninfiltration - 27 -

2.2.6.2 Vakuuminfiltration - 27 -

2.2.7 Herstellung von Proteinproben - 28 -

2.2.7.1 Proteinproben aus Tabakblättern - 28 -

2.2.7.2 Proteinproben aus Tabaksamen - 28 -

2.2.8 Western blot - 28 -

2.2.8.1 Protein Dot blot - 29 -

2.2.9 Coomassiefärbung - 29 -

2.2.10 Proteinreinigung aus Tabakblättern - 29 -

2.2.11 Proteinreinigung aus Tabaksamen - 30 -

2.2.12 Bestimmung der Enzymaktivität von Transglutaminase - 30 -

2.2.13 Dimerisierung von Proteinen mittels Transglutaminase - 31 -

3 Ergebnisse - 32 -

3.1 Expression von Spinnenseiden-Fusionsproteinen in Tabaksamen - 32 -

3.1.1 Konstruktion der Spinnenseiden-Fusionsgene mit

samenspezifischen Promotoren - 32 -

3.1.2 Test von Konstrukten mittels transienter Expression - 36 -

3.1.2.1 Transiente Expression von samenspezifisch exprimierten

Konstrukten - 36 -

3.1.3 Produktion stabil transformierter Tabakpflanzen mit

samenspezifischen Konstrukten - 38 -

3.1.3.1 Nachweis der samenspezifisch exprimierten Proteine aus stabil

transformierten Pflanzen mittels Western blot-Analyse - 39 -

3.1.4 Analyse der Langzeitstabilität von Spinnenseiden-

Fusionsproteinen in Tabaksamen - 47 -

3.1.5 Reinigung des Spinnenseiden-Fusionsproteins SO1-100xELP

aus Tabaksamen - 48 -

3.1.5.1 Anpassung der Inverse Transition Cycling-Methode an

Reinigung aus Tabaksamen - 49 -

3.1.5.2 Filterbasierte Reinigung - 56 -

3.1.5.3 Semiquantitative Auswertung des Reinigungsverfahrens - 58 -

3.2 Posttranslationale Polymerisierung von Spinnenseiden-

Fusionsproteinen - 61 -

3.2.1 Konstruktion der Spinnenseiden-Fusionsgene mit

Transglutaminasemarken - 61 -

3.2.2 Transiente Expression von Spinnenseidenproteinen mit

Transglutaminasemarken - 64 -

3.2.3 Stabile Transformation der Spinnenseiden-Fusionsproteine mit

Transglutaminase-marken - 64 -

3.2.4 Polymerisierung mittels bakterieller Transglutaminase - 65 -

3.2.5 Transglutaminase-vermittelte Integration von Spinnenseiden-

Fusionsproteinen in Gewebefasern - 70 -

4 Diskussion - 72 -

4.1 Sind Tabaksamen als Produktionsplattform für

Spinnenseidenproteine geeignet? - 74 -

4.2 Posttranslationale Verknüpfung von Spinnenseiden-

Fusionsproteinen - 80 -

5 Zusammenfassung - 84 -

6 Abbildungsverzeichnis - 86 -

7 Literaturverzeichnis - 89 -

1 Einleitung

- 1 -

1 Einleitung

1.1 Spinnenseide

Schon seit Urzeiten verwendet der Mensch natürliche Polymere zu unterschiedlichsten

Zwecken. Baumharze dienten als Klebstoffe, Naturkautschuk als Isolierung gegen

Feuchtigkeit, Seide und Wolle zur Herstellung von Kleidung. Synthetische Materialien

erweiterten das Spektrum an Werkstoffen durch ihre neuartigen Materialeigenschaften und

die relativ einfache Produktion in großen Mengen. Doch trotz der unbestrittenen Vorzüge von

synthetischen Materialien gibt es zahlreiche biologische Materialien, die den künstlich

erzeugten Stoffen ebenbürtig oder sogar überlegen sind. Eines der eindrucksvollsten Beispiele

für ein solches biologisches Supermaterial ist Spinnenseide (Vollrath 1999). Insbesondere die

Tragfadenseide stellt mit ihrer Verbindung aus Elastizität und Zugfestigkeit einen vielseitigen

potentiellen Werkstoff dar, doch sind auch andere Spinnenseidenarten von technischem

Interesse (Hayashi und Lewis 2001; Tian und Lewis 2005; Hayashi et. al. 2004).

Spinnenseide ist ein Sammelbegriff für eine Anzahl verschiedener Fasern, die von Spezies der

Ordnung Aranaea zu ebenso verschiedenen Zwecken zumeist in Abdominaldrüsen produziert

werden (Abb. 1). Eine Ausnahme ist die Produktion von Seidenfäden an den Füßen von

Taranteln zur Fortbewegung auf glatten Oberflächen (Gorb et. al. 2006).

Obwohl sich die sieben Arten der abdominalen Spinnenseide stark voneinander

unterscheiden, gibt es einige Gemeinsamkeiten. So bestehen alle Spinnenseiden aus

Proteinen, die nahezu irreversibel von einer extrem löslichen in eine extrem unlösliche Form

übergehen. Ebenso bestehen die meisten bekannten Spinnenseidenproteine (Spidroine oder

Fibroine) größtenteils aus Alanin, Serin und Glycin sowie in geringerem Umfang Glutamin,

Tyrosin, Leucin und Valin. Während der Herstellung des Netzes werden verschiedene Fäden

miteinander kombiniert, um schließlich das fertige Netz zu bilden.

Die große ampullenförmige Drüse und die darin enthaltenen Proteine wurden besonders

intensiv untersucht, da diese Drüse aufgrund ihrer Größe und Lage leichter zu präparieren ist

als die übrigen Spinndrüsen. Darüber hinaus ist das Produkt dieser Drüse die bereits erwähnte

Tragfadenseide, die aufgrund ihrer einzigartigen mechanischen Eigenschaften hochinteressant

für jede materialtechnische Untersuchung ist.

1 Einleitung

- 2 -

Abb. 1: Vereinfachte Darstellung von Aranaeus diadematus mit hervorgehobenen Netzdrüsen und der Funktion der zugehörigen Spinnenseiden (variiert aus Vollrath 2000).

Abgesehen von der erwähnten dorsalen Seidenproduktion bei Taranteln werden von Spinnen,

insbesondere natürlich von Webspinnen, bis zu sieben verschiedene Seidenarten produziert,

die nach der korrespondierenden Drüse benannt wurden (Tabelle 1). Jede dieser Seidenarten

erfüllt wichtige Funktionen. So wird die Seide der großen ampullenförmigen Drüse oft auch

nach ihrer Funktion als Tragfadenseide bezeichnet, da sie als „Rettungsleine“ der Spinne

dient, aber auch ein elementares Strukturelement des Spinnennetzes darstellt (Foelix 1996).

Andere Seidenarten, die dem elastischen Abstoppen und Einfangen von Beute dienen

(flagelliforme Seide), werden während der Konstruktion des Netzes als „Arbeitsgerüst“

verwendet (Seide der kleinen ampullenförmigen Drüse) oder konservieren gefangene Beute

(aciniforme Seide) und Spinneneier (tubuliforme Seide) als Bestandteile von Kokons (Hu et.

al. 2006b).

1 Einleitung

- 3 -

Tab. 1: Funktionen von Spinnenseidenarten (variiert nach Hu et. al. 2006b).

Bezeichnung der

Spinndrüse/seide

Funktion Strukturelement Basisproteine

Große Ampullendrüse

(mayor ampullate)

Fortbewegung,

Beutefang

Tragfäden,

Sicherheitsfaden

MaSp1 u. 2

Kleine Ampullendrüse

(minor ampullate)

Beutefang

(Netzkonstruktion)

Konstruktionsspirale,

Netzverstärkung

MiSp1 u. 2

Geißelförmige Drüse

(flagelliform)

Beutefang Fangspirale Flag

Traubenförmige Drüse

(aciniform)

Beuteverwahrung,

Fortpflanzung

Beutekokon,

Samennetz

AcSp1

Birnenförmige Drüse

(pyriform)

Beutefang Netzbefestigung,

Verbindungsfaser

Unbekannt

Röhrenförmige Drüse

(tubuliform)

Fortpflanzung Eierkokon TuSp1,

ECP-1, ECP-2

Clusterförmige Drüse

(aggregate)

Beutefang Klebstoff für

Fangspirale

Unbekannt

Die Tragfadenseide der großen ampullenförmigen Drüse besteht aus zwei

Hauptkomponenten: Major ampullate spidersilk protein (MaSp) 1 und 2 im Falle von Nephila

clavipes, bzw. Araneus diadematus fibroin 3 bzw. 4 (ADF-3 bzw. ADF 4, entsprechend

MaSp2) und Araneus diadematus fibroin 2 (ADF-2, entsprechend MaSp1), mit einer Größe

von 180 bis 720 kDa (Jackson und Obrien 1995; Candelas und Cintron 1981; Mello et. al.

1994; Guerette et. al. 1996). Das Verhältnis der beiden Komponenten zueinander variiert von

Spezies zu Spezies, jedoch ist zumeist MaSp1 in größeren Mengen vorhanden als MaSp2. Die

charakteristischen Motive der Tragfadenproteine MaSp1 und 2 sind poly-Alanin-Blöcke (in

Abb. 2 rot markiert), multiple Wiederholungen des Dipeptids Glycin-Alanin (in Abb. 2 gelb

markiert) sowie das Tripeptid Glycin-Glycin-X (in Abb. 2 grün markiert), wobei „X“ eine

beliebige Aminosäure darstellt. Diese Motive bilden in unterschiedlicher Anzahl eine

sogenannte Ensemblewiederholung, die zwischen den Spezies eine hohe Ähnlichkeit aufweist

(Abb. 2). Diese sich wiederholenden Sequenzen bilden die zentralen Elemente der

Spinnenseide und sind für die mechanischen Eigenschaften verantwortlich. Tragfadenproteine

1 Einleitung

- 4 -

enthalten überdies nichtrepetitive N-und C-Termini, deren genaue Funktion noch zu klären ist

(Motriuk-Smith et. al. 2005; Challis et. al. 2006).

Abb. 2: Vergleich der Ensemblewiederholungen von MaSp1-Proteinen aus verschiedenen Spinnenspezies, bzw. ADF-2 aus Araneus diadematus (Gatesy et. al. 2001).

Allerdings deuten erste Ergebnisse darauf hin, dass die C-Termini eine wichtige Rolle bei der

Steuerung des Löslichkeitsverhaltens von Tragfadenseide spielen (Huemmerich et. al. 2004)

oder in den Prozess der Polymerisierung und damit der Faserbildung aus Seidenproteinen

involviert sind (Sponner et. al. 2005).

Die zweite wichtige Komponente von Fangnetzen stellt die flagelliforme Seide dar, aus der

die Fangspirale des Netzes besteht. Damit stellt diese Komponente den funktionellen

Hauptteil des Netzes dar. Flagelliforme Seide besteht aus einem Hauptprotein, dem Flag –

Protein (Hayashi und Lewis 1998).

Abb. 3: Schematischer Aufbau des Flag-Proteins mit besonderer Betrachtung der charakteristischen Ensemblewiederholungen (Hayashi und Lewis 2000).

1 Einleitung

- 5 -

Dieses Protein hat eine Größe von ca. 500 kDa, ist in dieser Hinsicht also mit Proteinen der

Tragfadenseide vergleichbar. Das strukturelle Hauptmotiv der flagelliformen Seide ist das

Pentapeptid Glycin-Prolin-Glycin-Glycin-X (in Abb. 3 blau markiert), welches eine

Ähnlichkeit zum Pentapeptid des Elastin ähnlichen Polypeptids (ELP) besitzt. Zahlreiche

Wiederholungen dieses Pentapeptids umgeben zwei weitere Motive: das bereits aus

Tragfadenseide bekannte Tripeptid Gly-Gly-X (in Abb. 3 grün markiert) und eine glycinarme

Spacerregion von 28 Aminosäuren Länge (in Abb. 3 orange markiert). Diese Motive bilden

eine Ensemblewiederholung, die, unterbrochen von Introns, die Struktur des Flag-Proteins

ausmachen, wie es bereits aus den Proteinen der Tragfadenseide bekannt ist. Ebenso wie diese

Proteine besitzt das Flag-Protein nichtrepetitive N-und C-Termini.

Auch die Proteine der kleinen ampullenförmigen Drüse, MiSp1 und 2, wurden untersucht. Sie

unterteilen sich in zwei Bereiche, eine repetitive Region und einen nichtrepetitiven Spacer am

C-Terminus. Die repetitive Region enthält Motive, die denen von MaSp1 ähneln, allerdings

sind die sich wiederholenden Einheiten in MiSp1 und 2 stärker konserviert (Colgin und Lewis

1998). Die Größen von MiSp1 und MiSp2 liegen bei 320 kDa bzw. bei 250 kDa.

Tubuliforme Seide dient dem Schutz der Spinneneier in Form eines Kokons. Diese Seide

besteht aus tubuliformem Spinnseidenprotein (TuSp1), sowie den sogenannten

Kokonproteinen (egg case protein) ECP 1 und 2. Es wurde die Vermutung geäußert, dass

tubuliforme Seide die ursprüngliche Form der Spinnenseide war, aus der sich die übrigen

Seidentypen entwickelt haben (Tian und Lewis 2005).

Aciniforme Seide dient der Verpackung von Beute sowie der Herstellung von Samennetzen

(Foelix 1996). Sie unterscheidet sich in ihren Ensemblewiederholungen zum Teil erheblich

von den übrigen Spinnenseiden. Obwohl sie aufgrund ihrer Eigenschaften (hohe Elastizität

und geringe Bruchfestigkeit) eher Gemeinsamkeiten mit flagelliformer Seide aufweist, zeigen

genetische Untersuchungen des C-Terminus der aciniformen Seidenproteine neben

Ähnlichkeiten zur Sequenz des Flag-Proteins ebenfalls schwache Ähnlichkeiten mit den

Sequenzen von MaSp und MiSp (Hayashi et. al. 2004).

Über die pyriforme Seide ist relativ wenig bekannt. So liegt für diese Seide bisher noch keine

cDNA-Sequenz vor. Bisher ist lediglich sicher, dass pyriforme Seide die Aminosäuren Serin,

Asparagin, Glutaminsäure, Threonin, Lysin und Arginin enthält (Vollrath und Knight 2001).

Auch das Produkt der clusterförmigen Drüse (aggregate gland) ist noch weitgehend

unerforscht. Allerdings ist die Funktion bekannt, nämlich Klebstoff für die Fangspirale zu

bilden (Vollrath und Edmonds 1989).

1 Einleitung

- 6 -

Tab. 2: Aminosäuremotive der verschiedenen Spidroine (Hu et. al. 2006b).

Spinnenseidenprotein Charakteristische Motive

MaSp1 GGX, (GA)n, poly(A)-Blöcke,

MaSP2 poly(A)-Blöcke, GPGXX

MiSp1 GGX, (GA)n, poly(A)-Blöcke, Spacer

MiSp2 GGX,(GA)n, poly(A)-Blöcke, Spacer

Flag GGX, GPGG(X)n, Spacer

AcSp1 GGX, poly(S)-Blöcke

TuSp1 poly(S)-Blöcke, GX, AAQAASAA,

AAAQA, AASQAA, SQn

ECP-1 Kurze poly(A)-Blöcke, GA-Wiederholungen

ECP-2 Kurze poly(A)-Blöcke, GA-Wiederholungen

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sich alle bisher identifizierten

Spinnenseidenproteine durch charakteristische Aminosäuremotive auszeichnen. Diese Motive

sind bei den verschiedenen Arten der Webspinnen bereits über extreme Zeiträume

konserviert, im Falle von TuSp1 existieren diese seit mehr als 125 Millionen Jahre (Gatesy et.

al. 2001). Dies verdeutlicht die enorme Bedeutung dieser Motive für die korrekte Funktion

und für die beeindruckenden Eigenschaften dieser Proteine und der daraus produzierten

Spinnfäden.

Spinnenseide ist bereits im nativen Zustand ein vielseitiges Material und erfüllt zahlreiche

Aufgaben, vom Beutefang bis hin zur Fortpflanzung (Tab. 1). Die positiven Eigenschaften

dieses Materials sind bereits seit vielen Jahrhunderten bekannt und daher ist es nicht

verwunderlich, dass die ersten Vorschläge zur industriellen Nutzung von Spinnenseide bereits

aus dem 18. Jahrhundert stammen (Floericke 1919). Spinnenseide wurde allerdings schon im

antiken Griechenland als Wundauflage verwendet. Auf einigen Südseeinseln wurden

Spinnenfäden zur Herstellung von Fischkeschern benutzt. Der geringe Durchmesser von

Spinnenseide machte das Material geeignet zur Anwendung als „Fadenkreuz“ in optischen

Geräten, so zum Beispiel in Mikroskopen, Zielfernrohren und ähnlichem (Gertsch 1979). Bis

zum Zweiten Weltkrieg fanden Spinnenfäden hierfür Verwendung.

1 Einleitung

- 7 -

Zahlreiche weitere Anwendungen sind möglich. Allerdings ist dazu die Herstellung von

Spinnenseide in großen Mengen nötig. Sehr naheliegend ist die Verwendung von

Spinnenseide als technische Faser in direkter Konkurrenz zu synthetischen Fasern, wie zum

Beispiel aromatische Polyamide, bekannt unter den Markennamen Kevlar oder Nomex der

Firma DuPont. Diesen synthetischen Fasern ist die native Spinnenseide sowohl an

Bruchfestigkeit als auch an Dehnungsfähigkeit überlegen (Tab. 3 aus Tirrell 1996; Hinman et.

al. 2000; Vollrath und Knight 2001). Die Zugfestigkeit bezeichnet die maximale Spannung,

der ein Material vor dem Zerreißen widerstehen kann. Sie ergibt sich aus der Zugkraft im

Moment des Zerreißens bezogen auf den ursprünglichen Durchmesser des Werkstücks.

Tragfadenseide ist hinsichtlich der Zugfestigkeit der technischen Faser Kevlar zumindest

ebenbürtig. Beim Vergleich der Bruchenergie, also der Energie, die eine definierte

Materialmenge aufnehmen kann, bevor sie zerreißt, übertreffen sowohl Tragfadenseide als

auch flagelliforme Seide die bekannten synthetischen Materialien um wenigstens 200%. Im

Gegensatz zur Tragfadenseide, die ihre Stabilität, ähnlich Kevlar, aus der Zugfestigkeit

bezieht, ist die flagelliforme Seide eher mit Gummi vergleichbar. Beide Materialien besitzen

sowohl eine hohe Bruchenergie als auch eine Elastizität von mehreren hundert Prozent und

können sich also auf ein Vielfaches ihrer ursprünglichen Länge ausdehnen.

Tab. 3: Vergleich der Materialeigenschaften von Spinnenseide mit technischen Materialien (Tirrell 1996).

Material Zugfestigkeit

[N m-2]

Dehnung [%] Bruchenergie [J kg-1]

Tragfadenseide 4x109 35 1x105

Flagelliforme Seide 1x109 >200 1x105

Kevlar 4x109 5 3x104

Gummi 1x106 600 8x104

Tendon 1x109 5 5x103

Nylon (Typ 6) 4x107 200 6x104

Betrachtet man diese Eigenschaften, ist es nur zu klar, warum eine großtechnische Produktion

von Spinnenseiden ökonomisch interessant ist. Allerdings müssten zu diesem Zweck

Spinnenseidenproteine in einem weitaus größeren Maßstab hergestellt werden, als es bisher

1 Einleitung

- 8 -

möglich war. Ebenso ist das Problem der Polymerisierung von einzelnen Proteinen zur

fertigen Spinnenseide zu lösen, um die Verspinnung zu ermöglichen und damit eine technisch

verwendbare Faser zu erhalten. Spinnenseidenproteine wurden bereits erfolgreich als

Aufwuchsfläche für Chondrozytenzellkulturen (Knorpelzellen) verwendet (Scheller et. al.

2004). Dabei zeigte sich, dass Chondrozyten auf einer Matrix aus Spinnenseidenproteinen

sowohl weniger dedifferenzieren als auch in geringerem Maße absterben als auf Kulturmedien

ohne Serum oder ohne weitere Hilfsstoffe. Weiterhin wurde native Tragfadenseide der

Gattung Nephila als Stützstruktur für Schwannsche Zellen beim Aufbau künstlicher

Nervenfasern eingesetzt (Allmeling et. al. 2006). Bei diesen Experimenten konnten

erfolgreich einfache Nervenverbindungen hergestellt werden. Ein gänzlich anderer Ansatz

basiert auf der veränderlichen Kontraktion von Spinnenseide. Dabei wurden

Spinnenseidenfasern verwendet, um Blutgefäße gezielt zu verengen und so verschiedene

ischämische Krankheiten im Mausmodell simulieren zu können (Zhou et. al. 2006). Für die

meisten hier aufgeführten medizinischen Applikationen von Spinnenseide müssten die

Spinnenseidenkonstrukte direkt in den Organismus des Patienten eingebracht werden.

Aufgrund der geringen immunogenen Wirkung von Spinnenseide (Vollrath et. al. 2002) ist

dies nicht nur problemlos möglich, sondern es ergibt sich eine weitere grundlegende

Anwendung, nämlich als Beschichtung für Implantate, die unbeschichtet zu starken

Abstoßungsreaktionen führen würden.

Im Bereich der Nanotechnologie wurden Spinnenfasern als Stützstrukturen für Nanopartikel

aus Gold eingesetzt (Singh et. al. 2007). Dabei machte man ebenfalls die polaritätsabhängige

Längenänderung von Spinnenseide nutzbar, die, wie bereits erwähnt, für die Verengung von

Blutgefäßen eingesetzt werden kann. Durch die Abstandsänderung der auf die Spinnenseide

aufgebrachten Goldschicht wird die Leitfähigkeit der Nanopartikel verändert. Somit können

Konzentrationsänderungen verschiedener Lösungsmittel, wie zum Beispiel Chloroform oder

Methanol, in der Nähe der beschichteten Spinnenseide gemessen werden. Die hohe Stabilität

der Spinnenfäden ist auch bei dieser Anwendung entscheidend, um trotz des notwendigen

geringen Durchmessers der wiederholten mechanischen Beanspruchung während der

Längenänderungen widerstehen zu können.

Im Gegensatz zur Seide des Seidenspinners (Bombyx mory) kann Spinnenseide nicht in

größeren Mengen von der Spinne direkt gewonnen werden, da Spinnen ein starkes

Territorialverhalten besitzen und bei der Jagd auch vor Artgenossen nicht halt machen. Daher

ist die Haltung von Spinnen in größerer Stückzahl auf engem Raum kaum möglich, bzw.

1 Einleitung

- 9 -

extrem kostenintensiv. Ein weiteres Problem ist die notwendige Versorgung der Spinnen mit

Lebendfutter. Ebenso unpraktikabel für eine großtechnische Verwertung stellt sich die

Gewinnung einzelner Seidenarten dar. Da die verschiedenen Spinnenseidenarten im fertigen

Spinnennetz bereits miteinander kombiniert sind, ist die Gewinnung einer einzelnen Seidenart

kaum ohne Kontaminationen oder große Mengenverluste möglich. Die einzige bisherige

Alternative stellt das „Melken“ der Spinne („forced silking“) dar, wie es auch zur Gewinnung

von kleinsten Probenmengen zu Analysezwecken bis heute üblich ist. Bei dieser Methode

werden allerdings die mechanischen Eigenschaften verändert, sodass die Qualität von nativer

Spinnenseide nicht erreicht wird (Vollrath et. al. 2001).

Erste Versuche zur technischen Gewinnung von Spinnenfäden unternahm der Missionar Paul

Camboué (1849-1929). Er spannte weibliche Spinnen der Gattung Nephila in hohle

Korkstücke, wobei der Hinterleib hervorragte. Um nun die Spinne zum Absondern von

Seidenfäden zu veranlassen, hielt er der Spinne eine Fliege vor. Die so abgesonderten Fäden

wickelte er auf einer Haspel auf (Abb. 4).

Abb. 4: Halterung zur Gewinnung von Spinnenseide (Floericke 1919).

Abb. 5: Erweiterte Halterung mit verbesserter Haspel (Floericke 1919).

1 Einleitung

- 10 -

Das Prinzip dieser primitiven Vorrichtung wurde auch beim Nachfolgemodell verwendet

(Abb. 5). Allerdings konnte das Problem der Lebendfütterung der Spinnen nicht

wirtschaftlich gelöst werden und so wurde eine weitere industrielle Verwendung von

Spinnenseide für unmöglich gehalten (Floericke 1919). Aus diesen Gründen ist die

biotechnologische Herstellung von Spinnenseide die einzige Möglichkeit, diesen wertvollen

Rohstoff in technisch relevanten Mengen herzustellen. Erste Ansätze zur biotechnologischen

Herstellung von Spinnenseide beinhalteten Versuche zur Produktion von

Spinnenseidenproteinen in Bakterienkulturen (Prince et. al. 1995), Hefekulturen (Fahnestock

und Bedzyk 1997), Insektenzellkulturen (Miao et. al. 2006) und Säugetieren (Lazaris et. al.

2002).

Bei der Herstellung in E. coli ist sowohl die Gesamtgröße der exprimierten Spidroine als auch

die Produkthomogenität durch Terminierungsfehler während der Proteinbiosynthese stark

limitiert (Fahnestock et. al. 2000). Dieser Nachteil tritt bei der Produktion in Hefezellen

(Pichia pastoris) nicht auf (Fahnestock und Bedzyk 1997), allerdings ist dieses System,

ebenso wie die erwähnten tierische Zellkulturen sehr kostenintensiv und nur mit hohem

Aufwand an veränderte Produktionsmengen anzupassen (Ma et. al. 2005).

1.2 Pflanzen als Produktionsplattform für transgene Proteine

Im Gegensatz zu den oben angeführten Limitierungen ist die Vergrößerung der Anbaufläche

von Pflanzen relativ problemlos, was einen enormen Vorteil in Bezug auf Kosten und

Planungsflexibilität bedeutet (Raskin et. al. 2002). Andere Vorteile der Proteinproduktion in

Pflanzen sind die allgemein niedrigeren Produktionskosten im Vergleich zu transgenen

Tieren, Bioreaktoren und Fermentern und die gut etablierten Infrastrukturen für Produktion

und Ernte von Kulturpflanzen. Die meist korrekte Faltung und nur leicht abweichende

Glykosilierung von eukaryotischen Proteinen in Pflanzen (Lerouge et. al. 2000) und die

Möglichkeit zur Einlagerung von exprimierten Proteinen in Lagerkompartimente, die die

Stabilität der Proteine gewährleisten sind weitere Vorteile (Horn et. al. 2004). Ebenso ist die

Herstellung von pharmazeutischen Proteinen in Pflanzen nicht mit dem Risiko einer

Kontamination durch humane oder tierische Viren oder andere Krankheitserreger behaftet,

wie es im Falle von entsprechenden Zellkulturen oder transgenen Tieren der Fall wäre

(Commandeur et. al. 2003). Es wurden bereits zahlreiche pharmazeutische Proteine in

Pflanzen hergestellt, so zum Beispiel Impfstoffe zur Anwendung bei Hepatitis B (Richter et.

1 Einleitung

- 11 -

al. 2000), Diarrhöe (Tacket et. al. 1998) und Tollwut (Yusibov et. al. 2002), Antikörper

gegen Karies (Ma et. al. 1998) und gegen bösartige Lymphknotengeschwüre (McCormick et.

al. 1999). Darüber hinaus wurden zahlreiche weitere Anwendungen aus dem Bereich der

Medizin (Übersicht u. a. bei Ma et. al. 2005 und Twyman et. al. 2003) und der Tiermedizin

publiziert (Übersicht bei Floss et. al. 2007). Ein solches weiteres Beispiel ist die Herstellung

von Einzelkettenantikörperfragmenten (scFv) in Tabakpflanzen (Owen et. al. 1992).

Insbesondere die Expression von scFv´s in Tabaksamen (Fiedler und Conrad 1995) ist

aufgrund der Lagerstabilität bei Raumtemperatur ein vielversprechender Ansatz. So könnten

Pflanzen zu einer zuverlässigen und schnell einsetzbaren Quelle für monoklonale Antikörper

werden. Die Produktion in transgenen Säugetieren, wie zum Beispiel in der Milch von Kühen

oder Ziegen, setzt neben den bereits erwähnten höheren Kosten langfristige Wartezeiten von

fünf bis zehn Jahren von der Klonierung des Gens bis zur erstmaligen Proteinexpression

voraus (Fischer und Emans 2000). Seit der ersten stabilen Transformation einer höheren

Pflanze (Fraley et. al. 1983), namentlich Nicotiana tabacum, sind zahlreiche transgene

Proteine in Pflanzen exprimiert worden. Die ersten dieser Proteine, die explizit aus

kommerziellen Gründen in Pflanzen hergestellt wurden, waren Avidin (Hood et. al. 1997), β-

Glucuronidase (Witcher et. al. 1998) und Trypsin (Woodard et. al. 2003) in Mais. 100 kg

Samen aus transformierten Maispflanzen enthielten 20 g Avidin, eine Menge, die in etwa 900

kg Hühnereier enthalten ist. Erste Kostenabschätzungen ergaben einen Kostenrückgang um

den Faktor zehn bei der Herstellung des unbehandelten Rohmaterials. Für eine endgültige

Kostenberechnung muss die Isolierung des Avidins aus den Maiskörnern im großtechnischen

Maßstab möglichst kostengünstig und verlustarm realisierbar sein, ein Punkt, der bei nahezu

jeder Produktion von Proteinen in Pflanzen zu bedenken ist. Lediglich bei der Herstellung von

Impfstoffen in essbaren Pflanzen kann die Reinigung und die damit verbundenen Kosten

vermieden werden, sofern die Impfstoffe bei der Aufnahme mit der Nahrung eine

ausreichende Immunantwort bewirken (Daniell et. al. 2001; Boehm 2007).

Die Expression von Poly3-hydroxybutyrat (PHB) in transgenen Pflanzen zielt auf die

Herstellung von technischen Polymeren ab (Poirier et. al. 1992). Allerdings muss die

Produktivität der pflanzlichen Expression stark erhöht werden, da die Kosten für ölbasierte

Kunststoffe immer noch deutlich unter denen von Bioplastik liegen. Der Weltmarktpreis für

konventionelle Kunststoffe liegt bei unter einem Euro pro Kilogramm. Nach ungefähren

Schätzungen wäre es notwendig, den Anteil des jeweiligen Biopolymers auf 15% der

geernteten Trockenmasse zu erhöhen, um mit diesem Herstellungspreis konkurrieren zu

1 Einleitung

- 12 -

können (Scheller und Conrad 2005). Bei der Herstellung von PHB in Zuckerrohrhybriden

(Saccharum spp.) konnte ein maximaler PHB-Anteil von etwa 2% der Trockenmasse erreicht

werden (Petrasovits et. al. 2007). Bei der Expression in Rapssamen (Brassica napus) wurde

hingegen eine Konzentration von bis zu 8% erreicht (Houmiel et. al. 1999). Bereits

Konzentrationen in dieser Größenordnung führen oft zu Wachstumshemmungen und

Fehlbildungen der Pflanzen (Bohmert et. al. 2000), was zu einer geringen Erntemenge und

damit zu einer niedrigen absoluten Ausbeute an PHB führt. Induzierbare Systeme stellen eine

Möglichkeit dar, diese Schwierigkeit zu umgehen. Durch Induktion mit einem nicht-

steroidartigen Ecdyson-Analogon (Retnakaran et. al. 2003) konnten in Arabidopsis thaliana

Mengen von bis zu 14,3% des Trockengewichts erreicht werden (Kourtz et. al. 2006),

allerdings nur in jungen Pflanzen, was wiederum eine geringe absolute Menge bedeutet. In

älteren Blättern wurde lediglich ein Trockengewichtanteil von 7% erzielt.

Die Suche nach Möglichkeiten, die Ausbeute in pflanzlichen Expressionssystemen zu steigern

wird ständig fortgesetzt. Die Stabilisierung gegen Proteolyse kann durch die Expression des

Proteins mit einem geeigneten Fusionspartner erreicht werden (Jacquet et. al. 1999; Miyano

et. al. 2003). Eine Gruppe solcher stabilisierender Fusionspartner sind Elastin ähnliche

Polypeptide (ELP).

1.3 Elastin ähnliche Polypeptide (Elastin-like-polypeptides)

ELPs sind Polypeptide mit einer stark repetitiven Struktur, die auf Säugetier-Elastin basieren

(Urry 1988). ELP-Fusionsproteine, die verschiedene Spinnenseidenproteine oder Interleukine

als Fusionspartner enthielten, wurden im pflanzlichen Expressionssystem durch ELP

stabilisiert, wodurch die effektive Ausbeute der Fusionsproteine erhöht werden konnte

(Scheller et. al. 2004; Patel et. al. 2007). Die Fusion von ELP mit scFvs erhöhte die Ausbeute

sogar um das 40-fache, so dass ein Mengenanteil von 25% TSP erreicht werden konnte

(Scheller et. al. 2006). Neben der Stabilisierung des Fusionsproteins sind ELPs auch für die

Reinigung aus Pflanzenmaterial interessant.

Die Reinigung von Spinnenseidenproteinen aus pflanzlichem Material muss insbesondere mit

Blick auf die Herstellung wirtschaftlich lohnenswerter Proteinmengen betrachtet werden.

Die im Laborbetrieb üblichen Säulenreinigungsverfahren sind für eine Maßstabsvergrößerung

aus ersichtlichen Kostengründen nicht geeignet und selbst für eine Reinigung im

Labormaßstab ergeben sich Probleme, da zahlreiche Spinnenseidenproteine nur schwer vom

1 Einleitung

- 13 -

Säulenmaterial eluierbar sind. Ein Alternativverfahren, das erfolgreich bei der Reinigung von

Spinnenseidenproteinen aus Tabakblättern eingesetzt wurde, nutzt die temperaturabhängige

Löslichkeit von ELPs. Unterhalb einer bestimmten Temperatur (Transitionstemperatur) ist

ELP stark hydrophil. Wird die ELP-Lösung jedoch über diese Temperatur hinaus erhitzt, fällt

ELP aus. Diese Fällung wird durch Zugabe von NaCl unterstützt und ist nahezu vollständig

reversibel, was Reinigungsmethoden auf ELP-Basis ermöglicht. Bereits seit mehreren Jahren

wird diese Methode des Inverse Transition Cycling (ITC) zur Reinigung von ELP-

Fusionsproteinen eingesetzt. Eine ELP-Einheit ist ein Pentapeptid mit der

Aminosäuresequenz Val-Pro-Gly-Xaa-Gly (Xaa kann jede Aminosäure außer Prolin sein).

Die freie Aminosäure wird je nach gewünschter Anwendung gewählt, ebenso die Anzahl an

ELP-Einheiten im vollständigen ELP-Gen. Neben diesen Faktoren beeinflusst auch das mit

ELP fusionierte Protein die Transitionstemperatur und damit das Reinigungsverfahren

(Trabbic-Carlson et. al. 2004). Um die Ausfällung zu verstärken und auf diese Weise die

Ausbeute zu erhöhen, kann nicht fusioniertes ELP im Überschuss zugegeben werden und so

als Interaktionspartner für gering exprimierte ELP-Fusionsproteine dienen (Christensen et. al.

2007). Proteine mit His-Tag wurden erfolgreich an ELP mit metallbindenden Liganden

assoziiert (Stiborova et. al. 2003). Ebenso wurden mit ELP-Varianten Quecksilber, Arsen und

Cadmium aus wässrigen Lösungen entfernt (Kostal et. al. 2003; Kostal et. al. 2004; Kostal et.

al. 2005), spezifische Antigene gereinigt (Kim et. al. 2005) und lektinbindende Polymere

erzeugt (Sun et. al. 2005).

Neben der Reinigungsfunktion sind auch medizinische Anwendungen für ELP und ELP-

Fusionsproteine denkbar. ELP-Varianten wurde beispielsweise mittels rekombinanter

Gewebetransglutaminase zu einem Hydrogel vernetzt, um Knorpelgewebe zu ersetzen

(McHale et. al. 2005). Dazu wurden Chondrozyten mit zwei ELP-Varianten gemischt, die an

der Position der vierten Aminosäure in jedem siebten Pentapeptid die Aminosäuren Lysin

bzw. Glutamin enthielten, um an diesen Stellen die Vernetzung mit Transglutaminase zu

ermöglichen. Auf diese Weise wurden die Zellen innerhalb des sich bildenden ELP-

Hydrogels eingeschlossen, was eine Verbesserung der mechanischen Belastbarkeit der

Gewebematrix zur Folge hatte.

Ein interessanter Ansatz ist die Fusion von ELP mit pharmazeutischen Wirkstoffen. Durch die

präzise Kontrolle der Löslichkeit wäre es möglich, einen Wirkstoff in bestimmten Geweben

mittels einer lokal induzierten Hyperthermie auszufällen und so in diesem Gewebe den

Wirkstoff anzureichern (Meyer et. al. 2001a; Meyer et. al. 2001b). Dieses Verfahren wird

1 Einleitung

- 14 -

auch für die Krebstherapie getestet. So soll der Wirkstoff Doxorubicin gezielt in Tumore

geschleust und dort angereichert werden, da eine systemische Erhöhung des Wirkstoffs zu

starken Nebenwirkungen führt (Bidwell et. al. 2007b). Durch die Fusion mit ELP konnten

sogar Krebszellen, die gegen den verwendeten Wirkstoff resistent waren, erfolgreich

abgetötet werden. Dabei blockierte ELP offenbar den Transport des Wirkstoffs aus den

resistenten Krebszellen (Bidwell et. al. 2007a).

Aufgrund der exakt kontrollierbaren Löslichkeit ermöglichen ELP-Varianten ebenfalls die

Entwicklung von Biosensoren. Über eine Änderung der Temperatur oder des Salzgehaltes

kann ELP gezielt mittels hydrophober Wechselwirkungen an Oberflächen gebunden und

ebenso wieder gelöst werden. Somit können diese beiden Parameter im umgebenden Medium

anhand eines mit ELP fusionierten Markers bestimmt werden (Frey et. al. 2003a; Frey et. al.

2003b).

1.4 Proteinmodifikation

Neben den Strukturelementen der Spinnenseiden-Fusionsproteine ist auch die Gesamtgröße

der Proteine von enormer Bedeutung, namentlich für die Ausrichtung während des

Spinnvorganges (Kojic et. al. 2006). Daher ist es wünschenswert, die Größe der nativen

Spinnenseidenproteine zu erreichen. Die im Rahmen dieser Arbeit in Pflanzen hergestellten

Spinnenseiden-Fusionsproteine erreichen bereits eine Größe von über einhundert kDa. Eine

weitere Vergrößerung auf genetischer Basis, also die Klonierung eines größeren nativen

Spinnenseidenproteins ist mit enormen Stabilitätsproblemen verbunden (Hinman et. al. 1992).

Insbesondere während der Klonierung in E. coli ist die Instabilität von transgenen Sequenzen

durch Rekombination gut dokumentiert (Nakamura 1974; Pierce und Gutteridge 1985;

Bzymek und Lovett 2001). Ähnliche Prozesse in Agrobacterium tumefaciens wurden zwar

bisher nicht publiziert, doch ist anzunehmen, dass hochrepetitive Sequenzen in dieser

Größenordnung auch in diesem bakteriellen System instabil werden können. Eine

Möglichkeit zur Überwindung dieser Größenbegrenzung ist die posttranslationale

Modifikation bzw. Polymerisierung der Proteine.

Ein geeignetes Werkzeug für die posttranslationale Modifikation der Spinnenseiden-

Fusionsproteine, insbesondere für die Polymerisierung, ist Transglutaminase (Protein-

Glutamin-γ-Glutamyltransferase). Transglutaminase bildet Isopeptidbindungen zwischen der

ε-Aminogruppe der Aminosäure Lysin und der γ-Glutamylgruppe der Aminosäure Glutamin

1 Einleitung

- 15 -

(Pisano et. al. 1968). Diese kovalenten Bindungen können durch Proteasen nicht gespalten

werden, sind biochemisch also sehr stabil, was für die Verknüpfung von Strukturproteinen

notwendig ist, um die Gesamtstabilität nicht zu beeinträchtigen. Transglutaminasen sind weit

verbreitet. So wurden sie bereits unter anderem in Säugetieren (Sarkar et. al. 1957), Bakterien

(Kanaji et. al. 1993), Pflanzen (Serafini-Fracassini et. al. 2002) und in Amphibien (Zhang und

Masui 1997) gefunden. Calciumabhängige Transglutaminasen, die auch im menschlichen

Organismus nachgewiesen wurden, erfüllen Funktionen bei der Blutgerinnung, dem

Knochenwachstum und der Ausbildung von Zellstrukturen (Lorand und Graham 2003).

Obwohl bereits diese Enzyme für die Verknüpfung von Proteinen geeignet sind, konnte erst

an eine industrielle Verwertung gedacht werden, als eine calciumunabhängige bakterielle

Transglutaminase in Streptoverticillium mobaraense entdeckt wurde (Ando et. al. 1989).

Diese bakterielle Transglutaminase wird in das Kulturmedium der Bakteriensuspension

sekretiert, wodurch eine kostengünstige Massenproduktion möglich wurde. Das primäre

Anwendungsgebiet der Transglutaminase ist die Lebensmittelindustrie. Mittels

Transglutaminase werden strukturabhängige Eigenschaften von Nahrungsmitteln verbessert,

wie zum Beispiel die Bindung von Wasser, Viskosität, Elastizität oder Textur. Darüber hinaus

kann mittels Transglutaminase die Ausbeute an verwertbaren Fleischprodukten erhöht

werden, indem ansonsten unbrauchbare Fleischreste in Aussehen und Textur verbessert

werden und so anschließend für den Konsum geeignet sind (Muguruma et. al. 1990.) Aber

auch die Verbesserung der Backeigenschaften von Weizenmehl (Tseng und Lai 2002) oder

die erhöhte Haltbarkeit von Obst und Gemüse (Takagaki et. al. 1991) wird durch die

Behandlung mit bakterieller Transglutaminase erreicht. Eine extrem interessante Anwendung,

insbesondere im Hinblick auf die Nutzung von Spinnenseidenproteinen, ist die Bearbeitung

von Wollfasern mittels bakterieller Transglutaminase (Cortez et. al. 2004). Dabei wurden

Wollfasern entweder untereinander mit Transglutaminase verknüpft oder mit Seidenproteinen

der Seidenraupe Bombyx mori verbunden (Cortez et. al. 2005; Cortez et. al. 2007). Dadurch

konnte in beiden Fällen die Farbechtheit, die mechanische Belastbarkeit und

Widerstandsfähigkeit der Wollfasern gegen Abnutzung bei chemischer und enzymatischer

Behandlung (z.B. durch Reinigungsmittel) verbessert werden.

Alle aufgeführten Beispiele verdeutlichen eine weitere Eigenschaft der bakteriellen

Transglutaminase, nämlich eine geringe Substratspezifität (DeJong und Koppelman 2002),

was zahlreiche weitere Anwendungen ermöglicht.

1 Einleitung

- 16 -

1.5 Zielsetzung

Eine Herausforderung auf dem Weg zur technischen Produktion von Spinnenseidenproteinen

in Pflanzen ist deren kostengünstige Produktion in großen Mengen. Bereits im Labormaßstab

werden mehrere Gramm gereinigtes Spinnenseidenprotein benötigt, um eine möglichst

vollständige mechanische Testung zu ermöglichen. Die erfolgreiche Expression von

Spinnenseidenproteinen in Tabakblättern und das etablierte Reinigungsverfahren bieten eine

gute Ausgangsbasis für die Herstellung und mechanische Testung weiterer

Spinnenseidenproteine. Allerdings stellt sich das Problem der langfristigen Lagerung der

Tabakblätter, was im Labormaßstab ein organisatorisches Problem ist und bei größeren

Produktionsmengen den nötigen Aufwand für die Nutzung des Expressionssystems

Tabakblatt über ein tolerierbares Maß hinaus steigert.

Im Rahmen dieser Arbeit werden verschiedene Spinnenseidenkonstrukte in Samen von

Nicotiana tabacum exprimiert und das Samensystem mit der Expression im Blatt verglichen,

insbesondere die produzierbaren Mengen sowie die Anwendbarkeit und möglicherweise

notwendige Adaption des ELP-basierten Reinigungsverfahrens. Im Hinblick auf das erwähnte

Lagerungsproblem wird die Langzeitstabilität der Proteine im Samen bei Raumtemperatur

über einen Zeitraum von einem Jahr untersucht, um die Samenexpression als unkompliziertes

Produktionssystem für den Laborbedarf zu etablieren. Darüber hinaus könnten diese Versuche

Aufschluss über die Lagerungsstabilität von Spinnenseidenproteinen in anderen pflanzlichen

Systemen geben, die für eine kommerzielle Herstellung von Spinnenseidenproteinen in

Pflanzen zukünftig verwendet werden können.

Die Reinigung des transgenen Proteins wird, wie bereits erwähnt, mittels der etablierten

Inverse Transition Cycling-Methode durchgeführt. Die kritischen Parameter dieser

Reinigungsmethode sind die Transitionstemperatur und die Salzkonzentration während der

Fällung. Diese Parameter müssen gegebenenfalls für das neue Expressionssystem

Tabaksamen optimiert werden. Dabei sind selbstverständlich eine möglichst niedrige

Transitionstemperatur und eine ebenfalls möglichst niedrige Salzkonzentration

wünschenswert, da dies erstens eine Reduzierung der Reinigungskosten bedeuten würde und

zweitens die Reinigung im größeren Maßstab stark vereinfachen würde. So ist die Entfernung

des Salzes nach der Fällung mittels Dialyse ein kritischer Schritt der Reinigung, der mit

hohen Ausbeuteverlusten einhergeht. Eine geringe Salzkonzentration könnte die Dauer der

abschließenden Dialyse reduzieren und so die Proteinausbeute erhöhen.

1 Einleitung

- 17 -

Die im Rahmen dieses Projektes verwendeten repetitiven Spinnenseidenkonstrukte liegen in

einem Größenbereich oberhalb von einhundert kDa. In stabil transformierten Pflanzen

konnten derartige Proteine ohne nennenswerten Abbau exprimiert werden (Scheller et. al.

2001; Scheller et. al. 2004). Allerdings ist es für die Materialeigenschaften oder für eine

etwaige spätere Fasergewinnung der Spinnenseidenproteine wünschenswert, die Größe der

Fusionsproteine weiter zu erhöhen. Dazu werden verschiedene Spinnenseidenkonstrukte mit

Dimerisierungsmarken versehen und in Tabak exprimiert. Anschließend soll die

posttranslationale Dimerisierung mittels bakterieller Transglutaminase durchgeführt werden.

Neben der reinen Vergrößerung der Produkte soll ebenfalls die in-vitro Verknüpfung von

Spinnenseidenproteinen mit ELP-Blocks untersucht werden, um so das Protein nachträglich

mit einer Reinigungskomponente versehen zu können. Zusätzlich muss überprüft werden, ob

die Verknüpfung der Glutamin- und Lysinmarken spezifisch eine Heterodimerisierung

darstellt, oder ob ebenfalls unspezifische Verknüpfungen zwischen den Spinnenseiden-

Fusionsproteinen auftreten. Dies wäre zwar interessant für neue Materialeigenschaften,

könnte aber auch ein Problem für die Reinigung mittels Inverse Transition Cycling bedeuten,

da heterogene Produkte möglicherweise unterschiedliche Transitionstemperaturen aufweisen.

Zusammenfassend betrachtet soll im Rahmen dieser Arbeit die Produktion von

Spinnenseiden-Fusionsproteinen in Tabaksamen und damit eine mögliche Alternative für die

Produktion in Blättern etabliert werden. Darüber hinaus soll anhand dieses Modellsystems das

Potential von Samen zur Herstellung und Lagerung von Spinneseiden-Fusionsproteinen

bewertet werden.

Der zweite Teil dieser Arbeit zielt auf die posttranslationale Verknüpfung von Proteinen zur

Steigerung der Maximalgröße ab.

2 Material und Methoden

- 18 -


2.1 Material

2.1.1 Bakterienstämme

Escherichia coli:

XL1Blue (Stratagene) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB

lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] (Bullock et. al. 1987)

Agrobacterium tumefaciens:

pGV 2260 in C58C1 (Deblaere et. al. 1985)

2.1.2 Vektoren

pRTRA 7/3 Ampr (Artsaenko et. al. 1995)

pCB301 (Xiang et. al. 1999) mit Kanr (Scheller et. al. 2004)

2.1.3 Pflanzenmaterial

Die im Rahmen dieses Projektes verwendeten Spinnenseidenkonstrukte wurden in Blättern

von Nicotiana tabacum (Varietät Samsun NN) und Nicotiana benthamiana, sowie in Samen

von Nicotiana tabacum (Varietät Samsun NN) exprimiert. Blattmaterial wurde bis zur

Reinigung bei -80°C, Samen sowohl bei -80°C, als auch bei Raumtemperatur aufbewahrt.


- 19 -

2.1.4 Oligonukleotide, Primer

Tab. 4: Verwendete Oligonukleotide bzw. Primer

Name Sequenz (5´ > 3´) Hersteller Funktion

MaSp1-

for

gacggtaccgaaattgtttcagctttggta Metabion

(Martinsried)

Nachweis von MaSp1

mittels PCR

MaSp1-

rev

gacagtacttgagaatgcttggtttatag Metabion

(Martinsried)

Nachweis von MaSp1

mittels PCR

LeB4-

for

actcatgtggagtggcaggt Metabion

(Martinsried)

Nachweis des LeB4-

Promotors mittels PCR

LeB4-

rev

cacgtgtgacagaacgtgtg Metabion

(Martinsried)

Nachweis des LeB4-


USP-

for

gcaggtcgacctgcagca Metabion

(Martinsried)

Nachweis des USP-


USP-

rev

gtcgagatctgctggctatga Metabion

(Martinsried)

Nachweis des USP-


Gln-

for

gatccggctctggaatggctgaaacggccgc

agcggctttcgaaagacagcatatggattctg

Biomers.net

(Ulm)

Linker mit Glutamin-Tag

Gln-

rev

gatccagaatccatatgctgtctttcgaaagcc

gctgcggccgtttcagccattccagagccg

Biomers.net

(Ulm)

Linker mit Glutamin-Tag

Lys-

for

gatccggctctggaatgaaggaaacggccgc

agcgagattcgaaagaaaccatatggattctg

Biomers.net

(Ulm)

Linker mit Lysin-Tag

Lys-

rev

gatccagaatccatatggtttctttcgaatctcg

ctgcggccgtttccttcattccagagccg

Biomers.net

(Ulm)

Linker mit Lysin-Tag

2.1.5 Medien

2.1.5.1 Pflanzenmedien

MS-Medium: 4,3g/l Murashige und Skoog-Medium mit 0,5g/l MES,

1% Saccharose, pH mit 1N KOH auf 6,0 einstellen

MS-Agar: Zugabe von 0,8% (w/v) Agar


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MG-Medium: MS-Medium, 16g/l Glukose, 1mg/l BAP, 0,2mg/l NES,

500mg/l Cefotaxime, 50mg/l Kanamycin

MG-Agar: Zugabe von 0,9% Agar

2.1.5.2 Bakterienmedien

LB-Medium: 10g/l Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 0,17M NaCl, 0,1%(v/v) 1N NaOH

YEB-Medium: 1g/l Hefeextrakt, 5g/l Fleischextrakt, 5g/l Trypton, 15mM Saccharose,

2mM MgSO4, pH7,0

SOB-Medium : 20g/l Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 8,5mM NaCl, 2,5mM KCl

mit 5M NaOH auf pH7,0 einstellen

SOC-Medium: SOB-Medium, 100mM MgCl (steril), 50mM Glukose (sterilfiltriert)

2.1.6 Puffer

4xMarvelpuffer: 80mM TRIS (pH7,8), 720mM NaCl

Marvelmilch: 5% (w/v) Milchpulver in 1xMarvelpuffer

5xTBE: 0,44M TRIS HCl, 12mM EDTA, 0,44M Borsäure, pH8,0

Infiltrationspuffer: 10mM MES-NaOH (pH5,5), 10mM MgSO4

10xPBS: 0,02M KH2PO4, 0,08M Na2HPO4 x 2H2O, 1,5M NaCl, pH7,6

Samenextraktionspuffer : 50mM TRIS (pH8,0), 200mM NaCl, 5mM EDTA (pH8,0), 0,1%

(v/v) Tween 20

SDS-Elektrophoresepuffer: 0,025M TRIS, 0,25M Glycin, pH8,3, 3,5mM SDS

SDS-Probenpuffer: 36mM TRIS-HCl (pH6,8), 35mM SDS, 1,45mM Bromphenolblau,

0,68M Glycerin, 0,36M β-Mercaptoethanol

SDS-Sammelgelpuffer: 28mM SDS, 1M TRIS-HCl (pH6,8)

SDS-Trenngelpuffer: 28mM SDS, 2,7M TRIS-HCl (pH8,8)

Coomassie-Färbelösung (Variation nach Maldener 2004): 3,1M Isopropanol, 1,75M

Essigsäure, 0,6mM Coomassie-R250

TE-Puffer: 10mM TRIS-HCl (pH8,0), 1mM EDTA

Transferpuffer: 1000ml Methanol, 4000ml SDS-Elektrophoresepuffer


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2.1.7 Enzyme

Ajinomoto Foods Deutschland GmbH (Hamburg): Activa WM Transglutaminase

Boehringer (Mannheim): Restriktionsendonukleasen

Fermentas (Burlington, Kanada): Restriktionsendonukleasen, Shrimp alkalische Phosphatase

Gibco-BRL (Gaithersburg, USA): Restriktionsendonukleasen, T4-DNA-Ligase, Shrimp

Alkalische Phosphatase

Invitrogen (Paisley, UK): Agarose, Restriktionsnedonukleasen, T4-DNA-Ligase

N-Zyme BioTec GmbH (Darmstadt): rekombinante bakterielle Transglutaminase

2.1.8 Antibiotika

Die hier aufgeführten Antibiotika wurden als Selektionsmarker für Bakterienkolonien bzw.

für transgene Pflanzen verwendet.

Tab. 5: Verwendete Antibiotika

Antibiotikum Stammlösung

[µg/µl]

Endkonzentration

[µg/ml]

Hersteller

Kanamycin 50 50 Duchefa (Haalem, Niederlande)

Carbenicillin 100 500 Duchefa (Haalem, Niederlande)

Ampicillin 10 100 Duchefa (Haalem, Niederlande)

Rifampicin 50 50 Duchefa (Haalem, Niederlande)

Tetracyclin 5 12,5 Duchefa (Haalem, Niederlande)

2.1.9 Antikörper

GE Healthcare/Amersham (Braunschweig): Anti-Maus-IgG-POD (mit Meerrettichperoxidase

konjugierter Sekundärantikörper aus Kaninchen, gegen Maus-IgG gerichtet)

2.1.10 Pflanzenhormone

Sigma-Aldrich (St. Louis, USA): 6-Benzylaminopurin (BAP), Naphtylessigsäure (NES)


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2.1.11 Chemikalien, Reagenzien und Kits

Amersham Life Science (Braunschweig): ECL Western blotting analysis system

Appligene (Heidelberg): Ampicillin

BioRad (Richmond, USA): BIO-RAD-Protein Assay (Bradford Reagenz)

Difco Laboratories (Detroit, USA): Hefeextrakt, Bacto®-Agar, Bacto®- Trypton, Bacto®-

Pepton

Duchefa (Amsterdam, Niederlande): Murashige-Skoog Vollmedium

Eurogentec (Seraing, Belgien): DNA-SmartLadder (DNA-Längenstandard)

Gibco-BRL (Gaithersburg,USA): Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan (TRIS)

Merck (Darmstadt): Natriumhydroxid, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid,

Polyethylenglykol (PEG), Cystaminiumdichlorid, Glutathion (reduziert), Eisen(III)chlorid-

Hexahydrat, Hydroxylammoniumchlorid

N-Zyme BioTec GmbH (Darmstadt): Carbobenzoxy-L-Glutaminylglycin

Qiagen (Hilden): QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiaquick Gel Extraction Kit

Roche Diagnostics GmbH (Mannheim): Complete Protease Inhibitor

Roth (Karlsruhe): Acetosyringon, Chloroform, Ethidiumbromid, Ethanol, Essigsäure,

Fleischextrakt, Formaldehydlösung (37%), Glycin, Glyzerin, Isopropanol, Kaliumcarbonat,

Phenol/Chloroform, Methanol, Natriumacetat, Salzsäure, Natriumthiosulfat, Roti-Hybri-

Quick (Hybridisierungslösung), Rotiphorese Gel 30 (Acrylamid/Bisacrylamid 37,5:1),

Silbernitrat

Serva (Heidelberg): Tween-20, Natriumdodecylsulfat (SDS), , Bovines Serumalbumin (BSA),

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS),

Quarzsand, Dinatriumhydrogenphosphat, ß-Mercaptoethanol, Kaliumdihydrogenphosphat,

Natriumdihydrogenphosphat

Sigma (St. Louis, USA): Dimethylsulfoxid, Kaliumnitrat, Triton X-100, DEPC, Saccharose,

Bromphenolblau

2.1.12 Software

DNASTAR Inc. (Madison, USA): Computerprogramm Lasergene, Version 6.00


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2.1.13 Laborgeräte

Applied Biosystems (Foster City, USA): PE Geneamp 9700 PCR-System

Beckman Coulter (Fullerton, USA): GS-15R Zentrifuge, Allegra X-15R Zentrifuge

BioRad (München): Gene Pulser (Elektroporationsgerät), Mini-PROTEAN 3 und Tetra

Proteinelektrophorese- System, Mini Trans-blot Cell

DuPont (Wilmington, USA): Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge

Eppendorf (Hamburg): Concentrator 5301, Kühlzentrifuge 5402, Thermomixer 5436,

Tischzentrifuge 5415 C, Tischzentrifuge 5415 D, Präzisionspipetten

Gilson (Abimed Langenfeld): Präzisionspipetten

Heraeus Instruments (Hanau): Sepatech Suprafuge 22

Keutz (Reiskirchen) : Consort E835 Electrophoresis Power Supply

Hyco Vakuumtechnik (Krailling): Vakuumpumpe

IKA-Werke (Staufen): Magnetthermorührer IKAMAG RCT basic, Rührwerk Eurostar Digital

Infors-AG (Bottmingen, CH): Schüttelinkubatoren für die Bakterienkultivierung

Intas (Göttingen): Gel Jet Imager

Kern & Sohn GmbH (Balingen-Frommern): Elektronische Analysenwaage

Liebherr (Ochsenhausen): Kühlschränke, Tiefkühlschränke

Milton Roy (USA): UV/VIS Spektralphotometer Genesys 5

Qiagen(Hilden): TissueLyser (hergestellt von Retsch)

Sanyo (Bad Nenndorf): Ultratiefkühlschränke

Schott (Mainz): Vakuumexsikkator

SPEX Certiprep (Metuchen, USA): Kugelmühle Geno/Grinder 2000

Stovall Life Science (Greensboro,USA): Schüttler The Belly Dancer

Thermo Scientific (Waltham, USA): Sorvall EvolutionTM RC Superspeed Refrigerated

Centrifuge, Jouan GT4i Centrifuge

2.1.14 Verbrauchsmaterial

Amersham (Braunschweig): Nylonmembran (Hybond N+)

NalgeneTM (Rochester NY.,USA): Spritzenfilter 0,2µm Celluloseacetat

Schleicher und Schüll (Dassel): Nitrocellulosemembran (Cellulosenitratmembran BA 85),

Blotting Papier GB 002, Rundfilter (Durchmesser 70mm)


- 24 -

2.2 Methoden

Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Standardmethoden wie die Anzucht

von Bakterien, die Plasmidisolation aus E. coli Stämmen, Restriktionsspaltungen, Agarose-

Gelelektrophorese und Proteinanalyse mittels Western blot wurden nach den von Sambrook et

al. (1989) beschriebenen Protokollen durchgeführt.

2.2.1 Klonierung

Sämtliche Konstruktionsschritte erfolgten im pRTRA 7/3-Vektor. Nach der Spaltung und

Dephosphorylierung des Plasmids wurde das mit identischen kohäsiven Enden versehene

Fragment (Spinnenseidengen bzw. Dimerisierungsmarke) mittels T4-DNA-Ligase eingefügt.

Nach der Transformation mittels Eleptroporation in E. coli und der Kultivierung einzelner

Klone wurden deren Plasmide aus den Bakterienkulturen mittels des QIAprep Spin Miniprep

Kits präpariert und anschließend sequenziert. Nach Identifizierung eines geeigneten Klons

wurde das entsprechende Plasmid mit der Restriktionsendonuklease HindIII gespalten und

über ein Agarosegel (0,75%-1,5% in TBE) mittels Geleletrophorese aufgetrennt. Das gesuchte

Fragment wurde anhand eines Größenstandards identifiziert. Die durch interkalierendes

Ethidiumbromid fluoreszierenden DNS-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit

dem Qiaquick Gel Extraktions-Kit von Qiagen über eine Silica-Matrix gereinigt. Das so

erhaltene HindIII-Fragment wurde in den ebenfalls mit HindIII gespaltenen binären Vektor

pCB301 Kanr ligiert.

Die Ausgangskonstrukte wurden von Dr. Jürgen Scheller zur Verfügung gestellt.

2.2.2 Bakterienkultivierung

Der verwendete E. coli-Stamm XL 1 Blue wurde in LB-Flüssigmedium beziehungsweise auf

LB-Agar nach Sambrook und Russel 2000 unter Zugabe des jeweiligen selektiven

Antibiotikums bei 37°C kultiviert. Agrobacterium tumefaciens wurde in YEB-Flüssigmedium

bzw. auf YEB-Agarplatten ebenfalls unter Zusatz der entsprechenden Antibiotika bei 28°C

kultiviert.


- 25 -

2.2.3 Transformation mittels Elektroporation

2.2.3.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen (XL1Blue)

5ml Übernachtkultur kompetenter Zellen wurden in LB-Medium angesetzt. Nach 16 h

Inkubation bei 37°C und 260 rpm wurde das Inokulum zu 500 ml LB-Medium gegeben und

weiter bis zu einer OD von 0,5-0,8 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen jeweils 15 min

bei 5000 rpm und 4°C zentrifugiert und das Pellet in 500 ml sterilem ddH2O (4°C)

resuspendiert. Die Pelletierung wurde unter den genannten Bedingungen wiederholt und das

Pellet nacheinander in 250 ml sterilem ddH2O (4°C), 10 ml 10% Glycerin (4°C) und

schließlich in 1-1,5 ml 10% Glycerin (4°C) resuspendiert und in Aliquots von 40 µl bei -70°C

eingefroren.

2.2.3.2 Transformation

Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens erfolgte nach dem Protokoll von

Mersereau et. al. 1990), die Transformation von E. coli nach dem Protokoll von Inoue et. al.

1990). Ein Aliquot elektrokompetenter Zellen wurde auf Eis aufgetaut und 10µl

tropfendialysierter Ligationsansatz oder Plasmidlösung zugegeben. Die Mischung wurde in

eine Elektroporationsküvette gefüllt und mit einem BioRad Gene Pulser bei 25 µF, 1,8 kV

und 200 Ω transformiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 1ml gekühltem LB-Medium.

Die transformierten E. coli-Bakterien wurden 1 h bei 37°C inkubiert und abschließend auf

selektiven LB-Agarplatten ausgebracht. Agrobacterium tumefaciens wurden bei 30 min 28°C

inkubiert und auf YEB-Agarplatten ausplattiert.

2.2.4 Pflanzenanzucht

Die Kultivierung der Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) unter sterilen Bedingungen erfolgte

nach der Methode von Murashige und Skoog 1962) auf MS-Medium. Der pH-Wert von 5,8

des Mediums wurde vor dem Autoklavieren eingestellt. Die Aussaat von Tabaksamen erfolgte

auf MS-Agar nach Oberflächensterilisation der Samen in 80% Ethanol (2 min) mit

anschließenden Waschschritten (4x in ddH2O) und 30-minütiger Quellung. Nach der in vitro


- 26 -

Anzucht wurden die Pflanzen in Erde überführt und im Gewächshaus bei einem

Belichtungsrhythmus von 16 h Belichtung und 8 h Dunkelheit kultiviert.

Sowohl im Falle der transienten als auch der stabilen Transformation von Tabakpflanzen

erfolgte die Übertragung der DNS vermittels Agrobacterium tumefaciens-Infektion.

2.2.5 Stabile Tabaktransformation

Die Transformation von Nicotiana tabacum erfolgte nach einer variierten Methode von

Horsch et. al. 1985):

Blattmaterial von unter sterilen Bedingungen kultivierten Nicotiana tabacum-Pflanzen

(Varietät Samsun NN) wurde in Blattscheiben von ca. 1 cm2 Größe geschnitten. Für die

Transformation wurden diese in eine Suspension von transgenen Agrobacterium tumefaciens

(ÜN-Kultur mit MS-Medium 1:10 verd.) überführt und in dieser Lösung 10 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Blattstückchen von überschüssiger

Bakteriensuspension befreit und für die Kokultivierung auf MS-Agarplatten ausgelegt. Die

Kokultivierung erfolgte über Nacht im Kulturraum unter Lichtabschluss. Anschließend

wurden die Blattstücke auf MS-Agarplatten mit 0,1 mg/l NES, 1 mg/l BAP, 50mg/l

Kanamycin und

500 mg/l Cefotaxime transferiert und die Kultivierung mit einem 16 h / 8 h-Licht/Dunkel-

Rhythmus fortgesetzt. Die nach etwa 5-8 Wochen gebildeten Sprosse wurden zur

Wurzelbildung auf MS-Medium mit 50 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Cefotaxime überführt.

Die regenerierten Pflanzen wurden in Erde gesetzt und im Gewächshaus bis zur

Samenbildung kultiviert.

2.2.6 Transiente Tabaktransformation

Die transiente Infiltration von Agrobacterium tumefaciens in Blätter von Nicotiana tabacum

und Nicotiana benthamiana wurde lokal mittels Spritzeninfiltration (variiert nach Yang et. al.

2000) und für die Behandlung ganzer Pflanzen mittels Vakuuminfiltration (variiert nach

Kapila et. al. 1997) durchgeführt.


- 27 -

2.2.6.1 Spritzeninfiltration

Das zu infiltrierende Spinnenseidenkonstrukt wurde in 10 ml YEB-Medium unter Zugabe

selektiver Antibiotika (50 µg/ml Rifampicin, 50 µg/ml Carbenicillin, 50 µg/ml Kanamycin)

für 24 h bei 28°C und 170 rpm inkubiert. Anschließend wurden folgende Stammlösungen

zugegeben: 0,2 M Acetosyringon (Endkonzentration 20 µM), 1 M Glukose (Endkonzentration

10 mM) und 1 M MES (Endkonzentration 10 mM). Die Inkubation wurde für weitere 24

fortgesetzt. Abschließend erfolgte die Einstellung der optischen Dichte (OD600) auf 1 mit

ddH2O und 2xInfiltrationspuffer sowie die finale Zugabe von 0,2 M Acetosyringon

(Endkonzentration 200 µM). Anschließend wurde die Suspension mit einer Spritze in die

Unterseite der Tabakblätter injiziert und die Pflanzen 4 Tage bei ca. 22°C und 16 h/Tag Licht

inkubiert.

2.2.6.2 Vakuuminfiltration

Der Agrobacterium-tumefaciens-Stamm mit dem zu infiltrierenden Spinnenseidenkonstrukt

wurde in 10 ml YEB-Medium unter Zugabe selektiver Antibiotika (50 µg/ml Rifampicin,

50 µg/ml Carbenicillin, 50 µg/ml Kanamycin) für 48 h bei 28°C und 170 rpm inkubiert.

Anschließend wurde diese Vorkultur in 500 ml YEB-Medium (50 µg/ml Carbenicillin, 50

µg/ml Kanamycin) gegeben und weitere 24 h unter den genannten Bedingungen inkubiert.

Anschließend erfolgte die Zugabe folgender Stammlösungen: 0,2 M Acetosyringon

(Endkonzentration 20 µM), 1 M Glukose (Endkonzentration 10 mM) und 1M MES

(Endkonzentration 10 mM). Nach weiteren 24 h Inkubation bei 28°C und 170 rpm wurde die

optische Dichte (OD600) mittels ddH2O und 2xInfiltrationspuffer auf den Wert 1 eingestellt

(ca. 2 l Volumen) und 0,2M Acetosyringon (Endkonzentration 200 µM) zugegeben. Für die

eigentliche Infiltration wurden die Pflanzen vollständig in die Bakteriensuspension

eingetaucht und mittels einer Pumpe und eines Exsikkators ein starker Unterdruck angelegt.

Die infiltrierten Pflanzen wurden vier Tage bei ca. 22°C und 16 h Licht/Tag inkubiert.


- 28 -

2.2.7 Herstellung von Proteinproben

2.2.7.1 Proteinproben aus Tabakblättern

Die Extraktion der Proteine aus Blättern von Tabakpflanzen für die Western-blot-Analyse

erfolgte durch Homogenisierung von ca. 30 mg Blattmaterial in einem Reaktionsgefäß mit

Hilfe eines konischen Rührstabes (IKA Eurostar D) unter Zugabe von 100 µl SDS-

Probenpuffer. Die Proben wurden anschließend für 10 min bei 100°C denaturiert und bei rcf =

15000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Nach der Bestimmung des Proteingehaltes im

Überstand (Bradford 1976) mit BSA als Standardprotein wurden jeweils 20 µg TSP

gelelektrophoretisch aufgetrennt.

2.2.7.2 Proteinproben aus Tabaksamen

Für die Selektion der Samen wurde eine Probenmenge von ca. 80 mg reife Tabaksamen mit

Quarzsand in flüssigem Stickstoff gemörsert und 0,8 ml Proteinextraktionspuffer zugegeben.

Nach dem Auftauen wurden die Rohextrakte in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bei 4°C

und rcf = 15000 g für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die

Konzentration der löslichen Proteine in diesem Extrakt bestimmt (Bradford 1976). Für die

Analyse im Western blot wurden die Extrakte mit 2xSDS-Probenpuffer auf eine

Konzentration von 1 µg/µl TSP eingestellt und 10 min bei 100°C denaturiert.

2.2.8 Western blot

Die Proteine (je Proteinprobe 20µg/µl TSP) wurden in einem SDS-Polyacrylamidgel

(Konzentration zwischen 7,5% und 12%) in SDS-Elektrophoresepuffer aufgetrennt (Laemmli

1970). Nach der Elektrophorese wurden die aufgetrennten Proteine durch Elektrotransfer

(blotting) (~1,2mA/cm2, 16h) in einer mit Transferpuffer gefüllten Elektrotransferapparatur

auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell) übertragen. Anschließend wurden unspezifische

Bindungsstellen der Nitrozellulosemembran mit 5%-iger Trockenmilch in Marvelpuffer für

2h bei RT abgesättigt. Die Bindung des monoklonalen Antikörpers 9E10 (Evan et. al. 1985)

an das c-myc-Peptid der nachzuweisenden Proteine wurde durch eine zweistündige Inkubation

der Membran bei RT in einer 1:60 verdünnten Lösung von 9E10-Konzentrat in 5%-iger


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Marvelmilch erreicht. Danach wurde der Filter dreimal für jeweils 5 min mit 0,5%iger

Marvelmilch bei RT gewaschen und anschließend für 2h in einer Verdünnung des

Sekundärantikörpers (Anti-mouse IgG horseradish peroxidase) von 1:2000 in 5%-iger

Marvelmilch bei Raumtemperatur inkubiert. Nach den folgenden Waschschritten (je zweimal

5 min in 5%-iger Marvelmilch, Marvelpuffer und PBS) erfolgte der Nachweis der Proteine

durch Chemolumineszenz der antikörpergekoppelten Peroxidase mit einem ECL-Kit

(Western blotting analysis system, GE-Amersham). Der verwendete Primärantikörper wurde

als Konzentrat nach Ammoniumsulfatfällung und Dialyse gegen PBS aus dem Überstand der

Hybridomazellen 9E10 (Evan et. al. 1985) gewonnen, die im Zellzuchtlabor der

Arbeitsgruppe „Phytoantikörper“ kultiviert wurden. Das Epitop umfasst einen Bereich des

humanen Proto-Onkogens p62, c-myc (Bernard et al., 1983, Hilpert et al., 2001).

2.2.8.1 Protein Dot blot

Die Protein Dot blot-Methode ist eine methodische Vereinfachung der Western blot-Analyse.

Im Gegensatz zu dieser Methode werden die Proteinproben nicht auf einem Polyacrylamidgel

aufgetrennt, sondern direkt auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell) aufgetragen (Allen

und Parsons 1979). Nach 30 min Trocknung bei Raumtemperatur wird analog zur Western

blot-Methode verfahren.

2.2.9 Coomassiefärbung

Obwohl Spinnenseide-ELP-Fusionsproteine nicht effektiv durch Coomassie-Brillant-Blau

R250 angefärbt werden, konnte diese Methode benutzt werden, um Kontaminationen durch

Proteine aus Tabak während der Proteinreinigung nachzuweisen. Dazu wurde das SDS-Gel

über Nacht in einer variierten Coomassielösung (Maldener 2004) gefärbt. Die anschließende

Entfärbung erfolgte für ca. 2 h in 10% (v/v) Essigsäure.

2.2.10 Proteinreinigung aus Tabakblättern

Zur Reinigung der Spinnenseiden-Fusionsproteine aus Tabakblättern wurde eine Variation der

Inverse Transition Cycling-Methode angewandt (Meyer und Chilkoti 1999; Scheller et. al.

2004). Dazu wurden Tabakblätter bei -80°C eingefroren und in einem Mixer in PBS (ohne


- 30 -

NaCl) zerkleinert (pro Gramm Tabakblätter 1,5 ml PBS). Größere Blattteile wurden über ein

Sieb abgetrennt. Der so erhaltene Rohextrakt wurde eine Stunde bei 100°C erhitzt und

anschließend auf 60°C abgekühlt. Die Zentrifugation erfolgte für eine Stunde bei 4°C und rcf

= 10.000 g. Der abgenommene Überstand wurde mit 2 M NaCl versetzt und auf 50°C erhitzt.

Die nun folgende Zentrifugation wurde für eine Stunde bei 8000 rpm durchgeführt, allerdings

bei 40°C, um die ausgefällten ELP-Fusionsproteine nicht erneut zu lösen. Das Proteinpellet

wurde bei RT in 80 ml PBS (ohne NaCl) resuspendiert und sterilfiltriert (Spritzenfilter 0,2 µm

Porengröße). Abschließend erfolgte die Dialyse gegen PBS (ohne NaCl) mit anschließender

Trocknung des Proteins (Vakuumtrocknung oder Lyophilisierung).

2.2.11 Proteinreinigung aus Tabaksamen

Die Reinigung der Proteine aus Tabaksamen basiert, ebenso wie die Reinigung aus

Tabakblättern, auf der Inverse Transition Cycling-Methode. Dazu wurden jeweils 0,06 g reife

Tabaksamen mit Quarzsand in flüssigem Stickstoff gemörsert und 0,8ml

Proteinextraktionspuffer zugegeben. Nach dem Auftauen wurden die Rohextrakte in

Zentrifugenröhrchen überführt und bei 4°C und rcf = 10.000 g für 30 min zentrifugiert. Der

Überstand wurde abgenommen, 10 min bei 100°C und weitere 10 min bei 4°C inkubiert.

Anschließend wurde der Extrakt 30 min bei 4°C und >10.000g zentrifugiert, um denaturierte

Proteine abzutrennen. Der Überstand wurde mit 2M NaCl versetzt und 30 min bei RT

inkubiert. Die hierbei ausgefällten ELP-Fusionsproteine wurden mittels Zentrifugation bei RT

und rcf = 10.000 g für 30 min pelletiert und anschließend in PBS (ohne NaCl) resuspendiert

und sterilfiltriert (Spritzenfilter 0,2 µm Porengröße). Abschließend wurde die Proteinlösung

gegen PBS dialysiert und lyophilisiert.

2.2.12 Bestimmung der Enzymaktivität von Transglutaminase

Der Nachweis der Transglutaminaseaktivität basiert auf dem Verfahren von Grossowicz et. al.

1950). Dabei wird durch das Enzym der Einbau von Hydroxylamin in das synthetische

Substrat Carbobenzoxy-L-Glutamylglycin (Z-Gln-Gly-OH) katalysiert und die dabei

abgespaltene Hydroxamsäure mit Eisen(III)-Ionen komplexiert und photometrisch bei einer

Wellenlänge von 525nm nachgewiesen. Dazu wurden folgende Reagenzien benötigt:


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Reagenz 1:

30 mM Z-Gln-Gly-OH, 10 mM Glutathion, 0,1 M Hydroxylamin, 0,2 M TRIS pH 6,0

Reagenz 2:

1,1 M HCl, 0,24 M FeCl3 (angesetzt in 0,1 M HCl), 0,1 M Trichloressigsäure

500 µl Reagenz 1 wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 10 min bei 37°C

temperiert. Anschließend wurden 50 µl Probenflüssigkeit (Transglutaminaselösung) bzw.

Nullprobe (PBS) zugegeben und weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 500 µl

Reagenz 2 wurde die Reaktion beendet und die Absorption gegen die Nullprobe bestimmt.

2.2.13 Dimerisierung von Proteinen mittels Transglutaminase

Für die Transglutaminase-vermittelte Verknüpfung wurden Proteine mit Lysin- bzw.

Glutamin-Marker verwendet. Die verschiedenen Proteine wurden transient bzw. stabil in

Tabakblättern exprimiert und gereinigt. Anschließend wurden verschiedene Kombinationen

dieser Proteine zusammengegeben und mit Transglutaminase inkubiert (variiert nach Tanaka

et. al. 2004). Sowohl die Inkubationsdauer (2h-12h) als auch die Inkubationstemperatur (4°C-

25°C) wurden im Verlauf der Experimente variiert. Als kompetitiver Inhibitor zur

Negativkontrolle diente Cystamin (Lorand und Conrad 1984).

3 Ergebnisse

- 32 -

3 Ergebnisse

3.1 Expression von Spinnenseiden-Fusionsproteinen in Tabaksamen

Ein Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Evaluierung von Tabaksamen als

Produktionssystem für Spinnenseiden-Fusionsproteine, wie SO1-100xELP (Scheller et. al.

2001). Dazu wurden zunächst Spinnenseidenkonstrukte mit den samenspezifischen

Promotoren LeB4 und USP verwendet, die ursprünglich für die Expression in Erbsen

vorgesehen waren. Das zu exprimierende Spinnenseidenprotein SO1 ist ein synthetisches Gen

mit einer mehr als 90%-igen Sequenzhomologie zu einem der Proteine der Tragfadenseide der

goldenen Radnetzspinne Nephila clavipes (MaSp1: Mayor ampullate spidersilk protein 1).

Das Protein wurde mit 100 Wiederholungen des Elastin ähnlichen Polypeptids fusioniert, um

die Reinigung mittels der Inverse Transition Cycling-Methode (ITC) zu ermöglichen (Meyer

und Chilkoti 1999). ER-Retention ist heute generell die Methode der Wahl, um rekombinante

Proteine in transgenen Pflanzen zu produzieren. Das wurde sowohl für

Immunglobulinfragmente (Übersicht bei Conrad und Fiedler 1998) und komplette Antikörper

(Übersicht bei Twyman et. al. 2003, Fischer et. al. 2004) als auch für Vakzine gezeigt

(Übersicht bei Floss et. al. 2007). Diese Methode wurde daher auch bereits bei

Spinnenseidenproteinen angewandt (Scheller et. al. 2001). Daher enthalten die in dieser

Dissertation verwendeten Konstrukte das LeB4-Signalpeptid und ein ER-Retentionssignal

(KDEL), um die Lagerung der Spinnenseidenproteine im endoplasmatischen Retikulum zu

gewährleisten.

Abb. 6: Schematische Darstellung der verwendeten Spinnenseidenkonstrukte mit und ohne 100xELP.

3.1.1 Konstruktion der Spinnenseiden-Fusionsgene mit samenspezifischen Promotoren

Die ursprünglichen Samenkonstrukte wurden von Dr. Jürgen Scheller zur Verfügung gestellt.

Sie wurden auf der Basis von ubiquitär exprimierten Konstrukten für die Expression in

3 Ergebnisse

- 33 -

Tabakblättern hergestellt. Dazu wurde der dort verwendete CaMV-35S-Promotor mittels der

Restriktionsenzyme HincII und NcoI ausgeschnitten und der entsprechend geschnittene

Samenpromotor (USP bzw. LeB4) mittels T4 DNA-Ligase eingefügt (Abb. 7).

Abb. 7: Plasmidkarte pRTRA-SO1-ELP. Darstellung des Spinnenseidengens SO1 mit 100xELP als Fusionskonstrukt im Klonierungsvektor pRTRa 7/3 unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors LeB4. Der Austausch des ubiquitären Promotors CaMV-35S (blau markiert) gegen den samenspezifischen Promotor LeB4 erfolgte mittels Restriktion an den Schnittstellen HincII und NcoI (rot markiert).

Tab. 6: Funktionale Bestandteile der samenspezifisch exprimierten Konstrukte.

Promotor Signalpeptid Spidroin Fusionsprotein Marker

USP LeB4 SO1 - c-myc

USP LeB4 2xSO1 - c-myc

USP LeB4 3xSO1 - c-myc

LeB4 LeB4 2xSO1 - c-myc

LeB4 LeB4 SO1 100xELP c-myc

3 Ergebnisse

- 34 -

Anschließend wurde die gesamte Expressionskassette mittels des Restriktionsenzyms HindIII

aus dem Konstruktionsvektor getrennt und in den entsprechend geschnittenen

Transformationsvektor pCB301Kanr eingefügt (Abb. 8). Die weiteren Konstukte (Tab. 6)

basieren ebenfalls auf dem Spinnenseidenprotein SO1, allerdings wurden sie nicht mit

100xELP fusioniert. Stattdessen enthielten diese Konstrukte jeweils ein, zwei bzw. drei

Wiederholungen der SO1-Sequenz unter Kontrolle des samenspezifischen USP-Promotors

(Abb. 9) sowie 2xSO1 unter Kontrolle des bereits eingeführten LeB4-Promotors (Abb. 10).

Abb. 8: Plasmidkarte pCB301-Kan-LeB4-SO1-ELP. Darstellung der HindIII-Expressionskassette mit dem Spinnenseidengen SO1 mit 100xELP als Fusionskonstrukt unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors LeB4 im Transformationsvektor pCB 301-Kan. Die Expressionskassette wurde mittels HindIII Restriktion (rot markiert) und Ligation in das Plasmid eingefügt.

3 Ergebnisse

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Abb. 9: Plasmidkarte pRTRa LeB4-2xSO1. Darstellung des Spinnenseidengens 2xSO1 im Klonierungsvektor pRTRa 7/3 unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors LeB4. Die Expressionskassetten wurden mittels einer HindIII Restriktion ausgeschnitten (rot markiert) und in den Transformationsvektor pCB 301-Kan kloniert.

Abb. 10: Plasmidkarte pRTRA-USP-SO1/ 2xSO1/ 3xSO1. Darstellung der Spinnenseidengene SO1, 2xSO1 und 3xSO1 im Klonierungsvektor pRTRa 7/3 unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors USP. Die Expressionskassetten wurden mittels einer HindIII Restriktion ausgeschnitten (rot markiert) und in den Transformationsvektor pCB 301-Kan kloniert.

3 Ergebnisse

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3.1.2 Test von Konstrukten mittels transienter Expression

Nach der Klonierung und Sequenzierung der Spinnenseidenkonstrukte ist es insbesondere bei

Konstrukten mit einem derart hohen Anteil an hochrepetitiven Motiven hilfreich, die

vollständige Expression im pflanzlichen System zu überprüfen. Zu diesem Zweck wurde die

Technik der Agroinfiltration benutzt (Kapitel 2.2.5 und 2.2.6). Hier standen zwei

unterschiedliche Methoden zur Verfügung: Das Einspritzen von rekombinanten

Agrobakterien in die Blattspreiten sowie die Vakuuminfiltration. Die erste Methode diente zur

Konstruktkontrolle, die Vakuummethode ermöglichte die Infiltration in vollständige Pflanzen

und damit die Herstellung von ausreichenden Proteinmengen für weiterführende Versuche.

Auf diese Weise standen uns neue Proteinvarianten bereits Monate vor der Ernte der ersten

stabil transformierten Pflanzen zur Verfügung.

3.1.2.1 Transiente Expression von samenspezifisch exprimierten Konstrukten

Im Gegensatz zur transienten Expression von konstitutiv exprimierten Proteinen werden die

Konstrukte unter der Kontrolle der samenspezifischen Promotoren LeB4 und USP außerhalb

des Samengewebes kaum transkribiert. Um eine Ablesung durch die DNA-abhängige RNA-

Polymerase zu ermöglichen, ist die Anwesenheit eines samenspezifischen

Transkriptionsfaktors nötig, der an den samenspezifischen Promotor bindet und so die

Transkription initiiert. Daher wurden samenspezifische Konstrukte mit dem

Trankriptionsfaktor FUSCA3 (Bäumlein et. al. 1994; Baumlein et. al. 1994) koinfiltriert. Die

Bindung dieses Faktors an samenspezifische Promotoren in vitro und in vivo ist bekannt

(Mönke et. al. 2004, Reidt et. al. 2001). Es wurden zwei Agrobacterium tumefaciens-Kulturen

(GV 2260) jeweils mit einem samenspezifisch exprimierten Spinnenseidenkonstrukt bzw. mit

dem FUS3-Gen unter Kontrolle eines ubiquitären Pflanzenpromotors nach dem

Standardverfahren für Spritzeninfiltration in die Tabakpflanzen injiziert. Entgegen dem

Standardverfahren wurden die Pflanzen jedoch 6-7 Tage bis zur Probennahme bzw. Ernte

inkubiert, da zunächst der Transkriptionsfaktor FUSCA3 unter Kontrolle des CaMV 35S-

Promotors exprimiert wurde, woraufhin die Transkription des samenspezifischen Konstruktes

folgte. Daher war eine verlängerte Inkubationszeit nötig. Die transiente Expression der

samenspezifischen Konstrukte wurde sowohl in N. tabacum als auch in N. benthamiana

erfolgreich durchgeführt (Abb. 9A). Die verwendeten Konstrukte beinhalteten das

3 Ergebnisse

- 37 -

synthetische Spinnenseidengen SO1 sowie zwei bzw. drei Wiederholungen von SO1 (Abb.

9B). SO1 (ca. 51 kDa) und 2xSO1 (ca. 99 kDa) konnten erfolgreich transient exprimiert

werden. Die Proteinbanden im Western blot (Abb. 11) entsprachen den erwarteten

Proteingrößen (Tab. 7). Im Falle von 3xSO1 (ca. 140 kDa) waren nur vereinzelte Banden

unterhalb von 72 kDa sichtbar.

A B

Abb. 11: Western blot-Analyse von transient exprimierten Proteinen aus Tabakblättern. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA). A: Proteinbanden erwarteter Größe (51 kDa, rot markiert) sowie einige Abbaubanden sind sowohl in Proben aus N. benthamiana als auch aus N. tabacum bei gleichzeitiger Infiltration des Spinnenseiden-Fusionskonstrukts und des FUS3-Gens sichtbar. Schwache Proteinbanden sind ebenfalls sichtbar bei alleiniger Infiltration des Spinnenseidengens. B: Infiltration von Spinnenseidenproteinen in N .tabacum liefert Proteinbanden bis zu 99 kDa (2xSO1). Die Infiltration von 3xSO1 (erwartete Größe bei ca. 147 kDa) lieferte nicht das vollständige Protein, sondern lediglich Abbaubanden unterhalb von 72 kDa.

Fast alle Konstrukte unter Kontrolle des samenspezifischen USP-Promotors konnten

erfolgreich transient exprimiert werden. Lediglich das Konstrukt mit drei Wiederholungen der

SO1-Sequenz konnte nicht exprimiert werden. Es waren zwar Proteinbanden sichtbar, diese

lagen aber deutlich unterhalb der erwarteten Größe von 147 kDa und sind somit aller

Wahrscheinlichkeit nach ein Zeichen von Instabilität des Proteins. Die Konstrukte unter

3 Ergebnisse

- 38 -

Kontrolle des LeB4-Promotors (LeB4-2xSO1, LeB4-SO1-100xELP) wurden nicht transient

getestet, da diese Proteine bereits erfolgreich in Pflanzen exprimiert werden konnten (Scheller

und Conrad, unveröffentlicht).

Tab. 7: Erwartete Größe der samenspezifisch exprimierten Spinnenseiden-Fusionsproteine.

Transgen Proteingröße [kDa]

USP SO1 51

USP 2xSO1 99

USP 3xSO1 147

LeB4 2xSO1 99

LeB4 SO1-100xELP 94

Nach der erfolgreichen transienten Expression von SO1 und 2xSO1 unter Kontrolle des

samenspezifischen USP-Promotors wurden beide Konstrukte für die stabile Transformation

von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) ausgewählt. Trotz der unvollständigen Expression

von 3xSO1 wurde auch dieses Konstrukt für die stabile Transformation ausgewählt. In der

Analyse der mit 3xSO1 infiltrierten Tabakblätter waren, wie bereits erwähnt, deutlich zu

kleine Proteinbanden nachweisbar. Dies kann auch ein Artefakt der transienten Expression

sein und ist nicht zwangsläufig auf ein defektes Konstrukt zurückzuführen. Die bereits

erprobten Konstrukte unter Kontrolle des LeB4-Promotors wurden ebenfalls zur

Transformation verwendet.

3.1.3 Produktion stabil transformierter Tabakpflanzen mit samenspezifischen Konstrukten

Ziel der weiteren Experimente war die Erzeugung und Charakterisierung von transgenen

Tabaksamen und die Entwicklung eines geeigneten Reinigungsverfahrens zur Gewinnung der

Spinnenseiden-Fusionsproteine aus diesen Samen.

Nach den erfolgreichen transienten Tests wurden Tabakblattstücke (Nicotiana tabacum) mit

den erwähnten Konstrukten (Tab. 6) vermittels Agrobacterium tumefaciens transformiert und

jeweils 50 Pflanzen aus den Blattstücken regeneriert. Die regenerierten Pflanzen wurden in

Gewächshäusern bis zur Samenernte auf Erde kultiviert. Anschließend wurden die Samen

3 Ergebnisse

- 39 -

getrocknet und mittels Nachweis der c-myc-Marke im Western blot auf Expression der

Spinnenseidenproteine getestet (Abb. 12-16).

3.1.3.1 Nachweis der samenspezifisch exprimierten Proteine aus stabil transformierten

Pflanzen mittels Western blot-Analyse

Von 50 transgenen T0-Pflanzen konnte im Western blot je nach Konstrukt bei zwei bis

maximal 10 Pflanzen die Proteinexpression des Transgens nachgewiesen werden (Tab. 8,

Abb. 11-16). Je Konstrukt wurden 2 Linien zur weiteren Vermehrung ausgesät, während die

übrigen Linien für erste Reinigungsexperimente verwendet wurden.

Tab. 8: Anzahl der transformierten Pflanzen mit samenspezifisch exprimierten Konstrukten.

Konstrukt Regenerierte

Pflanzen

Spinnenseidenprotein

exprimierende Pflanzen

Bezeichnung der

vermehrten Linien

USP-SO1 50 6 34, 50

USP-2xSO1 50 2 5, 8

USP-3xSO1 50 2 (1 unstabil) 3

LeB4-2xSO1 50 5 24, 32

LeB4-SO1-

100xELP

50 10 14, 18

Abb. 12: Expressionsnachweis in transgenen Linien mit dem Konstrukt USP-SO1. Je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Sieben positive Linien (Nr. 1, 6, 34, 45, 49 und 50) wurden mittels c-myc-Antikörper und anti-Maus-Antikörper markiert und mittels ECL-Kit detektiert. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

3 Ergebnisse

- 40 -

In den Samen der 50 regenerierten USP-SO1-Pflanzen konnten sieben Linien (Nr. 1, 6, 34,

45, 49 und 50) anhand der c-myc-Marke als Expressionslinien für das Spinnenseiden-

Fusionsprotein identifiziert werden. Die Abschätzung des Molekulargewichtes im Western

blot ergab einen Wert von ca. 51 kDa. Dies entsprach der erwarteten Größe (Tab. 7)und ein

proteolytischer Abbau war nicht erkennbar. Während das Saatgut der Linien 34 und 50 weiter

vermehrt wurde, um genügend Samen für die Maßstabsvergrößerung der Reinigungsmethode

und die Etablierung einer stabilen Linie zu gewinnen, wurden die übrigen Samen für

Reinigungsexperimente verwendet.

Abb. 13: Expressionsnachweis in transgenen Linien mit dem Konstrukt USP-2xSO1. Je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Zwei positive Linien (Nr. 8 und 5) wurden mittels c-myc-Antikörper und anti-Maus-Antikörper markiert und mittels ECL-Kit detektiert. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

In den Samen der 50 regenerierten USP-2xSO1-Pflanzen konnten lediglich zwei Linien (Nr. 5

und Nr. 8) anhand der c-myc-Marke als Expressionslinien für das Spinnenseiden-


blot ergab einen Wert von ca. 100 kDa. Dies entsprach der erwarteten Größe (Tab. 7). Ein

proteolytischer Abbau war nicht erkennbar. Aufgrund der geringen Menge an exprimierenden

Linien wurden beide Linien vermehrt und zunächst keine Reinigungsexperimente mit diesem

transgenen Protein vorgenommen.

3 Ergebnisse

- 41 -

Abb. 14: Expressionsnachweis in transgenen Linien mit dem Konstrukt USP-3xSO1. Je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Zwei exprimierende Linien (Nr. 2 und 3) wurden mittels c-myc-Antikörper und anti-Maus-Antikörper markiert und mittels ECL-Kit detektiert. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA). In Linie 2 liegt das Protein in Fragmenten vor.

In den Samen der 50 regenerierten USP-3xSO1-Pflanzen konnte nur eine Linie (Nr. 3) anhand

der c-myc-Marke als Expressionslinie für das Spinnenseiden-Fusionsprotein identifiziert

werden. Die Abschätzung des Molekulargewichtes im Western blot ergab einen Wert von ca.

150 kDa. Dies entsprach der erwarteten Größe (Tab. 7). Ein proteolytischer Abbau war nicht

erkennbar. Das Saatgut der Linie 3 wurde weiter vermehrt, um genügend Samen für die

Etablierung der Reinigungsmethode und die Etablierung einer stabilen Linie zu gewinnen.

Linie 2 zeigt zwar ebenfalls Signale im Western blot, allerdings liegen 2 Banden von

vergleichsweise geringer Größe (ca. 55-60 kDa) vor. Daher wurde die Linie aufgrund dieser

Instabilität nicht weiter verwendet. Dieses Ergebnis zeigt erneut das Stabilitätsproblem der

hochrepetitiven Struktur von 3xSO1, welches bereits im transienten Test zu beobachten war

(Abb. 11B).

3 Ergebnisse

- 42 -

Abb. 15: Expressionsnachweis in transgenen Linien mit dem Konstrukt LeB4-2xSO1. Je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Auftrennung auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel. Fünf exprimierende Linien (Nr. 23, 24, 25, 32 und 39) wurden mittels c-myc-Antikörper und anti-Maus-Antikörper markiert und mittels ECL-Kit detektiert. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA). Linie 23 exprimiert das Protein nur in vergleichsweise geringer Menge.

In den Samen der 50 regenerierten LeB4-2xSO1-Pflanzen konnten fünf Linien (Nr. 23, 24,

25, 32 und 39) anhand der c-myc-Marke als Expressionslinien für das Spinnenseiden-


blot ergab einen Wert von ca. 100 kDa. Dies entsprach der erwarteten Größe (Tab. 7). Ein

proteolytischer Abbau war nicht erkennbar. Während das Saatgut der Linien 24 und 32 weiter

vermehrt wurde, um genügend Samen für die Maßstabsvergrößerung der Reinigungsmethode

und die Etablierung einer stabilen Linie zu gewinnen, wurden die übrigen Samen für

Reinigungsexperimente verwendet.

Die letzten untersuchten Linien wurden mit dem Konstrukt LeB4-SO1-ELP transformiert

worden. Von diesen Linien wurden ebenfalls 50 Pflanzen regeneriert und die daraus

gewonnenen Samen anhand der c-myc-Marke im Western blot charakterisiert (Abb. 16).

Dabei konnten zehn exprimierende Linien (Nr. 14, 18, 20, 21, 22, 29, 30, 38, 46 und 49)

identifiziert werden. Die Linien 14 und 18 wurden zur Etablierung stabiler Linien und zur

Maßstabsvergrößerung des Reinigungsverfahrens weiter vermehrt, während die übrigen

Linien für erste Reinigungsexperimente verwendet wurden.

3 Ergebnisse

- 43 -

Abb. 16: Expressionsnachweis in transgenen Linien der T0-Generation mit dem Konstrukt LeB4 SO1-ELP. Je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Zehn positive Linien (Nr. 14, 18, 20, 21, 22, 29, 30, 38, 46 und 49) wurden mittels c-myc-Antikörper und anti-Maus-Antikörper markiert und mittels ECL-Kit detektiert. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Die Ergebnisse der Nachkommensanalyse der Linien 14 und 18 (T1) sind in Abbildung 17

dargestellt.

3 Ergebnisse

- 44 -

A

B

Abb. 17: Expressionsnachweis in transgenen Linien der T1-Generation mit dem Konstrukt LeB4 SO1-100xELP. A: Linie 14/1-10; B: Linie 18/1-10; je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

In Linie 14 wurde nur in wenigen Sublinien Transgenexpression in T1-Nachkommen gezeigt. Ob dies auf Silencing-Effekte zurückzuführen war, bleibt offen.

Tab. 9: Anteil der Kanamycin-resistenten Pflanzen der weiter vermehrten SO1-ELP exprimierenden Linien (T1) bei jeweils einhundert neu ausgesäten Samen.

Linie Getestete Pflanzen Kanr Pflanzen

14/1 98 84

14/4 100 68

18/1 103 98

18/2 100 71

In Linie 18 wurde in nahezu allen Nachkommen Transgenexpression nachgewiesen. Das galt

auch für die T2-Generation (Abb. 18). Die bis zu diesem Zeitpunkt angewandte manuelle

Aufschlussmethode mittels Mörser war aufgrund der hohen Probenanzahl nicht praktikabel.

3 Ergebnisse

- 45 -

Daher musste eine neue Aufschlussmethode für Tabaksamen mit höherem Durchsatz etabliert

werden.

Nach der Ernte der ersten T2-Samen wurden dazu jeweils 0,06 g Samen mit Quarzsand und je

zwei Stahlkugeln in 2ml Eppendorfgefäße gefüllt und bei -80°C für 24 Stunden gelagert.

Anschließend wurden je 32 Proben mittels eines Qiagen (Retsch) TissueLyser (2 min Hubzahl

30 pro Sekunde) zerkleinert und je 800µl Samenextraktionspuffer zugegeben. Anschließend

wurde entsprechend der Standardmethode für Proteinproben aus Samen verfahren.

Abb. 18: Expressionsnachweis in transgenen Linien der T2-Generation mit dem Konstrukt LeB4 SO1-100xELP. Exemplarische Darstellung der Linien 18/1 Nr.51-65; je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Samenaufschluss erfolgte nach neuer Methode (Retschmühle). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Da in dieser Generation die Proteinexpression in den einzelnen Sublinien variierte, wurde eine

Dot blot-Methode inklusive mechanisierter Probengewinnung eingeführt, um Sublinien mit

stark exprimierenden Samen zu identifizieren. Dabei wurden je 0,04 g Samen der zu

beprobenden Linien mit 0,01 g Quarzsand und je zwei Stahlkugeln in einen 96-Well

Masterblock gefüllt und bei -80°C über Nacht gelagert. Anschließend wurde der Masterblock

bei 4°C 2 min bei 4750 rpm (rcf = 5251g) zentrifugiert, um die Samen zu konzentrieren.

Schließlich wurden die Samen in einer Geno/Grinder 2000-Kugelmühle 2 min bei einer

Hubzahl von 300 pro Minute aufgeschlossen, 400µl Samenextraktionspuffer zugegeben und

der Masterblock bei 4°C und 4750 rpm (rcf = 5251g) 30 min zentrifugiert, um die

Samentrümmer abzutrennen. Die Proteinproben wurden mit einer Mehrkanalpipette

entnommen und jeweils 20µl auf eine Nitrozellulosemembran aufgetragen. Der Nachweis des

Spinnenseiden-Fusionsproteins erfolgte anschließend nach der Standardmethode für Dot blot-

3 Ergebnisse

- 46 -

Analyse (Kapitel 2.2.8.1). Die Proteinproben wurden in drei Gruppen eingeteilt: stark

exprimierend, schwach exprimierend und nicht exprimierend. Stark exprimierende Samen

wurden während der Maßstabsvergrößerung des Reinigungsverfahrens verwendet.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 56 69 91 103 111 119 127 135 143 151 159 167 B 58 70 96 104 112 120 128 136 144 152 160 168 C 59 71 97 105 113 121 129 137 145 153 161 169 D 60 72 98 106 114 122 130 138 146 154 162 170 E 61 73 99 107 115 123 131 139 147 155 163 171 F 63 75 100 108 116 124 132 140 148 156 164 172 G 65 82 101 109 117 125 133 141 149 157 165 173 H 66 87 102 110 118 126 134 142 150 158 166 WT

Abb. 19: Dot blot-Analyse der Linien LeB4 SO1-100xELP (T2-Generation). Sublinien von 18/1; je 20µg TSP pro Probe wurden aufgetragen. Exemplarische Darstellung der ersten 95 Proben (+Wildtyp-Kontrolle) im 96-well Masterblock; Samenaufschluss erfolgte nach neuer Hochdurchsatzmethode (Aufschluss im GenoGrinder). Markierung mittels Anti-c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Stark exprimierende Linien wurden rot markiert, schwach exprimierende Linien blau.

In Abbildung 19 werden Samen von Sublinien von LeB4 SO1-100xELP Linie 18/1 im

Einzelnen analysiert. Die hier eingeführte Methode ermöglichte eine effiziente Untersuchung

größerer Probenzahlen, wie bei der Nachkommensanalyse transgener Pflanzen gefordert wird.

Die auf diese Weise analysierten transgenen Samen bildeten den Grundstock für die

nachfolgend beschriebenen Untersuchungen.

3 Ergebnisse

- 47 -

3.1.4 Analyse der Langzeitstabilität von Spinnenseiden-Fusionsproteinen in Tabaksamen

Lagerstabilität für Samenproteine stellt eine der Grundfunktionen von Pflanzensamen dar.

Diese Eigenschaft von Pflanzensamen führte auch zu ausgedehnter Lagerstabilität für

rekombinante Proteine in transgenen Samen, wie zum Beispiel rekombinante Antikörper

(Artsaenko et. al. 1995). Eine derartige Lagerstabilität wurde auch für entsprechende

rekombinante Antikörper-ELP-Fusionen gezeigt (Scheller et. al. 2006). Doch die

Lagerstabilität beschränkt sich nicht auf Tabaksamen. Auch in Kartoffelknollen konnten

rekombinante Antikörper stabil gelagert werden (Artsaenko et. al. 1998), während z.B. SO1-

100xELP in Knollen weder im Boden noch nach der Ernte stabil war und abgebaut wurde

(Münnich und Conrad, unveröffentlicht). Daher war es von großem Interesse, die

Lagerstabilität von SO1-ELP in Samen zu untersuchen. Dazu wurden Proben von zwei Linien

(Leb4 SO1-100xELP 18/3 und 18/9) jeweils unmittelbar nach der Ernte genommen. Nach

sechs Monaten Lagerung bei Raumtemperatur wurden monatlich Proben genommen, bis eine

Lagerzeit von insgesamt zwölf Monaten beendet war. Um die Vergleichbarkeit der Proben zu

gewährleisten, wurden jeweils 100 Samen abgezählt, in flüssigem Stickstoff gemörsert und

gleiche Volumina (je 20µl) im Western blot analysiert (Abb. 20 und 21).

Abb. 20: Western blot Analyse von Samenproben der Linie SO1-ELP. 18/3 zeigt die Stabilität der Spinnenseidenproteine nach 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 Monaten. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

3 Ergebnisse

- 48 -

Abb. 21: Western blot Analyse von Samenproben der Linie SO1-ELP. 18/9 zeigt die Stabilität der Spinnenseidenproteine nach 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 Monaten. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Beide hier analysierten Linien zeigen Proteinbanden der erwarteten Größe (ca. 94 kDa) in

allen zu verschiedenen Zeiten genommenen Proben. Leichte Schwankungen in der Stärke der

Proteinbanden waren erkennbar. Diese Schwankungen können zufällig und experimentell

bedingt sein. Proteinbanden geringerer Größe, die auf Abbauprozesse hindeuten wurden,

waren nicht erkennbar. Wie die Abbildungen 19 und 20 zeigen, wurde die Lagerstabilität von

SO1-ELP in Tabaksamen für zwei transgene Sublinien für lange Zeiträume (12 Monate)

nachgewiesen.

3.1.5 Reinigung des Spinnenseiden-Fusionsproteins SO1-100xELP aus Tabaksamen

Die Reinigung von Spinnenseidenproteinen aus Blattmaterial durch Inverse Transition

Cycling wurde von Scheller und Mitarbeitern 2004 beschrieben (Scheller et. al. 2004). Die

Extraktion und Reinigung aus Samen erfordert in vielerlei Hinsicht (Aufschlußverhalten,

hoher Ölgehalt, hoher Samenproteinanteil) eine Anpassung der Verfahrensweise.

Bedauerlicherweise konnte lediglich die Reinigung von SO1-ELP im Großmaßstab erprobt

werden, da die übrigen Linien durch experimentelle Probleme nicht in genügenden Mengen

zur Verfügung standen.

3 Ergebnisse

- 49 -

3.1.5.1 Anpassung der Inverse Transition Cycling-Methode an Reinigung aus Tabaksamen

Die Anpassung des Reinigungsverfahrens wurde zunächst im Labormaßstab (0,06 g Samen)

durchgeführt und später mit größeren Probenmengen (bis zu 50 g Samen) wiederholt.

Die Inverse Transition Cycling-Methode basiert auf der Löslichkeitsänderung von ELP-

Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der Temperatur, dem Salzgehalt und dem pH-Wert der

Proteinlösung. Daher wurden Fällungstemperatur und Salzgehalt unabhängig voneinander

variiert und die resultierenden Proteinpellets und Überstände mittels Western blot analysiert.

Bei diesen Experimenten wurde zunächst nur das Verhalten des transgenen Proteins

untersucht. Die ebenfalls im Extrakt enthaltenen Samenproteine wurden hier zunächst nicht

betrachtet.

Abb. 22: Optimierung der Proteineinigung aus Tabaksamen durch Variation der Salzkonzentration. 1: Rohextrakt; 2: Überstand Hitzebehandlung; 3: Überstand Salzfällung (+1Vol. ddH2O); 4: Überstand Salzfällung (+1 Vol. 2 M NaCl); 5: Überstand Salzfällung (+1 Vol. 5 M NaCl); 6: Überstand Salzfällung (+1 Vol. gesättigte NaCl-Lsg.); 7: Pellet Salzfällung (+1 Vol. ddH2O); 8: Pellet Salzfällung (+1 Vol. 2 M NaCl); 9: Pellet Salzfällung (+1 Vol. 5 M NaCl); 10: Pellet after Salzfällung (+1 Vol. gesättigte NaCl-Lsg.). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Die starke Abhängigkeit der Fällungseffizienz von der Salzkonzentration zeigte sich deutlich

bei der Variation dieses Parameters (Abb. 22). Die Standardmethode beinhaltet die Zugabe

von NaCl bis zur Endkonzentration von 2 M. Bei der Zugabe von 1Vol. ddH2O zur

3 Ergebnisse

- 50 -

Proteinlösung verblieb die gesamte Proteinmenge im Überstand. Bei einer Endkonzentration

von 1 M NaCl war zwar eine Proteinbande im Pellet zu erkennen, allerdings verblieb der

Großteil des Spinnenseiden-Fusionsproteins nach wie vor im Überstand. Die weitere

Erhöhung der Endkonzentration auf 2,5 M NaCl bzw. die Zugabe von 1 Vol. gesättigter

NaCl-Lösung führte zu einer völligen Fällung des Spinnenseidenproteins. Bei den Proben

dieser Fällungen zeigten sich im Western-blot (Proteinnachweis durch Anti-c-myc-

Antikörper) keine Banden des transgenen Proteins im Überstand und entsprechende

Zunahmen der korrespondierenden Banden im Pellet.

Abb. 23: Western blot-Analyse der Reinigungsoptimierung von SO1-ELP aus Tabaksamen im Labormaßstab durch Variation der Temperatur. 1: Rohextrakt; 2: Überstand Hitzebehandlung; 3: Überstand Salzfällung (95°C); 4: Überstand Salzfällung (75°C); 5: Überstand Salzfällung (65°C); 6: Überstand Salzfällung (50°C); 7: Pellet Salzfällung (95°C); 8: Pellet Salzfällung (75°C); 9: Pellet Salzfällung (65°C); 10: Pellet Salzfällung (50°C). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Die Variation der Fällungstemperatur bewirkte keinerlei Veränderung im Überstand nach der

Fällung bezogen auf das transgene Protein (Abb. 23). Es waren keine Banden des

Spinnenseidenproteins in den Überstandfraktionen im gesamten Temperaturspektrum (50°C-

95°C) sichtbar. Nennenswerte Unterschiede in den Bandenstärken der Pelletfraktionen waren

nicht zu erkennen. In weiterführenden Experimenten wurde die Fällungstemperatur weiter auf

bis zu 25°C abgesenkt (Abb. 24). Die Analyse dieser Fällung mittels Western blot zeigte eine

Erhöhung der Fällungseffizienz bei sinkenden Temperaturen. Bei allen Temperaturen waren

deutliche Proteinbanden im Pellet zu erkennen, allerdings nahm die Proteinmenge im

Überstand erkennbar mit der Temperatur (von 25°C über 37°C bis zu 50°C) zu.

3 Ergebnisse

- 51 -

Abb. 24: Western blot-Analyse der Reinigungsoptimierung von SO1-ELP aus Tabaksamen im Labormaßstab durch Variation der Temperatur. 1: Rohextrakt; 2: Überstand Hitzbehandlung; 3: Überstand Salzfällung (25°C); 4: Überstand Salzfällung (37°C); 5: Überstand Salzfällung (50°C); 6: Pellet Salzfällung (25°C); 7: Pellet Salzfällung (37°C); 8: Pellet Salzfällung (50°C). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Abb. 25: Western blot-Analyse der Reinigung von SO1-100xELP aus Tabaksamen im Labormaßstab. 1: Rohextrakt; 2: Überstand Hitzbehandlung; 3: Überstand Salzfällung (25°C); 4: Überstand Salzfällung (37°C); 5: Überstand Salzfällung (50°C); 6: Pellet Salzfällung (25°C); 7: Pellet Salzfällung (37°C); 8: Pellet Salzfällung (50°C); 9: Pellet 2 Salzfällung (25°C); 7: Pellet 2 Salzfällung (37°C); 8: Pellet 2 Salzfällung (50°C). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

3 Ergebnisse

- 52 -

Um die Vollständigkeit der Fällung zu überprüfen, wurde der Fällungsschritt ein weiteres Mal

unter identischen Bedingungen wiederholt (Abb. 25). In diesem Experiment wiederholten sich

die Ergebnisse der Temperaturvariation (Verbesserung der Fällungseffizienz bei Reduzierung

der Fällungstemperatur).

Der zweite Fällungsschritt lieferte jeweils eine schwache, kaum erkennbare Bande des

transgenen Proteins. Eine Wiederholung der Fällung erhöhte die Ausbeute nicht nennenswert.

Die Erhöhung der Probenmenge auf bis zu 50 g Tabaksamen machte einige zusätzliche

Reinigungsschritte notwendig. Im Labormaßstab wurde die notwendige Abtrennung der

öligen Phase aus dem Tabaksamenrohextrakt nach der ersten Zentrifugation manuell mittels

einer Pipette durchgeführt. Nach der Maßstabsvergrößerung war diese einfache Abtrennung

nicht mehr praktikabel, da die fetthaltige Phase mit zunehmender Oberfläche instabil wurde

und sich eine stabile Fett-in-Wasser-Emulsion bildete. Daher wurde eine zusätzliche Filtration

mit einem Faltenfilter vor der Hitzebehandlung durchgeführt und die Effizienz der

Reinigungsschritte mittels Western blot analysiert (Abb. 26). Die Salzfällung wurde

entsprechend der Temperaturoptimierung im Labormaßstab bei 25°C durchgeführt.

Abb. 26: Western blot-Analyse der maßstabsvergrößerten Reinigung von SO1-ELP aus Tabaksamen (50g) mit zusätzlichem Filterschritt. 1: Rohextrakt; 2: Filtrat; 3: Überstand Hitzebehandlung; 4: Pellet Hitzebehandlung; 5: Pellet Salzfällung; 6: Überstand Salzfällung; 7: Pellet Salzfällung (sterilfiltriert). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Es zeigte sich, dass unter den vorliegenden Bedingungen nach der Maßstabsvergrößerung

andere Bedingungen für die Fällung des Spinnenseiden-Fusionsproteins notwendig sind, da

sich nach der Salzfällung immer noch eine große Proteinmenge im Überstand befand (Abb.

26, Bahn 6). Zur Erhöhung der Ausbeute boten sich eine Erhöhung der Fällungstemperatur

3 Ergebnisse

- 53 -

oder eine Erhöhung der Salzkonzentration an. Eine Erhöhung der Salzkonzentration war nicht

wünschenswert, da es anschließend mittels eines Dialyseschrittes entfernt werden musste und

eine Verlängerung der Dialyse bei der Reinigung von Spinnenseidenproteinen aus anderen

Expressionssystemen zu Instabilität und starken Mengenverlusten geführt hat. Daher wurde

die Proteinlösung zur Fällung bei einer Temperatur von 37°C inkubiert und zentrifugiert. Zur

Abtrennung der Fettphase, die nach einer einfachen Filtration noch zu großen Teilen in der

Proteinlösung vorhanden war, wurden schließlich insgesamt zwei Filterschritte nach der

ersten Hitzebehandlung eingeführt, um die enthaltenen Fette abzutrennen.

Abb. 27: Analyse der maßstabsvergrößerten Reinigung (Inverse Transition Cycling) von SO1-100xELP aus Tabaksamen (50g) mittels Coomassiefärbung (A) und Western-blot (B). 1: Rohextrakt; 2: Pellet Rohextrakt; 3: Überstand Hitzebehandlung; 4: Pellet Hitzebehandlung; 5: Filter 1; 6: Filter 2; 7: Überstand Salzfällung; 8: Pellet Salzfällung; 9: Sterilfiltrat. Markierung (in B) mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Dazu wurde das Fett zunächst durch einen Faltenfilter und anschließend durch einen

Membranfilter (0,45µm) von der Proteinlösung abgetrennt. Mittels dieser Filterschritte wurde

die optische Dichte der Proteinlösung bei 600nm von über 4 auf 1,7 und schließlich auf 0,4

reduziert. Die abschließende Analyse der Reinigung wurde sowohl mit Hilfe des Western

3 Ergebnisse

- 54 -

blots (Abb. 27B) als auch durch Anfärbung mit Coomassie-Brilliant-Blau vorgenommen

(Abb. 27A), da das verwendete Spinnenseiden-Fusionsprotein nicht mit Coomassie-Brilliant-

Blau und nur minimal im Silbergel färbbar ist. Daher wurden Kontaminationen mittels

Coomassie-Färbung, bzw. Silberfärbung visualisiert, während die Ausbeute an

Spinnenseiden-Fusionsprotein im Western blot bewertet werden musste. Neben der höheren

Nachweisgrenze ist auch die Coomassie-Färbereaktion selbst denkbar ungeeignet, um

Spinnenseiden-ELP-Fusionen anzufärben, da sowohl SO1 als auch ELP kaum basische oder

aromatische Aminosäuren enthalten. Die Analyse des modifizierten Reinigungsverfahrens

mittels Western blot zeigte kaum Verluste im gesamten Verlauf der Reinigung (Abb. 27B). Es

waren keine nennenswerten Proteinbanden im Pellet des Rohextrakts (Abb. 27B, Bahn 2), im

Pellet der Hitzebehandlung (Abb. 27B, Bahn 4), oder im Überstand der Salzfällung (Abb.

27B, Bahn 7) erkennbar. Die finalen Banden (Abb. 27B, Bahn 8 und 9) wurden in dieser

Analyse 20-fach stärker konzentriert als die übrigen Banden, um etwaige Kontaminationen

mit Hilfe der Coomassiefärbung (Abb. 27A) besser nachweisen zu können.

Abb. 28: Analyse der modifizierten Reinigung von SO1-ELP aus Tabaksamen (50 g) mittels Silberfärbung (A) und Western blot (B). 1: Rohextrakt; 2: Pellet Rohextrakt; 3: Überstand Hitzebehandlung; 4: Pellet Hitzebehandlung; 5: Filter 1; 6: Filter 2; 7: Überstand Salzfällung; 8: Pellet Salzfällung; 9: Sterilfiltrat. Markierung (in B) mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

3 Ergebnisse

- 55 -

Doch trotz der Konzentrierung des Endprodukts waren keine Banden in der

Coomassiefärbung sichtbar. Proteinbanden waren vermehrt im Pellet des Rohextraktes (Abb.

27A, Bahn 2) sowie im Pellet der Hitzebehandlung (Abb. 27A, Bahn 4) zu erkennen.

Um die während der Reinigung auftretenden Verluste zu verdeutlichen, wurden die Proben in

vergleichbaren Volumina auf ein SDS-Polyacralamidgel aufgetragen und mittels Western blot

und Silberfärbung analysiert (Abb. 28). Im silbergefärbten Proteingel (Abb. 28A) sind zu

Beginn der Reinigung starke Kontaminationen sichtbar. Insbesondere in den ersten

Pelletfraktionen, also in den Pellets des Rohextraktes und der Hitzebehandlung, sind starke

Proteinbanden sichtbar. Die Filterschritte zur Eliminierung des Fettanteils haben keinen

erkennbaren Einfluss auf die verbliebenen Proteinbanden (Abb. 28A, Bahn 5 und 6). Die

abschließende Salzfällung hingegen trennt effektiv das Spinnenseiden-Fusionsprotein von den

verbliebenen Samenproteinen. Während die Samenproteine im Überstand (Abb. 28A, Bahn 7)

verbleiben, wird das Spinnenseiden-Fusionsprotein nahezu vollständig ausgefällt (Abb. 28B,

Bahn 8). Allerdings konnte auch im Silbergel keine sichtbare Anfärbung des Spinnenseiden-

Fusionsproteins erreicht werden.

Der Vergleich des Rohextraktes (Abb. 28B; Bahn 1) mit dem Sterilfiltrat des resolubilisierten

Proteinpellets (Abb. 28B; Bahn 8) zeigte den erwarteten Proteinverlust. Allerdings war dieser

Verlust, wie bereits erwähnt, nicht auf eine unvollständige Fällung zurückzuführen, da in den

Proben aus zu verwerfenden Phasen (Pellet Rohextrakt, Abb. 28B; Bande 2; Pellet

Hitzebehandlung, Abb. 28B; Bande 4; Überstand Salzfällung, Abb. 28B; Bande 7) kaum

Spinnenseiden-Proteinbanden sichtbar waren. Auch waren keine Abbaubanden erkennbar,

was auf Proteaseaktivität oder Hitzeinstabilität hindeuten würde. Eine schwache

Spinnenseiden-Proteinbande und damit ein Verlust ist im Pellet der Hitzebehandlung sichtbar

(Abb. 28B, Bahn 4). Demzufolge wurde nach der ersten Proteindenaturierung nicht das

gesamte transgene Protein wieder in Lösung gebracht und ging damit verloren. Schließlich

treten weiter Verluste während der Salzfällung auf, obwohl, wie bereits erwähnt, im

entsprechenden Überstand keine Bande des transgenen Proteins sichtbar ist (Abb. 28B, Bahn

7). Ein Verlust während dieses Verfahrensschrittes ist also nicht auf eine unvollständige

Fällung sondern wahrscheinlich auf Proteinabbau zurückzuführen. Da andererseits keine

Abbaubanden im Pellet der Salzfällung (Abb. 28B, Bahn 8) sichtbar sind, muss ein etwaiger

Abbau nahezu vollständig und ohne Zwischenprodukte verlaufen.

3 Ergebnisse

- 56 -

3.1.5.2 Filterbasierte Reinigung

Eine alternative Reinigungsmethode basiert auf der Arbeit von Ge et. al. 2006), in deren

Verlauf erfolgreich ELP-Fusionsproteine aus einer Bakteriensuspension gereinigt werden

konnten (Ge et. al. 2006). In diesem Verfahren wird, ebenso wie bei der ITC-Methode, die

kontrollierte und reversible Ausfällung von ELP-Fusionproteinen zur Trennung des

transgenen Proteins von Verunreinigungen verwendet. Im Falle der filterbasierten Reinigung

wurden die durch Salzzugabe aggregierten ELP-Fusionproteine allerdings nicht

abzentrifugiert, sondern mittels 0,2µm Zelluloseacetatfiltern vom Suspensionsmedium

abgetrennt. Anschließend wurden die auf der Filteroberfläche zurückgehaltenen

Proteinaggregate durch Zugabe eines salzfreien Lösungsmittels in Lösung gebracht und von

der Filteroberfläche gewaschen. Dieses Prinzip wurde auch zur Reinigung von

Spinnenseiden-Fusionsproteinen aus dem Rohextrakt von Tabaksamen erprobt (Abb. 29).

Im Western blot wurde erkennbar, dass das Spinnenseiden-Fusionsprotein nicht vollständig

vom Filter zurückgehalten wird, sondern dass ein Großteil der Proteinmenge im Durchlauf

verblieb (Abb. 29, Bahn 2). Ebenso wurde ein Teil des Proteins bei den folgenden

Waschschritten ausgespült. Das erste Eluat (Abb. 29, Bahn 5) war erkennbar höher

konzentriert als die Waschfraktionen, es fand also eine Anreicherung statt.

Abb. 29: Analyse der Filterreinigung des Spinnenseiden-Fusionsproteins SO1-100xELP mittels Western blot und Ponceaufärbung. 1: Rohextrakt; 2: Durchlauf; 3: Waschschritt 1; 4: Waschschritt 2; 5: Eluat1; 6: Eluat 2; 7: Eluat 3. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

So1-ELP

(Western blot)

Kontamination

(Ponceau)

3 Ergebnisse

- 57 -

Aufgrund der geringen Probenmengen konnte kein zweites Gel mit ausreichenden

Proteinmengen beladen werden, um eine Coomassiefärbung durchzuführen. Daher wurden die

auf der im Western blot analysierten Membran gebundenen Proteine mittels Ponceaurot

angefärbt.

Abb. 30: Western blot-Analyse der Filterreinigung von SO1-100xELP mit erhöhter Inkubationszeit (10 min). 1: Rohextrakt; 2: Durchlauf; 3: Waschschritt 1; 4: Waschschritt 2; 5: Eluat1; 6: Eluat 2; 7: Eluat 3. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Abb. 31: Western blot-Analyse der Filterreinigung von SO1-100xELP mit erhöhter Inkubationstemperatur (40°C) und -zeit (10 min). 1: Rohextrakt; 2: Durchlauf; 3: Waschschritt 1; 4: Waschschritt 2; 5: Eluat1; 6: Eluat 2; 7: Eluat 3. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Die Ponceaufärbung zeigte eine Verteilung der Kontaminationen analog zur Verteilung des

transgenen Proteins: ein Großteil verblieb im Durchfluss, in der ersten Waschfraktion war

3 Ergebnisse

- 58 -

eine deutliche Bande erkennbar und auch in den Eluaten 1 und 2 waren Kontaminationen

vorhanden. Eine Trennung von Kontaminationen und transgenem Protein konnte also nicht

erreicht werden. Eine Erhöhung der Inkubationszeit bewirkte keine Erhöhung der Ausbeute

(Abb. 30). Allerdings wurde in diesem Versuch deutlich, dass ein Großteil des Proteins weder

im Durchlauf noch in den Wasch- oder Eluatfraktionen nachweisbar war, also möglicherweise

auf dem Filter verblieb. Die Erhöhung der Inkubationstemperatur (Abb. 31) lieferte ebenfalls

keine klare Verbesserung der Ausbeute. Wieder war ein Proteinverlust im Verlauf der

Reinigung vom Rohextrakt zu den Eluatfraktionen erkennbar.

Die weitere Erprobung der filterbasierten Reinigung wurde daraufhin als wenig

erfolgversprechend bewertet und eingestellt.

3.1.5.3 Semiquantitative Auswertung des Reinigungsverfahrens

Um abschätzen zu können, welche biotechnische Kapazität ein „Expressionssystem

Tabaksamen“ aufweist, war es wichtig, die Ergebnisse der Reinigungen einer

semiquantitativen Analyse zu unterziehen. Nach drei durchgeführten Reinigungen im

Großmaßstab (50g) wurden die resolubilisierten Proteinpellets dialysiert und die finalen

Proben anhand eines geeigneten Standards quantifiziert (Abb. 32).

Abb. 32: Semiquantitative Auswertung der Samenlinien 18/1 a und b sowie 18/7. Je 2µl und 10µl gereinigtes Spinnenseidenprotein wurden mit definierten Standardmengen verglichen und so quantifiziert. Das Ergebnis der Auswertung ist aus Tabelle 10 (Seite 59) ersichtlich. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

3 Ergebnisse

- 59 -

Der verwendete Standard ist SO1-100xELP aus Tabakblättern. Das Fusionsprotein wurde

gereinigt, lyophilisiert und gewogen. Eine definierte Menge wurde anschließend in einem

definierten Volumen SDS-Probenpuffer gelöst und in verschiedenen Volumina im Western

blot mit den zu quantifizierenden Proben des Spinnenseidenproteins aus Samen verglichen.

Die Probenbande wurde mit der Standardbande gleicher Stärke gleichgesetzt. Die so

abgelesene Proteinmenge wurde anschließend auf das jeweilige Probenvolumen (2µl bzw.

10µl) bezogen und so eine vergleichbare Konzentration bestimmt. Aus beiden Proben wurde

anschließend der entsprechende Durchschnittswert für die Reinigungsprobe errechnet.

Allerdings stellte sich das Problem, dass die Analyse der Proben 18/1a -10µl und 18/1b-10µl

zu einer höheren Signalstärke führten als die Analyse der maximalen Standardprobe (40ng).

Dies erschwert die Bestimmung der Konzentrationen und verfälscht den Durchschnittswert.

Tab. 10: Konzentrationsbestimmung der gereinigten Spinnenseidenproteine anhand der ersten semiquantitativen Western blot-Analyse (Abb. 32).

Bezeichnung

der gereinigten

Samenlinie

Konzentration (2µl)

[ng/µl]

Konzentration (10µl)

[ng/µl]

Durchschnitt

[ng/µl]

18/1a 5 >4 >4

18/1b 5 >4 >4

18/7 <0,5 1,5 1<

Aus diesem Grund wurde der semiquantitative Western blot mit der Probe 18/1a wiederholt.

Ein weiteres Probenvolumen (0,5µl) wurde aufgetragen, um mit wenigstens zwei Proben

innerhalb der Standardmengengrenzen zu bleiben. Darüber hinaus wurden ebenso zwei

Proben des entsprechenden Rohextraktes der Probe 18/1a aufgetragen, um so die Ausbeute

der Reinigung bestimmen zu können (Abb. 33).

Bei der weiteren Auswertung der Analyse ist allerdings zu beachten, dass das gereinigte

Spinnenseidenprotein in einem geringeren Volumen gelöst wurde als der Rohextrakt (20-fach

konzentriert gegenüber dem Rohextrakt). Dieser Unterschied wurde rechnerisch

berücksichtigt, indem die errechnete Konzentration des Pellets durch den entsprechenden

Faktor 20 geteilt wurde (Tab. 11).

3 Ergebnisse

- 60 -

Abb. 33: Vergleich von SO1-100xELP im Rohextrakt und gereinigtem SO1-100xELP aus Tabaksamen der Linie 18/1a mit So1-100xELP-Standard (gereinigt aus Tabakblättern) mittels Western blot-Analyse. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Die 10µl-Probe wurde erneut aus der Berechnung ausgeschlossen, da die Menge transgenen

Proteins dieser Probe oberhalb des definierten Standardbereichs lag. Die durchschnittlich

gereinigte Proteinmenge entsprach einer Ausbeute von 44% der ursprünglich im Rohextrakt

vorhandenen Proteinmenge (Tab. 11).

Tab. 11: Konzentrationsbestimmung der gereinigten Spinnenseidenproteine anhand der zweiten semiquantitativen Western blot-Analyse und Bestimmung der Reinigungsausbeute (Abb. 33).

Rohextrakt Pellet (20-fach konzentriert)

Konzentration (2µl) [ng/µl] (1ng/2µl)

0,5

(15ng/2µl)

7,5

Konzentration (10µl) [ng/µl] (15ng/10µl)

1,5

(>40ng/10µl) außerhalb des Standards

>4:

Konzentration (0,5µl) [ng/µl] Nicht aufgetragen (5ng/0,5µl)

10

Durchschnittskonzentration [ng/µl] 1 8,75 (20x konz.)

Korrigiert: 0,4 (1x konz.)

Konzentration im Samen [µg/g] 4 1,75

Ausbeute [%] 44%

3 Ergebnisse

- 61 -

3.2 Posttranslationale Polymerisierung von Spinnenseiden-Fusionsproteinen

Die bisher verwendeten Spinnenseidenkonstrukte kodieren Proteine, die wesentlich kleiner

sind als native Spinnenseidenproteine. Die genetische Instabilität der hochrepetitiven

Sequenzen dieser Konstrukte limitiert die transgen herstellbare Proteingröße. Um die Größe

der transgenen Spinnenseidenproteine dennoch weiter zu steigern, wurde im Rahmen dieser

Arbeit die posttranslationale Multimerisierung von Spinnenseidefusionsproteinen mittels

bakterieller Transglutaminase etabliert. Auch native Spinnenseidenproteine werden in den

Spinndrüsen miteinander auf eine ähnliche Art und Weise verknüpft, wodurch die transgenen

Proteine nicht nur in ihrer Größe, sondern gegebenenfalls auch strukturell den nativen

Spinnenseidenproteinen weiter angeglichen werden.

3.2.1 Konstruktion der Spinnenseiden-Fusionsgene mit Transglutaminasemarken

Zur Durchführung der Transglutaminase-vermittelten Dimerisierung wurden verschiedene

Konstrukte (MaSp1 und MaSp2, SO1, SO1-100xELP sowie 100xELP) ausgewählt und mit

Glutamin- bzw. Lysin-Marken versehen (Aufbau der Dimerisierungsmarken siehe Tabelle

12). Dazu wurden die Dimerisierungsmarken als Einzelstrang-DNS synthetisiert und ligiert.

Die etablierten Spinnenseidenkonstrukte für ubiquitäre Expression wurden entsprechend der

überhängenden Enden der Marken mit BamHI zwischen Signalpeptid und Fusionsprotein

geschnitten und mit den Marken ligiert.

Tab. 12: DNS-und Aminosäuresequenzen der Dimerisierungsmarken (Bindungsstellen rot

markiert)

Marke DNS-Sequenz Aminosäuresequenz

Glutamin gatccggctctggaatggctgaaacggccgca

gcggctttcgaaagacagcatatggattctg

S G S G M A E T A A A A F E R Q H

M D

Lysin gatccggctctggaatgaaggaaacggccgca

gcgagattcgaaagaaaccatatggattctg

S G S G M K E T A A A R F E R N H

M D

Die Expression der neuen Konstrukte erfolgte sowohl transient als auch stabil im Blatt, um

möglichst frühzeitig genügende Proteinmengen für erste Verknüpfungsversuche zur

Verfügung zu haben. Auch diese Konstrukte wurden mit einem LeB4-Signalpeptid und einem

3 Ergebnisse

- 62 -

Retentionssignal versehen, um die Expression und Retention im Endoplasmatischen

Retikulum und damit eine möglichst gute Produktstabilität sicherzustellen.

Tab. 13: Aufbau der Konstrukte mit Transglutaminasemarken.

Promotor Signalpeptid Spidroin Fusionsprotein Nachweismarke

(Western blot)

Dimerisierungs-

marke

CaMV35S LeB4 - 100xELP c-myc Lysin

CaMV35S LeB4 MaSp1 100xELP c-myc Lysin

CaMV35S LeB4 MaSp1 100xELP c-myc Glutamin

CaMV35S LeB4 SO1 - c-myc Lysin

CaMV35S LeB4 MaSp2 - c-myc Glutamin

Abb. 34: Schematische Darstellung der Spinnenseidenkonstrukte mit Transglutaminase-Marken.

Abb. 35: Plasmidkarte pCB301-Kan MaSp1-ELP+Glu bzw.+Lys. Spinnenseiden-Fusionsprotein MaSp1-100xELP mit Lysin- bzw. Glutamin-Marke im Expressionsvektor pCB 301 Kan unter Kontrolle des ubiquitären CaMV-32S-Promotors. Die Dimerisierungsmarke wurde jeweils mittels BamHI-Restriktion in das bestehende Konstrukt eingefügt.

3 Ergebnisse

- 63 -



3 Ergebnisse

- 64 -

3.2.2 Transiente Expression von Spinnenseidenproteinen mit Transglutaminasemarken

Zur Kontrolle wurden die Konstrukte mit Transglutaminasemarken transient exprimiert und

mittels Western blot analysiert (Abb. 29). Alle transgenen Proteine zeigten die erwartete

Größe (1, 2: ca. 120 kDa; 3: ca. 60 kDa, 4, 5: ca. 70 kDa). Die hier gezeigten Konstrukte

wurden anschließend für stabile Transformationen verwendet. Bis zur Ernte der stabil

transformierten Tabakpflanzen (N. tabacum) wurde die transiente Transformation mehrfach

wiederholt, um genügend Proteinmaterial zur Durchführung erster Dimerisierungsversuche

bereitzustellen. Das so gewonnene Material wurde gemäß der etablierten Inverse Transition

Cycling-Methode gereinigt.

Abb. 38: Nachweis von transient exprimierten Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit Transglutaminasemarken mittels Western blot-Analyse. 1: MaSp1-100xELP+Lysinmarke; 2: MaSp1-100xELP+Glutaminmarke; 3: 100xELP +Lysinmarke; 4:MaSp2+Glutaminmarke; 5: SO1+Lysinmarke. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

3.2.3 Stabile Transformation der Spinnenseiden-Fusionsproteine mit Transglutaminase-

marken

Zur weiteren Produktion von Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit Transglutaminasemarken

wurden nach erfolgreicher transienter Erprobung stabile Transformationen in Tabakpflanzen

(Nicotiana tabacum) durchgeführt.

3 Ergebnisse

- 65 -

Abb. 39: Nachweis der Expression verschiedener Spinnenseiden-Fusionsproteine mit Transglutaminase-Marken mittels Western blot-Analyse. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Proben der regenerierten Pflanzen wurden zum frühestmöglichen Zeitpunkt genommen und

im Western blot analysiert (Abb. 39). Zahlreiche das Transgen exprimierende Linien wurden

bestimmt und zu gegebener Zeit geerntet. Weiterführende Reinigungen und

Dimerisierungsversuche der stabil exprimierten Spinnenseiden-Fusionsproteine konnten aus

zeitlichen Gründen nicht durchgeführt werden.

3.2.4 Polymerisierung mittels bakterieller Transglutaminase

Transglutaminasen katalysieren die Bildung kovalenter Bindungen zwischen einem primären

Amin, wie zum Beispiel Lysin, und der Säureamidgruppe von in Proteinen inkorporiertem

3 Ergebnisse

- 66 -

Glutamin. Die Verknüpfung ist insensitiv gegen proteolytischen Abbau und wird bereits als

industrielles Standardverfahren im Bereich der Lebensmitteltechnologie zur Verbesserung der

mechanischen Eigenschaften von Milch- und Fleischprodukten genutzt.

Im Rahmen des Projektes wurden Transglutaminasen von zwei Herstellern (Ajinomoto, N-

Zyme) verwendet. Die Ajinomoto-Transglutaminase ist für die lebensmitteltechnische

Anwendung gedacht, wohingegen die Transglutaminase der Firma N-Zyme als

Laborchemikalie vertrieben wird. Zunächst wurde die enzymatische Aktivität der

Transglutaminase photometrisch gemessen (Tab. 14).

Tab. 14: Photometrischer Nachweis der enzymatischen Aktivität von Transglutaminase.

Probe Konzentration [U/ml] Absorption bei 525nm

Ajinomoto 0,25 0,151

Ajinomoto 0,25 0,197

N-zyme 0,25 0,235

N-zyme 0,25 0,172

-Kontrolle 0 -0,031

-Kontrolle 0 0,010

N-zyme (+1M Cystein) 0,25 0,049

Die Aktivität der Transglutaminase beider Hersteller wurde eindeutig nachgewiesen (Kapitel

2.2.12). Ebenso wurde die kompetitive Inhibition mittels Cystamin erfolgreich durchgeführt.

3 Ergebnisse

- 67 -

Abb. 40: Posttranslationale Polymerisierung von Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit bakterieller Transglutaminase (N-Zyme). 1: 240µl ELP-Lysin+240µl Masp1-ELP-Glutamin+20µl Transglutaminase (0,05 U/µl); 2: 240µl ELP-Lysin+240µl Masp1-ELP-Glutamin+20µl ddH2O; 3: 480µl ELP-Lysin +20µl Transglutaminase (0,05 U/µl); 4: 480µl ELP-Lysin +20µl ddH2O; 5: 480µl Masp1-ELP-Glutamin+20µl Transglutaminase (0,05 U/µl); 6: 480µl Masp1-ELP-Glutamin+20µl ddH2O. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10% PAA).

Die Analyse der ersten erfolgreichen Dimerisierung von 100xELP und MaSp1-100xELP

mittels bakterieller Transglutaminase zeigt die Bildung einer Proteinbande oberhalb von 250

kDa, die nicht bei der Inkubation ohne Transglutaminase bzw. bei der Inkubation ohne

MaSp1-100xELP zu sehen war (Abb. 40). Wider Erwarten zeigte sich diese Bande jedoch

auch bei der Inkubation von MaSp1-100xELP-Glutamin ohne Zugabe des zweiten Monomers

100xELP-Lysin. Dies deutet auf Homodimerisierungen zwischen MaSp1-100xELP-

Glutamin-Monomeren unabhängig von der zweiten Dimerisierungsmarke hin. Um

auszuschließen, dass die Bildung der Dimerbande unabhängig von der Transglutaminase

erfolgt, wurde dieser Ansatz um eine weitere Negativkontrolle erweitert. Dazu wurde neben

Transglutaminase Cystamin als kompetitiver Inhibitor zugegeben (Abb. 41). Auch in diesem

Experiment zeigte sich die gewohnte Bande oberhalb von 250 kDa, wohingegen die

Dimerbande in der Negativkontrolle ohne Transglutaminase kaum sowie im Inhibitionsansatz

nicht sichtbar war. Eine extrem schwache Dimerisierung ist also ohne Inhibition auch ohne

Zugabe von Transglutaminase erkennbar.

+ - + - + -

Glu+Lys Lys Glu

3 Ergebnisse

- 68 -

Abb. 41: Western blot-Analyse der posttranslationalen Polymerisierung von Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit bakterieller Transglutaminase (N-Zyme). 1: ELP-Lysin + Masp1-ELP-Glutamin; 2: ELP-Lysin+Masp1-ELP-Glutamin + Transglutaminase (N-zyme, 2U/ml); 3: ELP-Lysin+Masp1-ELP-Glutamin + Transglutaminase (N-zyme 2U/ml)+1M Cystamin. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (8% PAA).

Bei allen hier durchgeführten Versuchen muss beachtet werden, dass der Elektrotransfer von

derart großen Proteinen im Western blot meist nicht ohne Verluste durchgeführt werden kann.

Es ist daher anzunehmen, dass Verhältnis der Signalstärken im Western blot nicht das

Verhältnis der Monomerkonzentrationen zur Dimerkonzentration wiedergibt.

Die Polymerisierung verschiedener Monomere mit Dimerisierungsmarken lieferte einige

unerwartete Ergebnisse (Abb. 42). Während MaSp1-ELP-Monomere (jeweils mit Glutamin-

bzw. Lysinmarken, Bahn 1 und 2) bei Zugabe von Transglutaminase (Bahn 1) größere Dimere

oberhalb von 250 kDa bildeten, bewirkte die Zugabe von Transglutaminase zu MaSp1-Elp-

Lysin und MaSp2-Glutamin keinerlei Dimerisierung (Bahn 3 und 5). Eine schwache

Dimerbande war im Falle von MaSp1-ELP-Glutamin und ELP-Lysin sichtbar, eine

wesentlich stärkere Bande jedoch im Falle von MaSp1-ELP-Lysin und ELP-Lysin. Diese

Banden befanden sich ebenfalls oberhalb von 250 kDa, obwohl das Monomer ELP-Lysin eine

Größe von lediglich ca. 50 kDa aufweist und damit ein Heterodimer mit MaSp1-ELP bei ca.

150 kDa liegen würde. Zur Überprüfung einer möglichen Homodimerisierung wurden die

Monomere MaSp1-ELP-Glutamin (Bahn 3) und MaSp1-ELP-Lysin (Bahn 6) getrennt mit

Transglutaminase inkubiert. In diesen Fällen war eine diffuse Bande oberhalb von 130 kDa

sichtbar. Diese diffuse Bande war deutlich stärker im Falle von MaSp1-ELP-Lysin. Eine

3 Ergebnisse

- 69 -

mögliche Erklärung für diese unspezifischen Dimerisierungen liefert die Aminosäuresequenz

der Spinnenseiden-Fusionsproteine. Die für die Bildung der kovalenten Bindungen

notwendigen Lysin- und Glutaminreste sind auch außerhalb der Dimerisierungsmarken

vorhanden. Allerdings ist nicht geklärt, inwieweit diese innerhalb der repetitiven Sequenz

gelegenen Aminosäuren zugänglich sind und damit für die Bildung der kovalenten Bindungen

zur Verfügung stehen. Dabei ist zu beachten, dass Glutamin vermehrt in SO1, MaSp1 und

MaSp2 auftritt, wohingegen Lysin lediglich im ER-Retentionssignal aller Fusionsproteine

vorhanden ist. Abgesehen von diesem Lysin enthält 100xELP keine vernetzbare Gruppe. Es

ist also anzunehmen, dass die Lysine zum limitierenden Faktor der Multimerisierungsreaktion

werden.

Abb. 42: Western blot-Analyse der posttranslationalen Polymerisierung von Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit bakterieller Transglutaminase (N-Zyme). 1: MaSp1-ELP-Lysin + Masp1-ELP-Glutamin + Transglutaminase (2U/ml); 2: MaSp1-ELP-Lysin + Masp1-ELP-Glutamin; 3: Masp1-ELP-Glutamin + Transglutaminase (2U/ml); 4: MaSp1-ELP-Lysin + MaSp2-Glutamin + Transglutaminase (2U/ml); 5: MaSp1-ELP-Lysin + MaSp2-Glutamin; 6: MaSp1-ELP-Lysin + Transglutaminase (2U/ml); 7: MaSp1-ELP-Glutamin + ELP-Lysin + Transglutaminase (2U/ml); 8: MaSp1-ELP-Lysin + ELP-Lysin + Transglutaminase (2U/ml). Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit. Die Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (8% PAA).

Weitere Unterschiede zwischen den einzelnen Proben können auch auf Unterschiede in den

Monomerkonzentrationen zurückzuführen sein.

3 Ergebnisse

- 70 -

3.2.5 Transglutaminase-vermittelte Integration von Spinnenseiden-Fusionsproteinen in

Gewebefasern

Neben dem Verspinnen von Spinnenseiden-Fusionsproteinen wurden bereits zahlreiche

weitere Methoden zur Nutzbarmachung ihrer positiven Eigenschaften erprobt, so zum

Beispiel die Herstellung von Folien und die Beschichtung von Gewebekulturplatten. Eine

weitere Anwendung, gerade im Hinblick auf die Transglutaminase-vermittelte Verknüpfung,

ist die Verbindung von Seidenproteinen in Textilfasern, wie zum Beispiel Wolle (Cortez et.

al. 2007). In diesen Experimenten wurde das bei der Seidenproduktion anfallende Protein

Sericin, auch bekannt als Seidenleim, mittels Transglutaminase mit Wollfasern verknüpft. Um

diese Methode mit Spinnenseiden-Fusionsproteinen anzuwenden, wurden gereinigte

Konstrukte mit Transglutaminasemarken in PBS zu Wollfäden gegeben und nach Zugabe von

Transglutaminase 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Fäden

sorgfältig mit PBS ausgewaschen, um nicht verknüpfte Proteine zu entfernen. Die

beschichteten Fäden wurden nach dem Standardprotokoll für Western blot-Analyse behandelt

(Abb. 43).

Abb. 43: Western blot-Analyse von Wollfäden nach Inkubation mit Spinnenseiden-Fusionsproteinen und bakterieller Transglutaminase. 1: Negativkontrolle (PBS); 2: 98µl ELP-Lysin+2µl TGase (1U/ml); 3: 49µl MaSp1-ELP-Glutamin + 49µl ELP-Lysin+2µl TGase (1U/ml); 4: Proben Nr. 3 erneut in PBS ausgespült. Markierung mittels c-myc-Antikörper und Anti-Maus-Antikörper, Detektion mittels ECL-Kit.

3 Ergebnisse

- 71 -

Während in den PBS-Negativkontrollen keinerlei Signal im Western blot sichtbar war,

zeigten sich deutliche Signale in den mit Spinnenseidenproteinen inkubierten Wollfäden.

Dabei war kein Unterschied zwischen den unterschiedlichen Transglutaminasen erkennbar.

Ebenfalls deutliche, wenn auch erheblich schwächere Signale waren bei der Inkubation mit

Spinnenseiden-Fusionsproteinen, ohne Zugabe von Transglutaminase sichtbar. Nach einem

erneuten Waschschritt mit PBS waren nur noch Signale an den Wollfäden sichtbar, die mit

Transglutaminase inkubiert worden waren.

4 Diskussion

- 72 -

4 Diskussion

Die Herstellung von transgenen Proteinen in Pflanzen, insbesondere für medizinische

Anwendungen, wird als kostengünstige Alternative zur Herstellung derartiger Proteine in

transgenen Tieren oder Zellkulturen angesehen (Daniell et. al. 2001). Zahlreiche Produkte

wurden bereits in pflanzlichen Systemen hergestellt und die Liste dieser Produkte wächst

ständig weiter (Übersicht bei Horn et. al. 2004; Ma et. al. 2005). In den USA wurde Anfang

2006 ein von der Firma Dow AgroSciences in Tabakzellkultur hergestellter

veterinärmedizinischer Impfstoff für den Markt zugelassen (Floss et. al. 2007)

Bei der Herstellung von technischen Materialien in Pflanzen wurde bisher zumeist auf bereits

in Pflanzen produzierte Stoffe zurückgegriffen, die in genügend großen Mengen vorliegen.

Ein Beispiel hierfür ist die Gewinnung von technischer Stärke zur Herstellung von Bioplastik

(Übersicht bei Bastioli 2004). Eine Grundvoraussetzung für die Produktion von technischen

Materialien ist die Erhöhung der Produktivität, um einen wirtschaftlich attraktiven

Herstellungs- und damit Verkaufspreis zu erreichen. Dies gilt auch für die Produktion von

Spinnenseidenproteinen.

Die potentiellen Anwendungsgebiete von Spinnenseiden sind, ebenso wie die Eigenschaften

dieser Materialgruppe, sehr weit gefächert. Die Anwendung, die der natürlichen Funktion der

meisten Spinnenfäden am nächsten kommt, ist die Herstellung und Verbesserung technischer

Fasern. Der Markt für heutige Hochleistungsfasern, namentlich Aramide wie Kevlar®,

umfasst eine Produktion von über 30.000 Tonen pro Jahr und wächst jedes Jahr um 5-10%

(10% im Jahr 2007). Bei weiter steigenden Produktionsmengen und steigenden

Rohstoffpreisen ist der Versuch einer Herstellung von hochwertigen technischen Fasern aus

nachwachsenden Rohstoffen ein wirtschaftlich sinnvolles Projekt. Doch die Anwendbarkeit

der Spinnenfasern erstreckt sich darüber hinaus auf zahlreiche weitere Bereiche und wird von

Jahr zu Jahr vielfältiger. Die in vitro-Züchtung von Nervenfasern (Allmeling et. al. 2006),

Verkapselung von Medikamenten (Hermanson et. al. 2007) oder der Bau von Komponenten

in mikroelektromechanischen Systemen (Bai et. al. 2006) wurden in den letzten Jahren mit

Spinnenseidenproteinen realisiert. Durch die weitere Aufklärung der Sequenzen verschiedener

Spinnenseidenproteine und die Evaluierung der Eigenschaften nativer und künstlich erzeugter

Spinnenseidenarten werden die Anwendungsmöglichkeiten in den nächsten Jahren

voraussichtlich stark erweitert.

4 Diskussion

- 73 -

Im letzten Jahr wurden die vollständigen Sequenzen der Tragfadenseidenproteine MaSp1 und

MaSp2 der Spinnenart Latrodectus hesperus (Westliche Schwarze Witwe) veröffentlicht

(Ayoub et. al. 2007). Damit ist die Produktion dieser extrem stabilen Proteine erstmals in der

vollständigen nativen Form möglich, sofern es gelingt, diese hochrepetitiven Proteine mit der

beachtlichen Größe von mehr als 3000 Aminosäuren im Großmaßstab stabil herzustellen.

Demzufolge ist zu erwarten, dass die Herstellungsmethoden von Spinnenseidenproteinen in

den nächsten Jahren ebenfalls weiter verbessert werden. Allein im Jahr 2007 wurden

zahlreiche Patente auf diesem Gebiet eingereicht (Scheibel et. al. 2007; Scheibel 2007;

Johansson et. al. 2007; Lewis und Roth 2007).

Bei gegebener starker Nachfrage nach hochwertigen technischen Materialien muss eine

kostengünstige Produktion in einem ausreichenden Maßstab etabliert werden. Je nach

geplanter Anwendung und Aufbau der experimentell verwendeten Spinnenseidenproteine

werden momentan verschiedene Herstellungsverfahren zur Produktion der notwendigen

Mengen benutzt. Von einer großindustriellen Herstellung sind jedoch alle

Produktionsplattformen noch weit entfernt. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit

verwendete Produktionsplattform, N. tabacum, wurde zur Herstellung von Proteinen im

Labormaßstab und als Modellpflanze zur Bewertung zukünftiger Produktionsplattformen

verwendet. Wie bereits erläutert ist die Nutzung von Spinnen als Produktionsplattform nicht

möglich. Grundsätzlich ist daher zu fragen, inwieweit pflanzliche Expressionssysteme eine

für technische Anwendungen notwendige Produktivität ermöglichen. Das umfasst nicht nur

die Expressionshöhe der transgenen Proteine, sondern auch deren Gewinnung und Reinigung.

Hierzu zählen auch Möglichkeiten zur Lagerung von Rohprodukten sowie die gesamte

Prozessierung. Um diese Fragen zu beantworten, wurden samenspezifische

Expressionssysteme für Spinnenseidenproteine experimentell evaluiert. Hier standen die

Expressionshöhe, die Lagerstabilität sowie die Extraktion und Anreicherung der transgenen

Proteine im Mittelpunkt.

Eine grundsätzliche Schwierigkeit bei der Produktion von Spinnenseidenproteinen ist die

enorme Größe dieser Proteine. Dieses Problem stellt sich insbesondere bei der Produktion in

Bakterienkulturen. Doch selbst in pflanzlichen Systemen wurde die Herstellung von

Spinnenseidenproteinen nativer Größe noch nicht realisiert. Mögliche Lösungen dieser

Probleme sind verschiedene Methoden zur posttranslationalen Dimerisierung, die in der

vorliegenden Arbeit angewendet wurden. Auf diese Weise werden zu ausgedehnte

hochrepetitive Sequenzen vermieden, die zu genetischer Instabilität in Agrobakterien führen

4 Diskussion

- 74 -

können. Darüber hinaus sollte geprüft werden, ob Grundbausteine (Module) aus Pflanzen

gewonnen und erst ausserhalb der Pflanze zu größeren variablen Endprodukten

zusammengefügt werden können.

4.1 Sind Tabaksamen als Produktionsplattform für Spinnenseidenproteine geeignet?

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf Spinnenseidenkonstrukte erstmals erfolgreich in

Tabaksamen exprimiert (Tab. 7, Abb. 12-16). Neben den bereits getesteten Konstrukten

LeB4-2xSO1 und LeB4-SO1-ELP (Scheller und Conrad, unveröffentlicht) wurden drei

Konstrukte unter der Kontrolle des USP-Promotors verwendet. Diese Konstrukte wurden

mittels eines transienten Verfahrens zur Expression von samenspezifischen Konstrukten

getestet, das im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde (Abb. 11). Als Ausgangsverfahren

diente die transiente Expression mittels Agrobacterium tumefaciens (Janssen und Gardner

1990). Mittels dieses Verfahrens ist der problemlose Test von ubiquitär exprimierten

Konstrukten in Tabakblättern möglich (Vaquero et. al. 1999). Urch die Cotransformation mit

dem Transkriptionsfaktor FUSCA3 ist es nun möglich, die Expression von samenspezifischen

Konstrukten innerhalb von 14 Tagen zu überprüfen. Im Gegensatz dazu war es bisher

lediglich möglich, die entsprechenden DNS-Sequenzen zu überprüfen und anschließend

mehrere Monate bis zur Samenernte von stabil transformierten Pflanzen abzuwarten, um dann

die transgenen Proteine nachzuweisen. Die hier vorgestellte schnelle und unkomplizierte

Überprüfung neuer Konstrukte wird bei zukünftigen experimentellen Ansätzen zur

samenspezifischen Expression vermehrt Verwendung finden. Nachdem die USP-Konstrukte

erfolgreich transient exprimiert werden konnten, wurden alle genannten Konstrukte stabil in

Nicotiana tabacum transformiert. Nach der Samenernte und der Selektion positiver Linien

wurden jeweils zwei Linien vermehrt, um ausreichende Samenmengen für die

Maßstabsvergrößerung der Reinigungsmethode zu erzeugen. Bedauerlicherweise konnten

aufgrund von experimentellen Problemen lediglich die Linien mit dem Transgen SO1-

100xELP unter Kontrolle des LeB4-Promotors in ausreichenden Mengen geerntet werden.

Das transgene Protein SO1-100xELP konnte bis zur T2-Generation mittels Western blot

nachgewiesen werden. Weiterführende Nachkommensuntersuchungen wurden bisher nicht

durchgeführt. Die im Verlauf der Reinigungsexperimente verwendeten stark exprimierenden

Samenlinien unter Kontrolle des LeB4-Promotors wiesen eine Menge von 4µg SO1-100xELP

pro Gramm Tabaksamen auf (Tab. 11). Von diesen Samen standen ca. 250 g für die

4 Diskussion

- 75 -

abschließenden Experimente zur Verfügung, was theoretisch einer Gesamtmenge von 1mg

SO1-100xELP entspricht. Im Vergleich dazu konnten in früheren Experimenten, z. B. in

Tabakblättern, deutlich höhere Mengen von bis zu 80mg Protein pro Kilogramm Blattmasse

(Frischgewicht) erreicht werden (Scheller et. al. 2004). Selbst bei einer Produktion von 1170

kg Samen pro Hektar, wie sie von einigen Tabaksorten erreicht wird (Patel und Parmar 1997),

würde sich die Produktionsmenge an SO1-100xELP in Tabaksamen auf etwa 4 g pro Hektar

belaufen, was in keiner Weise für eine wirtschaftliche Produktion ausreicht. Allerdings war

die Anzahl exprimierender Linien zu gering, um das gesamte Potential dieses Konstruktes in

Tabaksamen abschätzen zu können. Eine Erhöhung der Produktionsmenge ist unbedingt

notwendig, um eine Produktion von Spinnenseidenproteinen unter wirtschaftlichen

Gesichtspunkten möglich zu machen.

Der in dieser Arbeit verwendete LeB4-Promotor wurde bereits bei der Expression von scFV-

ELP-Fusionen in Tabaksamen benutzt (Scheller et. al. 2006). Dabei konnten Produktmengen

bis zu 25% TSP erreicht werden. Die hier erreichten Mengen (Tab. 11) entsprechen etwa

0,013% TSP und liegen damit deutlich unter diesem Wert, was auf die Größe und die

repetitive Struktur des Spinnenseiden-Fusionsproteins zurückzuführen sein kann. Andererseits

wurden bei der Expression von Spinnenseiden-Fusionsproteinen in Tabakblättern unter der

Kontrolle des ubiquitären CaMV 35S-Promotors maximale Proteinmengen von 4% TSP im

Western blot nachgewiesen (Scheller et. al. 2004). Dies liegt ebenfalls deutlich über den im

Samen erreichten Mengen. Eine Instabilität des Fusionsproteins ist auszuschließen, da zu

keiner Zeit im Western blot Abbaubanden erkennbar waren. Diesbezüglich ist insbesondere

der Langzeitversuch zu beachten (Abb. 20 und 21). Es stellt sich die Frage, ob eventuell

Silencing-Effekte für die niedrige Proteinkonzentration verantwortlich sind. Eine Erhöhung

der Expression in Tabaksamen könnte durch eine Optimierung des Promotors (Jaeger et. al.

2002) sowie durch die Angleichung der DNS-Sequenz des Spinnenseidenkonstruktes an die

Codonnutzung in Tabak erfolgen (Übersicht bei Gustafsson et. al. 2004). Dennoch ist es

fraglich, ob im Produktionssystem Tabaksamen eine ausreichende Proteinproduktion etabliert

werden kann. Daher ist der Wechsel des Expressionssystems notwendig, um die

wirtschaftlich sinnvolle Produktion von Spinnenseidenproteinen zu erreichen. So wäre die

Transformation einer Pflanze mit einem höheren Proteingehalt und generell größeren Samen,

also höherem Ernteertrag als Tabaksamen ein vielversprechender Ansatz. Erbsen oder

Sojabohnen übertreffen mit einer durchschnittlichen Jahresernte von ca. 2500 kg pro Hektar

4 Diskussion

- 76 -

und einem Proteingehalt von bis zu 25% bzw. über 40% Tabak mit einer maximalen

Samenernte von 1170 kg und einem Proteingehalt von etwa 10% bei Weitem (Tab. 15).

Tab. 15: Betrachtung der Ausbeute an Samen und Samenprotein verschiedener

Kulturpflanzen (Stoger et. al. 2005).

Spezies Durchschnittliche

jährliche Ernte [kg ha-1]

Protein-

anteil (%)

Mais (Zea mays) 8670 10

Reis (Oryza sativa) 7270 8

Gerste (Hordeum vulgare) 3100 13

Weizen (Triticum aestivium) 2700 12

Soja (Glycine max) 2600* >40*

Erbse (Pisum sativum) 2500 (max. 4000*) 20-25*

Raps (Brassica napus) 1500 22

Färberdistel (Carthamnus tinctorius) 1500 25

Leindotter (Camelina sativa) 1100 25 *: Angaben über Ernte und Proteinanteil von Soja und Erbse aus De Kathen und Pickardt 2005

Ein Wechsel des Expressionssystems für zukünftige Experimente zu diesen Pflanzen ist also

durchaus empfehlenswert. Für alle weiteren Expressionsversuche ist die Langzeitstabilität der

Spinnenseidenproteine in Tabaksamen zu bewerten, da diese Produktionsplattform als

Modellsystem dienen kann. Die Langzeitstabilität der Fusionsproteine im gewählten

Expressionssystem ist von entscheidender Bedeutung, um eine Lagerung nach der Ernte bis

zur Reinigung bzw. einen kostengünstigen Transport von der Anbaufläche zur

Reinigungsanlage zu ermöglichen. Im Falle der Expression von Spinnenseidenproteinen in

Tabakblättern erfolgt die Lagerung bei -80°C, was die Anwendbarkeit der

Produktionsplattform Tabakblatt an vorhandene Tiefkühlkapazitäten bindet. Kartoffeln

wurden ebenfalls als Produktionsplattform getestet. Dabei traten sowohl bei gekühlter

Lagerung der Kartoffeln (10°C) als auch bei der anschließenden Reinigung Abbauvorgänge

auf, die zu starken Verlusten des exprimierten Fusionsproteins bis hin zum vollständigen

Abbau führten. Dieser Abbau begann bereits vor der Ernte in den noch im Boden befindlichen

Knollen (C. Münnich und U. Conrad, unpublizierte Daten). Das Produktionssystem

Tabaksamen wurde als vielversprechend angesehen, da bereits in früheren Arbeiten die

4 Diskussion

- 77 -

Langzeitstabilität von Einzelketten-Antikörperfragmenten (scFv) in Tabaksamen

nachgewiesen werden konnte (Scheller et. al. 2006). Die starken Unterschiede der Stabilität

bei unterschiedlichen Proteinen im selben Expressionssystem haben sich allerdings bereits im

Falle der Produktion in der Kartoffelknolle gezeigt. Während bei der Produktion von scFv-

Antikörpern in Kartoffelknollen nach 1,5 Jahren Lagerung noch 50% der ursprünglichen

Proteinmenge vorhanden waren und problemlos gereinigt werden konnten (Artsaenko et. al.

1998), wurden Spinnenseidenproteine, wie bereits zuvor erwähnt, nahezu vollständig

abgebaut. Im Gegensatz dazu blieben die Spinnenseidenproteine in Tabaksamen auch über

lange Zeiträume (1 Jahr) stabil. Darüber hinaus waren keinerlei Spuren von Abbauprozessen

sichtbar. Damit erfüllt die Produktion von Spinnenseidenproteinen in Samen ein

Hauptkriterium als wirtschaftlich interessante Produktionsplattform.

Abschließend sind die Reinigung aus Samen und die dabei erzielte Proteinausbeute zu

bewerten. Bei der Herstellung von technischen Materialien sind die Anforderungen an die

Reinheit des Rohstoffes weniger streng als bei pharmazeutischen Produkten, aber trotzdem ist

der Aufschluss der Samen und die Entfernung von Kontaminationen möglichst ohne

Produktverluste selbst bei geeigneten Proteinmengen im Samen von entscheidender

Bedeutung. Bei einem zu hohen Fremdstoffanteil können eine Verschlechterung der positiven

Eigenschaften des Spinnenseidenproteins und eine höhere Variation der Produktqualität

eintreten, was eine industrielle Verwertung unmöglich machen würde.

Die bereits vielfach erfolgreich angewandte ITC-Methode konnte auch für die Reinigung von

Spinnenseiden-Fusionsproteinen aus Samen verwendet werden. Allerdings war die

Anpassung dieser Methode an den hohen Fettgehalt der Samen notwendig. Nachdem dieses

verfahrenstechnische Problem mittels zweier zusätzlicher Filtrationsschritte gelöst werden

konnte, wurde die Menge an Reinigungsgut vom Kleinstmaßstab (0,06 g Tabaksamen) auf

den maximalen Labormaßstab (bis zu 50 g Tabaksamen) erhöht. Kontaminationen des

transgenen Proteins mit Samenproteinen konnten weder mittels Silber- noch mit

Coomassiefärbung nachgewiesen werden (Abb. 27A, 28A), was den Erfolg des angewandten

Reinigungsverfahrens verdeutlicht. Trotz der geringen Proteinkonzentration und der bereits

erwähnten zusätzlichen Verfahrensschritte zur Abtrennung von Fetten konnte eine

Proteinausbeute von über 40% bezogen auf den Rohextrakt erreicht werden (Kap. 3.1.5.3).

Zwar können mittels chromatographischer Methoden (Übersicht bei Müller 2005) oder

4 Diskussion

- 78 -

Adsorptionsverfahren teilweise durchaus höhere Ausbeuten erreicht werden (Tab. 16), jedoch

verursachen dieses Verfahren wesentlich höhere Kosten als die Inverse Transition Cycling-

Methode.

Tab. 16: Vergleich von verschiedenen Reinigungsverfahren mittels Adsorption an

magnetische Partikel (variiert aus Franzreb et. al. 2006) mit der ITC-Reinigung

von Spinneseiden-Fusionsproteinen aus Tabaksamen

Reinigungsgut Protein-

ausbeute

(%)

Referenz

Fv-Antikörperfragmente aus geklärtem E.

coli-Lysat

53 Zulqarnain 2000

L1 Hüllprotein aus E. coli-Lysat (mit

Spermin)

72 Heeboll-Nielsen et. al. 2003

His-eGFP aus E. coli-Lysat 61 Ebner 2006



Lactatdehydrogenase aus Hefehomogenat 44 Zulqarnain 2000

Malatdehydrogenase aus Hefehomogenat 32 Zulqarnain 2000

Lactoperoxidase aus hydrolisierter Molke 90 Heebøll-Nielsen et. al. 2004b

Trypsin aus hydrolisierter Molke 75 Heebøll-Nielsen 2003

Superoxiddismutase aus hydrolisierter Molke 79 Meyer et. al. 2005

Lactoferrin aus hydrolisierter Molke 47 Meyer 2004

Trypsin aus entfetteter Molke 34 Hubbuch 2001

Trypsin aus Schweinepankreatin 62 Hubbuch und Thomas 2002

Maus-Ig2b-Antikörper 75 Holschuh und Schwammle 2005

Lektin (ConA) aus zerkleinerten Jackbohnen

(Canavalia ensiformis)

69 Heebøll-Nielsen et. al. 2004a

Spinnenseiden-Fusionsproteine (mittels ITC)

aus Tabaksamen (Nicotiana tabacum)*

44

*aus der vorliegenden Arbeit

4 Diskussion

- 79 -

Dieser wirtschaftlich relevante Unterschied wird bei chromatographischen Systemen durch

die Kosten des Adsorbens bedingt. Ist die Aufnahmekapazität des Adsorbens überschritten,

treten Verluste auf, da das transgene Protein nicht mehr gebunden werden kann. Daher muss

eine genügend große Menge an Adsorbens zur Verfügung stehen. Im Gegensatz dazu kann

die ITC-Methode in nahezu beliebigen Durchsatzmengen durchgeführt werden und es wird

lediglich NaCl in größeren Mengen benötigt.

Einzig die Pelletierung des ELP-Fusionsproteins mittels Zentrifugation stellt im industriellen

Maßstab einen limitierenden Schritt dar und sollte daher, wenn möglich, durch andere

Trennungsverfahren ersetzt oder ergänzt werden. Bisherige Versuche zur Abtrennung des

ELP-Fusionsproteins mittels Filtration im Labormaßstab scheiterten an den auftretenden

starken Proteinverlusten, die wahrscheinlich auf eine irreversible Bindung des ausgefällten

Fusionsproteins an die Filtermembran zurückzuführen sind (Kap. 3.1.5.2). Das im Rohextrakt

mittels Western blot nachweisbare Fusionsprotein wurde nach der Ausfällung über die

Filtermembran vom Durchfluss getrennt, was durch die deutlich schwächere Proteinbande in

der Durchflussprobe nachgewiesen wurde (Abb. 30 und 31). Anschließend konnte das Protein

jedoch nur in extrem geringen Mengen wieder in Lösung gebracht werden. Außerdem wurden

bei höheren Konzentrationen im Rohextrakt stärkere Proteinbanden im Durchfluss und damit

Proteinverluste gezeigt (Abb. 29). Im Gegensatz zu unseren Experimenten gelang die

Abtrennung eines Thioredoxin-ELP-Fusionproteins aus einer Bakteriensuspension mit diesem

Verfahren problemlos (Ge et. al. 2006). Es ist daher anzunehmen, dass entweder die Anzahl

der ELP-Pentapeptide oder der Fusionspartner entscheidend für die erneute Lösung des

Fusionsproteins von der Membranoberfläche sind. Die Filtration zur Abtrennung der im

Samenrohextrakt vorhandenen Fette erfolgte vor der Fällung des Fusionsproteins, wodurch

keine nennenswerten Verluste auftraten (Abb.26, 27B, 28B). Überdies wurden hierbei Filter

mit größeren Poren verwendet. Die ausschließlich filterbasierte Reinigung stellt also keine

Alternative zur gut funktionierenden ITC-Methode mittels Zentrifugation bei der Reinigung

von Spinnenseiden-ELP-Fusionsproteinen dar.

Tabaksamen sind als Produktionssystem für Spinnenseiden-Fusionsproteine im Labormaßstab

durchaus geeignet, insbesondere durch die unkomplizierte Lagerung. Für Produktionen in

größeren Maßstäben sind die bisher erreichten Mengen an Spinnenseidenproteinen in

Tabaksamen nicht ausreichend.

4 Diskussion

- 80 -

4.2 Können Spinnenseiden-Fusionsproteine posttranslational verknüpft werden?

Alle bisher identifizierten Spinnenseidenproteine weisen eine enorme Größe und eine

hochrepetitive Struktur auf (Prashad et. al. 1972; Hayashi und Lewis 1998; Rising et. al.

2005; Hu et. al. 2006a; Zhao et. al. 2006; Higgins et. al. 2007; Tian und Lewis 2005). Ein

Beispiel dafür sind die Tragfadenproteine MaSp1 und MaSp2 von Latrodectus hesperus,

deren Sequenzen inzwischen vollständig bekannt sind (Ayoub et. al. 2007). MaSp1 hat eine

Größe von 9390 bp und kodiert für 3129 Aminosäuren. Das MaSp2-Gen umfasst 11340 bp

und kodiert für 3779 Aminosäuren. Aufgrund dieser Eigenschaften stellt die Produktion von

vollständigen nativen Spinnenseidenproteinen immer noch ein enormes Problem dar. Eine

alternative Strategie zur Expression kompletter Spinnenseidenproteine natürlicher Größe im

jeweiligen Expressionssystem ist die Herstellung verschiedener Proteinmonomere und deren

posttranslationale Verknüpfung. Diese Strategie bietet nicht nur den Vorteil einer

problemlosen Erhöhung der Proteingröße, sondern stellt ebenfalls eine Erweiterung des

Produktspektrums dar, denn durch die spätere Dimerisierung können weitere funktionelle

Gruppen an Spinnenseidenproteine angefügt werden und so die Basis für neue

Verbundwerkstoffe bilden (Kap. 4.2.2). Die Strategie der Verbindung von funktionellen

Gruppen mit Strukturelementen aus Spinnenseidenproteinen wurde bereits bei der modularen

Konstruktion synthetischer Spinnenseidenproteine verfolgt (Scheibel 2004). Allerdings wurde

die Verbindung der funktionellen Gruppen und der Strukturelemente bereits auf der Ebene der

DNS-Konstrukte vorgenommen. Eine spätere in vitro Verknüpfung hingegen erlaubt die

flexible Anpassung der Konstrukte, da fertige Proteinmonomere gereinigt und gelagert

werden und zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt mit Proteinen aus neuen Konstrukten

kombiniert werden können. Eine Methode zur posttranslationalen Verknüpfung von Proteinen

ist die Inkubation mit bakterieller Transglutaminase. Die Verwendung von Transglutaminase

zur unspezifischen Verknüpfung von Proteinen, namentlich in der Lebensmittelindustrie, ist

weit verbreitet (Muguruma et. al. 1990; Takagaki et. al. 1991; DeJong und Koppelman 2002;

Tseng und Lai 2002; Malandain 2005). Über die gezielte Heterodimerisierung von Proteinen

mittels Transglutaminase wurde erst vor kurzer Zeit berichtet (Tanaka et. al. 2004).

Die Polymerisierung von Spinnenseiden-Fusionsproteinen mittels Transglutaminase wurde

erstmals im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich durchgeführt. Auf diese Weise konnten

rekombinante Proteine mit einer Größe von über 200 kDa erzeugt werden (Abb. 40 und 41).

Spinnenseidenproteine dieser Größe konnten bisher nicht in transgenen Systemen erzeugt

4 Diskussion

- 81 -

werden. Allerdings ist zu beachten, dass die Polymerbildung nicht vollständig war, sondern

ein Großteil der Proteine weiterhin in Monomerform vorlag. Um die Verknüpfung der

Monomere weiter zu verbessern, könnte die Zugabe der Transglutaminase sukzessiv erfolgen

und gleichzeitig die Inkubationszeit verlängert werden. Darüber hinaus ist die Qualität der

Transglutaminase von entscheidender Bedeutung. Die zunächst verwendete Transglutaminase

in Lebensmittelqualität (Ajinomoto) konnte aufgrund von Verunreinigungen nicht verwendet

werden. Erst die für den Laborbedarf hergestellte Transglutaminase (N-Zyme) war für die

Polymerisierung der Spinnenseiden-Fusionsproteine einsetzbar. Während dieser Experimente

wurden schwache Polymerbanden bereits vereinzelt in Rohextrakten aus Tabakblättern

beobachtet. Eine Erklärung für diese Reaktion könnte, neben unspezifischen Bindungen der

Monomere, die Anwesenheit von Transglutaminasen in pflanzlichem Gewebe sein. Dies

wurde bereits im Gewebe des Blütenkelches von Nicotiana tabacum nachgewiesen (Serafini-

Fracassini et. al. 2002). Allerdings ist diese Transglutaminaseaktivität nur unwesentlich

stärker als in der Negativkontrolle. In zukünftigen Experimenten werden unter anderem die

Reinigung und Charakterisierung der Polymere sowie der vollständige Umsatz der Monomere

zu realisieren sein.

Zwar ist die Verspinnung von Spinnenseidenproteinen zu Fasern und Fäden das langfristige

Ziel zur Nutzung dieses vielseitigen Materials, doch wie aus den vorangegangenen

Ausführungen hervorgeht, sind noch einige technische Schwierigkeiten zu überwinden. Eine

Möglichkeit, die bereits herstellbaren Spinnenseidenproteine technisch zu nutzen, ist unter

anderem die Anwendung in mikroelektromechanischen Systemen, da dort nur winzige

Mengen des Proteins benötigt werden und das Verspinnen zu Fasern nicht notwendig ist (Bai

et. al. 2006). In bisherigen Tests wurde eine selbsttragende Struktur, eine sogenannte

Mikrobrücke, aus Spinnenseidenproteinen erstellt und die mechanischen Eigenschaften

ermittelt. Obwohl die maximale Belastbarkeit und Elastizität der verwendeten Tragfadenseide

aus N. clavipes wegen der Seidengewinnung durch Melken der Spinnen und des

anschließenden Lösens der Proteine in 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-propanol deutlich reduziert

war, konnte die selbsttragende Brücke zwei- bis zehnmal höheren Belastungen standhalten als

alle bisher für derartige Konstrukte verwendeten Biopolymere, wie z.B. Hydrogele. Eine

weitere Anwendungsmöglichkeit ist die hier vorgestellte Einbindung von

Spinnenseidenproteinen in Wollfäden. Wie bereits erwähnt wird Transglutaminase zur

Verknüpfung von zahlreichen Proteinen eingesetzt. Eine Anwendung, die erst vor kurzem

beschrieben wurde, ist die Verbesserung der Materialeigenschaften von Wolle (Cortez et. al.

4 Diskussion

- 82 -

2004; Cortez et. al. 2005). Diese Behandlung führte zu einem Zuwachs der mechanischen

Belastbarkeit der Wollfasern. Eine interessante Variante dieses Verfahrens ist die

Transglutaminase-vermittelte Einbindung von Sericin in Wollfasern (Cortez et. al. 2007).

Sericin ist auch bekannt als Seidenleim und fällt als Abfallprodukt bei der Gewinnung von

Seidenfäden aus Bombyx mori an. Durch die Behandlung mit Transglutaminase wurde

Seidenleim sowohl an der Oberfläche als auch in den tieferen Schichten der Wollfaser

gebunden. Die Eigenschaften der behandelten Wollfasern entsprachen im Wesentlichen den

Eigenschaften der nur mit Transglutaminase behandelten Fasern. Allerdings war die

mechanische Belastbarkeit weiter erhöht und die Fasern wiesen eine weichere Oberfläche auf.

Aufbauend auf diesen Experimenten konnten wir die stabile Einbindung von Spinnenseiden-

Fusionsproteinen und ELP-Konstrukten in Wollfasern mittels Western blot-Analyse

demonstrieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die mit Transglutaminase inkubierten

Fusionsproteine auch bei mehrmaliger intensiver Waschung nicht aus den Wollfasern gelöst

werden konnten. Im Gegensatz dazu wurden nicht verknüpfte Fusionsproteine einfach

ausgespült Abb.43). In zukünftigen Experimenten werden die Materialeigenschaften der

veränderten Wollfasern und damit der potentielle Nutzen dieses neuen Materials untersucht

und bewertet werden. In den bereits durchgeführten Experimenten wurde die

posttranslationale Verknüpfung der Spinnenseiden-Fusionsproteine eindeutig gezeigt.

Obwohl weitere Verbesserungen der Expression von Spinnenseiden-Fusionsproteinen in

Tabaksamen denkbar sind, ist für eine großtechnische Herstellung von

Spinnenseidenproteinen in Pflanzen eine alternative Expressionsplattform zu wählen, da die

Menge des transgenen Proteins im Tabaksamen um ein Vielfaches zu niedrig ist.

Allerdings wird durch die Ergebnisse der Versuche zur Langzeitstabilität von Spinnenseiden-

Fusionsproteinen in Tabaksamen deutlich, dass die weitere Verwendung von Samen als

Expressionssystem durchaus Vorteile bietet. Ebenfalls für die weitere Verwendung von

Samen spricht die Tatsache, dass die Inverse Transition Cycling-Methode zur Reinigung von

ELP-Fusionsproteinen an die Reinigung aus Samen und insbesondere an den hohen Fettgehalt

des Rohextraktes angepasst werden konnte. Damit steht für die Reinigung aus Samen eine

effektive Methode für Samenmengen bis zu 50 g zur Verfügung. Diese Reinigungsmethode

verläuft effektiver bei zunehmender Konzentration des ELP-Fusionsproteins (Meyer und

Chilkoti 2002), was eine höhere Ausbeute bei Samen mit einer höheren Produktion des

transgenen Proteins bedeuten könnte.

4 Diskussion

- 83 -

Die Versuche zur ausschließlich filterbasierten Reinigung, die bei der Reinigung aus

Bakteriensuspensionen erfolgreich eingesetzt wird, konnten bisher nicht mit

Spinnenseidenproteinen repliziert werden. Die auftretenden Proteinverluste nach der

Abtrennung des ausgefällten Fusionsproteins aus dem Rohextrakt sind höchstwahrscheinlich

auf irreversible Bindungen an die Filtermembran zurückzuführen. Die Verwendung anderer

Filtermaterialien könnte dieses Problem lösen. Damit könnte die bisher notwendige

Zentrifugation der Proteinproben zur Pelletierung des gefällten Spinnenseiden-

Fusionsproteins unnötig werden.

Mittels des Modellsystems Tabaksamen konnte das Potential von Samen als Lagersystem für

Spinnenseiden-Fusionsproteine erfolgreich gezeigt werden. Allerdings ist Tabak selbst nicht

als technische Produktionsplattform geeignet. Stattdessen sollte eine Pflanze mit einem hohen

Proteinanteil im Samen verwendet werden. Auf diese Weise könnten die Vorteile einer hohen

Produktionsrate mit der hervorragenden Lagerstabilität kombiniert werden. Dann bedarf es

nur minimaler Anpassungen des etablierten Reinigungsverfahrens an die neue Pflanze, um

das Expressionssystem zu einer vollständigen Produktionsplattform zu machen.

5 Zusammenfassung

- 84 -

5 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde geprüft, ob Tabaksamen als Produktionsplattform für

Spinnenseiden-Fusionsproteine geeignet sind. Darüber hinaus wurden neue

Spinnenseidenkonstrukte zur posttranslationalen Modifikation mittels bakterieller

Transglutaminase erzeugt. Im Folgenden werden die Ergebnisse der Arbeit kurz

zusammengefasst.

1. Verschiedene Spinnenseidenproteine, basierend auf dem semisynthetischen Protein SO1,

wurden erstmalig erfolgreich in Tabaksamen unter Kontrolle des LeB4-bzw. USP-

Promotors exprimiert. Das Spinnenseiden-Fusionsprotein SO1-100xELP unter Kontrolle

des LeB4-Promotors wurde weiter vermehrt und konnte bis zur T2-Generation

nachgewiesen werden. Die Gesamtmenge an Protein pro Samen blieb sowohl deutlich

unter den bisher erreichten Mengen an Spinnenseidenproteinen in Tabakblättern als auch

unter den Mengen an Einzelkettenantikörper-ELP-Fusionen in Tabaksamen.

2. Die Expression von samenspezifisch exprimierten Konstrukten in Tabakblättern konnte

durch Cotransformation mit dem Transkriptionsfaktor FUSCA3 induziert werden. Damit

steht ein schnelles und effektives Testverfahren für samenspezifisch exprimierte

Konstrukte zur Verfügung.

3. Trotz der niedrigen Konzentration des transgenen Proteins konnte bei der Reinigung aus

Tabaksamen mittels der durch Filtrationsschritte erweiterten Inverse Transition Cycling-

Methode eine Ausbeute von über 40% erreicht werden. Erste Versuche zur ausschließlich

filterbasierten Reinigung von ELP-Fusionproteinen lieferten kein befriedigendes

Ergebnis, da ein Großteil des transgenen Proteins nach der salzinduzierten Fällung nicht

wieder von der Filtermembran gelöst werden konnte und dadurch starke Verluste

auftraten.

4. Das Spinnenseiden-Fusionsprotein SO1-100xELP blieb bei Raumtemperatur in

Tabaksamen über den Zeitraum von einem Jahr stabil. Es konnten weder Mengenverluste

5 Zusammenfassung

- 85 -

noch Abbaubanden im Western blot nachgewiesen werden. Dies verdeutlicht das Potential

von Samen als Produktionssystem für Spinnenseiden-Fusionsproteine.

5. ELP-Fusionskonstrukte mit Dimerisierungsmarken (Glutamin-bzw. Lysinmarke) wurden

erzeugt und sowohl transient als auch stabil in Tabakblättern exprimiert. Die gereinigten

Fusionsproteine ermöglichten die Transglutaminase-vermittelte Herstellung von

transgenen Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit einer bisher unerreichten Größe von über

200 kDa. Darüber hinaus verspricht diese Methode die Herstellung von neuartigen

Verbundstoffen mit interessanten Eigenschaften. So wurden Spinnenseiden-

Fusionsproteine mittels Transglutaminase in Wollfasern stabil eingefügt. Allerdings

konnte bisher kein vollständiger Umsatz der Monomere zum Polymer erreicht werden,

was das Ziel weiterer Versuche sein wird.

6 Abbildungsverzeichnis

- 86 -


Abb. 1: Vereinfachte Darstellung von Aranaeus diadematus mit hervorgehobenen Netzdrüsen

und der Funktion der zugehörigen Spinnenseiden (variiert aus Vollrath 2000);......- 2 -

Abb. 2: Vergleich der Ensemblewiederholungen von MaSp1-Proteinen aus verschiedenen

Spinnenspezies, bzw. ADF-2 aus Araneus diadematus (Gatesy et. al. 2001); .......- 4 -

Abb. 3:Schematischer Aufbau des Flag-Proteins mit besonderer Betrachtung der

charakteristischen Ensemblewiederholungen (Hayashi und Lewis 2000); .............- 4 -

Abb. 4: Halterung zur Gewinnung von Spinnenseide (Floericke 1919); ...............................- 9 -

Abb. 5: Erweiterte Halterung mit verbesserter Haspel (Floericke 1919);..............................- 9 -

Abb. 6: Schematische Darstellung der Spinnenseidenkonstrukte mit und ohne ELP;.........- 32 -

Abb. 7: Plasmidkarte SO1-100xELP im Konstruktionsvektor pRTRa 7/3 unter Kontrolle des

samenspezifischen Promotors LeB4; .....................................................................- 33 -

Abb. 8: Plasmidkarte SO1-100xELP im Transformationsvektor pCB 301 Kanr unter Kontrolle

des samenspezifischen LeB4-Promotors;................................................................- 34 -

Abb. 9: Western blot-Analyse von transient exprimierten Proteinen aus Tabakblättern;....- 37 -

Abb. 10: Nachweis transgener Linien LeB4 SO1-100xELP der T0-Generation mittels

Western blot-Analyse;........................................................................................- 43 -

Abb. 11: Nachweis transgener Linien LeB4 SO1-100xELP der T1-Generation mittels Western

blot-Analyse; .........................................................................................................- 44 -

Abb. 12: Nachweis transgener Linien LeB4 SO1-100xELP der T2-Generation mittels Western

blot-Analyse (Linie 18/1 36-65; je 20µg TSP pro Probe); ....................................- 45 -

Abb. 13: :Nachweis der transgenen Linien LeB4 SO1-100xELP der T2-Generation mittels Dot

blot-Analyse (Linien 18/1 2.Aussaat); .................................................................- 46 -

Abb. 14: Western blot Analyse von Samenproben der Linie SO1-ELP 18/3 zeigt Stabilität der

Spinnenseidenproteine nach 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 Monaten. ..........................- 47 -

Abb. 15: Western blot Analyse von Samenproben der Linie SO1-ELP 18/9 zeigt Stabilität der

Spinnenseidenproteine nach 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 Monaten. ..........................- 48 -

Abb. 16: Analyse der Filterreinigung des Spinnenseiden-Fusionsproteins SO1-100xELP

mittels Western blot und Ponceaufärbung;.........................................................- 56 -

Abb. 17: Western blot-Analyse der Filterreinigung von SO1-100xELP mit erhöhter

Inkubationszeit (10 min); ..................................................................................- 57 -


- 87 -

Abb. 18: Western blot-Analyse der Filterreinigung von SO1-100xELP mit erhöhter

Inkubationstemperatur (40°C) und -zeit (10 min); ...........................................- 57 -

Abb. 19: Optimierung der Reinigung aus Tabaksamen (Salzkonzentration); .....................- 49 -

Abb. 20: Western blot-Analyse der Reinigungsoptimierung von SO1-ELP aus Tabaksamen

im Labormaßstab (0,06g) (Temperatur1); ...........................................................- 50 -

Abb. 21: Western blot-Analyse der Reinigungsoptimierung von SO1-ELP aus Tabaksamen

im Labormaßstab (0,06g) (Temperatur2); ...........................................................- 51 -

Abb. 22: Western blot-Analyse der Reinigung von SO1-100xELP aus Tabaksamen im

Labormaßstab (0,06g);........................................................................................- 51 -

Abb. 23: Western blot-Analyse der maßstabsvergrößerten Reinigung von SO1-ELP aus

Tabaksamen (50g) mit zusätzlichem Filterschritt; .............................................- 52 -

Abb. 24: Analyse der maßstabsvergrößerten Reinigung (Inverse Transition Cycling) von

SO1-100xELP aus Tabaksamen (50g) mittels Coomassiefärbung (A) und Western-

blot (B); ...............................................................................................................- 53 -

Abb. 25: Analyse der modifizierten Reinigung von SO1-ELP aus Tabaksamen (50g)mittels

Silberfärbung (A) und Western blot (B); .............................................................- 54 -

Abb. 26: Vergleich von gereinigtem SO1-100xELP aus Tabaksamen der Linien 18/1 (zwei

Reinigungsansätze) und 18/7 mit So1-100xELP-Standard (gereinigt aus

Tabakblättern) mittels Western blot-Analyse;.....................................................- 58 -

Abb. 27: Vergleich von SO1-100xELP im Rohextrakt und gereinigtem SO1-100xELP aus

Tabaksamen der Linie 18/1 mit So1-100xELP-Standard (gereinigt aus

Tabakblättern) mittels Western blot-Analyse;.....................................................- 60 -

Abb. 28: Schematische Darstellung der Spinnenseidenkonstrukte mit Transglutaminase-

Marken................................................................................................................- 62 -

Abb. 29: Nachweis von transient exprimierten Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit

Transglutaminasemarken mittels Western blot-Analyse; ................................- 64 -

Abb. 30: Posttranslationale Polymerisierung von Spinnenseiden-Fusionsproteinen mit

bakterieller Transglutaminase (N-Zyme); ........................................................- 67 -

Abb. 31: Western blot-Analyse der posttranslationalen Polymerisierung von Spinnenseiden-

fusionsproteinen mit bakterieller Transglutaminase (N-Zyme); .........................- 68 -

Abb. 32: Western blot-Analyse der posttranslationalen Polymerisierung von Spinnenseiden-

fusionsproteinen mit bakterieller Transglutaminase (N-Zyme); .........................- 69 -


- 88 -

Abb. 33: Western blot-Analyse von Wollfäden nach Inkubation mit Spinnenseiden-

Fusionsproteinen und bakterieller Transglutaminase;.......................................- 70 -

Abb. 34: Nachweis der Expression verschiedener Spinnenseiden-Fusionsproteine mit

Transglutaminase-Marken mittels Western blot-Analyse................................- 65 -

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Lebenslauf

Persönliche Informationen Familienstand: verheiratet

Nationalität: deutsch

Geburtsdatum: 20.07.1977

Geburtsort: Marburg

Ausbildung und Berufser-fahrung

Seit 01.11.2003 IPK-Gatersleben

Durchführung der experimentellen Arbeiten zum Thema „Herstellung von Spinnensei-denproteinen in Tabaksamen“ als wissenschaftlicher Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Phytoantikörper.

01.10.1997-26.04.2003 TU Braunschweig Diplom in Biotechnologie

Gesamtnote: gut

Anfertigung der Diplomarbeit zum Thema: „Biotechnische Untersuchungen zur Er-tüchtigung eines 600 m2 Biofilters der Kläranlage Steinhof unter veränderten Hochlast-bedingungen (Faulschlammentwässerung)“

Note: sehr gut

Anfertigung der Studienarbeit zum Thema: „Untersuchung der differentiellen Chemo-kininduktion während einer Infektion mit Listeria monocytogenes“

Note: sehr gut

1988-1997 Gustav Stresemann-Schule Bad Wildungen

Allgemeine Hochschulreife

Abschlussnote: 1,3

1984-1988 Grundschule Bad Wildungen-Braunau

Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe ver-fasst, ausschließlich die darin angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und die den be-nutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Informationen als solche kenntlich gemacht habe. Gatersleben, den 06.03.2008

Kai Schallau

Documents

Herstellung von Spinnenseidenproteinen in Tabaksamen