Heterologe Expression

und funktionelle Grundcharakterisierung

von Myelinproteinen aus dem ZNS

der Regenbogenforelle (Oncorrhynchus mykiss)

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der

Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

des Fachbereiches Biologie/Chemieder Universität Osnabrück

vorgelegt von

Carsten Lanwertaus Osnabrück

Frühjahr 2000

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1 Einleitung

Im Laufe der Evolution haben die Vertebraten ein neuronales Netzwerk entwickelt, das in

Komplexität und Leistungsfähigkeit einzigartig ist. Die besondere Leistungsfähigkeit

verdankt es dem Myelin, welches die Axone der Nervenfasern des zentralen (ZNS) und

peripheren Nervensystems (PNS) umgibt und somit gegen transmembrane Ionenströme

isoliert. Die Erregungsleitung kann sich daher nur an nicht myelinisierten Bereichen der

Nervenfaser, den Ranvierschen Schnürringen, sprunghaft ausbreiten. Diese sog. saltatorische

Erregungsleitung spart gegenüber der kontinuierlichen Erregungsleitung Zeit, Energie und

Platz und bildet somit Grundstein für die unglaubliche Rechenleistung der Vertebratengehirne

(BUNGE, 1968; MORELL UND NORTON 1980; REVIEW: HILDEBRAND ET AL., 1993). Die

Myelinhülle wird von spezialisierten Gliazellen gebildet. Im zentralen Nervensystem sind

dieses die Oligodendrozyten, im PNS übernehmen die Schwannschen Zellen die Aufgabe der

Myelinogenese. Diese myelinformenden spezialisierten Zellen wickeln die Membranen ihrer

Zellfortsätze als flache Zunge mehrfach konzentrisch um die Axone von Nervenfasern und

bilden durch Verdichtung die typische

kompakte, multilamelläre Struktur des

Myelins (WOOD UND BUNGE, 1984,

PETERS ET AL., 1976; RUMSBY UND

CRANG, 1977). Innerhalb des kompakten

Myelins werden durch die dichte

Aufeinanderlagerung der cytoplas-

matischen Seiten der Plasmamembran der

Schwannschen Zellen, bzw. des

Oligodendrozyten die sog. „major dense

line“ gebildet, und durch Apposition der

extrazellulären Seiten des Bilayers die

sog. „intraperiod line“ des Myelins, die

nach ihrer Struktur in elektronen-

mikroskopischen Aufnahmen benannt wurden.

Die Fähigkeit zur elektrischen Isolation spiegelt sich in der biochemischen Zusammensetzung

Abbildung 1: ElektronenmikroskopischeAufnahme einer typischen myelinisiertenNervenfaser aus dem ZNS (Rückenmark Hund).Der Zellkörper des Oligodendrozyten istzuerkennen (Pfeil). Man sieht deutlich diecytoplasmatische „major dense line“ als scharfeschwarze Linie und die extrazelluläre„intraperiod line“ als gräuliche Substanz(x135000) (entnommen aus: „BasicNeurochemistry“ Lippincott-Raven, 1998)

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der Myelinmembran wieder: Sie besteht zu rund 70 % aus hydrophoben und elektrisch

isolierenden Lipiden (MORELL, 1977), unter denen das Galactocerebrosid (GalC) als

spezifischer Marker für Oligodendrozyten und Schwannschen Zellen identifiziert wurde (YU

UND IQBAL, 1979). Der Proteinanteil ist mit 30 % relativ gering, aber äußerst

charakteristisch. Eine wesentliche Funktion dieser Proteine ist es, die Adhäsion der einzelnen

Myelinlamellen im kompakten Myelin zu vermitteln. Im ZNS der höheren Vertebraten, wie

z.B. Säuger, Vögel, Reptilien und Amphibien, besteht der Proteinanteil zu 50 % aus dem

hydrophoben, nichtglykosilierten Proteolipid Protein PLP (LEES UND BROSTOFF, 1984). Die

basischen Myelinproteine (MBP’s) sind mit 30 % die zweithäufigsten Vertreter. Sie bilden

eine Klasse von Proteinen, deren Molekulargewicht von 12 bis 22 kDa reicht und von nur

einem Gen durch alternatives RNA-Splicing gebildet werden (BARBARESE ET AL., 1977;

GREENFIELD ET AL., 1982; REVIEW: KAMHOLZ UND WRABETZ, 1992). Weitere

charakteristische Proteine sind die 2’3’-cyclisches Nukleotid-3’-Phosphohydrolase (CNPase)

mit 5% und das Myelinassoziierte Glykoprotein (MAG), welches in zwei Isoformen vorliegt

und weniger als 1% der Proteine ausmacht (VOGEL UND THOMPSON, 1988; CAMPAGNONI,

1988, LAI ET AL., 1987).

Das PLP tritt ausschließlich im ZNS auf, während im PNS seine Funktion vom

transmembranen Glykoprotein P0, das mit bis zu 60 % den weitaus größten Teil der

gesamten Myelinproteinfraktion darstellt,

übernommen wird. Die Proteine PLP und P0

unterscheiden sich gravierend in der

Aminosäuresequenz, Membran-Topologie

und Genstruktur. Während das 30 kDa

große, stark acylierte PLP vier

Transmembran-Durchgänge aufweist, die

intra- und extrazellulär durch hydrophile

Schleifen verbunden sind (POPOT ET AL.,

1991), besitzt das P0-Protein nur ein

einzelnes Membran-Segment sowie eine

stark basische intrazelluläre Domäne (LEMKE UND AXEL, 1985, LAI ET AL., 1987; DING UND

BRUNDEN, 1994). Als weitere charakteristische PNS-Myelinproteine wurde das P2-Protein,

Abbildung 2: SDS-PAGE von Myelin MO: Maus; TR:Forelle; OX Rind; (Abbildung aus: Jeserich undWaehneldt, 1986b)

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das periphere Myelinprotein 22 (PMP22) mit einem Anteil von bis zu 5 % (PAREEK ET AL.,

1993) MAG, MBP’s (bis zu 15 %) und Connexin 32 (Cx32) charakterisiert (BERGOFFEN ET

AL., 1993; REVIEW: SNIPES UND SUTER, 1995).

Das Myelin aus dem ZNS phylogenetisch älterer Vertebraten, wie den Fischen, unterscheidet

sich in seinem Proteinmuster von dem der übrigen Vertebraten (JESERICH 1983; WAEHNELDT

UND JESERICH, 1984). PLP sucht man hier vergeblich: es wird durch P0-ähnliche Proteine

ersetzt. Bei der Forelle sind dieses die intermediären, in zwei Isoformen durch alternatives

Splicing auftretenden Glykoproteine IP1 und IP2. (JESERICH UND WAEHNELDT, 1986A;

JESERICH UND WAEHNELDT, 1987). Die Sequenz von IP1 konnte bestimmt und ihre

strukturelle Verwandtschaft zu P0, auf die im folgenden noch genauer eingegangen wird,

näher charakterisiert werden (STRATMANN UND JESERICH, 1995). Interessanterweise ist die

Expression der Splice-Varianten IP1 und IP2 entwicklungsabhängig, denn die größere

Isoform wird während der Oligodendrozytenentwicklung früher exprimiert als die kleinere

(JESERICH ET AL. 1990).

Ein weiteres einzigartiges, nur im ZNS der Fische vorkommendes Protein ist ein

nichtglykosiliertes, cytoplasmatisches, membranassoziiertes Protein mit dem

Molekulargewicht von 36 kDa, genannt 36K-Protein (JESERICH, 1983; JESERICH UND

WAEHNELDT, 1986B). Die cDNA-, bzw. Proteinsequenz ist bislang nicht vollständig bekannt,

doch aufgrund von computergestützten Vorhersagen, basierend auf gDNA-Teilfragmenten,

wurde deutlich, daß sich das 36K-Protein in Sequenz und Struktur von allen von höheren

Vertebraten bekannten Myelinproteinen unterscheidet. Statt dessen konnte eine auffällige

Ähnlichkeit zu Vertretern der kurzkettigen NAD/NADP-abhängigen Oxido-Reduktasen

ausgemacht werden (STRELAU, DISSERTATION, 1997). Die Aufgabe dieser einzigartigen

Myelinkomponente ist bislang noch ein Rätsel. Im PNS der Forelle fehlt 36K. Es treten neben

zwei weiteren IP-ähnlichen Proteinen (IPb und IPc) MAG und niedermolekulare basische

Proteine auf. Zusammenfassend läßt sich demnach sagen, daß die Oligodendrozyten aus dem

ZNS der Fische bezüglich ihrer Morphologie den Säuger-Oligodendrozyten ähneln, bezüglich

ihrer biochemischen Zusammensetzung jedoch Ähnlichkeit zu Säuger-Schwannzellen

aufweisen.

Die besondere Stellung von Fisch-Oligodendrozyten zeigt sich, außer in der oben

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beschriebenen biochemische Zusammensetzung, in einer weiteren außergewöhnlichen

Eigenschaft. Sie besitzen die Fähigkeit, Axone nach Verletzungen vollständig zu

remyelinisieren (WOLBURG, 1981), eine Fähigkeit, die sonst nur bei Schwannschen Zellen im

PNS zu finden ist. Außerdem unterstützen sie in vitro die neuronale Regeneration

(BASTMEYER ET AL. 1991). Da dem P0-Protein aus dem PNS der Säuger die Fähigkeit

nachgewiesen wurde, das Auswachsen von Neuriten zu fördern (SCHNEIDER-SCHAULIES ET

AL., 1990, YAZAKI ET AL., 1994), ist es denkbar, daß im Fisch-ZNS die P0-ähnlichen

Proteine IP1 und IP2 in den Remyelinisierungs- und Regenerationsprozessen involviert sind.

Aufgrund der auffälligen

Sekundärstruktur von IP1 und IP2

werden diese Forellenmyelinproteine als

typische Vertreter der Immunglobulin-

Superfamilie (Ig-CAM) angesehen

(STRATMANN & JESERICH, 1995).

Vertreter dieser Proteinfamilie definieren

sich über Regionen, die Ähnlichkeiten

mit der variablen Domäne der

Immunglobuline aufweisen. Diese

Immunglobulin-Domänen bestehen aus

alternierenden hydrophoben und

hydrophilen Aminosäureresten, die eine

Serie aus antiparallelen β-Strängen

bilden. Diese β-Stränge falten sich zu 2

β-Faltblättern, die durch Disulfidbrücken stabilisiert werden (WILLIAMS UND BARCLAY,

1987; EDELMAN, 1988). Zu den Ig-CAM gehören z.B. das N-CAM (neural cell adhesion

molecule), MAG und P0. Man konnte allen diesen aufgeführten Proteinen eine Funktion als

homophiles/heterophiles Adhäsionsmolekül sowohl im Nerven- als auch im Immunsystem

experimentell nachweisen (FILBIN ET AL, 1990; D’URSO ET AL., 1990; SALZER UND COLMAN,

1989; AFAR ET AL., 1991; POLTORAK ET AL., 1987).

Abbildung 3: Vertreter der Ig-CAM Superfamilie: Zuihnen gehören P0, NCAM, MAG und weitere Vertreter.Die überwältigende Mehrheit der Moleküle sindVertreter der Subklasse Typ I zu denen auch dieForellenmyelinproteine IP1/2 zählen. (entnommen aus:„Basic Neurochemistry“ Lippincott-Raven, 1998)

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Da das IP1-Protein der Forelle eine auffällige Ähnlichkeit zu dem P0-Protein der Säuger

aufweist, wurde bereits 1995

von Stratmann und Jeserich

vorgeschlagen, daß es P0-

ähnliche Adhäsionsaufgaben

in der extrazellulären

„intraperiod line“ zur

Kompaktierung des

Forellenmyelins ausführen

könnte. Zur Kompaktierung

der cytoplasmatischen „major

dense line“ des Forellenmyelin

wäre es denkbar, daß die

cytoplasmatischen Domänen

der IP Splice-Varianten

hierbei von großer Bedeutung

sind. Zwar ist die vollständige

Sequenz der längeren IP2

Splice-Variante noch nicht

bekannt, dennoch wird deutlich, daß die cytoplasmatischen Domänen der IP-Proteine eine

positive Nettoladung aufweisen und somit über elektrostatische Wechselwirkungen an saure

d.h. negativ-geladene Phospholipide der Plasmamembran binden könnten (STRATMANN UND

JESERICH, 1995). Eine derartige Eigenschaft konnte den korrespondieren Proteindomänen

des P0-Protein und den Basischen Myelinproteinen bereits nachgewiesen werden (DING UND

BRUNDEN, 1994; CHEIFETZ ET AL., 1985, ROUX ET AL. 1994; REVIEW: STAUGAITIS ET AL.,

1995) Die Funktion des Forellen ZNS-spezifischen 36K Proteines ist noch völlig ungeklärt.

Es ist denkbar, daß es aufgrund seiner ebenfalls stark basischen d.h. positiven Ladung an

negativ-geladene saure Phospholipide der Zellmembran bindet und so die Apposition der

cytoplasmatischen „major dense line“ unterstützt.

In der vorliegenden Dissertation sollten mit Hilfe der heterologen Expression erste

experimentelle Hinweise auf die Funktion der Hauptmyelinproteine IP1 und IP2 sowie 36K

Abbildung 4: Hypothetisches Forellenmyelinmodell: Zelladhäsionan der intraperiod line wird druch die IgCAM Proteine IP1/2vermittelt. Die Apposition der cytoplasmatischen major dense lineerfolgt über die cytoplasmatischen Domänen von IP1/2 sowie überdie Basischen Myelinproteine (BP) und 36K. ElektrostatischeAnziehungskräfte sind gestrichelt angedeutet

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gewonnen werden. Diese funktionellen Grundcharakterisierungen könnten zum besseren

Verständinis der Myelinogenese beitragen und als Basis für weiterführende Experimente

dienen.

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2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Bakterienstämme

Bakterienstamm Genotyp

E. coli JM 109 mcrA, rec A1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,supE44, relA1, ∆(lac-proAB), [F´ tra∆36,proAB, lacIq, lacZ∆M15]

E. coli XL-1-Blue MRF’ ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1lac[F’ proAB laclq Z∆M15 Tn10 (Tetr)

E. coli MRA(P2) ∆(mcrA)183, ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)171,endA1, supE44, thi-1, gyrA96, relA1, lac (P2lysogen)

E. coli HB 101 F-, thi-1, hsdS20 (rB-, mB

-), galK2, supE44,recA13, ara-14, leuB6, proA2, lacY1,rpsL20(strr), xyl-5, mtl-1, l

E. coli DH5α F- Φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169endA1 recA1 hsdR17(rK

-mK+) deoR thi-1

supE44 λ-gyrA96 relA1

E. coli BL21(DE3)/pLysS E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB-mB

-)galλ(DE3) [pLysS Camr]

E. coli UT 5600 F- ara-14 leuB6 azi-6 lacY1 proC14 tsx-67∆(ompT-fepC)266 entA403 trpE38 rfbD1rpsL109 xyl-5 mtl-1 thi-1

E. coli TB-1 F- ara∆(lac-proAB) rpsL (Strr)[Φ80dlac∆(lacZ)M15] thi hsdR(rK

-mK+)

E. coli DH10Bac F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZ∆M15 ∆lacX74 endA1 recA1 deoR∆(ara, leu)7697 araD139 galU galK nupGrpsL λ-/bMON14272/pMON7124

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2.1.2 Plasmide

Plasmide bezogen von Referenz

pBK-CMV Fa. Stratgene

pBK-CMV/ IP cDNA Lanwert (Diplomarbeit, 1996)

pGEM-4/P0 cDNA Laborsammlung Lemke et al. (1985)

pGEM-T Easy Fa. Promega

pET 16b Fa. Novagen

pCYB 1-4 Fa. NEB

pMYB Fa. NEB

pMAL C2 / P2 Fa. NEB

pFastbac Fa. Gibco

pFastbac HTa-c Fa. Gibco

pFastbac Dual Fa. Gibco

pIRES-neo Fa. Clontech

pIRES-hygro Fa. Clontech

pBluescriptSK(-) Fa. Stratagene

2.1.3 Larvenstadien und Jungfische der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

Von dem Forellenzuchtbetrieb „Lindhorst-Emme“, Stuckenbrock-Holte, bzw. „Errboe“,

Silkeborg, (DK), wurden befruchtete Eier bezogen, die in den hauseigenen und gut belüfteten

Aquarien bei ca. 10°C zu den verwendeten Larvalstadien, bzw. Jungfischen herangezogen

wurden. Die Larvalstadien wurden anhand der von Vernier (1969) erstellten

Entwicklungstabelle bestimmt.

2.1.4 Zellinien

Die OLN-93-Zellen, eine Oligodendrogliazelle, stammen von Frau Dr. Richter-Landsberg,

Oldenburg (RICHTER-LANDSBERG UND HEINRICH, 1996)

Die CHO-K1-Zellen wurden von der Firma Imperial, England bezogen.

rP0/CHO(DG44)-Zellen sind eine freundliche Gabe von M. Filbin, New York

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Sf21 und HighFive-Zellen stammen von Fa. Invitrogen und sind eine freundliche Gabe von

Herrn Dr. R.Wagner, Osnabrück

2.1.5 Chemikalien

Bacto-Agar, Bacto-Trypton, Bacto-Yeast extrakt von Difco, Fa. Nordwald, Hamburg

Tetramethylammoniumchlorid (TMAC), IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid,

Tetracyclin-HCl, Kanamycin, Agarose Typ II Medium EEO, Fluoreszenz-Antikörper-

konjugate, Proteinase-Inhibitor-cocktail von der Fa. Sigma, Deisenhofen

Sterile Petrischalen und Multiwellplatten für die Zellkulturen von Nunc, Dänemark

Restriktionsenzyme und -Puffer, sowie Taq-Polymerase, T4-Ligase, Superscript RT II,

RNase H (alle samt Puffer) von Fa. Gibco/BRL, Eggenheim, bzw. Fa. NEB, Schwalbach

Transfectam von Fa. Promega, Cellfectin von Fa. Gibco

Soweit im Methodenteil (siehe 2.) nicht anders vermerkt, sind alle Reagenzien und

Chemikalien von den Firmen Riedel-de Haen, Seelze oder von der Firma Sigma, Deisenhofen

in der Qualität p.A. bezogen worden.

2.1.6 Medien zur Anzucht von Bakterien

LB-Medium 10 g Bacto tryptone; 10 g NaCl, 10 g Hefeextrakt pro 1l

LB-Bac-Medium LB mit 50µg/ml Kanamycin, 7 µg/ml Gentamycin, 10 µl/ml Tetrazyklin

LB-Agar LB-Medium mit 7,5 g Bacto-Agar pro l

LB-Bac-Agar LB-Agar mit mit 50µg/ml Kanamycin, 7 µg/ml Gentamycin, 10 µl/ml

Tetrazyklin, 100µg X-gal und 40µg/ml IPTG

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SOB-Medium 2 % Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextract, 10mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10

mM MgCl2, 10 mM MgSO4

TFB-1-Medium 30 mM Kalium Acetat, 50 mM MnCl2, 100 mM RbCl2, 10 mM CaCl2,

15% Glycerin, pH 5,8

TFB-2-Medium 10 mM Na-MOPS, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl2, 15% Glycerin, pH 7,0

TSS-Puffer LB-Medium mit 10 % PEG 8000, 5 % DMSO 50 mM MgSO4 oder

MgCl2, pH 6,5

RM-Medium 10 g Trypton, 5g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 2g Glucose pH 7,4 pro 1l

2xYT Medium 10g NaCl, 10g Hefeextrakt, 16g Bactotrypton pro 1l

2.1.7 PCR Primer

Die verwendeten PCR-Primer wurden von der Fa. TIB MolBiol, Berlin, Gibco BLR,

Schottland, MWG, Ebersberg, bzw. Genaxis, Spechbach synthetisiert.

Name Sequenz 5⇒́ 3´

36K-2-R TAA ACT GTT AAA GTA GTG CAA ATC

36K-CF-1 CTC GAG TAC CAC CCT GTG GAA TGG AGC AGT

36K-CL-F4 TAC AAC GCA TAT GTC TCT TTA CCG CA

36K-CL-F6 TCT GAA AGG AAT GAC TGA ATT C

36K-CL-F7 GGA CTC AAA TCC CTG GCT ACA A

36K-CL-R5 ATC GAT TTA GTT TGT AAC TTG T

36K-CL-R6 GAA TTC AGT CAT TCC TTT CAG A

36K-mal-F2 ACG GGA TCC ATG TCT CTT TAC CGC

36K-mal-R2 GTC TCT AGA TCA GTG GGG CTG GAA

36K-R2 CTC CTT GAC AAT GTC AGC CCT

HTB-F1 ATG TCG TAC TAC CAT CAC CA

IP2-C3mal-R TGA AGC TTC ATC AGC ACC CTA

IP2-C3-R GTC ATC AGC ACC CTA CCA GG

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IP2-CIZ-F ACA GGG CCC AAC TCT CTC CAT

IP2-IZ-F GAC CCG TCC AAG CTG AAG GCC GCC

IP-4E-mal CCT AAG CTT TAG AAG AGA GAG C

IP-5F CTG GAA CCC TGC ACC CCT CTG

IP-cyto-F1 AGG GAA TTC CTG GTG GCC CGC

Po-fus3-f ATT TCT AGA TAC TGC TGG CTG CGC AGG CA

2.2 Methoden

Alle im folgenden beschriebenen Methoden wurden, wenn nicht anders vermerkt, bei RT

durchgeführt.

2.2.1 Bakterienkulturen/Kryokonservierung von Bakterienkulturen

Die Bakterienflüssigkulturen wurden in Wachstumsmedium (s.o.) mit einer Platinöse von

einer Einzelkolonie angeimpft. Am Vortage wurden die Bakterien aus einer Dauerkultur zu

einer Einzelkolonie auf der entsprechenden LB-Platte vereinzelt. Die frisch inokulierten

Flüssigkulturen wurden auf einem Roller, bzw. Schütteltisch zur besseren Durchlüftung bei

37°C bis zum nächsten Morgen, bzw. bis zur gewünschten OD650 inkubiert.

Zur Kryokonservierung von Bakterienkulturen wurden 800 µl der Flüssigkulturen mit 70 µl

DMSO vermischt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert.

2.2.2 Plasmidpräparationen

Die verwendeten Plasmidpräparations-Kits enthalten Puffer und Säulen mit einer DNA

bindenden Gelmatrix und basieren auf dem gleichen Prinzip. Nach alkalischer Lyse bindet die

Plasmid DNA in Gegenwart von chaotropen Salzen an eine Silicagelmatrix (QIAprep Spin

Plasmid Kit), bzw. Ionenaustauscher („Jet star“ Plasmid-Präparation) und kann mit Hilfe

von A. dest. von der Matrix wieder abgelöst werden.

2.2.2.1 „Spin (Mini) -Präp“-Methode

Zur schnellen Plasmid-DNA Präparation für PCR, Restriktionsanalysen oder Ligationen

wurde das QIAprep Spin Plasmid Kit (Fa. Qiagen) eingesetzt. Die Durchführung erfolgte

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nach Protokoll des Herstellers. Nach alkalische Lyse und Zentrifugation wurde der

Überstand auf die Säulen pipettiert und für 30 sec bei 12000 rpm zentrifugiert. Nach 2-4

maligem Waschen mit Waschpuffer wurde 50 µl TE-Puffer oder A. dest. auf die Mitte der

Gelmatrix der Säule pipettiert und für 1 min inkubiert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA

durch zweiminütiges Zentrifugieren (12000 rpm) eluiert.

2.2.2.2 „Jet star“ Plasmid-Präparation (Fa. Genomed)

Für spätere Transfektionen mußte die DNA eine besonders hohe Qualität aufweisen, da

Kontaminationen mit Proteinen, Endotoxinen, genomischer DNA oder Salzrückständen die

Transfektionseffizienz deutlich reduziert. Die „Jet Star“ Plasmid-Präparation liefert hochreine

und endotoxinfreie DNA (vergleichbar mit 2x CsCl Gradient) und wurde streng nach

Angaben des Herstellers durchgeführt. 3 ml einer Übernacht-Bakterienkultur wurden

abzentrifugiert, das Pellet in 400 µl des Resuspensionspuffers resuspendiert. Nach Zellyse

durch 400 µl des alkalischen, SDS-haltigen Lysis-Puffer (5 min bei RT) erfolgte die

Neutralisierung mit 400 µl Neutralisierungspuffer mit anschließender Zentrifugation bei RT

für 20 min (16000xg). Hierbei wurden die Proteine und Zelltrümmer pelletiert und der

Überstand auf die DNA-bindende, zuvor equilibrierte Säule gegeben. Der Puffer lief von der

Schwerkraft getrieben durch die Säule und wurde verworfen, während die Plasmid-DNA an

der Gelmatrix bindet. In nachfolgenden Waschschritten (2x 2ml Waschpuffer) wurden

Proteine, genomische DNA, RNA, Proteine und alle anderen Metabolite herausgewaschen.

Die Plasmid DNA wurde mit 0,9 ml des Elutionspuffers von der Gelmatrix eluiert und mit

630 µl Isopropanol gefällt, 30 min bei 4°C und 15000 rpm pelletiert und vorsichtig mit 200

µl 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50-100 µl A. dest. resuspendiert.

2.2.3 RNA/DNA-Quantifizierung durch Methylen-Blau-Spot-Test

Bei dem Methylen-Blau-Spot-Test wird die Fähigkeit von DNA bzw. RNA ausgenutzt, im

saurem Milieu basische Farbstoffe zu binden. Dazu wird 1 µl der zu quantifizierenden

Lösung auf eine positiv-geladene Nylonmembran (Fa. Boehringer) pipettiert und im UV-

Crosslinker (Fa. Stratagene) bei 120 mJ/cm2 mit der Membran kovalent verbunden. Die

Membran wurde in 5 % Essigsäure auf pH 4 für 15 min equilibriert. Nach anschließendem

viertelstündigem Anfärben in Methylen-Blau-Färbelösung (0,5 M Na-Acetat, 0,04%

Methylen-Blau, pH 5,2) wurde die Membran unter leichtem Schütteln in mehreren Schritten

13

in A. dest. vollständig entfärbt. Anhand einer vorher erstellten Eichreihe wird die DNA-

Menge colorimetrisch bestimmt.

2.2.4 RNA/DNA-Quantifizierung durch Photometrie

Mit Hilfe des Spectralphotometers kann die Nukleinsäurekonzentration wäßriger Lösungen

bestimmt werden. Eine OD 260 von 1,0 entspricht 50µg/ml bei DNA, bzw. 40µg/ml bei

RNA.

2.2.5 Restriktion von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Zur Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen wurde ca. 1 µg DNA pro 10 µl

Ansatzvolumen mit 2-10 U des gewünschten Enzyms im Wasserbad bei 37°C (bzw.

abweichenden Temperaturoptima nach Hersteller) 1-2 h inkubiert. Als Puffersystem diente

der vom Hersteller mitgelieferte 10x Puffer.

2.2.6 Agarose-Gelelektrophorese

DNA Fragmente können mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese im elektrischen Feld der

Größe nach aufgetrennt werden. Dazu wurden 0,7 bis 2 % Agarose (w/v) in 1x TAE-Puffer

(0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA, pH 8) verwendet. Die DNA-Proben wurden mit einem

1/5 Gel-Ladepuffer (1x TAE, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 50 % Glycerin )

versetzt und die Elektrophorese bei 5-10 V/cm Elektrodenabstand durchgeführt

(Elektrophoresekammer Mini-Sub Electrophoresis Cell, Fa. Biorad). Als Größenstandard für

die zu analysierenden DNA-Fragmente diente EcoR I/Hind III verdaute λ-Phagen DNA (Fa.

Sigma), Smart-Ladder (Fa. Eurogentec), bzw. eine 100 bp DNA-Leiter (100-1500 bp) (Fa.

Gibco). Die DNA-Fragmente im Gel wurden anschließend für 10 min im Ethidiumbromid-

Bad (2µg/ml, Fa. Serva) gefärbt, für 10 min in dH2O gespült, auf einem UV-Transluminator

bei 302 nm sichtbar gemacht und auf einem Videoprinter (Fa. Sony) dokumentiert.

2.2.7 Gelextraktionsmethoden

2.2.7.1 DNA-Gelextraktion „Jet-sorb“ -Methode (Fa. Genomed)

Bei der Jet sorb“ Gelextraktion Methode aus TAE-Agarosegelen wird die DNA nach

Elektrophorese (2.2.6) aus einem Agarosegel herausgeschnitten und gewogen. Die Menge an

eingesetzten Puffern richtet sich nach dem Gewicht des ausgeschnittenen Fragmentes (pro

100mg Gel/ 300µl Puffer A1 und A2 mit 15 µl Silika-Beads) Der mitgelieferte Puffer A1

14

enthält einen TAE-Gel Solubilizer, der die H-Brücken zwischen den Zuckern im

Agarosepolymer zerstört. Das Gel löst sich daher bereits bei 50°C auf, so daß die DNA in

diesem Milieu an den mitgelieferten Silika-Beads binden kann. Nach diversen Waschschritten

mit Puffer A1 kann die DNA im Niedrigsalz-Puffer A2 bei 50°C eluiert werden. Die „Jet-

sorb“-Methode wurde streng nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.7.2 DNA Gelextraktion „Qiaquick Gel Extraction Kit“ Fa. Qiagen

Die Gelextraktionmethode der Fa. Qiagen ähnelt der oben beschriebenen Jet-sorb Methode,

mit dem Unterschied, daß die Silica Matrix in Form kleiner Säulchen vorliegt und daher

einfacher in der Handhabung ist. Die Methode wurde streng nach Protokoll des Herstellers

durchgeführt.

2.2.8 Klonierungen

2.2.8.1 Dephosphorylierung von Plasmidvektoren

Zur Klonierung von DNA-Fragmenten, die nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten

wurden und daher unter Ligationsbedingungen zur Rezirkulation neigen, müssen die 5´-

Phosphatgruppen des Vektors hydrolysiert werden. Hierzu wurde der geschnittene Vektor

vor Ligation mit alkalischer Phosphatase (CIAP calf intestinal alkaline phosphatase, Fa.

Promega) behandelt: Es wurden 5µl CIAP (0,5 U) sowie mitgelieferter 10x Reaktionspuffer

pro 2µg linearisiertem Vektor pipettiert und das Volumen des Ansatzes mit A.dest. auf 50µl

eingestellt. Die Dephosphorylierung erfolgte für 60min bei 37° C bzw. für 30 min bei 37° C

und anschließend für 30 min bei 56° C unter Zugabe von weiteren 0,5µl Enzym.

2.2.8.2 Sticky end-Ligation

Für die sog. „sticky end“-Ligation werden kohäsive, komplementäre Enden benötigt, die

durch die Restriktion der doppelsträngigen DNA entstehen können. Hierzu bedient man sich

der Eigenschaft bestimmter Restriktionsenzyme, 3’ oder 5’ überhängende Termini zu

produzieren, in dem sie den DNA-Doppelstrang „versetzt“ schneiden. Durch die

Verwendung von zwei unterschiedlichen Restriktionsenymen, kann man gezielt und gerichtet

klonieren. Für eine ungerichtete Klonierung (nur mit einem Enzym geschnitten) mußte der

geöffnete Vektor dephosphoriliert werden (2.2.8.1) Die Ligationsreaktionen wurden im 10 µl

Ansatz durchführt, wobei 0,5 µl T4-Ligase (Fa. Gibco) sowie 2 µl des vom Hersteller

15

mitgelieferten 5x Reaktionspuffer verwendet wurden. Das für die Reaktion notwendige ATP

war bereits im Reaktionpuffer enthalten. Es wurden 50 µg Vektor/Plasmid-DNA und die im

molaren Verhältnis 3-6 fachen Menge an Insert -DNA eingesetzt. Durch die größere Menge

an Insert DNA sollte die intermolekulare Ligation von Vektor/Insert gegenüber

intramolekularen Bindungen begünstigt werden. Die Reaktion erfolgte über Nacht bei 16° C

oder 1h bei RT.

2.2.8.3 blunt end-Ligation

Bei der Restriktion von DNA mit Enzymen, die nicht versetzt schneiden, entstehen sog. blunt

ends, glatte DNA-Termini. Die T4-Ligase ist in der Lage auch blunt ends zu ligieren, jedoch

ist nur eine ungerichtete Ligation möglich. Außerdem ist die Effizienz gegenüber der sticky

end-Ligation nicht so hoch. Um die Effizienz zu steigern wurde die bis zu 10-fache molare

Menge an blunt end-Insert DNA gegenüber der Vektor DNA eingesetzt.

2.2.9 Herstellung von glatten Enden mit T4 Polymerase („blunting“)

Nach einer Restriktion können 5‘ oder 3‘ Überhänge auf glatte Enden (blunt ends) aufgefüllt,

bzw. abgedaut werden. Dazu wurden 0,3 – 2 µg der verdauten und gereinigten DNA im 20

µl Ansatz mit 10 U T4-Polymerase (Gibco), 1µl 100mM DTT und dem mitgelieferten 5x

Reaktionspuffer versetzt. Im Falle einer Auffüllreaktion wurde zusätzlich 2µl 10mM dNTP-

Mix pipettiert und für 15 min bei 12° C inkubiert. Die Reaktion wurde anschließend für 10

min bei 70° C Hitzeinaktiviert.

2.2.10 Reinigung von DNA Fragment aus wäßrigen enzymatischen Lösungen

Zur Reinigung von DNA aus wäßrigen Lösungen nach enzymatischen Reaktionen, z.B.

Restriktionsverdau, PCR oder DNA-Modifikationen wurde der Ansatz mit 50 µl

Chloroform/Phenol (Fa. Roth) vermischt und 5 min bei RT (12000 rpm) zentrifugiert. Die

wäßrige Phase wurde vorsichtig abgezogen und nach Zugabe von 1/6,3 Volumen 3 M

Natriumacetat (pH 4,5) und des dreifachen Volumen eiskalten absoluten Ethanols für 30 min

bei -70° C gefällt. Anschließend wurde das Präzipitat 30 min bei 4° C und 15000 rpm

zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen und in 10 µl dH2O oder TE-Puffer (10 mM Tris, 1

mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert.

Alternativ wurde das „Qiaquick PCR Purification Kit“ der Fa. Qiagen nach Protokoll des

16

Herstellers verwendet. Hierbei handelt es sich um kleine Säulchen mit einer DNA-bindenden

Silicamatrix, die ähnlich wie unter 2.2.2.1 beschrieben eine schnelle und phenolfreie

Aufreinigung erlaubten.

2.2.11 Klonierung von PCR-Produkten / pGEM-T easy

PCR-Produkte, die durch Taq-Polymerase amplifiziert wurden, konnten mit Hilfe des

pGEM-T Easy System (Fa. Promega) einfach kloniert werden. Hierbei wird die terminale

Transferase-Aktivität (hohe Affinität für dATP) der Taq-Polymerase ausgenutzt, die am 3‘

Ende eines Taq-Amplifikates ein d(A)-Überhang entsteht läßt. Über eine A/T sticky end

Ligation mit dem vom Hersteller mit einem d(T)-Überhang modifizierten, linearisierten

pGEM-T easy Vektor konnte sehr effektiv kloniert werden. Der 10µl Ligationsansatz

bestand aus 0,5µl pGEM-T easy, 1µl (3U) Ligase, 5µl Ligasepuffer (alles Bestandteile des

Kits) sowie 4 µl des gereinigten PCR-Produktes. Die Ligation wurde entweder für 1h bei RT

oder ÜN bei 4°C inkubiert.

2.2.12 Plasmid Transformation

2.2.12.1 TFB-Methode und Blau/Weiß-Selektion

Zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen wurde die TFB-Methode (buffers for

transformation and frozen storage of competent cells), nach dem modifizierten Protokoll von

Hanahan (1983) durchgeführt. Von einer Einzelkolonie wurde eine 5 ml Übernachtkultur

angeimpft. Von 1 ml dieser Übernachtkultur wurden 200 ml SOB-Medium angeimpft und bei

37°C auf dem Schüttler bis zu einer OD650 von 0,4 bis 0,5 inkubiert. Anschließend wurden

sie bei 4°C und 500 g für 10 min abzentrifugiert, in 60 ml TFB-1-Medium resuspendiert und

für 10 min auf Eis gekühlt. Die in diesem speziellen Transformationsmedium enthaltenen

Salze sollen die Bakterienmembran „löcherig“ und somit für die Aufnahme der Plasmid-DNA

fähig, d.h. kompetent machen. Nach erneutem Pelletieren und Resuspendieren in 8 ml TFB-2,

wurden die erhaltenen kompetenten Zellen zu 200 µl aliquotiert, in flüssigen Stickstoff

schockgefroren und bei -70° C gelagert.

Pro Transformationsansatz wurden 100 µl der eingefrorenen kompetenten Zellen auf

Eiswasser aufgetaut und vorsichtig gemischt. Nach Zugabe von 50 ng klonierter DNA (bis zu

10 µl des Ligationsansatzes) und 10 minütiger Inkubation auf Eis erfolgte der Hitzeschock

17

für 75 sec bei genau 42° C mit anschließender Abkühlung auf Eis für 2 min. Während dieser

Hitzeschock-Phase nehmen die Bakterien die DNA auf. Zur phänotypische Expression des

Resistenzgenes wurde der Ansatz mit 900µl LB versetzt und für 1 h bei 37°C im Roller

inkubiert, 30 sec bei 12000xg abzentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 100 µl

LB-Medium resuspendiert, mit einem Drigalski-Spatel auf einer entsprechenden

Selektionsplatte ausplattiert und bei 37° C ÜN inkubiert. Im Falle einer Blau-Weiß-Selektion

(αKomplementationstest nach SAMBROCK ET AL., 1989) wurde zusätzlich 100 µl 100 mM

IPTG und 100 µl X-Gal (2% in Dimethylformamid) vor dem Plattieren der Bakterien

eingespatelt.

2.2.12.2 TSS Methode

Die TSS- (Transformation and storage solution) Methode wurde nach dem Protokoll von

Chung et al. (1989) durchgeführt. Eine mitlogarhythmische Bakterienkultur wurde bei 2000

g, 4°C, abzentrifugiert und die Pellets in jeweils 100 µl TSS-Medium resuspendiert. Nach 10

min Inkubation der Zellen auf Eis wurden 10 µl des Ligationsansatzes dazugegeben und nach

weiteren 20 min auf Eis 900 µl TSS-Puffer dazupipettiert. Nach phänotypischer Expression

wurden die Zellen auf Selektionsplatten ausplattiert und ÜN inkubiert.

2.2.13 Polymerase-chain-reaction (PCR)-Techniken

2.2.13.1 PCR Primer Design und PCR-gerichtetete Mutagenese

Beim Primerdesign wurde auf einen ausgewogenen GC-Gehalt (zwischen 40 und 60 %)

geachtet. Bei einer Länge von 20-26 Nukleotiden resultierte daraus eine Schmelztemperatur

von 48-68°C. Um Primer-Dimere auszuschließen, besaßen die Primerpaare möglichst wenig

Komplementarität zueinander, sowie möglichst wenig palindrome Sequenzen, um die

Ausbildung von Sekundärstrukturen zu vermeiden.

Zur PCR-gerichteten Mutagenese wurde die gewünschte Mutation, z.B. Basenaustausche

zum Einführen von Restriktionsschnittstellen, in den sequenzspezifischen Primer im Bereich

des 5‘-Endes eingefügt. Im Falle von Restriktionsschnittstellen wurden zusätzlich 4-6

Nukleotide an das 5‘ Ende angefügt.

2.2.13.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR zur Amplifizierung von DNA-Templates (SAIKI ET AL., 1988) wurde in einem 50µl-

18

Reaktionsansatz durchgeführt. Die Menge an eingesetztem Template betrug 0,1-30ng. Pro

Reaktion wurden je 50pMol der beiden PCR-Primer eingesetzt, die dNTP-Konzentration war

200µM. Die MgCl2 Konzentrationen variierten je nach Anwendung von 10mM (Standard)

bis zu 17,5 mM bei Amplifikationen größer als 4 kb. Eingesetzt wurden die Taq DNA

Polymerasen/Reaktionspuffer der Firmen Gibco, bzw. Boehringer (Hifi-Taq)

Die PCR-Reaktionen bestanden aus 30-40 Temperaturzyklen. Dabei wurde die DNA zur

Denaturierung auf eine Temperatur von 95° C (1 min) erhitzt. Da die Taq-Polymerase

(Temperaturoptimum 72° C) bereits bei 30-50°C eine partielle Aktivität besitzt, wurde

generell die sog „Hot Start-PCR“ durchgeführt, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden

(ERLICH ET AL., 1991). Bei der Hot Start-PCR wird das Enzym erst nach einer

Hitzeinkubation von 1-5 min bei 95° C und einem anschließenden Abkühlen auf 72° C

dazugegeben. Für die nachfolgende Bindung der PCR-Primer an das DNA-Template wurde

die sog. Annealing-Temperatur der Schmelztemperatur der Primer angepaßt. Sie betrug

zwischen 50-60° C (30 sec). Anschließend folgte die 5´→3´ Kettenverlängerung (sog.

Extension) des Primer-Template-Komplexes bei einer Temperatur von 72°C (45 sec für

Amplifikationen bis 1kb, Extension bis zu 6min +5 sec /Zyklus bei longdistance PCR). Um

unspezifische Primer-Template-Bindungen zu unterbinden, wurden wahlweise 2,5 µl

Tetramethylammoniumchlorid (100mM TMAC) oder bis zu 2µl DMSO in den

Reaktionsansatz gegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit zwei bis drei

Tropfen DNase-freiem Mineralöl (Fa. Sigma) überschichtet, um eine Evaporation der Lösung

während der Reaktion zu verhindern.

Alle PCR-Reaktionen wurden in einem programmierbaren Thermocycler (Nr. IHB101) der

Fa. Biometra bzw. Primus Thermocycler der Fa. MWG-Biotech durchgeführt.

2.2.13.3 Invers-PCR

Die inverse PCR wurde erstmal von Ochman et al. (1988) beschrieben. Die inverse PCR

wurde zur Identifizierung unbekannter gDNA Fragmente im Anschluß an ein Southern-

Blotting (2.2.41) durchgeführt. Der Größenbereich, der dem positiven Signal des Southern-

Blottes entspricht, wurde in einem Parallelansatz aus dem Agarosegel herausgeschnitten und

aufgereinigt (2.2.7). Da beide Enden des mit nur einem Enzym geschnittenen DNA-

Fragmentes mit sich selbst kompatibel sind, wurde in einem Ligationsansatz für 1h bei RT in

19

einer sticky-end Ligation (2.2.8.2) das DNA-Fragment zirkularisiert. Dieses kovalent

geschlossenen DNA-Fragment diente als Template für die subsidiäre Invers-PCR. Mit Hilfe

der Invers-PCR kann ein zirkuläres, kovalent geschlossenes DNA Fragment vollständig

amplifiziert werden. Dazu werden PCR-Primer so generiert, daß sie invers zur

konventionellen PCR orientiert ist. So erfolgt während der PCR die Kettenverlängerung

„run-around“. Die Invers PCR wurde ausschließlich mit „Expand HiFi Taq“ (Fa. Boehringer)

durchgeführt.

2.2.13.4 rapid PCR /Transformanden Screening

Mit einem sterilen Zahnstocher wurde etwas Zellmaterial einer Bakterien-

Transformandenkolonie von der Selektionsplatte gepickt und direkt in ein PCR-Gefäß

überführt, welches den vollständigen PCR-Mix enthält. Anschließend wurde mit diesem

Zahnstocher eine Duplikatsplatte ausgestrichen und ÜN bei 37°C inkubiert. Die PCR-Primer

wurden nach Möglichkeit so gewählt, daß einer komplementär zu Sequenzen im Insert, der

andere komplementär zu Sequenzen im Vektors ist („Vektor/Insert-PCR“). So ist nur bei

gewünschter Klonierungsrichtung eine Bande zu erwarten.

2.2.13.5 RT-PCR

Eine PCR im Anschluß an eine Reverse Transkription wird Reverse Transkription-PCR (RT-

PCR) genannt. Es wurden zur RT-PCR die gleichen Mengen an Puffern, Lösungen und

Primern, sowie dieselben Zyklen verwendet wie unter 2.2.13.2. beschrieben. Als Template

dienten hier 1-50 ng der nach der Reversen Transkription erhaltenen Erststrang-cDNA (siehe

2.2.53).

2.2.13.6 5‘ bzw. 3‘ RACE (random amplification of cDNA ends) –PCR und „nested“PCR

Die Methode der RACE-PCR dient der Amplifikation von vollständigen cDNA Sequenzen

ausgehend von einer bekannten „internen“ Sequenz und den 5‘ bzw. 3‘ Endes der cDNA. Die

RACES wurden mit dem 5‘/3‘ RACE-Kit der Firma Boehringer, Mannheim streng nach

Protokoll des Herstellers durchgeführt. Hierzu wurde poly(A)+-mRNA (2.2.52) isoliert und

mit der im Kit enthaltenen AMV-Reversen Transkriptase bzw. der Superscript II (Gibco) in

cDNA umgeschrieben (2.2.53) Für das 3‘ RACE erfolgte die RT mit dem mitgelieferten

oligo d(T) Ankerprimer 1, der außer der oligo d(T) Sequenz eine zusätzliche Sequenz trägt,

20

die vom Ankerprimer 2 erkannt werden kann. Mit Hilfe einer anschließenden PCR mit einem

„gene of interest“-spezifischen vorwärts Primer im Kombination mit Ankerprimer 1 wird das

3‘Ende der gesuchten cDNA komplettiert. Durch eine zweite „nested“ PCR mit einem weiter

innenliegenden cDNA-spezifischem Primer in Kombination mit dem Ankerprimer 2 kann die

Spezifität des erhaltenen Amplifikates überprüft werden.

Im Falle eines 5‘ RACES wurde die mRNA mit einem reversen genspezifischen Primer

umgeschrieben und somit vorselektiert. Mit Hilfe der im Kit enthaltenen Terminalen

Transferase wurde an das 5‘ Ende der erhaltenen cDNAs ein poly(A)-Schwanz angehängt. In

zwei PCR Reaktionen im Anschluß wurden als reverse Primer zwei genspezifische Primer

zusammen mit den Ankerprimern 1 und 2 verwendet.

2.2.13.7 Herstellung von nicht-radioaktiven DIG-Sonden per PCR

Für Southern-Blots (2.2.41) und Plaque-Hybridisierungen (2.2.18) wurden nicht-radioaktive

Digoxygenin (DIG) markierte Gensonden hergestellt. Digoxygenin ist ein aus Digitalis

purpurea gewonnenes Cardenolid-Steroid und kann nach Hybridisierung durch einen

Antikörper immunologisch detektiert werden (2.2.35). Die Markierung der DNA-Sonde

erfolgte mit Hilfe der PCR (2.2.13). Anstelle des „normalen“ dNTP Mixes wurde ein DIG-

dNTP-labelling-Mix (Fa. Boehringer) verwendet, der einen Teil der dTTP’s durch DIG-11-

dUTP substituiert hat. Durch den Einbau dieses Nukleotides in das Amplifikat wird die

Sonde mit DIG markiert.

2.2.14 Chemolumineszenzdetektion/ ECL-Kit (Fa. Amersham)

Diese Methode wurde zum Nachweis von Proteinen im Westernblot (2.2.35) mit sekundären

Peroxidase-gekoppelten Antikörpern angewandt. Das ECL Kit basiert auf einer Peroxidase-

gekoppelten Reaktion, wodurch ein Luminol (Bestandteil des Kits) oxidiert wird. Bei dieser

Oxidation wird Licht mit einer Wellenlänge von 428nm mit einer Halbwertzeit von ca. 60

min emittiert und kann nach Exposition auf einem Röntgenfilm (Hyperfilm, Fa. Amersham)

nachgewiesen werden. Die Durchführung der Detektion erfolgte streng nach den Angaben

des Herstellers.

2.2.15 Alkalische Phosphatase-NBT/BCIP-Farbreaktion

Die Alkalische Phosphatase-NBT/BCIP-Farbreaktion basiert auf der Oxidation von 5-

21

Bromo-4-chloro-3-indolyl-Phosphat (BCIP) zu Indigo nach Freisetzung der Phosphatgruppe

durch die alkalische Phosphatase. In einer simultanen gekoppelten Reaktion wird Nitroblau

Tetrazoliumchlorid (NBT) zu Diformazan reduziert. Beide Prozesse führen zur Bildung eines

bläulichen unlöslichen Farbpräzipitates. Die NBT/BCIP Farbreaktion wurde zur

immunologische Identifizierung mit Alkalischer Phosphatase gekoppeltem anti-DIG-Anti-

körper von DIG-Sonden hybridisierten Phagenplaques wie unter 2.2.18 beschrieben. Dazu

wurde die NC-Membran in AP-Puffer (100 mM Tris-HCl pH9,5, 100 mM NaCl, 50 mM

MgCl2) equilibriert und mit 99 µl BCIP (50 mg/ml in DMF) und 132 µl NBT (75µg/ml in

70% (v/v) DMF) pro 15 ml AP-Puffer bis zum Farbumschlag inkubiert. Die Reaktion wurde

durch Waschen mit Wasser oder TE gestoppt.

2.2.16 Alkalische Phophatasenachweis mit CSPD (Fa. Boehringer)

Der Nachweis mit alkalischer Phophatase gekoppelter Antikörper wurde streng nach

Vorschrift des Herstellers mit dem CSPD-Kit (Fa. Boehringer) durchgeführt. Es handelt sich

hierbei um eine Chemolumineszenzreaktion, die auf Röntgenfilm dokumentiert werden kann

und ist in Sensitivität und Reaktionsmechanismus vergleichbar mit dem ECL-Kit (2.2.14)

2.2.17 Peroxidasenachweis mit 4-Chloro-1-Naphtol (4CN) (nach Sambrock)

Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Antikörper wurden mit Hilfe von 4 Chloro-1-Naphtol

(4CN) nachgewiesen. 4CN ist farblos und wird unter Zugabe von H2O2 und Peroxidase

oxidiert, was durch einen blauen unlöslichen Niederschlag sichtbar wird. Dazu wurden 15mg

4CN in 5ml Methanol gelöst und mit 25 ml TBS (vorgewärmt auf 37°C) vermischt. Die

Reaktion wurde mit 40µl H2O2 gestartet und mit A. dest. nach Farbumschlag gestoppt.

2.2.18 Screening einer λ-UNI ZAP-cDNA Libary mit DIG markierten DNA-Sonden

Eine cDNA Phagen-libary aus mRNA des Forellengehirns (Stadium 37) lag vor Beginn

dieser Arbeit vor (Dissertation Astrid Stratmann, 1995). Die Durchführung dieses

Hybridisierungsscreenings erfolgte im wesentlichen nach der von Sambrock et al. (1989)

beschriebenen Methode und ist bereits in mehreren Dissertationen (Stratmann, 1995, Strelau,

1997, Nguyen, 1998) detailliert beschrieben.

Eine lamB –induzierte ÜK von E. coli XL-1Blue (Wachstum in LB Medium mit 0,2%

Maltose, 10 mM MgSO4) wurde mit 3-4 x 105 pfu der Phagenlibary infiziert und in

22

verflüssigtem Topagar auf NZY-Platten ausplattiert. Nach Inkubation ÜN bei 37°C sind

klare einzelne Phagenplaques im Bakterienrasen zuerkennen. Nach Abkühlung der Agarplatte

auf 4°C wurde ein Nitrocellulose-Filter aufgelegt, markiert und so ein Abdruck der Plaques

erstellt. Der NC-Filter wurde für 5 min in Denaturierungslösung (1,5M NaCl, 0,5M NaOH)

inkubiert und anschließend mit 1,5M NaCl, 0,5M TrisHCl pH8,0 neutralisiert. Die Filter

wurden kurz in 2xSSC gewaschen und die DNA auf dem Filter durch 20 min 120°C

immobilisiert.

Zur Hybridisierung wurden die Filter in Hybridisierungsbeutel (Fa. Gibco) transferiert und

mit 10 ml Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5xSSC, 2% Blockierungsreagenz Fa.

Boehringer, 0,1% N-Laurylsarcosin, 0,02% SDS) für 1h bei 42°C prähybridisiert. Die

anschließende Hybridisierung mit der DIG-Sonde (50-75 ng/ml Hybridisierungslösung, frisch

denaturiert durch 10 min 95°C, anschließend 5 min auf Eis) erfolgte ÜN bei 42°C.

Der Filter wurde zum stringenten Waschen aus dem Beutel genommen und 2 mal mit

Stringenz A (2xSSC, 0,1% SDS) bei RT und zweimal mit Stringenz B (0,1x SSC, 0,1%

SDS) bei 68°C für je 15 min gewaschen.

Der subsequente Nachweis von hybridisierter DIG-DNA-Sonden erfolgte mit NBT/BCIP

Farbnachweis (siehe 2.2.15). Positive blaugefärbte Signale auf den Filtern konnten eindeutig

Plaques auf den Agarplatten zugewiesen werden. Diese Plaques wurden mit einer

abgeschnittenen Pasteurpipette ausgestochen und in 1 ml SM-Puffer Puffer (5,8g NaCl, 2g

MgSO4 x 7H2O, 50ml 1M TrisHCl pH 7,5, 5ml 2% Gelatine pro Liter) gevortext und ÜN

bei 4°C leicht geschüttelt. Die Phagen diffundieren während dieser Zeit in den SM-Puffer.

Mit Hilfe einer PCR konnte die Spezifität der Hybridisierung überprüft und die

rekombinanten Plaques von falsch positiven diskriminiert werden. Durch zwei

„rescreenings“, in denen der oben beschriebene Ablauf noch zweimal durchgeführt wurde,

wurde ein positiver Plaque auf nahezu Homogenität aufgereinigt.

2.2.19 In vivo excision positiver cDNA/Phagen-Klone

Die in vivo Excision positiver Phagenklone erfolgte mit Hilfe von R408 Helferphagen (Fa.

Stratagene). Bei der in-vivo Excision nutzt man in trans wirkende Proteine des

Helferphagen, die zwei Domänen (Initiator und Terminator des f1 origin) erkennen, welche

23

flankierend zu den cDNA-Inserts auf dem λ-UNI-ZAP Phagenarmen positioniert sind. Die

dazwischenliegenden DNA-Sequenzen (pBluescript mit cDNA-Inserts) wird als

zirkularisierter Einzelstrang in filamentöse Phagmide verpackt und sekretiert. Diese

ssPhagmide können neue Bakterien infizieren, so daß die cDNAs als dsPlasmid-DNA

vorliegen. Die vivo Excision erfolgte streng nach Vorschrift des Herstellers.

Zur in vivo Excision wurden lamB-induzierte E. coli XL1-Blue Zellen (200 µl einer OD600

von 1,0 in 10 mM MgSO4)mit ca. 5x105 pfu des positiven λ-UNI-ZAP Klones und 1x104

R408 Helferphagen für 15 min bei 37° C coinfiziert. Nach Inkubation mit 2xYT Medium für

3h bei 37°C sind mit Hilfe der Helferphagen pBluescript-Phagmide entstanden, die die

gesuchte cDNA als Insert in der multi cloning-site tragen, sekretiert worden. Die Bakterien

werden durch 20 minütiger Hitzeinkubation bei 70° C abgetötet. Die Hitzeresistenten

pBluescriptphagmide liegen im Überstand vor. Durch eine anschließende Infektion frischer

XL1-Blue-Zellen mit diesen Phagmiden und subsequentes Ausplattieren auf einer Amp-

Selektionplatte (ÜN 37° C) wurde auf die pBluescript-Plasmid tragenden Bakterien

selektioniert. Die Plasmid-DNA, die das gesuchte cDNA Insert trägt, konnte mit unter 2.2.2

beschriebenen Methoden präpariert werden.

2.2.20 Heterologe Expression in Insektenzellen mit Baculoviren / Bac-to-Bac-System(Fa.Gibco)

Der Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), kurz auch Baculovirus

genannt, infiziert Insektenzellen, schleust sein Genom in die Wirtszelle ein und bedient sich

des Proteinbiosyntheseapparates des Wirtes zur eigenen Vermehrung. Die Wirtszelle lysiert

nach Virusvermehrung und setzt so neue Viren frei. Da das Virusgenom bei einer Größe von

ca. 130 kb auch nicht-essentielle Bereiche enthält, ist der Baculovirus ein idealer Transporter

für Fremd-cDNA und daher geeignet für heterologe Proteinexpression. Aufgrund der Größe

des AcNPV-Genomes ist eine direkte Klonierung mit Fremd-DNA ähnlich der Konstruktion

rekombinanter Plasmide nicht möglich. Das verwendete Bac-to-Bac-System löst das

Klonierungsproblem durch gerichtete Transposition. Die Ziel-cDNA wird zunächst in

pFastbac unter der Kontrolle des für Insektenzellen konstitutiven Polyhedrin-Promoters

(bzw. für pFastbacDual P10-Promoters) subkloniert. Der Vektor pFastbac trägt flankierend

zum Polylinker (Multicloningsite) Konsensussequenzen für das bakterielle Tn7 Transposon

24

und dient einzig als Klonierungs-Vektor. Das AcNPV-Genom ist ebenfalls rekombinant

verändert worden und liegt als Shuttle-Vektor (Bacmid genannt) in einem speziellen

DH10Bac-E. coli-Stamm vor. Dieses Bacmid (bMON14272) trägt die essentiellen AcNPV-

Gene, darüber hinaus aber u.a. Resistenzmarker, mini-F-Replikon und eine lacZ-Kassette zur

α-Komplementation (Blau/Weiß-Selektion, 2.2.12.1), die es möglich machen, das AcNPV

Genom in E. coli zu replizieren. Das Bacmid trägt außerdem Tn7-Transposon attachment

sites. Die Tn7 Transpositionsfunktionen werden in trans durch ein weiteres Helferplasmid

(pMON7124) in DH10Bac zur Verfügung gestellt. Transformiert man nun sein Zielgen mit

Hilfe des pFastbac in kompetente DH10Bac, so springt es samt Polyhedrinpromoter durch

gerichtete Transposition in das Bacmid. Durch Blau/Weiß-Selektion kann man auf

rekombinante Bacmid-Kolonien diskriminieren. Nach Präparation der rBacmid-DNA wird sie

in Insektenzellen transfiziert, so daß nach 4-6 Tagen rekombinante AcNPV geerntet werden

können.

2.2.20.1 Herstellung rekombinanter AcNPV / Lagerung

Das Bac-to-Bac System wurde im wesentlichen nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt:

Nach Subklonierung des Zielgenes in pFastbac erfolgte die Transformation in DH10Bac nach

der TFB-Methode (2.2.12), wobei mehrere Verdünnungsstufen auf LB-Bac Agarplatte

ausplattiert wurden. Nach 2 d Inkubation bei 37° C zur Transposition/Blau-Weiß-Selektion

wurden weiße Kolonien erneut auf einer Selektionsplatte ausgestrichen, um falsch positive

Kolonien auszuschließen. Die positiven Bacmidklone wurden ÜN bei 37°C in LB Bac-

Medium (2.1.6) kultiviert. Abweichend zum Herstellerprotokoll erfolgte die Bacmid-

Präparation mit Hilfe der Jet-Star Präparation (2.2.2.2), wobei der Elutionspuffer auf 65°C

erhitzt wurde, um die rBacmidDNA (>100kb) besser zu eluieren. Die initiale Transfektion

von Insektenzellen erfolgte mit Cellfectin in 35 mm Zellkulturschälchen (2.2.50). Wurde das

Reportergen GFP verwendet, so waren bereits nach 2 Tagen Inkubation bei 27°C die ersten

positiven Zellen detektierbar. Nach weiteren 3-6 Tagen waren nahezu alle Zellen infiziert,

einige bereits lysiert. Das rAcNPV enthaltende Medium wurde abpipettiert und sterilfiltriert.

So wurden pro 35 mm Transfektion 1 ml Primärviren gewonnen. Die rAcNPV wurden nun in

Nunc-Kryoröhrchen dunkel bei 4°C gelagert und waren länger als 1 Jahr infektiös.

Zur Virusvermehrung wurden 1 ml der Primärviren auf eine 50ml HighFive, bzw. Sf21

25

Kultur (2.2.45) gegeben und für 6-7 Tage bis annähernd zur vollständigen Zellyse bei 27°C

inkubiert, der Virusüberstand abgenommen, sterilfiltriert und bei 4°C gelagert. Zur

Kryokonservierung wurde dem Medium DMSO (Endkonzentration 10%) und FCS

(Endkonz. 10%) hinzugefügt und wie eine Bakteriendauerkultur bei -70°C gelagert. Zum

Auftauen werden sie bei 37°C im Wasserbad zügig erwärmt und für 1-2 h auf eine

vorbereitete Flasche konfluenter Insektenzellen gegeben. Anschließend kann das Medium

durch frisches Kulturmedium ersetzt werden.

2.2.20.2 Virustiterbestimmung und Klonierung durch limitierende Verdünnung

Der Titer der rAcNPV wurde durch limitierende Verdünnung bestimmt (Nur bei GFP oder

anderen Reportergen-tragenden rAcNPV möglich). Dazu wurde in einer 96 Napf-(well)

Mikrotiterplatte Sf21 bzw. HighFive Zellen in einem Volumen von je 100 µl auf ca. 50 %

Konfluenz angezogen. In Napf A1 wurden 100 µl der zu untersuchenden Viruslösung

gegeben, gut durchmischt und 100 µl des Überstandes in B1 pipettiert. Aus diesem Napf

wurden nach dem gleichen Schema 100 µl in den jeweilig nächsten Napf pipettiert bis H1

erreicht wird. Von den dort anfallenden 200 µl wurden 100 µl nach Durchmischung

verworfen. Nach gleichen Schema wurden die senkrechten wells reihenweise verdünnt. Die

so pipettierte Mikrotiterplatte enthält in der Waagerechten und Senkrechten subsequente

50% Verdünnungen, wobei die aufsteigenden Diagonalen jeweils die gleichen

Verdünnungsstufen aufweisen. Nach anschließender Inkubation der Platte bei 27°C wurde

die GFP Expression 4-6 Tage später kontrolliert. Mit Hilfe der Verdünnungsstufen konnte

der Virustiter errechnet werden. Er lag bei 2-4x 106 pfu/ml. Der Virenüberstand der letzten

positiven Verdünnungsstufe wurde abgenommen und als Virenklon amplifiziert. Aufgrund

der großen Zeitspanne des Experimentes wurden 2 –3 verschiedene Virusvorverdünnungen

parallel getestet.

2.2.20.3 Infektion und Expression/Aufreinigung im Baculovirus-System

Der Primärvirusüberstand eines Virenklones wurde zur heterologen Expression eingesetzt.

Dazu wurde eine konfluente 5 ml Kultur mit HighFive-Zellen auf 100 ml Kulturmedium

verdünnt und in einer 600 ml Kulturflasche bei 27° C bis zum Anheften der Zellen inkubiert.

Die Infektion erfolgte mit 200 µl des Primärvirusüberstand eines Virenklones (d.h. ca. 8x 105

pfu). 5 Tage nach Infektion wurden die Zellen mit einem Rubberpoliceman geerntet, 5 min

26

800xg pelletiert und der Virusüberstand für weitere Expressionen aufbewahrt. Die weitere

Aufreinigung erfolgte mit dem His-Bind-Kit (2.2.24 f) mit folgenden Veränderungen: Das

Zellpellet wurde in 1 ml 1x His-Bindingpuffer, supplementiert mit ca. 20 µg/ml DNase I (Fa.

Boehringer) und 200 µl Proteinase-Inhibitor-Cocktail, der keine Metall-Chelat-

Affinitätschromatographie inhibierenden Agenzien enthielt (Fa. Sigma), resuspendiert. Die

Zellyse erfolgte durch 3x Gefrier/Auftau-Zyklen mit subsidiärem Abbau der freigewordenen

und hochviskosen gDNA durch DNase I (15 min Inkubation bei 37°C). Diese

Proteinsuspension wurde auf 10 ml 1x His-Bindepuffer aufgefüllt. Diesem Bindepuffer wurde

wahlweise 1% NP-40, 2% Triton X-100 oder 6 M Guanidin-HCl (Endkonzentrationen)

zugesetzt. Nach zusätzlichem Scheren der DNA durch mehrmaliges Passieren einer 21 gauge

Kanüle wurden die verbleibenden Zelltrümmer bei 21000xg bei 4°C für 20 min pelletiert. Im

Falle der denaturierenden Aufreinigung in Gegenwart von 6 M Gu-HCl wurde die

Zellsuspension vor der Zentrifugation für 1 h auf Eiswasser inkubiert, um die an den

Zellmembrantrümmern gebundenen Proteine abzulösen. Die weitere Aufreinigung erfolgte

wie unter 2.2.24, mit dem Unterschied, daß Detergenzien bzw. 6 M Gu-HCl allen

verwendeten Puffern zugesetzt wurden. Proteinproben, die in Gegenwart von 6 M Gu-HCl

erstellt worden sind, mußten vor einer SDS-PAGE erst mit Hilfe von Slide-A-Lyzern

Dialysemembranrähmchen (Fa. Pierce) gegen entsprechenden Puffer ohne das chaotrope Salz

dialysiert werden.

2.2.21 Heterologe Expression in E. coli /pMAL-System (Fa. NEB)

Der pMAL-C2 Vektor trägt unter der Kontrolle des starken induzierbaren bakteriellen tac

Promotors das malE Gen, welches für das Maltose-Binde-Protein aus E. coli codiert. Durch

Insertion des Zielproteingenes in den dahinterliegenden Polylinker entsteht unter Beachtung

des Leserahmens bei Expression eine c-terminale Fusion des Maltose-Binde-Proteins mit dem

Zielprotein. Dieses Fusionsprotein kann aufgrund der Affinität des Maltose-Binde-Proteins

zu Amylose durch eine Affinitätschromatographie aufgereinigt werden.

Durch PCR-gerichteter Mutagenese konnten die entsprechenden Zielproteine in den pMAL-

C2 Vektor kloniert werden. Das entstandene Konstrukt wurde durch PCR und

Restriktionsverdau, sowie durch Sequenzierung auf Richtigkeit kontrolliert. Nach

Transformation in den lon und omp Protease-defizienten E. coli-Stamm TB-1 wurden 500 ml

27

RM-Medium mit 5 ml dieser ÜK angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,8-1,0 im

Schikanekolben bei 37°C 150 rpm inkubiert, mit IPTG (Endkonzentration 0,3 mM) induziert

und für weitere 3h bei 37°C inkubiert. Zur Zellernte wurden die Zellen bei 4°C für 5 min und

5000g abzentrifugiert und in 10 ml Bindepuffer (siehe 2.2.22) resuspendiert und bei –20°C

ÜN gelagert.

2.2.22 Affinitätschromatographie mit Amylose-Beads (pMAL-System)

Die Affinitätschromatographie mit Amylose-Beads erfolgte nach Protokoll des Herstellers.

Die Zellen wurden in Bindepuffer (20 mM TrisHCl, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4)

im Eisbad aufgetaut und mit dem Sonifier (Fa. Branson) für ca. 20 min im Eisbad mit

Pulslängen von ca. 1 Sekunde mit Ultraschall lysiert. Die lysierten Zellen wurden für 30 min

bei 9000xg 4° C zentrifugiert und der Überstand auf die zuvor mit Bindepuffer equilibrierte

Amylosebead-Säule (Fa. NEB) gegeben. Die Säule wurde subsidiär mit 10-fachem

Säulenvolumen Bindepuffer gespült. Die an der Säule gebundene Maltosebindeproteinfusion

wurde mit Elutionspuffer (Bindepuffer mit 20 mM Maltose) von der Säule abgelöst, in 1 ml

Fraktionen aufgefangen, die Proteinkonzentrationen bestimmt und die proteinhaltigen

Fraktionen durch eine anschließende SDS-PAGE analysiert. Die so aufgereinigten

Proteinfusionen wurden im Elutionspuffer bei 4°C gelagert bzw. lyophilisiert.

2.2.23 Heterologe Expression in E. coli/pET-System (Fa. Novagen)

Die heterologe Expression in E. coli/pET-System erfolgte im wesentlichen nach Protokoll

des Herstellers (Fa. Novagen).

Der pET-16b Vektor trägt unter der Kontrolle des induzierbaren Bakteriophagenpromotors

T7 eine Nukleotidsequenz, die für 10 aufeinanderfolgende Histidine codiert. Durch

Klonierung des Zielproteins unter Beachtung des Leserahmens in den distalen Polylinker

entsteht bei Expression eine c-terminale „His(10)-Tag“-Zielprotein-Fusion, die durch Ni2+-

chelatierende Sepharose durch Affinitätschromatographie (2.2.24) aufgereinigt werden kann.

Die codierende Sequenz des 36K Proteins wurde unter Berücksichtigung des Leserahmens

mit Hilfe der PCR-Mutagenese in pET 16b kloniert. Das Konstrukt wurde sequenziert und in

den für dieses System optimierten E. coli Expressionsstamm BL21 DE3 (pLysS )

transformiert. Dieser Bakterienstamm trägt auf einem Prophagen das Gen für die T7-

Polymerase, welche nach Induktion mit IPTG die Expression des His-Tag-Fusionsproteines

28

erlaubt. Zur Expression wurden 500 ml LB-Amp Medium mit 5 ml einer ÜK angeimpft bei

37° C bei 150 rpm im Schikanekolben inkubiert und bei einer OD600 von 0,8 bis 1,0 mit

IPTG (Endkonz. 1 mM) für 3 h induziert.

2.2.24 Affinitätschromatographie mit Ni 2+-chelatierender Sepharose

Die Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose kann unter nativen und

unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von chaotropen Salzen durchgeführt

werden. Sie erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers (His-Bind Kit, Fa. Novagen).

Native Aufreinigung: Nach Zellernte wurde das Zellpellet in His-Binde Puffer (5 mM

Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM TrisHCl, pH 7,9) resuspendiert und bis zur Zellyse

sonifiziert. Nach Pelletierung der unlöslichen Bestandteile und Zelltrümmer für 15 min bei

21000xg wurde der lösliche Überstand auf eine zuvor mit NiS04 geladene (Ladepuffer 50

mM NiS04) und mit His-Bindepuffer equilibrierte His-Bind Sepharose (Fa. Novagen)

gegeben. Anschließendes Säulenwaschen erfolgte durch His-Bindepuffer (10 faches

Säulenvolumen ) und 5x Säulenvolumen His-Waschpuffer (His-Bindepuffer mit 60 mM

Imidazol). Nach Elution mit His-Elutionspuffer (His-Bindepuffer mit 1M Imidazol) erfolgte

die Fraktionierung und Proteinanalyse wie unter 2.2.22 beschrieben.

Zur denaturierenden Aufreinigung (2.2.25) wurde den Puffermedien (außer dem Ladepuffer)

6M Harnstoff bzw. 6M Guanidin-Hydrochlorid zugefügt. Unter denaturierenden

Bedingungen ist die Bindung von His-Tag-Proteine an die Säule nicht mehr so stark. Um

Proteinverluste zu vermeiden, erfolgten die Waschschritte mit reduzierten

Imidazolkonzentrationen (His-Bindepuffer mit 15 mM Imidazol).

2.2.25 Aufschluß von Einschlußkörpern (inclusion bodies)

Nach Induktion liegen viele hochexprimierten Proteine in E. coli als Einschlußkörper

(inclusion bodies) vor. Diese sind nicht löslich und werden nach Zellyse wie oben beschrieben

mit den Zelltrümmern sedimentiert. Um Proteine aus diesem unlöslichen Bestandteilen

herauslösen zu können, wurden chaotrope Salze wie 6 M Harnstoff oder 6 M Guanidin-

Hydrochlorid verwendet. Die His-Tag Fusionsproteine binden unter diesen denaturierenden

Bedingungen immer noch selektiv an die Säulenmatrix. Zur Aufreinigung von Zielprotein aus

29

inclusion bodies wurde das Zellpellet nach Zellyse (siehe 2.2.24) in Bindepuffer mit 6 M

Harnstoff aufgenommen, durch eine Kanüle resuspendiert und für 1h auf Eis inkubiert. Durch

anschließende Zentrifugation bei 20000xg für 45 min wurde der Überstand mit einem 0,45

µm Sterilfilter filtriert, um letzte unlösliche Bestandteile und DNA-Reste von der

niedrigviskosen und klaren Proteinlösung abzutrennen. Dieser Proteinüberstand wurde wie

oben beschrieben in Gegenwart von 6 M Harnstoff auf die His-Bind Säule gegeben und

weiter aufgereinigt.

2.2.26 Affinitätschromatographie mit Farbsepharosen (reactive-red, Fa. Merck)

Farbsepharosen wie „reactive-red“ (Fa. Merck) ähneln auf ihrer Oberfläche den

Dinukleotiden NAD/NADP. Es ist daher möglich mit „reactive-red“ NAD/NADP-bindende

Proteine in einer Affinitätschromatographie aufzureinigen. Die Affinitätschromatographie mit

Farbsepharosen wurde daher als alternative native Aufreinigungsmethode für das 36K

Protein eingesetzt. Die Farbsepharose wurde mit 50 mM TrisHCl pH 7,4 equilibriert, die

induzierten Bakterienzellen geerntet, in 50 mM TrisHCl pH 7,4 resuspendiert und lysiert. Der

lösliche Überstand wurde auf die Säule gegeben. Nach Waschen der Säule mit 10-fachen

Säulenvolumen mit 50 mM TrisHCl wurde das gebundene Protein mit Hilfe von TrisHCl

supplementiert mit 25 mM NAD bzw. NADP eluiert. Die eluierten Proteinfraktionen wurden

gefällt (2.2.30 bzw.2.2.31) und im Westernblot (2.2.34 f) detektiert.

2.2.27 Heterologe Expression in E. coli /IMPACT-System (Fa. NEB)

Bei dem IMPACT-System wird das Zielprotein als N-Terminale Fusion unter Beachtung des

Leserahmens exklusive des Stop-Codons vor ein Gen kloniert, welches für eine

Inteinsequenz codiert, gefolgt von einer Chitinbindedomäne. So entsteht nach Induktion des

pTac-Promotors eines Proteinfusion, die über eine Affinitätschromatographie mit Chitin-

Kügelchen aufgereinigt werden kann. Durch die selbstspleißende Aktivität innerhalb der

Inteinsequenz zwischen Zielprotein und Chitinbindedomäne wird die Fusion zielgerichtet

unter Verwendung von reduzierenden Agenzien wie DTT hydrolysiert und kann daher ohne

Erweiterung von der Chitinsäule eluiert werden. Die Durchführung dieser Methode erfolgte

streng nach Protokoll des Herstellers.

2.2.28 Proteinbestimmung (nach Bradford, 1979)

30

Es wurde die zu bestimmende Proteinlösung auf 500 µl A. dest. verdünnt und mit 500 µl

Bradford-Farbreagenz (50 mg Coomassie Brilliant Blue G 250 gelöst in 10 ml absolutem

Ethanol p.A., 175 ml ortho-Phosphosäure (85%) auf 1000 ml A.dest.) in einer 1 ml

Mikroküvette 15 min bei RT inkubiert. Die Absorption bei 595 nm wurde im

Spektralphotometer bestimmt. Durch eine Referenzkurve (1 bis 10 µg BSA) konnte die

Proteinkonzentration errechnet werden.

2.2.29 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel Test

Es wurde 1 µl der zu bestimmenden Proteinlösung auf einen Nitroacetatstreifen aufgespottet

und für 3 min in Amidoschwarz (0,5% (w/v) Amidoschwarz in 9:1 Methanol/Eisessig)

gefärbt. Durch anschließendes Entfärben in 9:1 Methanol/Eisessig kann mit Hilfe einer

parallel durchgeführten Standard Eichreihe die Proteinkonzentration bestimmt werden.

2.2.30 Proteinfällung mit Aceton

Zur Proteinfällung mit Aceton wurde die wäßrige Proteinlösung mit 3x Volumen –20°C

kaltem Aceton durchmischt und für 30 min bei –20° C inkubiert. Die präzipitierten Proteine

wurden bei 4° C bei 20.000xg für 20 min pelletiert und zweimal mit kaltem Aceton

gewaschen. Nach Absaugen des Acetonüberstandes und Evaporation von Acetonresten in

der Speedvac (1 min, Schalterstellung low), wurde das Präzipitat in 1x Laemmlipuffer (siehe

2.2.32), bzw. Puffer nach Wahl resuspendiert.

2.2.31 Proteinfällung mit TCA

Die Proteinlösung wurde mit Trichloressigsäure (TCA) versetzt (Endkonzentration 10%), 10

min auf Eis inkubiert und bei 4°C, 20.000xg für 10 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde

zweimal mit eiskaltem Aceton gewaschen und schließlich wie unter 2.2.30 beschrieben

resuspendiert.

2.2.32 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli)

Zur analytischen Proteingelelektrophorese nach Laemmli wurden diskontinuierliche Puffer-

Systeme gewählt. Zunächst wurden die Trenngele (12-16 % Endkonz. bei einer AA/BAA

Konzentration von 37,5:1 (Fertiglösung Fa. Roth)), und 1/1000 Volumen TEMED, 1/500

Volumen Ammoniumpersulfatlsg. (10% w/v), 0,375 M TrisHCl pH 8,8, 1% SDS im Hoefer

Mighty Small Gelcaster gegossen und mit n-Butanol überschichtet. Nach Polymerisation

31

wurde das Butanol abgegossen, kurz mit Wasser gespült, das Sammelgel (5% wie oben mit

0,125 M TrisHCl, pH 6,8) eingefüllt und der Teflonkamm eingeführt. Proteinproben wurden

vor dem Lauf mit 2x Lämmlipuffer (Präzipitate mit 1x Lämmlipuffer) für 3 min aufgekocht.

Die Elektrophorese erfolgte bei 15 mA im Sammelgel und 30 mA im Trenngel.

2.2.33 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Native-PAGE)

Die Native PAGE (nicht-denaturierend ohne SDS) wurde mit fertigen 4-20% „NuPAGE“

Tris-Glycin Gelen (Fa. Novex) nach Vorschrift des Herstellers in Nativ-Laufpuffer bei

konstant 125V gefahren.

2.2.34 Proteintransfer auf Nitrozellulosemembran (Westernblot)

Es wurden drei Lagen Blotpapier (Fa. Schleicher & Schuell) in Größe des zu blottenden Gels

in Transferpuffer (25 mM Tris, 20 mM Glycin, 20% (v/v) Methanol) getränkt und auf die

Anode der Semi-Dry-Blotting Apparatur (Fa. Phase) gelegt. Darüber wurde ein gleich

großes mit Transferpuffer getränktes Stück Nitrozellulose (Fa. Schleicher & Schuell)

luftblasenfrei aufgelegt. Das darüber aufgelegte SDS-Gel bzw. native Gel wurde vorher für 5

min in Transferpuffer equilibriert und mit weiteren drei Lagen getränktem Blotting-Papier

blasenfrei bedeckt. Die Kathode der Blotkammer wurde auf das Sandwich aufgelegt und mit

ca. 1 kg beschwert. Der Transfer erfolgte bei 150 mA für 1,5 h. Die auf der Nitrozellulose

transferierten Proteine wurden durch 5 min Inkubation in Ponceau-S-Lösung (0,1% (w/v)

Ponceau-S, 5% (v/v) Essigsäure) und anschließendes Spülen mit TBS (10 mM Tris HCl pH

8,0, 150 mM NaCl) reversibel angefärbt, wobei der Größenstandard vor Entfärbung mit dem

Skalpell abgetrennt wurde.

2.2.35 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulosemembran

Die proteintragende Nitrozellulosemembran wurde für 30 min in TBST/Gelatine (10 mM

TrisHCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,3% Gelatine) geschwenkt, um

unspezifische Antikörperbindung zu vermeiden. Nach 30 min Inkubation mit dem

entsprechenden Antikörper (verdünnt in TSBT/Gelatine) und 3x5 minütigem Waschen der

Membran mit TBST/Gelatine wurde der sekundäre Peroxidase oder Alkalische Phosphatase

gekoppelte Antikörper (ebenfalls verdünnt in TBST/Gelatine) für 30 min dazugegeben.

32

Anschließend wurde der überschüssige Antikörper durch 3x5 min Waschen der Membran in

TBS entfernt. Die Bindung des Antikörpers konnte wie unter 2.2.14 - 2.2.17 beschrieben

detektiert werden.

2.2.36 Zellaggregations/Adhäsionstest

Im Zellaggregationstest konnte die Adhäsivität von heterolog exprimierten

Oberflächenproteinen in stabil transfizierten rekombinanten Zellinien (2.2.51) detektiert

werden. Der Assay basiert auf der Tatsache, daß Einzelzellen in Suspension unter leichtem

Schwenken in charakteristischer Weise zu Zellaggregaten aus vielen Einzelzellen aggregieren

können, was zur Abnahme der absoluten Partikelzahl in der Suspension führt. Die Abnahme

der absoluten Partikelzahl mit der Zeit kann mit Hilfe eines Partikelzählgerätes (Coulter

Counter Mod. ZM) quantifiziert werden und ergibt ein Maß für die adhäsiven Eigenschaften

der Oberflächenproteine der Zelle, ausgedrückt durch den Quotient der absoluten

Partikelanzahl zum gewählten Zeitpunkt / absoluten Partikelanzahl zum Startzeitpunkt t=0

(N(t) /N(0)) und kann visuell unter dem Mikroskop verifiziert werden.

Dazu wurden je drei 100 mm-Zellkulturschälchen stabiler Expressoren sowie eine nicht

transfizierte Kontrolle der gleichen Zellinie bis zu einer Konfluenz von 80-90% inkubiert,

zweimal mit serumfreien DMEM gewaschen und mild trypsiniert (0,0025% (w/v) Trypsin in

DMEM). Die Zellen wurden im Mikroskop beobachtet und nach ca. 10 min die leicht

angelösten Zellen mit einer 10 ml Pipette vom Zellkulturschälchen abgespült, dreimal mit 4°

C kaltem Kulturmedium gewaschen (Zentrifugation für 5 min bei 800xg 4°C) und in 1 ml

4°C kalten DMEM (supplementiert mit 10% FCS, 20 mM Glutamin) durch viermaliges

Pipettieren durch eine 18 gauge Kanüle zu Einzelzellen resuspendiert. Unter dem Mikroskop

wurde die Suspension auf das Vorhandensein von mindestens 99% Einzelzellen kontrolliert

und die absolute Partikelanzahl mit Hilfe eines Coulter Counters bestimmt. Es wurden jeweils

2 x106 Zellen/ml für den Aggregationsassay eingesetzt. Die Zellen wurden bis zum Start des

Assays auf 4° C gehalten. Der Assay erfolgte in Doppelproben auf einer Wippe (Fa.

Heidolph) bei 37° C und 5-10 rpm im 2 ml-Eppendorfcup. Nach 5 min Inkubation in 37° C

hatte die Zellsuspension die Assaytemperatur von 37° C erreicht. Es wurde die Zellzahl

bestimmt und als Referenzwert zum Zeitpunkt 0 definiert. Die weitere Probenentnahme nach

definierten Zeitabständen erfolgte mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze mit einer so

33

vergrößerten Öffnung, um mögliche Zellaggregate durch auftretende Scherkräfte während

des Pipettierens nicht zu zerstören. Vor der Probenentnahme wurde das Reaktionsgefäß

einmal vorsichtig invertiert. Die absolute Partikelanzahl wurde mit dem Coulter Counter

bestimmt. Es wurden pro Doppel-Probe je drei unabhängige Experimente durchgeführt und

gemittelt.

2.2.37 Trypan-Blau-Ausschlußtest

Durch einen Trypan-Blau-Auschlußtest konnten lebende von toten Zellen unterschieden

werden. 0,1 ml der Färbelösung (0,4 % Trypan-Blau in PBS, pH 7,2) wurde pro ml

Zellkulturmedium auf die adhärenten Zellen gegeben und unter dem Mikroskop betrachtet.

Tote Zellen färben sich blau, während lebende Zellen nicht angefärbt werden.

2.2.38 ELISA zur Quantifikation extrazellulärer IP-Proteindomänen

Um das Expressionsniveau der IP-Proteine bzw. ihrer Konstrukte auf der Zellmembran stabil

transfizierter Expressoren zu bestimmen, wurde ein indirekter ELISA (weitestgehend nach

DOHERTY ET AL., 1990) durchgeführt. Dazu wurden ca. 2000-3000 Zellen (quantifiziert mit

dem Coulter Counter) pro Napf in einer Nunc-96-well Mikrotiterplatte gegeben und ÜN im

Brutschrank inkubiert. Am nächsten Morgen wurde eine Reihe Zellen (8 Näpfe) trypsiniert,

abgelöst und die mittlere Zellzahl/Napf erneut bestimmt. Die verbleibenden Zellen wurden

zweimal mit kaltem PBS gespült, bei RT mit 4% Paraformaldehyd/PBS für 30 min fixiert und

wiederum mit PBS gespült. Die fixierten Zellen wurden für 30 min in 1%BSA/PBS zur

Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen bei RT inkubiert. Nach Zugabe des

primären Antikörpers (αIP1 bzw. αIP2 beide 1:100 in PBS/BSA verdünnt) für 30 min

wurden die Zellen erneut dreimal für 5 min mit PBS/BSA gespült. Der sekundäre

Peroxidase-gekoppelte Antikörper (Fa. Biorad, 1:3000) wurde nach 30 min Inkubation

fünfmal mit PBS abgespült und anschließend mit 100 µl dH2O überschichtet. Die

subsequente Farbreaktion erfolgte durch Zugabe von 50 µl 0,2% (w/v) o-phenylenediamine

(OPD, Fa. Sigma) in 0,05 M Citratpuffer pH 5,5 mit 0,02% H2O2 pro Napf. Die

enzymatische Reaktion wurde nach 15 – 45 min durch Zugabe von 50% H2SO4 gestoppt und

die optische Dichte im Multiwellreader (Fa. Molecular Devices) bei 490 nm bestimmt. Als

Kontrolle dienten nicht transfizierte CHO-Zellen. Es wurden pro Zelltyp mindestens 28

34

Näpfe je dreimal bestimmt und so die OD 490/Zellanzahl gemittelt. Der Quotient (Verhältnis)

aus mittlerer OD490/Zellzahl transfizierter Zellen und mittlerer OD490/Zahl nichtransfizierter

Zellen ergibt eine dimensionslose Einheit für das Maß der Expression der extrazellulären

Epitope der IP-Proteine bzw. IP-Konstrukte auf der Oberfläche der CHO-Zellmembran.

2.2.39 Protein-Phospholipid-Bindungstudien mit Transil-Kügelchen (Fa. Nimbus)

Transil-Kügelchen sind auf ihrer Oberfläche mit Phospholipiden beschichtet, die in der

Zusammensetzung definiert variiert werden können. Sie stellen daher ein ideales System zur

Untersuchung von Protein-Phospholipid-Wechselwirkungen dar. Hierzu wurde das zu

untersuchende Zielprotein (gelöst in 20 mM HEPES pH 7 und 50 mM NaCl) für 15 min bei

RT mit Transilen unterschiedlicher Phospholipidzusammensetzung gegeben und unter

leichtem Schwenken inkubiert. Die Transilkügelchen wurden pelletiert, das gebundene

Protein durch Zugabe von 2 % SDS abgelöst, die gebundene Proteinmenge nach Bradford

(2.2.28) bestimmt und auf ein SDS-PAGE aufgetragen werden. Die Transil-Bindungsstudien

wurden als Auftragsarbeit von der Firma Nimbus durchgeführt.

2.2.40 Protein-Protein-Bindungsstudien („overlay-assay“)

Für Protein-Protein-Bindungsstudien wurde ein ca. 1 µg Protein als „Köder“ auf eine

Nitrozellulosemembran aufgespottet und so immobilisiert. Die Membran wurde zur

Absättigung unspezifischer Proteinbindungen für 30 min in TSB/ 1% BSA inkubiert.

Anschließend wurde die Membran in der zu detektierenden Proteinlösung (ca. 1 mg/ml in 20

mM TrisHCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM Maltose) für 30 min geschwenkt. Die Detektion

der Bindung des Zielproteins an das Köderprotein erfolgte immunologisch wie unter 2.2.35

beschrieben.

2.2.41 DNA-Transfer auf positivierter Nylonmembran (Southern-Blot)

Nach elektrophoretischer Auftrennung von DNA-Fragmenten (ca. 5 µg gDNA pro

Restriktionsverdau) wurde das 0,8 % ige Gel für 10 min in Denaturierungspuffer (1,5 M

NaCl, 0,5 N NaOH) denaturiert, kurz in A. dest. gespült und anschließend für 2 x 15 min im

Neutralisierungspuffer (1 M TrisHCl, 1,5 M NaCl, pH 7,4) unter leichtem Schütteln

neutralisiert. Danach wurde überschüssiges Gelmaterial abgetrennt und das Gel vor Beginn

35

des Transfers für 30 min in 20 x SSC inkubiert und der Blot-Sandwich wie unter Sambrock

et al. (1989) beschrieben installiert. Als Blot-Membran diente positivierte Nylonmembran

(Fa. Boehringer). Der Kapillartransfer erfolgte über Nacht. Die Hybridisierung mit der DIG-

markierten Sonde erfolgte wie unter unter 2.2.18 beschrieben. Der Farbnachweis erfolgte mit

Hilfe des CSPD-Kits (2.2.16) nach Vorschrift des Herstellers.

2.2.42 Radioaktive DNA-Kettenabbruch-Sequenzierungen (nach Sanger)

Die Sequenzierung von DNA wurde nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode (SANGER

ET AL., 1977) mit Sequenase Version 2.0 (Fa. USB) durchgeführt. Als Template für die

Sequenzierung diente Plasmid-DNA, die durch Jet-Star-Präp (2.2.2.2) gewonnen wurde.

Als Sequenzgele wurden 5%, 6% oder 8% Long Ranger (chemisch modifiziertes Acrylamid-

monomer mit neuartigem Cross-Linker, Fa. AT Biochem) und 7 M Harnstoff (in 1,2-fach

TBE-Puffer) enthaltende denaturierende Gele gegossen. Die Gele waren 0,23 mm dünn und

die Probentaschen wurden mit einem Sägezahnkamm geformt. Als Laufpuffer diente 0,6 x

TBE (1xTBE: 45 mM Tris, 45 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8). Für die Elektrophorese

der Sequenzgele wurde die Sequenzgelapparatur DS 91 (Fa. Biometra) eingesetzt. Die

Elektrophorese wurde mittels einer temperierbaren Laminarstromplatte bei einer konstanten

Temperatur von 50°C und einer Spannung von 2500 V, bei max. 96 W durchgeführt. Nach

der Elektrophorese wurde das Gel in 10% Essigsäure für 20 min fixiert. Nach Auswaschen

des Harnstoffs mit Leitungswasser wurde das Gel bei 80° C für 2 hrs in einem Sterilofen

getrocknet. Anschließend wurde das Gel in einer Exponierkassette 12-48 hrs auf X-OMAT,

XAR 351 (Fa. Kodak) exponiert. Die Entwicklung des Films erfolgte mit den entsprechenden

Fotochemikalien ( GBX Developer, GBX Fixer, Fa. Kodak).

2.2.43 Auftragssequenzierungen

Auftragssequenzierungen wurden von der Firma Seqlab GmbH, Göttingen auf ABI Prism

377 Sequenzautomaten durchgeführt.

2.2.44 Computergestützte Sequenzanalysen

Die computergestützten Sequenzanalysen wurden mit dem Softwarepaket DNasis for

Windows 3.5 (Fa. Hitachi), bzw. im Internet mit Hilfe der biocomputing Programme am

36

NCBI oder EMBL durchgeführt. Datenbankenvergleich wurden mit dem BLAST-Programm

in den Datenbanken GenBank, Swissprot durchgeführt.

2.2.45 Eukaryotische Zellkulturlinien

Die Zellkulturlinie OLN-93 wurde in „Dulbecco’s modifiziertes essentielles Eagles Medium“

(DMEM) der Fa. ICN mit 10 % fötalem Rinderserum (FCS) gehalten. Das Medium wurde

zusätzlich mit 20 mM L-Glutamin, 7,5 % Bicarbonat und 1 % Gentamycin (alles Fa. Gibco)

supplementiert.

Die CHO-K-1-Zellen wurden in einer 1:1 Mischung aus DMEM /Ham’s F-12 Medium (Fa.

Gibco) mit 10 % FCS, 1 % Gentamycin, 7,5% Bicarbonat, 20 mM Glutamin gehalten.

rP0/CHO(DG44)-Zellen wurden in DMEM mit 10 % FCS, 0,5 µm MTX, 20 mM Glutamin,

7,5 % Bicarbonat, supplementiert mit 40 mg/l Prolin, 0,73 mg/l Thymidin, 7,5 mg/l Glycin

gehalten.

Die Zellkulturen wuchsen als adhärente Monolayer-Kulturen auf unbeschichteten Nuncolon

Delta-Dishes (Fa. Nunc, Dänemark) bei 37°C in einer Wasserdampf-gesättigten Atmosphäre

mit 5 % CO2 im begasbaren Zellkulturschrank (Fa. Kendro/Heraeus).

Sf21 und HighFive-Zellen wuchsen in 50 ml Zellkulturflaschen der Fa. Greiner. Sie wurden

pro 50 ml Flasche in 5 ml Insect-Xpress (BioWhittaker, Belgien) mit 2% FCS und 100 µg/ml

Gentamycin bei 27 °C ohne CO2 Begasung gehalten.

2.2.46 Subkultivieren („passagieren“) von Säuger-Zellkulturen

Bei einer Konfluenz > 90 % (d.h. fast Monolayer) wurden die Zellen passagiert. Dazu

wurden die Zellen mit 0,25% Trypsin in DMEM (Fa. Sigma) unter leichtem Schwenken für

ca. 10 min trypsiniert. Anschließend wurde 500 µl Trypsininhibitor (0,025 % mit 0,004 %

DNase I Fa. Sigma in DMEM) dazugegeben. Durch vorsichtiges Spülen mit Medium mit der

Pipettenspitze wurden die restlichen Zellen vom Untergrund abgelöst und für 5 min bei ca.

800 g, 18°C zentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen mit DMEM wurde das Zellpellet mit

in Kulturmedium (siehe oben) resuspendiert und auf die gewünschte Zelldichte ausplattiert.

2.2.47 Subkultivieren („passagieren“) von Insektenzellen

Insektenzellen wurden bei einer Konfluenz von ca. 90% durch einfaches Abschlagen (leichtes

37

Schlagen der Zellkulturflasche an den Handballen) vom Untergrund abgelöst. Noch

anheftende Zellen wurden durch Spülen mit Medium mit der Pipette vorsichtig abgewaschen.

Je nach gewünschter Zelldichte wurden 0,5 bis 2 ml dieser Zellsuspension in eine neue

Zellkulturflasche mit 5 ml frischen InsectXpress (siehe oben) überimpft.

2.2.48 Kryokonservierung von eukaryotischen Zellinien

Eukaryotische Zellinien können ähnlich einer Bakterienkultur (siehe 2.2.1) als DMSO-

Dauerkultur gehalten werden. Dazu wurden die Zellen von ihren Kulturschalen, bzw. Kultur–

flaschen, abgelöst und mit nichtsupplementiertem Medium gewaschen (siehe 2.2.46). Die

Zellen wurden anschließend mit einem DMSO-haltigen Gefriermedium (DMEM, 20% FCS,

10% DMSO) in einem Kyro-Röhrchen resuspendiert. Die Zellen wurden über Nacht auf -70°

C gekühlt und danach in flüssigem Stickstoff gelagert.

Zum Auftauen wurden die Zellen schnell im Wasserbad bei 37° C aufgetaut und pro ml

Gefriermedium mit 10 ml frischem Kulturmedium verdünnt und ÜN bei 37° C ,bzw. 27° C

kultiviert. Am nächsten Morgen wurde das Medium durch frisches Kulturmedium ersetzt.

2.2.49 Transfektionen von Säugerzellen /Transfectam Methode

Die Transfektion von Säugerzellen erfolgte nach der Transfectam Methode (Fa. Promega),

wie bereits im Detail beschrieben (LANWERT, DIPLOMARBEIT 1996). Sie wurde über Nacht

(für stabile Transfektionen), bzw. für 5 h für transiente Transfektionen durchgeführt. Es

wurden pro 35 mm-Zellkulturschale 2 µg DNA und 4 µl Transfectam verwendet.

2.2.50 Transfektion von Insektenzellen/ Cellfectin (Gibco)

Zur Transfektion von Sf21 und HighFive-Zellen wurden 50% konfluente 35 mm-Kulturen

verwendet. Die Zellen wurde einmal mit nichtsupplementiertem InsectXpress gespült. Pro

Kultur wurden 2-6 µg DNA gelöst in 200 µl Medium mit 15 µl Cellfectin (ebenfalls in 200 µl

verdünnt), gemischt und für 15 min bei RT inkubiert. Dieses Transfektionsgemisch wurde auf

1 ml mit InsectXpress aufgefüllt, auf die Zellkulturen gegeben und für 6 h bei 27° C

inkubiert. Anschließend wurde das Transfektionsmedium entfernt und durch Kulturmedium

ersetzt.

2.2.51 Hygromycin und G-418 („Geneticin“) Selektion /Stabile Transfektion mitpIRES-neo

38

Hygromycin wie G-418 sind Antibiotika, welche für die meisten eukaryotischen Zellen, wie

Hefen, Pflanzen und Säugerzellen, aber auch für Bakterien toxisch sind. Hygromycin bzw. G-

418 wirkt auf die ribosomale Proteinbiosynthese der Zellen. Beide Antibiotika eignen sich in

Verbindung zur Selektion auf stabil transfizierte Zellkulturen. Als Expressionsvektor zur

stabilen Transfektion diente pIRES-neo bzw. pIRES-hygro. Diese bicistronischen Vektoren

tragen hinter der Multicloningsite, in der das Zielprotein ohne poly(A)-Signale kloniert

werden kann, eine IRES-Erkennungssequenz gefolgt von der codierenden Region des G-

418/Hygromycin Genes. Die virale IRES-Sequenz (intra ribosomal entry site ) erlaubt es den

Ribosomen (ähnlich der polycistronische Genstruktur der Prokaryoten) an der mRNA

festzumachen und die Translation des zweiten (Resistenz-)Proteines von einem Transkript zu

initiieren. Da Zielprotein und Resistenzgen somit auf dieselbe mRNA zurückgehen, ist die

Wahrscheinlichkeit sehr hoch, daß resistente Zellen auch das Zielprotein exprimieren.

2 Tage nach Übernacht-Transfektion von CHO-K1-Zellen (siehe 2.2.49) wurden die Zellen

passagiert (siehe 2.2.46) und auf das mindestens 200 faches Volumen in mit 1000µg G-

418/ml (bzw. 200 µg Hygromycin/ml) supplementierten Kulturmedium gebracht und auf

100-mm-Dishes verteilt. Ca. 14-20 Tage nach Transfektion entstanden Zellkolonien, die aus

einer bzw. wenigen Zellen hervorgegangen sind. Es wurden nach dem Zufallsprinzip ca. 20

Zellkolonien mit einem Klonierungszylinder (Fa. Sigma) abgegrenzt und selektiv von der

Kulturschale mit Trypsin abgelöst. Ein Teil dieser Zellsuspension wurde zur

immunologischen Kontrolle der stabilen Expression (siehe 2.2.54) erneut ausplattiert, die

andere Hälfte in 96 well-Platten zu Einzelzellen ausverdünnt. So wurde gewährleistet, daß es

sich bei den verwendeten stabilen Expressoren um reine Klone handelt. Nach weiteren 8-14

Tagen hatten sich die Zellen eines Klones soweit vermehrt, daß wiederum Duplikatkulturen

erstellt und so die Reinheit des Klones anhand der Expressionsrate immunologisch

kontrolliert werden konnten. Stabile Expressoren wurden zweimal rekloniert und auch nach

erfolgreicher Selektion und Klonierung stets weiterhin in Selektionsmedium gehalten.

2.2.52 Dynabead oligo d(T)-mRNA-Isolierungen aus Hirngewebe

Die Dynabead oligo d(T)-mRNA-Isolierung basiert auf der Hybridisation zwischen den 3’

poly(A)-Enden der eukaryotischen mRNAs und den oligod(T)-Resten der supramagnetischen

Dynabeads. Die mRNA-bindenden supramagnetischen Beads können während der

39

Wachsschritte durch einen Magneten fixiert und dadurch separiert und gereinigt werden. Das

Gewebe (0,1g) wurde in einem Glas-Homogenisator in 1 ml Lysis/Binde-Puffer (100 mM

TrisHCl, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DTT, pH 8 ) für 1-2 min manuell

homogenisiert. Das Lysat wurde anschließend in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß dekantiert

und 30 sec in einer Eppendorf Zentrifuge zentrifugiert. Danach wurde der Überstand in ein

neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und 1,5 mg oligo d(T)25-Dynabeads zugegeben.

Nach vorsichtigem Mischen und einer Inkubationszeit von 5 min wurde das Gefäß für 1 min

in die Magnethalterung gestellt. Die paramagnetischen Kügelchen mit der gebundenen

mRNA wanderten während dieser Zeit zu der dem Magneten zugewandten Gefäßwand.

Anschließend konnte der Überstand vorsichtig abpipettiert und verworfen werden. Die an der

Gefäßwand fixierten Kügelchen wurden nun mit 0,5 ml Waschpuffer (10 mM TrisHCl, 0,15

M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1-0,3 % SDS, pH 7,5) resuspendiert und der Separationsvorgang

wurde mehrmals wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt wurde die an den „Beads“

gebundene mRNA durch Zugabe von 10 µl Elutionspuffer (2 mM EDTA, pH 7,5) und

Erhitzen (2 min, 65° C) von den „Beads“ getrennt. Danach wurde das Eluat im

Magnetpartikelkonzentrator von den Kügelchen befreit und der mRNA-enthaltende

Überstand in ein neues Gefäß überführt. Die so gewonnene mRNA (400-800 ng/µl) wurde

sofort zur cDNA Erststrangsynthese eingesetzt.

2.2.53 cDNA Erststrangsynthese (Reverse Transkription)

Zur cDNA Erststrangsynthese wurden pro 20 µl Gesamtreaktionsansatz ca. 600 ng mRNA

eingesetzt. Als Primer für die Reverse Transkriptase wurde 1 µl des oligo dT-Primers (Fa.

Gibco) verwendet. Das Gemisch wurde für 10 min auf 70°C erhitzt, um Sekundärstrukturen

der RNA zu unterbinden und das Anlagern des Primers zu ermöglichen. Anschließend

wurden pro Ansatz 4 µl des 5x Erststrangpuffers, 2 µl 10 mM dNTP-Mix , 2 µl 0,1 M DTT

und 1 µl (200 U) Superscript RT II (alles Fa. Gibco) dazupipettiert. Die Reverse

Transkription wurde zunächst für 10 min bei RT, anschließend für weitere 50 min bei 42°C

durchgeführt. Nach anschließendem Stoppen durch Erhitzen auf 95°C für 5 min wurde 1 µl

RNase H (Fa. Gibco) dazugegeben und für 20 min bei 37°C inkubiert, um die RNA-

Komponente in den entstandenen RNA-DNA-Hybriden abzubauen. Die so erhaltene

40

Erststrang cDNA wurde bei -20°C gelagert oder sofort für die PCR verwandt.

2.2.54 Immunocytochemie/indirekte Immunfluoreszenz

Gelvatol:

Lösung A 6 g Glyzerin (Fa. Fluka), 6 ml dH2O, 2,4 g Gelvatol, 2ml TrisHCl

(pH 8,5)

Lösung B 0,5 g N-Propyl-Gallat (Fa. Sigma), 12,6 g Glyzerin, 0,176 g

NaCl, 10 ml 0,2 M TrisHCl (pH 8,5)

Die Lösungen A und B wurden im Verhältnis 1:3 gemischt und unter Alufolie bei 4° C

gelagert.

Zur indirekten Immunfluoreszenz wurden mono- bzw. polyklonale Antikörper verwendet, die

ein oder mehrere spezifische Epitope des speziellen Proteins erkennen. Die verwendeten

primären Antikörper sind bereits in früheren Studien hinreichend charakterisiert worden. Die

Zellkulturen wurden zweimal mit MEM („Minimal essential Medium“ nach Eagles, 10 mM

Hepes, 0,076 % Bicarbonat; pH 7,4) gewaschen und wahlweise mit Methanol für 20 min bei

-20° C oder mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min bei RT fixiert. Die Methanolfixierung

permeabilisiert die Zellmembranen und bietet daher die Möglichkeit auch cytoplasmatische

Epitope zu erkennen. Die Paraformaldehydfixierung wurde für Oberflächenmarkierungen

eingesetzt. Die Zellen wurden vor der Inkubation mit einem Antikörper jeweils fünfmal mit

MEM gewaschen. Zur Absättigung unspezifischer Bindungen wurden die Zellen jeweils 45

min bei RT mit MEM/1% BSA inkubiert. Die verwendeten monoklonalen Antikörper

wurden unverdünnt, die polyklonalen ersten Antikörper wurden 1:50-1:100 verdünnt in

MEM/BSA auf die Zellen gegeben und für 30 min bis 24 h bei RT inkubiert. Als zweite

Antikörper dienten FITC oder Cy3-markierte Fluoreszenzkonjugate, die ebenfalls in

MEM/BSA 1:50 (bzw. 1:400 bei Cy3) verdünnt wurden und für 30 min bis 2 h inkubiert

wurden. Die Präparate wurden abschließend fünfmal mit MEM gewaschen und anschließend

mit wenigen Tropfen Gelvatol mit einem Deckgläschen eingedeckelt, bzw. ohne

Deckgläschen in TBS gehalten. Sie wurden unter einem Olympus Fluoreszenz Mikroskop

Typ ITM-2. mit geeigneten Fluoreszenzfiltern betrachtet und ggf. auf einem Foto

dokumentiert.

41

42

3 Ergebnisse

3.1 Isolierung der vollständigen cDNA Sequenz für das IP2-Protein

Vor Beginn dieser Arbeit lag eine vollständige

exprimierbare cDNA für das in der cytoplasmatischen

Domäne kürzeren IP1 Splicevariante vor, während von

der längeren Isoform (IP2) lediglich ein Teilfragment

existierte (STRATMANN & JESERICH, 1995). Mit Hilfe

der IP2-Teilfragment-Sequenzinformation wurde ein

spezifischer PCR-Primer generiert und für eine 3‘

RACE PCR (2.2.13.6) eingesetzt. So konnte die

fehlende codierende Region für die cytoplasmatische

Domäne inkl. 3‘ UTR gefunden werden. Durch eine

unabhängige RT-PCR (2.2.13.5) wurde die vollständige

codierende Region der IP2 Splice-Variante verifiziert

und kloniert (Abbildung 5). Die Nukleotidsequenz der

cDNA der IP2 Isoform in Abbildung 8 ist ab den in

beiden Varianten unterschiedlichen cytoplasmatischen Domänen dargestellt. Die codierende

Region der cytoplasmatischen Domäne der IP2 Variante ist im Vergleich zu IP1 um 90 bp

(inkl. Stop-Codon) auf 180 bp verlängert. Im Anschluß an das Stop-Codon erstreckt sich

eine IP2-spezifische 3‘ UTR von 133 bp Länge, welche in Position 940 in eine Sequenz

mündet, die mit der 3‘ UTR der bereits bekannten kürzeren Splice-Variante identisch ist.

Eine schematische Darstellung der cDNA Sequenzen der beiden Splice-Varianten IP1 und

IP2 ist in Abbildung 6 dargestellt. Aufgrund der neugewonnenen Sequenzdaten und der aus

der cDNA abgeleiteten Membran-Topologie konnte ein hypothetisches Modell für die

zugrundeliegende Struktur des IP-Genes vorgeschlagen werden (Abbildung 6).

1 2 St

1000 bp

Abbildung 5: Agarosegel Spur 1:RT-PCR mit IP-5-F/ IP2 C3-R; Spur2: 3‘RACE-PCR mit IP2-CIZ-F/Ankerprimer 2; St: Standard (smartladder, Fa. Eurogentec)

43

Abbildung 6: Hypothetische Genstruktur des IP-Genes, schwarze Winkel: konstitutive Splice-Vorgänge, roteWinkel: alternative Splicevorgänge

Abbildung 7: cDNA Schema der IP Splice-Varianten

44

Abbildung 8: IP2 cDNA Sequenz dargestellt ab Beginn der cytoplasmatischen Domäne; codierende Regionist grau unterlegt, IP2 spezifische 3‘ UTR ist rot unterstrichen, Rest 3‘ UTR ist identisch mit IP1 3‘UTR

3.1.1 Aminosäuresequenz der vollständigen cytoplasmatischen Domäne von IP2

625 ATG AGG TTC CTG GTG GCC CGC AGA GTC TTC AAC CTC AGT GTC172 Met Arg Phe Leu Val Ala Arg Arg Val Phe Asn Leu Ser Val

667 AGC AAA CAT GGA AAG AAA GGG AAG GGT AAA GAG GGA TCA CAG186 Ser Lys His Gly Lys Lys Gly Lys Gly Lys Glu Gly Ser Gln

709 CAG AGA CAG GGC CCA ACT CTC TCC ATC GGA GAC CCG TCC AAG200 Gln Arg Gln Gly Pro Thr Leu Ser Ile Gly Asp Pro Ser Arg

751 CTG AAG GCC GCC GCC TCA GAA AAG AAG AAG CAG GAG TCG CGC214 Leu Arg Ala Ala Ala Ser Glu Lys Lys Lys Gln Glu Ser Arg

793 AAG GAT AAG AAA TAG228 Lys Asp Lys Lys ---

Abbildung 9: Translatierte AS-Sequenz der cytoplasmatischen Domäne von IP2

Die cytoplasmatische Domäne der IP2 Splice-Variante (IP2cyto) ist im Vergleich zu IP1 um

45

29 AS länger und somit insgesamt 59 Aminosäuren lang, woraus sich ein vollständiges IP2-

Protein von 231 AS und ein Molekulargewicht des reifen Proteines von 23 kDa ergibt.

Dieses paßt gut zu früheren Untersuchungen von Jeserich & Waehneldt (1987), in denen dem

reifen deglykosiliertem IP2 Protein ein apparentes Molekulargewicht von 23 kDa zugewiesen

werden konnte. Ein Sequenzvergleich des verlängerten C-Terminus des IP2 Proteins mit der

intrazellulären Domäne des P0-Proteins verschiedener Vertebratenspezies (Abbildung 10

nächste Seite) ließ mehrere konservierte, meist basische, positiv geladene Aminosäuren in

diesem Bereich erkennen. Das gehäufte Auftreten von Lysinen und Argininen am C-

Terminus der cytoplasmatischen Domäne steht im Einklang mit der ansonsten stark positiven

Ladung dieser Proteinregion. Während die cytoplasmatischen Domänen der aufgeführten

Vertebraten Spezies zwischen 69 AS (Mensch und Ratte) bzw. 68 AS (Hai) aufweisen, ist

der IP2 C-Terminus der Forelle mit einer Länge von 59 AS um 9 bzw. 10 AS kürzer. Säuger

und Hai besitzen im Vergleich zu IP2 einen „Einschub“ von 9 AS im Anschluß an das

Transmembransegment zu Beginn der cytoplasmatischen Domäne. In diesem Bereich ist die

Aminosäureübereinstimmung zwischen IP2 und den aufgeführten Spezies daher mit 34 %

relativ gering, während der C-Terminus von IP2cyto ca. 71% Sequenzübereinstimmung mit

den P0-Homologen aufweist. Die letzten 7 AS sind in allen aufgeführten Vertebratenspezies

identisch. In IP2cyto konnten zwei putative Phosphorylierungs-Stellen für Casein-Kinase II

(Position 207-210: SIGD bzw. Position 226-229: SRKD) ausgemacht werden, wobei die

letztere ebenfalls als putative Phosphorylierungsstelle für die Protein-Kinase C (Position 226-

228: SRK) angesehen werden kann. Darüber hinaus wurde eine zweite potentielle PKC-

Phosphorylierungsstelle in Position 219-221: (SEK) ausgemacht.

3.2 Untersuchungen zur Funktion von IP1/2 alsAdhäsionsmolekül

In der vorliegenden Dissertation sollten experimentelle Hinweise auf die Funktion von IP1/2

als homophiles Adhäsionsmolekül gesammelt werden. Hierzu wurde der Ansatz der

heterologen Expression von IP in eukaryotischen Zellinien gewählt. Transfizierte Zellen

sollten sich aufgrund ihres differierenden Membranproteinrepertoires in Suspension unter

definierten Bedingungen im Adhäsionsverhalten von nicht-transfizierten Kontrollzellen

46

unterscheiden.

Human P0 178 VRYCWLRRQAA.....LQRRLSAMEKGKLHKPGKDA..SKRatte P0 178 IRYCWLRRQAA.....LQRRLSAMEKGKFHKSSKDS..SKHai P0 177 FRYI.VRRRARSETSFLQRRRSAAERGKV..SGKAGTVSKIP1/2 172 MRF............LVARRVFNLSVSKHGKKGKGKEGSQ

+ ++ - + ++ + +- -

Human P0 211 RGRQTPVLYAMLDHSRSTKAVSEKKAKGLGESRKDKKRatte P0 211 RGRQTPVLYAMLDHSRSTKAASEKKSKGLGESRKDKKHai P0 214 .G...PVLYATLDQSKSGKGASEKKSK.LSESKRDKKIP1/2 200 Q.RQGPTL.SIGDPSKLKAAASEKK.KQ..ESRKDKK

- +- - + + -++ +- - ++-++ ↑Abbildung 10: Aminosäuresequenzvergleich zwischen den cytoplasmatischen Domänen von P0verschiedener Vertebratenspezies mit IP1 bzw. IP2. Identische AS-Reste sind schwarz unterlegt, ähnlichegrau. +/- repräsentieren geladene AS. Das Ende der kürzeren IP1 Isoform ist mit einem Pfeil markiert.Auffällig ist die Häufung konservierter positiv-geladener AS am C-Terminus der verglichenen Proteine.

3.2.1 Aufbau eines Adhäsionsassays

Mit Hilfe der Zellinien OLN-93, einer Oligodendrogliazelle, (RICHTER-LANDSBERG UND

HEINRICH, 1996) , CHO-K1, einer Fibroblastenzelle und stabil exprimierenden rP0/CHO-

DG44-Zellen (freundliche Gabe von M. Filbin, New York) konnte ein Adhäsionsassay

etabliert werden, der es möglich machte, die Abnahme der absoluten Partikelzahl mit der Zeit

einhergehend mit der Zunahme von Zellaggregaten zu quantifizieren. Im Rahmen dieser

Dissertation wurden verschiedene Protokolle mit unterschiedlichen Inkubationsbedingungen,

Medien und Temperaturen erarbeitet und verglichen. Durch Trypan-Blau-Ausschlußtest

(2.2.37) wurde die Vitalität der Zellen überprüft und somit sichergestellt, daß eine Adhäsion

nicht auf die unspezifische Verklumpung toter Zellen zurückzuführen ist. Desweiteren wurde

deutlich, daß die Intensität der Zellablösung durch Trypsin entscheidenden Einfluß auf das

Adhäsionsverhalten hatte. Wurden die Zellen zu lange trypsiniert, war absolut keine

Adhäsion mehr detektierbar, was belegt, daß die gemessenen Adhäsionen auf

Proteininteraktionen zurückzuführen sind. Es zeigte sich, daß das unter 2.2.36 detailliert

beschriebene Protokoll geeignet war und reproduzierbare Ergebnisse lieferte.

47

Abbildung 11: Adhäsionsassay mit OLN 93, CHO-K1 und rP0/CHO-Zellen. Abnahme der absolutenTeilchenzahl in Suspension mit der Zeit (N(t) /N(0) ).

Während des Versuchszeitraumes bildeten die Einzelzellsuspensionen für jeden Zelltyp

charakteristische Zellaggregate aus mehreren Zellen. Die mit der Zunahme der Zellaggregate

korrelierende Abnahme der absoluten Partikelzahl in der Suspension konnte mit einem

automatischen Teilchenzählgerät quantifiziert werden. Bereits untransfizierte

Oligodendoglialzellen (OLN-93-Zellen) waren nach 90 min stark adhäsiv und bildeten

Zellklumpen, die mit einem N(t)/N(0)-Wert von 0,19 (+/- 0,06) quantifiziert werden konnten.

Untransfizierte CHO-K1-Zellen bildeten im gleichen Zeitraum signifikant weniger

Zellaggregate (N(t=90)/N(0) Werte von 0,45 (+/- 0,08)), während für stabile rP0/CHO-Zellen

nach 90 min ein N(t) /N(0)-Wert von 0,1 (+/- 0,03) ermittelt wurde. Der unterschiedliche Grad

der Verklumpung der Zellen wurde im Mikroskop weit deutlicher. Untransfizierte CHO-

Zellen bildeten nach 90 min hauptsächlich Zellaggregate aus drei bis vier Zellen, während

0 20 40 60 800,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0 CHO P0 OLN93

N(t

)/N

(0)

t [min]

48

OLN-93 Zellklumpen aus bis zu 30 Zellen und rP0/CHO-DG44 Aggregate aus mehreren

hundert Zellen bildeten. Das hier ermittelte Aggregationsverhalten von rP0/CHO-

Kontrollzellen paßt gut zu früheren Studien (WONG UND FILBIN, 1996) und belegt somit die

Funktionalität und Reproduzierbarkeit des etablierten Adhäsionsassays.

Da die intrinsischen Adhäsionseigenschaften der myelinbildenden Oligodendrogliazelle OLN-

93 Zellen wie erwartet bereits zu starker Aggregation führten, wurden für die folgenden

Untersuchungen die Fibroblastenzelline CHO-K1 als Wirtszelle für die Adhäsionsassays

verwendet.

3.2.2 Heterologe transiente Expression von IP1 und IP2 in CHO-K1-Zellen

Zur heterologen Expression in CHO-K1-Zellen wurden die vollständigen codierenden

Regionen der cDNAs von IP1 bzw. IP2 in den bicistronischen Expressionsvektor pIRES-neo

kloniert (7.1 und 7.2). Mit Hilfe der Transfectam-Methode (2.2.49) konnten ca. 5 %. einer

CHO-K1-Zellkultur erfolgreich transfiziert werden. 48 h nach Transfektion zeigten

transfizierte CHO-K1-Zellen nach Methanolfixierung eine starke granuläre Immunfärbung im

Cytoplasma der Zelle. Mit Hilfe der Paraformaldehydfixierung / Oberflächenmarkierung

(2.2.54) konnten mit den polyklonalen Antikörpern αIP1 und αIP2 eine Fluoreszenzfärbung

der extrazellulären Domäne von rIP1-, bzw. rIP2-CHO-Zellen detektiert werden, die die

Integration der Forellenmyelinproteine in die Zellmembran der Säugerwirtszelle belegte

(Abbildung 12). Oberflächenfluoreszenzmarkierungen an rIP1/CHO-Zellen mit dem

monoklonalen Antikörper 7C4, spezifisch für die intrazelluläre Domäne von IP1

(STROTMANN, DIPLOMARBEIT, 1988), blieben negativ und stützten obiges Resultat.

49

Abbildung 12: Immunfloureszenzaufnahmen 48h nach Transfektion: oben links: rIP1/CHO-Zellen(Methanolfixierung, αIP1/cy,3 600x); oben rechts: rIP2/CHO-Zellen (Methanolfixierung, αIP2/cy3, 600x);unten links: Oberflächenmarkierung rIP1/CHO-Zellen (αIP1/cy3, 400x); unten rechts:Oberflächenmarkierung rIP2/CHO-Zellen (αIP2/cy3, 400x)

Abbildung 13: Westernblots (links αIP1, rechts αIP2): my: Forellenmyelin; 1: CHO-Zellysat; 2: rIP2/CHO-Zellysat; 3: CHO-Zellysat; 4: rIP2/CHO-Zellysat

50

Abbildung 13 zeigt die korrespondierenden Westernblots. Aus dem elektrophoretischen

Laufverhalten von rIP1 und rIP2 wird deutlich, daß beide Isoformen auch in CHO-K1 in der

glykosilierten Form ähnlich der nichtrekombinanten Variante aus Forellenmyelin vorliegen

muß.

3.2.3 Klonierung von stabil-transfizierten rIP1/CHO-K1-Zellen

Durch die Zugabe des Antibiotikums G-418 nach Transfektion, Selektion und zweimaligem

Reklonieren konnte nach ca. 12-16 Wochen ein stabil-exprimierender rIP1/CHO-Zellklon

separiert werden (2.2.51). Nahezu 100% der Zellen konnten durch Immunfluoreszenz als

Expressoren eingestuft und die Expression außerdem durch Westernblot-Analyse verifiziert

werden. Die Klonierung stabiler rIP2/CHO-Expressoren ist trotz mehrmaliger Versuche nicht

gelungen.

3.2.4 Adhäsion von rIP1/CHO-Zellen unter definierten Bedingungen

Abbildung 14 zeigt das charakteristische Adhäsionsverhalten des rIP1/CHO-Klones. Im

Partikelzählgerät konnte nach 90 min ein leichter Unterschied in der Zellaggregation

zwischen rIP1/CHO-, und CHO-Zellen festgestellt werden. rIP1/CHO-Zellen fielen im Laufe

des Experimentes auf einen N(t=90) /N(0) Wert von 0,36 (+/-0,09) zurück, während nicht

transfizierte CHO-Zellen einen N(t=90) /N(0) Wert von 0,45 (+-0,08) aufwiesen. Deutlicher

wurden diese Unterschiede in der visuellen mikroskopischen Analyse: CHO-Zellen fanden

sich über den Versuchszeitraum nur zu Duplett-, oder Triplett-Aggregaten zusammen,

während in der rIP1/CHO-Population überwiegend Aggregate aus 6 bis 10 Zellen beobachtet

werden konnten (Abbildung 15).

51

Abbildung 14. Adhäsionsassay mit CHO-K1 und rIP1/CHO-Zellen

Abbildung 15: Phasenkontrastaufnahmen Adhäsionsassay: oben links CHO-Zellen bei t=0 min; oben rechts:CHO-Zellen bei t=90 min; unten Mitte: rIP1/CHO-Zellen bei t=90 min

0 20 40 60 80 1000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0 CHO IP1

N(t

)/N

(0)

t [min]

52

3.2.5 Konstruktion einer IP-P0-Chimäre

Für viele Adhäsionsproteine, wie z.B. P0 und den Cadherinen, gibt es gibt es Hinweise, daß

die intakte vollständige cytoplasmatische Domäne eine für die Adhäsionfunktion des

Proteines essentielle Aufgabe als Membran-, bzw. Cytoskelettanker ausübt (NAGAFUCHI UND

TAKEICHI, 1988; NAGAFUCHI ET AL., 1991; HIRANO ET AL., 1992). So waren in der

cytoplasmatischen Domäne trunkierte P0-Expressoren trotz der Expression der Adhäsion-

vermittelnden extrazellulären Domäne im Aggregationsverhalten nicht von untransfizierten

Kontrollzellen zu unterscheiden (WONG & FILBIN, 1994 UND 1996). Bei dem IP1-Protein der

Forelle handelt es sich um eine natürlich vorkommende, im Vergleich zu IP2 in der

cytoplasmatischen Domäne kürzeren Splice-Variante. Um also Hinweise auf einen möglichen

Einfluß der cytoplasmatischen Domäne von IP1 auf die Zelladhäsion zu erhalten, wurde ein

chimäres Fusionsprotein konstruiert (7.3). Es bestand aus der extrazellulären Domäne sowie

der Transmembrandomäne des IP-Proteins. Die gesamte intrazelluläre Domäne stammt von

dem P0-Protein der Ratte (Abbildung 16).

Abbildung 16: Schematische Darstellung der IP-P0-Chimäre

3.2.6 Stabile Expression und Adhäsionsverhalten von rIP-P0/CHO-Zellen

Nach Transfektion und G418-Selektion konnte wie oben beschrieben ein stabiler rIP-

P0/CHO-Klon selektiert werden. Die Oberflächenexpression der extrazellulären IP-Domäne

53

konnte durch Immunfluoreszenz mit dem Antikörper αIP1 nachgewiesen werden (Abbildung

18). Im korrespondierenden Westernblot (Abbildung 17) wurde eine immunopositive Bande

detektiert, die im elektrophoretischen Laufverhalten zwischen IP1 und IP2 liegt.

Abbildung 17: Westernblot. Spur My: Forellenmyelin; CHO: untransfizierte CHO-Zellen; CHO/IP-P0: stabiltransfizierte rIP-P0/CHO-Zellen; IP0: Proteoloyse-Produkt von IP1/2; Nachweis mit monoklonalem 4C5Antikörper (spezifisch gegen IPex)

Abbildung 18: Immunfloureszenz (Oberflächenmarkierung) 48h nach Transfektion an rIP-P0/CHO-Zellen(αIP1/cy3, 400x)

54

rIP-P0/CHO-Zellen zeigten im Verlauf des Adhäsionsassays eine charakteristische

Aggregationskinetik (Abbildung 19). Über die ersten 45 min der Versuchsreihe unterschieden

sich Expressoren nicht von untransfizierten CHO-Zellen. Bis zum Ende der Versuchsreihe

(nach 90 min) sank der N(t) /N(0)-Wert von rIP-P0/CHO-Zellen auf 0,24 (+/- 0,05). Die

mikroskopische Untersuchung zeigte große Zellaggregate aus bis zu 35 Zellen (Abbildung

20), während untransfizierte CHO-Zellen überwiegend Tripletts (maximum fünf Zellen)

ausbildeten (Abbildung 15) und N(t=90) /N(0)-Werte von 0,45 (+/-0,08) aufwiesen (Abbildung

14). Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die extrazelluläre Domäne der IP-Proteine

Adhäsion vermittelt. Die cytoplasmatische Domäne hat offensichtlich Einfluß auf die

Aggregation, da die Adhäsivität von rIP-P0/CHO im Vergleich zu rIP1/CHO signifikant

stärker ausgeprägt ist.

Abbildung 19: Adhäsionsassay mit CHO-K1-Zellen und rIP-P0/CHO

0 20 40 60 80 1000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

CHO IPP0

N(t

)/N

(0)

t [min]

55

Abbildung 20: Phasenkontrastaufnahme Adhäsionsassay rIP-P0/CHO-Zellen bei t=90 min

3.2.7 Vergleichende Quantifizierung der Oberflächenexpression

Um auszuschließen, daß das unterschiedliche Aggregationsverhalten von rIP1/CHO und rIP-

P0/CHO auf ein unterschiedliches Oberflächenexpressionsniveau der extrazellulären Domäne

von IP (IPex) zurückzuführen ist, wurde ein Zell-ELISA an fixierten, nicht-permeabilisierten

Expressoren mit den Antikörpern αIP1 und αIP2 durchgeführt. Als Kontrolle dienten

untransfizierte Zellen (2.2.38). Die relative Oberflächenexpression ist in Abbildung 21

dargestellt. Es waren geringe, nicht signifikante Unterschiede zwischen rIP1/CHO und rIP-

P0/CHO auszumachen. Das rel. Oberflächenexpressionsniveau von rIP-P0/CHO wurde mit

5,12 (+/- 1,6), von rIP1/CHO mit 4,08 (+/- 1,59) quantifiziert. rIP-P0/CHO-Zellen

exprimierten demnach das 1,25 fache (d. h. 25% mehr) IPex auf ihrer Zelloberfläche im

Vergleich zu rIP1/CHO-Zellen. Bei Verwendung des αIP1-Antikörpers lagen die Werte der

relativen Expressionseinheiten insgesamt höher als beim vergleichbaren αIP2-Antikörper.

Wurde dieser Antikörper verwendet, konnte für rIP-P0/CHO-Zellen (2,27 (+/- 0,85) 1,41-

fach mehr Antigen auf der Zelloberfläche detektiert werden (rIP1/CHO: 1,6 (+/- 1,43)). Das

geringfügig höhere Expressionsniveau von rIP-P0 ist jedoch nicht signifikant und kann daher

die unterschiedlichen Aggregationseigenschaften der beiden Zellpopulationen von rIP1/CHO

und rIP-P0/CHO nicht erkären.

56

Abbildung 21: rel. Oberflächenexpressionsniveau von rIP-P0/CHO und rIP1/CHO-Zellen; links detektiertmit αIP1; rechts mit αIP2

3.2.8 Inhibierung der Zell/Zell-Adhäsion von rIP-P0/CHO durch Antikörper

Um zu überprüfen, ob die Aggregation von rIP-P0/CHO auf die Oberflächenexpression von

IPex zurückzuführen ist, wurde vor dem Start des Adhäsionsassays der für das

Oberflächenepitop von IP spezifische Antikörper αIP1 (3.3) der Zellsuspension hinzugefügt.

Es zeigte sich, daß die adhäsiven Eigenschaften und die damit einhergehende Zellaggregation

vollständig und selektiv inhibiert werden konnte (Abbildung 22). In Gegenwart von αIP1-

Antikörpern bildeten rIP-P0/CHO-Zellen nach 90 min Zellaggregate bestehend aus bis zu

fünf Zellen mit korrespondierenden N(t) /N(0) Werten von 0,57 (+/- 0,1) im Gegensatz zu 0,24

(bis zu 35 Zellen) ohne Antikörper (3.2.4). Die Zugabe des Antikörpers hatte keinen Einfluß

auf das Aggregationsverhalten untransfizierter CHO-Kontrollzellen (Abbildung 23). Durch

mikroskopische Analyse der Zellaggregate war kein Unterschied zwischen beiden

Kontrollversuchen erkennbar. Diese Ergebnisse geben weitere Hinweise darauf, daß die

Zell/Zell-Adhäsion auf die Expression der IPex-Domäne auf der Zelloberfläche transfizierter

Zellen zurückzuführen ist, da sie durch einen spezifischen Antikörper vollständig inhibiert

57

werden konnte.

Abbildung 22: Adhäsionsassay rIP-P0/CHO-Zellen mit und ohne Antikörperzugabe (αIP1)

Abbildung 23: Adhäsionsassay CHO-Zellen (Kontrolle) mit und ohne Antikörperzugabe (αIP1)

0 20 40 60 80 1000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0 IP-P0 ohne AK IP-P0 mit AK

(Nt)

/N(0

)

t [min]

0 20 40 60 80 1000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0 CHO ohne AK CHO mit AK

N(t

)/N

(0)

t [min]

58

3.2.9 Heterologe Expression und Adhäsion von IP1 in Insektenzellen

Wie unter 7.4 beschrieben, wurde die vollständige codierende Region der IP1cDNA in

pFastbac kloniert und so rIP1AcNPV isoliert, die zur Infektion von Sf21-Zellen eingesetzt

wurden. Ca. 48 h nach Infektion zeigten ca. 80% der Zellen eine deutliche Immunfärbung.

Diese Zellen wurden in einem Adhäsionsassay eingesetzt. Als Kontrolle der

Aggregationskinetik dienten mit den Reportergen Grünfluoreszierendes Protein (GFP)

infizierte Zellen (rekombinante GFP-Viren waren freundliche Gabe von R. Wagner,

Osnabrück) sowie nicht transfizierte Sf21-Zellen. Es zeigte sich, daß IP1-Expressoren mit

N(t) /N(0) Werten von 0,68 (+/- 0,28) im Vergleich zu GFP infizierten und nicht transfizierten

Sf21-Zellen (N(t) /N(0) Wert von 0,85 bzw. 0,94) geringfügig adhäsiver waren. Der Nachteil

des hier beschriebenen Baculovirus-Systems zur Detektion von Adhäsionen liegt allerdings

eindeutig darin, daß infizierte Zellen nach einer gewissen Expressionsdauer lysierten. Es muß

daher an dieser Stelle erwähnt werden, daß der Zeitpunkt der Zellernte sowie die zur

Infektion eingesetzte Virusmenge offensichtlichen Einfluß auf das Aggregationsverhalten der

Wirtszelle hatte. Die Standardisierung dieser Parameter erwies sich als äußerst schwierig und

wenig konsistent (siehe Standardfehler (+/- SE) in Abbildung 24). Hilfreich wäre

diesbezüglich die Konstruktion von IP1/2-GFP-Koexpressoren, die eine einfache visuelle

Kontrolle über das Infektions-, bzw. Expressionsniveau der Zellkultur erlauben würde (siehe

3.8).

N(t=90) /N(0) -Wert +/- SE

Sf21 nicht inf. 0,94 +/- 0,09

IP1/Sf21 0,68 +/- 0,28

GFP/Sf21 0,85 +/- 0,29

Abbildung 24: N(t) /N(0) -Werte (nach 90 min) im Adhäsionsassay mit Baculovirus-infizierten Sf21-Zellen3 Tage nach Infektion

59

3.3 Heterologe Expression der cytoplasmatischen Domänen vonIP1 und IP2 in E. coli

Im Rahmen dieser Dissertation wurden dazu drei verschiedene E. coli Expressionssysteme

vergleichend eingesetzt. Es zeigte sich, daß weder das pET- noch das IMPACT-System

(2.2.27 und 2.2.23) eine Expression und Aufreinigung von kurzkettigen Peptiden, wie sie

IP1cyto mit ca. 3,5 kDa und IP2cyto mit ca. 6,5 kDa darstellen, geeignet waren und wurden

daher verworfen (Daten nicht gezeigt). Einzig das pMAL-System erlaubte eine Aufreinigung

von rIP1/2cyto in ausreichenden Ausbeuten.

Zur pMAL-Expression wurden die korrespondierenden cDNAs der vollständigen

cytoplasmatischen Domänen von IP1 und IP2, wie unter 7.8 beschrieben, in den E. coli

Expressionsvektor pMAL-C2 kloniert. Auf diese Weise entstanden Fusionen der Zielpeptide

mit dem Maltose-Binde-Protein. Aufgrund der hohen Affinität des Maltose-Binde-Proteins

zu Amylose-Sepharose, konnten die nativen Fusionsproteine präparativ aufgereinigt werden

(2.2.21 und 2.2.22).

Abbildung 26 zeigt eine typische Expression und Aufreinigung von MBP/IP1cyto und

MBP/IP2cyto im SDS-PAGE. Nach Induktion war in beiden Fällen eine prominente Bande in

der erwarteten Höhe von 46 kDa (MBP/IP1cyto) bzw. 49 kDa (MBP/IP2cyto) sichtbar. In

den eluierten Proteinfraktionen befanden sich in beiden Fällen außer dem Zielprotein eine

weitere ca. 42 kDa große Proteinbande. Die korrespondierenden Westernblots (Abbildung

25) zeigen ein stark immunopositives Signal jeweils in Höhe der oberen Bande, die dem

erwarteten molekularen Gewicht der Zielproteine entsprachen. Hierbei zeigte sich, daß der

monoklonale 7C4-Antikörper im Westernblot spezifisch IP1cyto erkennt, während die

längere IP2-Variante nicht markiert wurde. Der polyklonale αIP2-Antikörper hingegen

erkannte im Westernblot ausschließlich IP2cyto, während IP1cyto nicht detektiert wurde.

Interessanterweise konnten weder IP1cyto noch IP2cyto mit dem polyklonalen αIP1-

Antikörper markiert werden. Hierdurch konnte gezeigt werden, das der polyklonale αIP1-

Antikörper ausschließlich extrazelluläre Epitope erkennt (3.2.2 und 3.2.8).

60

Bei dem co-eluierten 42kDa-Protein handelte es sich offensichtlich um ein Abbauprodukt

bzw. eine nichtfusionierte Form des Maltose-Binde-Proteins. Eine typische Aufreinigung von

MBP/IP1cyto ergab Ausbeuten von ca. 1,5 mg Zielprotein/ 1l Kultur, eine Aufreinigung von

MBP/IP2cyto ergab ca. 2,5 mg Zielprotein/ 1l Kultur.

3.3.1 Bindestudien von MBP/IP2cyto an phospholipidbeschichteten Trägermatrices(Transil)

Da sich beide MBP/IPcyto-Fusionen als resistent gegen einen Faktor Xa-Verdau erwiesen,

der spezifisch die IP1/2cyto-Peptide von ihrem „Ankerprotein“ MBP trennen sollte, wurde

MBP/IP2cyto-Fusion für Protein/Phospholipid- Bindungsstudien mit der Transil-Methode

(2.2.39) eingesetzt. Als Kontrolle diente das in der eluierten Proteinfraktion enthaltene

nichtfusionierte MBP. Eine Analyse der gebundenen Proteine ist in Abbildung 27 zu sehen.

Spur 6 zeigt die eingesetzte Probe vor Transilbindung in einem annähernd equimolaren

Verhältnis beider Proteinbanden. Es zeigte sich, daß im Falle von Transil PS (Transil

Oberfläche mit 20 % Phophatidylserin), Transil PC (Transil Oberfläche mit 20 %

Phophatidylcholin) und Transil Duo (Oberfläche mit positiven und negativen Ladungen) eine

Verschiebung dieses Verhältnisses auf ca. 80:20 zugunsten des MBP/IP2-Fusionsproteines

verschoben wurde. Durch die Zugabe von 150 mM Maltose konnte dieses Verhältnis nicht

Abbildung 25: Westernblot vonIP1/2cyto MBP-Fusionen nachElution, 1: IP2 cyto mit 7C4, 2:IP1 cyto mit 7C4; 3: IP2cyto mitαIP2; 4: IP1cyto mit αIP2

Abbildung 26: SDS-PAGE (CBB) 1:Zellysat 3h nach InduktionMBP/IP2cyto; 2: Eluat MBP/IP2cyto; 3: Zellysat 3h nachInduktion MBP/IP1cyto; 4: EluatMBP/IP1cyto/

61

variiert werden (Daten nicht gezeigt). Der Einfluß des MBP-Fusionsanteiles ist unter diesen

Bedingungen nicht genau bestimmbar, so daß quantitative Messungen zur Membranaffinität

des IP2cyto mit der MBP/IP2cyto-Fusion nicht möglich waren.

Abbildung 27: SDS-PAGE nach Elution von Transilkügelchen; 1: Transil neutral, 2: Transil positiv geladen,3: Transil neg. und pos. geladen, 4: Transil mit Phosphatidylserin; 5: Transil mit Phophatidylcholin; 6:Probe ohne Transil

3.3.2 Untersuchung zu Protein-Protein-Wechselwirkungen von IP1/2cyto

Die eluierten Proteinfraktionen MBP/IP1cyto und MBP/IP2cyto wurden auf ein natives-

PAGE (2.2.33) in Abwesenheit von denaturierenden Detergenzien wie SDS aufgetragen. Im

apparenten Laufverhalten der nativen MBP/IP1cyto und MBP/IP2cyto ist im Vergleich zur

denaturierenden SDS-PAGE kein Unterschied erkennbar (Abbildung 28). Dieses ist als

Hinweis zu deuten, daß die cytoplasmatischen Domänen von IP1/2 nicht zur

Oligomerisierung neigen und daher als Monomer vorliegen.

Abbildung 28: Natives NuPAGE (4-20%, Fa. Novex). 1: MBP/IP1cyto; 2: MBP/IP2cyto

Um Hinweise auf eine denkbare Interaktion von IP1cyto und IP2cyto zu erhalten, wurde eine

Protein-Protein-Bindungsstudie mit dem Overlay-Assay (2.2.40) durchgeführt. Hierzu wurde

62

sowohl MBP/IP1cyto auf einer Nitrozellulosemembran als „Köder“ immobilisiert und in einer

Proteinlösung mit MBP/IP2cyto inkubiert, als auch vice versa. Mit Hilfe der für die jeweilige

Isoform spezifischen Antikörperkombination (7C4/anti-Maus-IgG -Peroxidase für Ip1cyto

und αIP2/anti-Hase-IgG-Peroxidase für IP2cyto) konnte gezeigt werden, daß

MBP/IP1/2cyto offensichtlich nicht die Tendenz haben, spezifische intermolekulare Protein-

Protein-Interaktionen einzugehen (Abbildung 29). Es konnte in keinem Fall am Köderprotein

gebundenes Zielprotein detektiert werden.

Abbildung 29: Overlayblot: 1: immobil. IP1cyto mit IP2cyto inkubiert (Nachweis mit α IP2); 2: immobil.IP2cyto mit IP1cyto inkubiert (Nachweis mit 7C4); 3: Positiv-Kontrolle immobil. IP1cyto (Nachweis mit7C4); 4: Positiv-Kontrolle immobil. IP2cyto (Nachweis αIP2)

63

3.4 Isolierung der cDNA Sequenz für das 36K- Protein

Das zweite Hauptmyelinprotein der Forelle ist das cytoplasmatische und membranassoziierte

36K. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, ist es denkbar, daß 36K eine Rolle in der

Apposition der cytoplasmatischen „major dense line“ ausübt, ähnlich wie oben für IP1/2cyto

vermutet. Um erste Hinweise auf die Funktion dieses zweiten Hauptmyelinproteines zu

erhalten, wurde im Rahmen dieser Dissertation wiederum die Methode der heterologen

Expression gewählt.

Vor Beginn dieser Arbeit existierte keine exprimierbare

cDNA des 36K-Proteins. Es lag lediglich ein

Teilfragment der 36K cDNA Sequenz sowie eine gDNA

Teilsequenz für das 36K-Protein vor (STRELAU,

DISSERTATION 1997), so daß zunächst eine vollständige

cDNA isoliert werden mußte. Mit Hilfe der bereits

bekannten Teilsequenzen war es möglich, per PCR eine

DIG-markierte Sonde herzustellen, mit der eine Forellen

cDNA λ-Phagenbank durchsucht werden konnte. Wie

unter 2.2.18 f beschrieben, konnte ein positiver

Phagenklon isoliert, durch dreimaliges Rescreening

gereinigt und amplifiziert werden. Nach in vivo Excision

lag das cDNA-Fragment als Insert in pBluescript vor

und konnte sequenziert werden. In einer unabhängigen RT-PCR an Forellen konnte die

Existenz der isolierten cDNA-Sequenz verifiziert werden. Abbildung 30 zeigt das PCR-

Amplifikat in der erwarteten Höhe von 950 bp. Das Amplifikat wurde kloniert und

sequenziert und stimmte mit der in Abbildung 31 gezeigten durch Genbank-Screening

gefundenen cDNA Sequenz zu 100% überein.

950 bp

Abbildung 30: Agarosegelelek-trophorese, Spur 1: RT-PCR mit36K-CL-F4/36K2R an ForellenHirn; Spur 2: Standard (smartladder, Fa. Eurogentec); Spur 3:H2O-PCR (neg. Kontrolle)

64

Abbildung 31: Sequenz der 36K cDNA nach λ-Phagenbank Screening, ATG und TGA sind durch Fettdruckhervorgehoben; die codierende Region in Großbuchstaben ist grau unterlegt, die 5‘ UTR und die 3‘ UTR istdurch Kleinbuchstaben dargestellt; poly(a) Signale fett

65

Die vollständige 36K cDNA ist 2120 bp lang. Der größte offene Leserahmen ist 963 bp lang,

befindet sich zwischen Position 10 (Start ATG) und Stop-Codon (TGA) in Position 973 und

codiert für ein 320 Aminosäuren großes Protein. Die untranslatierte 5‘Region ist mit 10 bp

auffällig kurz, während die untranslatierte 3‘ Region 1167 bp lang ist. Sie trägt in Position

1838, 2034 und überlappend in Position 2087 und 2089 am 3‘ Ende 3 poly (A) Signale (nach

PROUDFOOT UND BROWNLEE, 1976).

3.4.1 Aminosäuresequenz des 36K-Proteins

Die aus den 320 Triplett des größten offenen Leserahmens abgeleitete Aminosäuresequenz

ist in Abbildung 32 dargestellt.

1 ATG TCT CTT TAC CGC AAC TCT GCG TGG TTT CTG AAA GGA ATG1 Met Ser Leu Tyr Arg Asn Ser Ala Trp Phe Leu Lys Gly Met

42 ACT GAA TTC ACC AGG AGT GCG TTC CTC TCT GCC GCC AAA CAC14 Thr Glu Phe Thr Arg Ser Ala Phe Leu Ser Ala Ala Lys His

84 TTT GTG GAA AAG GAC CTG GAG GTG TCC ATG GCA GGC AGG GTC28 Phe Val Glu Lys Asp Leu Glu Val Ser Met Ala Gly Arg Val

126 TTC ATG ATC ACC GGA GCC AAC AGT GGC ATA GGG AGA GCT ACA42 Phe Met Ile Thr Gly Ala Asn Ser Gly Ile Gly Arg Ala Thr

168 GCC ATG GCC ATC GCC AAG AGA GGT GGT ACA GTC CAC ATG GTG56 Ala Met Ala Ile Ala Lys Arg Gly Gly Thr Val His Met Val

210 TGC AGG AAC AAG GAC AAA GCA GAA GAG GCC AGG GCT GAC ATT70 Cys Arg Asn Lys Asp Lys Ala Glu Glu Ala Arg Ala Asp Ile

252 GTC AAG GAG TCA GGA AAT AAA GAA ATA TAT GTC CAC ATT CTG84 Val Lys Glu Ser Gly Asn Lys Glu Ile Tyr Val His Ile Leu

294 GAC CTG TCT GAG ACA CGG AAG GTT TGG GAG TTT GCA GAG GCC98 Asp Leu Ser Glu Thr Arg Lys Val Trp Glu Phe Ala Glu Ala

336 TTC AAG AGG AAG TAC AAA GCC TTG AAT GTA CTG ATA AAT AAT112 Phe Lys Arg Lys Tyr Lys Ala Leu Asn Val Leu Ile Asn Asn

378 GCA GGC TGC ATC ATG AGT GAG AGG GAT GTG AAC GCT GAG GGG126 Ala Gly Cys Ile Met Ser Glu Arg Asp Val Asn Ala Glu Gly

66

420 CTG GAG AAG AGC TTT GCC AGT AAC GTC ATG GGT GTG TAT ATC140 Leu Glu Lys Ser Phe Ala Ser Asn Val Met Gly Val Tyr Ile

462 CTG ACC AAG GGC CTG ATT CCT TTA CTG GAG AAG AGT GCA GAG154 Leu Thr Lys Gly Leu Ile Pro Leu Leu Glu Lys Ser Ala Glu

504 CCA AGA GTG ATC ACA GTT TCA TCT GGA GGG ATG CTG GTC CAG168 Pro Arg Val Ile Thr Val Ser Ser Gly Gly Met Leu Val Gln

546 AAG CTG AGG ACA GGG AAC CTG CAG ACA GAA ATA GGT CGC TAT182 Lys Leu Arg Thr Gly Asn Leu Gln Thr Glu Ile Gly Arg Tyr

588 GAC GGC ACC ATG GTC TAC GCA CAG CAC AAG AGG CAA CAG GTG196 Asp Gly Thr Met Val Tyr Ala Gln His Lys Arg Gln Gln Val

630 GTG ATG ACA GAG CAG TGG GCC AAG ACC CAT AGC AAC GTC CAC210 Val Met Thr Glu Gln Trp Ala Lys Thr His Ser Asn Val His

672 TTC TCA GTG ATG CAC CCT GGC TGG GTG GAC ACG CCG GCG GTG224 Phe Ser Val Met His Pro Gly Trp Val Asp Thr Pro Ala Val

714 GCC AAT GCC ATG CCT GAC TTC CAC CAG TCT ATG AAG GAC AGT238 Ala Asn Ala Met Pro Asp Phe His Gln Ser Met Lys Asp Ser

756 ATG AGG ACC CCG GAG CAG GGG GCT GAC ACC ACG GTG TGG TTG252 Met Arg Thr Pro Glu Gln Gly Ala Asp Thr Thr Val Trp Leu

798 GCC ATC TCA GAG GCC GCC GCC ACC AAG CCC AGC GGA AGC TTC266 Ala Ile Ser Glu Ala Ala Ala Thr Lys Pro Ser Gly Ser Phe

840 TTC CAG GAT CGG AGG ATG GTG TCG GCC CAC CTG CCC CTG GCC280 Phe Gln Asp Arg Arg Met Val Ser Ala His Leu Pro Leu Ala

882 TGG ACC CAC AGT TCC CAG TTG GAG CAG CAG AAG TTC ATG AGT294 Trp Thr His Ser Ser Gln Leu Glu Gln Gln Lys Phe Met Ser

924 GTG ATG GAG GAT CTG GCC AAG ACC TTC CAG CCC CAC TGA308 Val Met Glu Asp Leu Ala Lys Thr Phe Gln Pro His ***

Abbildung 32: Translatierte Aminosäuresequenz der isolierten 36K cDNA

Es konnte eine eindeutige Codonpräferenz festgestellt werden; dieses gilt vor allem für die

Tripletts der Aminosäuren Ala (20 von 33: GCC), Phe (10 von 14: TTC), Leu (15 von 17:

CTG), His (10 von 11: CAC), Gln (12 von 13: CAG), Lys (17 von 21: AAG), Arg (10 von

17: AGG), Val (14 von 25: GTG). Diese Codonnutzung entspricht der von WADA (1991) für

67

Knochenfische festgestellten Präferenz.

Anhand der Aminosäuresequenz wurde ein Molekulargewicht errechnet, welches mit 35,7

kDa annähernd dem apparenten Molekulargewicht des 36K-Proteins in der SDS-

Gelelektrophorese entspricht. Der kalkulierte isoelektrische Punkt liegt bei pH 9,54.

Computergestützte Sequenzanalysen sagen kein sekretorisches Signalpeptid voraus.

Ebenfalls fehlt ein Transmembransegment, so daß es sich um ein cytoplasmatisches Protein

handeln dürfte. Es können 4 potentielle Phosphorylierungsstellen für Protein-Kinase-C

ausgemacht werden (Position 103-105: TRK; Position 132-134: SER; Position 248-250:

SMK; Position 252-254: SMR). Außerdem sind 4 putative Phosphorylierungsstellen für

Casein Kinase II auszumachen (Position 132-135: SERD; Position 248-251: SMKD;

Position 299-302: SQLE; Position 308-311: SVME). Wie schon in der Einleitung erwähnt,

konnte vor Beginn dieser Arbeit bereits anhand von gDNA-Fragmenten ein putatives 36K-

Protein vorausgesagt werden. Vergleicht man diese Voraussage mit der hier isolierten

translatierten cDNA Sequenz, fällt auf, daß sich beide Proteine im N-Terminus

unterscheiden, was aber keine Auswirkungen auf die vorhergesagte Sekundärstruktur des

Proteines hat (näheres unter 3.5.1).

Sekundärstrukturanalysen mit der hier isolierten Sequenz nach dem Chou/Fasman

Algorithmus (1978) ergaben eine charakteristische Abfolge von 6 β-Faltblätter und 6 α-

Helices. Innerhalb dieser 6 β-Faltblätter wurden außerdem Bereiche mit hohem β-Turn-

Potential identifiziert. Diese β6/α6-Struktur ist bereits 1974 von Rossman et al. beschrieben

worden. Gestützt durch Proteindatenbank-Sequenzvergleiche wurde deutlich, daß 36K daher

eine signifikante Ähnlichkeit zu klassischen Vertretern dieser charakteristisch strukturierten

Proteine, den NAD/NADP-abhängigen Oxido-Reduktasen aufweist. Diese bestehen zumeist

aus einer Dinukleotid- und einer substratbindenden Domäne. Das aktive Zentrum der

Enzyme liegt dabei zwischen beiden Abschnitten. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit

durchgeführten Sekundärstrukturvorhersagen stützten die bereits von Strelau postulierte

Struktur des vorhergesagten putativen 36K-Proteins, so daß an dieser Stelle auf diese Arbeit

verwiesen werden kann. (STRELAU, DISSERTATION 1997).

68

Abbildung 33: Hypothetisches Sekundärstrukturmodell von 36K, gestützt durch Protein-Datenbankvergleiche; β-Faltblätter sind durch blaue Pfeile dargestellt, die alternierenden α-Helices durchrote Tonnen; eine putative NAD/NADP-Bindestelle ist durch die rote Strukturformel angedeutet. DieseSekundärstruktur ähnelt den Rossman-gefalteten Oxido-Reduktasen.

3.5 Untersuchungen zur 36K-Genstruktur durch PCR

Um Aufschluß über die zugrundeliegenden Genstruktur zu

erhalten und somit die Intron/Exon-Grenzen festlegen zu

können, wurde gDNA aus der Forellenleber isoliert und

als Template für eine PCR eingesetzt. Es ergab sich ein

heterologes Amplifikat aus Fragmenten unterschiedlicher

Länge. Es konnten jedoch fünf prominente Banden

ausgemacht werden (Abbildung 34), die zur Verifikation

kloniert und sequenziert wurden. Durch

Sequenzvergleiche mit der in dieser Arbeit isolierten

cDNA konnten die erhaltenen Amplifikate auf ihre

Spezifität verifiziert und das größte Amplifikat von ca.

2000 bp Länge eindeutig als das zugrundeliegende

Genfragment identifiziert werden. So war es möglich, die Intron/Exon-Strukturen des 36K-

Abbildung 34: AgarosegelelektrophoreseSpur 1: gDNA-PCR mit 36K-CL-F4/36KR2; 1968 bp Amplifikat ist 36KGenfragment, Spur 2: Smart Ladder(Standard); Spur 3: gleiche PCR mit H20(neg. Kontrolle)

69

Genes in diesem Bereich festzulegen (Abbildung 36). Das 5‘ Ende des gDNA-Amplifikates

entsprach exakt dem 5‘ Ende des codierenden Bereiches der in dieser Arbeit isolierten

cDNA-Sequenz. Der als Exon I bezeichnete Bereich endet nach 56 bp in einen kanonischen

5‘ Splice Donor (GT). Das 1551 bp lange Intron I endet bei Nukleotid 1607 in einen

kanonischen 3‘ Splice Akzeptor (AG). Strangabwärts folgen 138 bp Exon II, die wiederum

in einen kanonischen GT 5‘ Splice Donor münden (Position 1745). Das Intron II umfaßt die

folgenden 172 bp und endet mit AG als 3‘ Splice-Akzeptor, an dem sich das Exon III

anschließt, welches bis zur Primersequenz dargestellt ist. Alle gefundenen Splice-Punkte des

36K-Genes unterliegen demnach der GT/AG Regel von Breathnach et al. (1978). Eine

Intron/Exon-Karte des 36K-Genes ist in Abbildung 35 dargestellt.

Abbildung 35: Karte der Intron/Exon-Struktur des 36K-Genes (modifiziert nach Strelau); für die Rossman-Faltung der Proteinstruktur wichtige Domänen (βn αn) sind in keinem Falle durch Introns getrennt.

70

71

Abbildung 36 (vorherige Seite): Sequenz des zugrundeliegenden 36K-Genes (gDNA-PCR): verwendetePrimer sind fett gedruckt, Start-ATG ist unterstrichen; codierende Regionen (Exons) in Großbuchstaben sindgrau unterlegt; Splice-Punkte sind rot dargestellt. Von Strelau (Dissertation,1997) ermittelterTranskriptionsstart ist fett/kursiv, die postulierten alternativen Start-ATG’s sind unterstrichen(Erläuterungen hierzu siehe 3.5.1)

3.5.1 Diskrepanz zwischen isolierter und vorhergesagter 36K-Sequenz

Vergleicht man die Aminosäuresequenz bzw. die zugrundeliegende Nukleotidsequenz der

hier isolierten 36k cDNA mit der von Strelau (DISSERTATION, 1997) anhand von gDNA-

Fragmenten vorhergesagten cDNA-Sequenz, fällt auf, daß sie sich im N-Terminus der

codierenden Region unterscheiden. Diese Diskrepanz erklärt sich durch eine abweichende

Nukleotidfolge (TTCCA statt TTCA) in der gDNA-Sequenz, die als Grundlage für die

Vorhersage der putativen 36K-Sequenz diente. Interessanterweise ergibt sich durch die

abweichende Sequenz eine translatierte Proteinsequenz, die bis auf 40 AS im N-Terminus mit

der hier isolierten Sequenz identisch ist und keinen Einfluß auf die vorhergesagte

Sekundärstruktur des Proteines hat (siehe auch 3.4.1, bzw. STRELAU, DISSERTATION, 1997).

ATGGAGCAGTGGATGGATAGCCTCCACCTGACTGTTTATCTTTGTGTTG-ATGTCTCTTTACCGCAACTCTGCGTGGTTTCTGAAAGGAATGACTGAATT

---CAGGAGTGCGTTCCTGTCTGCAGCCAAGCACTTTGTGGAAAAGGACCCACCAGGAGTGCGTTCCTCTCTGCCGCCAAACACTTTGTGGAAAAGGACC

TGGAGGTGTCCATGGCAGGCAGGGTCTTCCATGATCACCGGAGCCAAC..TGGAGGTGTCCATGGCAGGCAGGGTCTTC-ATGATCACCGGAGCCAAC..

Abbildung 37: Nukleotidvergleich zwischen N-Terminus der vorhergesagten cDNA-Sequenz (Strelau,Dissertation, 1997) in rot und hier isolierter cDNA Sequenz in schwarz; Start-ATG sind unterstrichen;Sequenzunterschiede (Cytosin-Insertion) ist eingerahmt

Die von Strelau zur cDNA-Vorhersage verwendetet gDNA-Sequenz ist mit der im Rahmen

dieser Dissertation ermittelten und oben beschriebenen Gensequenz in Abbildung 36 bis zur

Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym ClaI identisch (exklusive der Cytosin-Insertion;

Abbildung). Durch RT-PCR konnte in dieser Arbeit das von Strelau durch Primerextension

gefundene Transkript (Transkriptionsstart und putative Start-ATGs sind in Abbildung 36

verzeichnet) verifiziert werden. Die ermittelte Sequenz entsprach wiederum der TTCA-

Nukleotidfolge, wie sie im Rahmen dieser Arbeit stets gefunden wurde. Eine Translation

72

dieses Transkriptes, ausgehend von den von Strelau vorgeschlagenen Start-ATGs, ergibt ein

Protein von 78 AS Länge.

Abbildung 38: Agarosegelelektrophorese Verifikation eines weiteren nicht 36K-Transkriptes Spur 1: RT-PCR mit 36K CF1/36KR2; Spur 2: H2O-PCR; St: 100bp Ladder (Fa. Gibco); Spur 3: RT-PCR 36KCL-F4/36KR2; Spur 4: H2O-PCR

3.5.2 Klonierung einer putativen Promotorregion des 36K-Genes durch „inversePCR“

Nachdem die oben beschriebene Intron/Exon-Struktur des 36K-Genes nunmehr vollständig

aufgeklärt war (Abbildung 35), ergab sich die Frage nach der Sequenz und Struktur des

zugrundeliegenden Promotors. Damit einher ging die Frage nach dem Transkriptionsstart des

36K codierenden Transkriptes. Der bisher unbekannte Bereich strangaufwärts des Start-

ATGs sollte mit Hilfe der inversen PCR (2.2.13.3), die im Rahmen dieser Dissertation

etabliert wurde, kloniert werden.

Per PCR wurde eine ca. 300 bp lange DIG-markierte

Sonde spezifisch gegen den Bereich strangaufwärts

der Erkennungsstelle für Cla I inkl. des Exon I,

codierend für den N-Terminus von 36K, generiert.

Nach southernbotting von Cla I verdauter Forellen

gDNA war in Höhe von 1,2 kb sowie in Höhe von ca.

3,5 kb ein schwach positives Signal erkennbar. Aus

einem Parallelgel wurde Cla I verdaute gDNA diesesAbbildung 39: Agarosegel-elektrophorese, inverse PCR anzirkularisierter Cla I verdautergDNA mit 36K-CL-R6/ 36K-CL-F71: Template 3,5 kb gDNA; 2: 1,2 kbgDNA

73

Größenbereiches herausgeschnitten, aufgereinigt und zur Selbstligation/Zirkularisierung über

die Cla I kompatiblen Enden eingesetzt (2.2.13.3). Die inverse PCR an zirkularisierter 1,2 kb

DNA als Matrize ergab eine prominente Bande in der erwarteten Höhe, an zirklarisierter 3 kb

DNA war kein PCR-Amplifikat detektierbar (Abbildung 39). Nach Klonierung,

Sequenzierung und Sequenzvergleich mit der bislang bekannten 36K-Gensequenz konnte die

ermittelte Sequenz der 1,2 kb Bande eindeutig als distaler gDNA Bereich stromaufwärts des

Start-ATGs eingestuft werden (Abbildung 40). Die Existenz und Orientierung dieser

neugewonnenen Nukleotidsequenz konnte in einer unabhängigen PCR an unverdauter gDNA

verifiziert werden.

1 ATCGATAAAC CGCTTCTTAT GCAAGACAGA CGGCACAACT GTTCAAGTGG

50 GAGATGTGGT TTCAGTGGTG CCAGCCAGCA ACGCTTCTTT AAGCTACTGT

100 AGTGTCCGGG CAAACAGGTG GAGACAACCT GCCAAATGAA CTGGGTGTGG

150 CATTGACAAC ACCGTTACTG TAGCCTACAC ACCTTTTGGA CAGGTGCATG

200 TTCGATAGAG AGAATGTACT TGCCCTGTAA AATGTCAAAA CATGGAACCA

250 AAAGCAGACA TTTTACTCAC CATCGTGAAG CTGCAATGTG ACAGTAAGGA

300 CAACAGTTGA GGGAAAATAT GTTAACTACA TTCTTGCGTA AAACCGGTAC

350 ATAGGGACTG GCAACGTCAA ATTCCCACAA TGCTGTGGGT TAAGTTGCGA

400 AACCATATCT TCTCTTGTCT TGACTGTGCC GCGCCCCGCN TTTTGCTTTG

450 CTTGGTCAGA AAAGGTTCAC ACCTTTCACA GGAGGTTCCT GGGCAAGGTG

500 CATTGTAGTA CTGTACTAAC TGGTTTATGA TCAAATATAG ATATTATCCT

550 GTTTGTCAAG CCAAGTTATG TGCGTCTATT ATTTCATTTC CAGCGACAGA

600 CATATTGCGT GTTCTTTTGG ATTTTTCTAT TGTAGCCTAA AGGCCTATAA

650 AAACCGACAA TTAGTCTCAG TTCCCCCAGA ATTATTATCA ATAATTCCCT

700 GATTTAATTT TATTCTGTTA CTNAAATATG CGGTCGTTGA AATGTAATTT

750 GAAATGCTGT GCATGCAACT CCTGAATTTG CCATGCAAAC CTATTGGAGA

800 TTCAGTAGGA TTGTTTTTTA ACATTAATTC AAGCCTATAG ACATCATGGA

850 CAGTGTCGAG CTGACACCAG TTGACACCGA GTTTGATTGT GCCTCAGTTG

900 TTGATCCCAA CTCGCCGCTG GGTGGCCGAA GGTGTCATCC AATGTAAATT

950 CACACACGTG GGTTTGGTCC AAGTTAAAAC CGGAGGAGAG AGTGCAATAA

1000 CGGACGACGG GACGAGAGGA TTCCATGGGT AATTCAACGA TGTCTCTTTA

1050 CCGCAACTCC GCGTGGTTTC TGAAAGGAAT GACTGAATTC

Abbildung 40: Durch inverse PCR erhaltene gDNA-Sequenz (putative Promotorregion); codierende Regionist grau unterlegt; Erkennungsstelle für Cla I ist umrahmt; Start-ATG der isolierten 36K cDNA ist rot und

74

unterstrichen; putatives Start-ATG in Position 1024 rot; strangauwärts „in-frame“ Stop-codon rot; putativeTATA-Boxen kursiv

Die neugewonnene putative Promotor-, bzw. 5‘ UTR-Sequenz ist in Abbildung 40 in der

korrespondierenden Genstruktur dargestellt. In Position 1039 befindet sich das Start-ATG

der isolierten cDNA. Die N-terminale codierende Region erstreckt sich bis zum Ende der

dargestellten Sequenz. Der Bereich zwischen Position 1029-1039 ist bis auf ein

Nukleotidaustausch (Position 1034 T statt A) mit der als 5‘ UTR interpretierten Sequenz der

isolierten 36K cDNA (Abbildung 31) identisch. In Position 1024 befindet sich im gleichen

Leserahmen wie das isolierte 36K-Transkript als erstes ATG hinter einem Stop-Codon

(Position 998) ein weiteres putatives Start-ATG. Innerhalb der putativen Promotorregion

konnten mehrere potentielle TATA-Boxen gefunden werden (Position 589, Position 681;

Position 703; Position 823). Die potentiellen TATA-Boxen in Position 823 (Sequenz

TTAATTCAA), in Position 589 (Sequenz TTATTTCAT) und in Position 681 (Sequenz

TTATTATCAA) weisen auffällige Ähnlichkeiten zu der für das IP-Gen gefundenen TATA-

Box (JESERICH, STRELAU UND LANWERT, 1997), dargestellt in Abbildung 41 auf.

Abbildung 41: Sequenzvergleich zwischen putativen TATA-Boxen des 36K-Genes mit der TATA-Box des IP-Genes; identische Nukleotide sind grau hinterlegt

3.6 Heterologe Expression der isolierten 36K cDNA in CHO-K1

Die codierende Region der isolierten 36K cDNA wurde wie unter 7.5 beschrieben, in den

pIRES-hygro Expressionsvektor kloniert und diente zur Transfektion von CHO-K1-Zellen

(2.2.49). 48h nach Transfektion zeigten ca. 5% der CHO-Zellen eine deutliche granuläre

Immunfärbung im Bereich des Cytoplasmas (Abbildung 43). Der korrespondierende

Westernblot (Abbildung 42) zeigt eine immunopositve Bande, die leicht unterhalb der

nichtrekombinanten Forellenmyelin 36K-Probe läuft. Eine Klonierung von stabilen

Expressoren mit Hilfe der Hygromycin/G418-Selektion (2.2.51) ist leider trotz mehrerer

75

Ansätze nicht gelungen.

Abbildung 42. Westernblot mit 36K transfizierten CHO-Zellen (36K/CHO); daneben Forellenmyelin (My)bzw. untransfizierte CHOZellen (CHO); (Nachweis mit α36K)

Abbildung 43: Immunfloureszenz 48 h nach Transfektion: r36K/CHO-Zellen (Methanolfixierung α36K/cy3,600x)

3.7 Expression in E. coli (pET-System)Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei verschiedene präparative E. coli

Expressionssysteme etabliert und vergleichend eingesetzt. Hierbei handelte es sich um das

IMPACT-System, pMAL-System (2.2.27 und 2.2.21) sowie das pET-System (2.2.23).

Es zeigte sich, daß weder das IMPACT-System noch das pMAL-System für die Expression

76

von r36K geeignet war. Nach Induktion und Aufreinigung (2.2.27 und 2.2.21 f ) waren nur

marginale Proteinausbeuten von ≤ 550µg/ 1l Kultur detektierbar, die außerdem stark mit

Fremdprotein kontaminiert waren. Das Zielprotein machte somit nur ca. 15 % aus (Daten

nicht gezeigt). Diese geringen Ausbeuten waren durch Veränderung der

Induktionsbedingungen (Zeitpunkt und -dauer und/oder Temperatur nach Induktion) nicht zu

verbessern. Daher wurden diese Ansätze verworfen. Das pET-System lieferte jedoch

ansprechende Resultate.

In dieser Dissertation ist es gelungen, 36K mit Hilfe des pET-System (Klonierungsschema

siehe 7.7) unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von 6M Harnstoff in großen

Mengen aufzureinigen (2.2.23 ff). Nach

dreistündiger Induktion bei 37° C war im

Vergleich zur nicht induzierten Spur auf dem

SDS-PAGE in Abbildung 44 eine prominente

Bande in der erwarteten Größe sichtbar.

Nach Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie

in Gegenwart von 6M Harnstoff konnte das

rHis-Tag-36K-Protein nahezu ohne

Fremdproteinkontaminationen aufgereinigt

werden. Eine vergleichende Aufreinigung

unter nativen Bedingungen ohne Harnstoff

brachte nur unbefriedigende Ausbeuten und

starke Kontaminationen durch Fremdprotein

(Abbildung 44) Das rekombinante His-Tag-

36K liegt in der Bakterienwirtszelle nach

Induktion offensichtlich zum größten Teil in

Einschlußkörpern („inclusion bodies“) vor. Der korrespondierende Westernblot zeigt ein

immunopositives Signal auf der Höhe der eluierten Bande. Das elektrophoretische

Laufverhalten des rHis-Tag-36K Proteins weicht von dem des „nativen“ 36K aus dem Myelin

der Forelle aufgrund der „His-Tag“-Erweiterung durch zusätzliche 21 Aminosäuren, davon

10 geladene Histidine, in der erwarteten Weise ab (Abbildung 44). Die denaturierende

Aufreinigung des rHis Tag-36K ergab Ausbeuten von ≥ 7,5 mg Zielprotein / 1l Kultur.

Abbildung 44: SDS-PAGE/Westernblot einertypischen Expression von 36KHT in E.coli BL 21(DE3)/pLysS-36K/pET16b und Aufreinigung inGegenwart von 6M Harnstoff; Spur 1: nicht induzierteZellen; Spur 2: 3h nach Induktion bei 37°C; Spur 3:denaturiernd aufgereinigtes 36KHT in Gegenwart von6M Harnstoff; Spur4: nativ aufgereinigtes Eluat; Spur5: Westernblot vom 36KHT Eluat denat.

77

3.7.1 Alternative Aufreinigung von His-Tag-36K durch Affinitätschromatographiemit Farbsepharosen

Um erste Hinweise auf eine denkbare NAD- bzw. NADP-bindende Funktion des 36K

Proteines zu erhalten wurde eine Affinitätschromatographie mit Farbsepharosen (2.2.26)

durchgeführt. Wie aus Abbildung 45 deutlich wird, konnte jedoch natives HisTag-36K mit

dieser Methode unter den gewählten Bedingungen nicht aufgereinigt werden. Durch

Veränderung der Pufferbedingungen und/oder der Farbsepharose könnten weiterführende

Studien mit renaturiertem, gereinigtem 36KHT jedoch Hinweise auf eine NAD/NADP-

Abhängigkeit des HisTag-36K-Proteines bringen.

Abbildung 45: Westernblot alternative 36K Aufreinigung mit „reactive red“ Sepharose; my: ZNS Myelin;neg.: E coli Zellysat nicht induziert; 1: nativ aufgereinigtes 36KHT Eluat nach Umpuffern; Spur 2: nicht anSäule gebundener Durchlauf; Spur 3: Waschdurchlauf; Spur 4 und 5: Elution mit 20 mM NAD bzw. NADP

3.8 Expression in Insektenzellen / Baculovirus-SystemVergleichend zu den E. coli Systemen wurde in der vorliegenden Dissertation die Methode

der Baculovirus-Expression „Bac-to-Bac“ (siehe 2.2.20 f.) als weitere heterologe

eukaryotische Proteinexpressionsmethode etabliert. Als Wirtszellen dienten HighFive-Zellen

(H5) bzw. Sf21-Zellen. Da die Baculovirus-Expression zur Lyse der infizierten Wirtszelle

führt, ist es günstig, den Erfolg und den zeitlichen Verlauf der Infektion überprüfen zu

können (3.2.9). Hierzu diente in der vorliegenden Arbeit das Grünfluoreszierende Protein

(GFP) als Reportergen. Das komplexe Klonierungsschema des Konstruktes, bestehend aus

78

Reportergen und Zielproteingen, ist unter 7.6 ausführlich dargestellt. Wie unter 2.2.20.1 f

beschrieben, konnten r36KHT/GFP-DualAcNPV kloniert werden, die für die

Proteinexpression (2.2.20.3) eingesetzt wurden.

Abbildung 46 zeigt zeigt r36KHT/GFP-DualAcNPV infizierte HighFive-Zellen im

Fluoreszenzmikroskop 72h nach Infektion. Zu diesem Zeitpunkt waren bereits ca. 50 % aller

Zellen infiziert und zeigten eine deutliche Immunfärbung.

Abbildung 46: links: Immunfloureszenz 72h nach Infektion 36KHT/GFP-Dual/High Five (α36K/cy3, 400x),GFP-Markierung der 36KHT/GFP-Dual-Expressoren

Abbildung 47: SDS-PAGE; 1: HighFive Zellysat; 2: HighFive 3 Tage nach Infektion mit r36KHT/AcNPV; 3:r36KHT Eluat nach Aufreinigung; 4: Westernblot (α36K) an r36KHT-Eluat

Die SDS-PAGE in Abbildung 47 zeigt eine typische Expression und His-Tag -Aufreinigung

(2.2.24) des rHis-Tag 36K aus HighFive-Zellen in Gegenwart von 6M Guanidin-HCl,

79

daneben der korrespondierende Westernblot mit einer immunopositiven Bande in der

erwarteten Höhe. Das Laufverhalten des rHis-Tag-36K weicht aufgrund der His-Tag-

Erweiterung um insgesamt 28 Aminosäuren wie schon unter 3.7 beobachtet ab. Die

Ausbeuten der Baculovirus-Expression fielen mit ca. 500µg Zielprotein /1l Kultur um eine

10er Potenz geringer aus als das vergleichbare E. coli System (3.7).

80

4 Diskussion

Im Rahmen dieser Dissertation konnten die cDNAs der Hauptmyelinproteine IP2 und 36K

aus dem ZNS der Forelle vervollständigt und in unterschiedlichen Systemen heterolog

exprimiert werden, so daß eine erste Grundcharakterisierung dieser Proteine möglich wurde.

Es konnten erste experimentelle Hinweise auf die Funktionen dieser putativen

Adhäsionsmyelinproteine in mimetischen Systemen gewonnen und darüberhinaus weitere

Einsichten in die Sequenz und Struktur der zugrundeliegenden Myelinproteingene erhalten

werden.

Da die Sequenz der IP2 cDNA vor Beginn der Arbeit nicht vollständig bekannt war, wurde

sie zunächst durch PCR-gestützte Techniken komplettiert. Die IP2 cDNA Nukleotidsequenz

ist in dem codierenden Bereich mit der cDNA-Sequenz der bereits isolierten IP1-Isoform

identisch, am 3‘ Ende aber um 90 bp verlängert. Die 3‘ UTR der IP2 cDNA ist mit ca. 1000

bp auffällig lang und besitzt charakteristische Merkmale. Im Anschluß an die verlängerte

codierende Region erstreckt sich eine kurze IP2 spezifische 3‘UTR, die in eine für beide IP-

Isoformen identische 3‘UTR inkl. poly (A). mündet. Die cDNAs der beiden Splice-Varianten

IP1 und IP2 unterscheiden sich also außer in der verlängerten cytoplasmatischen Domäne nur

durch kurze Isoform-spezifische 3‘ UTR-Abschnitte. Es ist zur Zeit noch nicht geklärt, ob

die gemeinsame 3‘ UTR-Sequenz zweimal auf der gemeinsamen prä-mRNA vertreten ist

oder aber als konstitutives Exon innerhalb der 3‘ UTR entsprechend für beide Varianten

prozessiert wird. Über die physiologische Bedeutung von 3‘ UTRs ist allgemein wenig

bekannt, doch dürften sie eine wichtige Rolle bei der Prozessierung von Transkripten und

somit bei der Regulation des alternativen Splicings spielen. Beiden IP-Isoformen liegt der

gleiche Promotor zugrunde (JESERICH, STRELAU UND LANWERT, 1997), die Expression der

Proteinvarianten wird jedoch entwicklungsabhängig gesteuert. Hierbei wird zunächst die

längere IP2 Isoform exprimiert, erst in späteren Entwicklungsstadien folgt die Expression

von IP1 (JESERICH ET AL., 1990A). Es ist daher anzunehmen, daß sich auf der beiden

Varianten zugrundeliegenden gemeinsamen prä-mRNA Sequenzmotive befinden, die die

Auswahl der alternativen Splice-Punkte beeinflussen und somit die differentielle

Proteinexpression regulieren. Die Regulation von alternativen Splice-Vorgängen ist bisher

nur wenig verstanden, doch konnten hierfür bereits Protein-Protein-, Protein-RNA-, und

81

RNA-RNA-Interaktionen verantwortlich gemacht werden, die ihrerseits

entwicklungsabhängig reguliert werden. (STOJDL UND BELL, 1999; ZHAO ET AL, 1999;

LOPEZ, 1998; VARANI UND NAGAI, 1998). Innerhalb der gemeinsamen reifen 3‘ UTR von

IP1 und IP2 konnten außerdem AT-reiche Sequenzmotive gefunden werden. Diese Motive

könnten Determinanten für die Instabilität einer mRNA darstellen und ihre Degradation

beeinflussen (SHAW UND KAMEN, 1986). Weiterhin gibt es Hinweise, daß die 3‘ UTR-

Sequenzen von Myelinproteinen die Translationseffizienz beeinflussen und so zur Regulation

der Proteinexpression beitragen können. So sind z. B. für das Basische Myelinprotein durch

progressive Deletionen der 3‘ UTR bis zu zehnfache Unterschiede in der Translations-

effizienz beobachtet worden (UENO ET AL., 1994). Auch für das Periphere Myelinprotein 22

(PMP22) ist seit kurzem bekannt, daß die 3‘ UTR cis-inhibierenden Motive enthält, welche

die Translationseffizienz beeinflussen (BOSSE ET AL., 1999) Der molekulare Mechanismus

hinter dieser post-transkriptionellen Regulation sowie eventuelle konservierte Konsensus-

Sequenzmotive sind bislang jedoch noch nicht bekannt. Ein weiterer denkbarer Aspekt für

die Funktion der IP1/2 spezifischen 3‘ UTR ist die Regulation der Proteinlokalisation des

translatierten Proteines. Erst kürzlich konnte in Drosophila-Oozyten gezeigt werden, daß die

subzelluläre Lokalisation dreier durch alternatives Splicing entstandener Genprodukte durch

unterschiedliche 3‘ UTRs reguliert wird. (WHITTAKER ET AL. 1999). Ähnliche mRNA-

abhängige Proteintranslokation ist ebenfalls für das Basische Myelinprotein beschrieben,

wobei die regulatorischen Sequenzmotive jedoch nicht ausschließlich auf die 3‘ UTR

beschränkt, sondern auch innerhalb der codierenden Region auszumachen sind (BOCCACIO ET

AL., 1999; WOODRUFF UND FRANKLIN,1998; COLMAN ET AL., 1982; GOTTLIEB, 1992;

REVIEW: CARSON ET AL.,1998). Weiterführende Arbeiten, in denen die 3‘UTR von IP1/2

hinter die codierende Region eines Reportergenes wie das Grünfluoreszierende Protein

(GFP) oder Chloramphenicol-Acetly-Transferase (CAT) kloniert werden würde sowie die

Isolierung der zugrundeliegenden Gen-, bzw. prä-mRNA-Sequenz, könnten interessante

physiologische Aufgaben der proteinspezifischen bzw. gemeinsamen 3‘ UTR liefern.

Anhand der isolierten cDNA-Sequenz wurde die Aminosäuresequenz des IP2-Proteines

abgeleitet. Für viele der in der IP2 cDNA-Sequenz codierten Aminosäuren konnte eine

auffällige Codonpräferenz ausgemacht werden. Die bevorzugten Codons stehen in

Übereinstimmung mit der von Wada et al. (1991) veröffentlichten Codonpräferenz von

82

Knochenfischen. Das IP2-Protein ist 231 Aminosäuren lang und in der cytoplasmatischen

Domäne im Vergleich zur IP1-Splice-Variante um 29 Aminosäurereste verlängert. Das

kalkulierte Molekulargewicht des reifen Proteines von 23 kDa steht in guter

Übereinstimmung mit der elektrophoretischen Mobilität des reifen deglykosilierten IP2-

Moleküls (JESERICH UND WAEHNELDT, 1987). Außerdem stimmt der vorhergesagte

isoelektrische Punkt des Proteines (pI: 10,53) mit früher gewonnenen Resultaten aus 2 D-

Gelektrophorese-Analysen überein (JESERICH UND WAEHNELDT, 1986).

Sequenzvergleiche der cytoplasmatischen Domäne des IP2-Porteins aus dem ZNS der Forelle

mit den cytoplasmatischen Domänen des obligatorischen PNS-Adhäsionsprotein P0 von

Ratte (LEMKE UND AXEL, 1985), Mensch (HAYASAKA ET AL., 1991) und Hai (SAAVEDRA ET

AL., 1989) zeigten eine charakteristische Verteilung von identischen Aminosäuren. Diese

Aminosäureübereinstimmung ist im verlängerten C-terminalen Proteinbereich, der nur in der

IP2 Splice-Variante zu finden ist, mit 71% besonders hoch. Die letzten sieben Aminosäuren

mit einer positiven Nettoladung sind in allen verglichenen Spezies identisch. In dem Teil der

cytoplasmatischen Domäne, der von IP1 und IP2 geteilt wird, beträgt die Aminosäure-

übereinstimmung lediglich 34%. Phylogenetisch konservierte Aminosäuren sind meist

basisch, d.h. positiv-geladen. Zu den konservierten Bereichen gehören auch zwei Protein-

Kinase C-Phosphorylierungsstellen. Aufgrund der auffälligen Verteilung von konservierten

Aminosäuren ist eine wichtige funktionelle Rolle der cytoplasmatischen Domäne des IP2-

Proteines zu vermuten. Es ist denkbar, daß die stark positiv-geladene, basische Domäne

aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen an saure negativ-geladene

Membranphospholipide bindet, also als „Membrananker“ fungiert und somit die Apposition

der cytoplasmatischen „major dense line“ unterstützt. Eine derartige Membranassoziation

wurde bereits 1985 von Lemke und Axel für das P0-Protein postuliert und konnte

experimentell mit Hilfe von artifiziellen negativ-geladenen Liposomen und die durch

chemische Spaltung als Peptidfragmente isolierte cytoplasmatische Domäne des P0-Proteins

nachgewiesen werden (DING UND BRUNDEN, 1994). In diesem Zusammenhang ist

erwähnenswert, daß die verwendeten cytoplasmatischen P0-Domänen eine

Mikroheterogenität in der Nettoladung aufwiesen, die auf einen unterschiedlichen

Phosphorylierungsgrad zurückzuführen ist. Die Zelle ist so in der Lage, aufgrund von

Phosphorylierungen die Membranbindung der cytoplasmatischen Domäne zu modulieren. Die

83

phylogenetische Konservierung der Position der Protein-Kinase C-Phosphorylierungstellen

zwischen dem evolutiv weit entfernten P0-Protein der Säuger und dem IP2-Protein der

Forelle läßt eine vergleichbare Funktion nicht abwegig erscheinen. Eine ebenfalls für P0

beschriebene Membranverankerung durch Palmytilierung der cytoplasmatischen Domäne

(GAO UND FILBIN, 1999), die z.B. auch in dem neuralen Zelladhäsionsmolekül N-CAM

(LITTLE ET AL., 1998) und PLP (POPOT ET AL., 1991) gefunden werden konnte, scheidet für

das IP2-Protein aus, da es keine cytoplasmatischen acylierbaren Cysteinreste besitzt.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß durch die hier gefundenen auffälligen Sequenzüberein-

stimmungen zwischen IP2 und P0 innerhalb der cytoplasmatischen Domäne die bereits von

Stratmann und Jeserich (1995) beschriebene strukturelle und sequentielle Ähnlichkeit

zwischen IP und dem obligatorischen Adhäsionsprotein P0 gestützt werden konnte.

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die adhäsiven Eigenschaften der in beiden

Isoformen identischen extrazellulären Domänen von IP in einem mimetischen Zellsystems zu

untersuchen. Dazu wurde ein Adhäsionstest etabliert, der es ermöglichte, das

Aggregationsverhalten von transfizierten und nicht transfizierten Einzelzell-Suspensionen zu

vergleichen. Da sich eine transfizierte Zelle nur durch die Expression des jeweiligen

Zielproteins von einer nicht-transfizierten Zelle unterscheidet, konnten Unterschiede im

Aggregationsverhalten auf adhäsive Eigenschaften des heterolog exprimierten Zielproteins

zurückgeführt werden. Durch Trypanblau-Ausschluß-Test wurde überprüft, daß die

aggregierten Zellen vital sind, so daß eine unspezifische Verklumpung von toten Zellen

auszuschließen ist. Die Zunahme der gebildeten Zellaggregate in der Zellsuspension wurde

mit einem automatischen Teilchenzählgerät quantifiziert und zusätzlich mikroskopisch

analysiert. Wie erwartet aggregierten bereits untransfizierte Zellen der myelinbildenden

oligodrendroglialen OLN-93-Zellinie aufgrund starker intrinsischer Adhäsionseigenschaften

zu großen Zellaggregaten und kamen daher als Wirtszelle für die Adhäsionsassays nicht in

Frage. Untransfizierte CHO-K1-Zellen waren deutlich weniger adhäsiv, so daß sie als

Wirtszelle für alle folgenden Experimente eingesetzt wurde. Es wurde deutlich, daß bei

alleiniger Betrachtung der durch die automatische Quantifizierung der absoluten Teilchenzahl

in der Zellsuspension ermittelten N(t)/N(0)-Werte die durch mikroskopische Analyse ermittelte

Aggregation unterschätzt werden kann. Es ist denkbar, daß durch auftretenden Scherkräfte

während der Partikelzählung Zellaggregate partiell dissoziieren können, so daß nur sehr

84

starke Adhäsionen quantifizierbar sind. Durch die mikroskopische Analyse ist daher

zusätzlich eine Detektion von schwächeren Bindungen bzw. Interaktionen möglich. Die

Funktionalität und Reproduzierbarkeit des etablierten Adhäsionsassays konnte mit Hilfe der

rP0/CHO-Kontrollzellen überprüft werden, da die im Rahmen dieser Dissertation

gemessenen und beobachteten Adhäsionen frühere Untersuchungen mit diesen Zellen

stützten (FILBIN ET AL, 1990; WONG UND FILBIN, 1996; GAO UND FILBIN, 1999).

IP1 und IP2 konnten transient in CHO-Zellen exprimiert werden. 48 h nach Transfektion

zeigten ca. 5% der transfizierten Zellen eine deutliche Immunfärbung. Durch eine

Oberflächenmarkierung von nicht permeabilisierten transfizierten Wirtszellen wurde deutlich,

daß IP1 und IP2 auch in CHO-Zellen in die Zellmembran integriert wurden. Im

korrespondierenden Westernblot zeigte sich, daß IP1/2 auch in der CHO-Wirtszelle

glykosiliert werden, da das apparente Laufverhalten der heterolog exprimierten IP-Splice-

Varianten exakt mit dem Laufverhalten der aus Forellenmyelin isolierten IP-Proteine

übereinstimmte. Diese Glykosilierung könnte eine wichtige funktionelle Bedeutung für IP1/2

besitzen. Zwar ist die Kohlenhydratseitenkette von IP noch nicht im Detail analysiert, doch

konnte in gereinigtem PNS-Myelin der Forelle sowie im ZNS-Myelin des Karpfens durch

Immunreaktion das Kohlenhydrat-Epitop HNK-1 nachgewiesen werden (HAMMER ET AL.,

1993; TAKEI ET AL., 1993), welches außer im Immunsystem und einer Anzahl von neuralen

Adhäsionsproteinen auch im P0-Protein auftritt (BOLLENSEN UND SCHACHNER, 1987). Die

Kohlenhydratseitenkette wurde für P0 durch Kristallstrukturanalysen an der Basis der

extrazellulären Domäne in der Nähe der Zellmembran positioniert (SHAPIRO ET AL., 1996).

Die Funktion ist bislang umstritten. Während Filbin und Tennekoon 1991 dem

Kohlenhydratrest eine für die homophile Adhäsion essentielle Lectin-ähnliche Funktion

zugeschrieben haben, fanden Schachner und Mitarbeiter, daß die bakteriell heterolog

exprimierte extrazelluläre P0-Domäne, die demnach nicht-glykosiliert vorliegt, ebenfalls

homophile Bindekapazitäten besitzt (GRIFFITH ET AL., 1992). Kürzlich konnte die Struktur

des HNK-1 Kohlenhydratkette des P0-Proteines aus Rind durch NMR-Spektroskopie

bestimmt werden, die genaue Funktion bleibt aber weiterhin unbekannt (VOSHOL ET AL.,

1996). Durch Untersuchungen mit Endoglykosidase F konnten neben dem gemeinsamen

HNK-1-Epitop signifikante Unterschiede im Kohlenhydratrest der IP-Proteine der Forelle

und dem P0-Protein aufgedeckt werden (JESERICH UND WAEHNELDT, 1987), so daß auch

85

über die Funktion der IP-Glykosilierung bislang nur spekuliert werden kann.

Es konnte ein stabiler IP1/CHO-Zellklon durch Antibiotikaselektion und limitierender

Verdünnung selektiert, expandiert und für die Adhäsionstests eingesetzt werden. Nahezu

100% der Zellen wurden per Immunfärbung als positive Expressoren identifiziert. Aufgrund

der im Vergleich zur transienten Expression schwächeren Fluoreszenzfärbung von stabilen

Transfektanden, kann davon ausgegangen werden, daß das Expressionsniveau stabiler

Expressoren pro Zelle unter dem von transient exprimierenden Zellen lag. Während bei der

transienten Expression offensichtlich mehrere Kopien des Expressionsvektor-Konstruktes in

der Zelle vorliegen, integriert bei der stabilen Expression durch das seltene Ereignis der

nicht-homologen Rekombination nur eine oder wenige Kopien des Expressionsvektors in das

Genom der Zelle, so daß das Expressionsniveau sinkt. Es ist an dieser Stelle wichtig zu

erwähnen, daß die als Positivkontrolle verwendeten rP0/CHO-Zellen ein deutlich höheres

Expressionsniveau aufweisen: Bei den verwendeten P0-Zellen handelt es sich nämlich um

eine spezielle Dihydrofolat-Reduktase (dhfr) defiziente CHO-DG44-Zelle. Dieser Gendefekt

des essentielle Enzymes wurde in trans mit dem Expressionsvektor, der auch das P0-

Zielprotein codiert, komplementiert. So war es möglich, durch Zellkultivierung in

ansteigenden Methotrexat (MTX)-Dosen (dhfr-Antagonist), aufgrund des bislang nicht

detailliert beschriebenen Phänomens der Genamplifikation, das Expressionsniveau von P0 zu

erhöhen. Im Vergleich zu nicht geboosteten transfizierten Zellen liegen mehrere Kopien

integriert im Genom der Wirtszelle vor, was mit einer Steigerung der P0 Expression um

590% einhergeht und somit 8-16 fach über dem Expressionsniveau von kultivierten

Sekundären Schwannzellen liegt (FILBIN UND TENNEKOON, 1990). Das Phänomen der

Genamplifikation ist offensichtlich auf einige spezielle Gene, darunter die beschrieben dhfr-

Amplifikation, beschränkt (SINGER UND BERG, 1992; KAUFMAN ET AL., 1979; MONTOYA-

ZAVALA ET AL., 1985), da es in dieser Arbeit nicht gelungen ist, durch ansteigende

Antibiotikakonzentrationen das Expressionsniveau von IP in CHO-Zellen zu steigern. Eine

vergleichende Quantifizierung des Oberflächenexpressionsniveaus der P0-Zellen mit den in

dieser Arbeit isolierten stabilen IP-Expressoren, z.B. durch einen Zell-ELISA, ist nicht

möglich, da hierfür unterschiedliche Antikörper verwendet werden müßten, zwischen denen

nicht verglichen werden kann. Folglich ist auch ein direkter quantitativer Vergleich zwischen

allen im Rahmen dieser Arbeit gemessenen Adhäsionswerten der IP-Expressoren und den P0-

86

Kontrollzellen nicht möglich.

In den im Rahmen dieser Dissertation erstmals durchgeführten Adhäsionstests konnte gezeigt

werden, daß das IP-Protein der Forelle eine Funktion als Adhäsionsmolekül ausübt. Stabil

transfizierte rIP1/CHO-Zellen waren im Vergleich zu nicht transfizierten CHO-Zellen

schwach adhäsiv. Die absolute Partikelzahl ging in der rIP1/CHO-Zellpopulation auf ca. 36%

zurück, während in nicht-transfizierten CHO-Kontrollzellen aufgrund ihrer intrinsischen

Adhäsionseigenschaften die Teilchenzahl auf ca. 45% zurückging. Noch deutlicher wurde die

gemessene Adhäsion in der mikroskopischen Anlayse: rIP1/CHO-Zellen bildeten

hauptsächlich Zellaggregate aus bis zu 10 Zellen, während sich untransfizierte CHO-Zellen

überwiegend zu Tripletts zusammenfanden. Die gebildeten rIP1/CHO-Zellaggregate konnten

allerdings durch mehrmaliges Invertieren wieder dissoziiert werden. Es dürfte sich daher bei

der IP1-vermittelten Adhäsion um recht schwache Interaktionen handeln. Dieses könnte den

Unterschied zwischen der durch automatische Teilchenzählung (Scherkräfte) gemessenen

und der mikroskopisch beobachteten Adhäsion erklären.

rIP-P0/CHO-Zellen, die ein chimäres Fusionsprotein bestehend aus der extrazellulären und

transmembranellen Domäne des IP und der vollständigen cytoplasmatischen Domäne des P0

Proteins exprimierten, waren deutlich adhäsiver als rIP1/CHO-Zellen. Die absolute

Partikelzahl von rIP-P0/CHO ging im Adhäsionsassay auf ca. 24% zurück, im Gegensatz zu

ca. 45% bei den nicht-transfizierten Kontrollzellen und 36% bei rIP1/CHO. Auch in diesem

Fall wurde die Adhäsion von rIP-P0/CHO-Zellen in der mikroskopischen Kontrolle

deutlicher: rIP-P0/CHO-Zellen bildeten während des Adhäsionsassays Zellaggregate von bis

zu 35 Zellen, während sich IP1/CHO-Zellen zu kleineren Aggregaten von 6-10 Zellen

zusammenfanden. Diese Unterschiede im Aggregationsverhalten lassen sich nicht durch die in

einem vergleichenden Zell-ELISA detektierten geringen, aber nicht-signifikanten

Unterschiede im Oberflächenexpressionsniveau (ca. 1,3 fach mehr IP-P0 als IP1) erklären.

Der Unterschied im Adhäsionsverhalten zwischen rIP-P0/CHO und rIP1/CHO ist daher nicht

auf einen Gendosiseffekt, sondern auf die unterschiedlichen cytoplasmatischen Domänen der

Adhäsionsproteine zurückzuführen. Die cytoplasmatische Domäne wirkt offenbar als eine Art

„Membran/Cytoskelettanker“ was somit eine stärkere Adhäsion ermöglichen würde. Der hier

gefundene Einfluß der cytoplasmatischen Domäne auf die Adhäsionseigenschaften des IP-

87

Proteins steht in Übereinstimmung mit Untersuchungen beim P0-Protein. Mutierte bzw.

trunkierte P0 Varianten (Deletion der cytoplasmatischen Domäne) waren im Adhäsionsassay

nicht von untransfizierten Zellen zu unterscheiden (GAO UND FILBIN 1999; WONG UND

FILBIN, 1994). Nicht nur für P0, sondern auch für die Cadherine, eine Gruppe von

Adhäsionsmolekülen, die nicht wie IP und P0 zur Immunglobulin-Superfamilie gezählt

werden, ist bekannt, daß die intakte cytoplasmatische Domäne mit Bestandteilen des

Cytoskeletts interagiert und so essentiell für die Funktion als Adhäsionsmolekül ist

(NAGAFUCHI UND TAKEICHI, 1988; NAGAFUCHI ET AL., 1991; HIRANO ET AL., 1992).

Die adhäsiven Eigenschaften der rIP-P0/CHO-Zellen waren durch Zugabe des αIP1-

Antikörpers, der in dieser Arbeit als spezifischer Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne

von IP charakterisiert wurde, vollständig und selektiv zu blockieren. Durch Antikörper

blockierte rIP-P0/CHO-Zellen waren praktisch nicht von untransfizierten CHO-

Kontrollzellen zu unterscheiden, auf die der Antikörper keinen Effekt hatte. Beide

Zellpopulationen bildeten Zellaggregate aus bis zu 5 Zellen, während sich rIP-P0/CHO-

Zellen ohne Antikörperzugabe zu Zellaggregaten aus bis zu 35 Zellen zusammenfanden.

Diese selektive Inhibierung der Adhäsion durch einen spezifischen Antikörper gegen ein

Oberflächenepitop der IP-Proteine unterstreicht die Korrelation zwischen IP-Expression und

Zellaggregation und paßt gut zu vergleichbaren Studien mit dem P0-Protein (ZHANG ET AL.,

1996). Der Antikörper bindet an der extrazellulären Domäne und maskiert sie gegen

Proteininteraktionen. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Untersuchungen, daß die

extrazelluläre Immunglobulin-ähnliche Domäne der IP-Splice-Varianten Zell-Zell-Adhäsion

vermittelt. Die cytoplasmatische Domäne fungiert wahrscheinlich als Membran-, bzw.

Cytoskelettanker und festigt somit die Zell-Zell-Kontakte. IP1/2 ist demnach als Vertreter

der Ig-CAM-Superfamilie ebenfalls als typisches Adhäsionsprotein einzustufen.

Weiterführende Studien mit mehreren verschiedenen Zellklonen stabiler IP2-Expressoren

könnten wichtige neue Einsichten zur Funktion der cytoplasmatischen Domänen der IP-

Splicevarianten ermöglichen. Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung innerhalb der

cytoplasmatischen Domänen zwischen P0 und IP2, könnte für IP2 ein dem chimären IP-P0-

Fusionsprotein ähnliches Aggregationsverhalten vermutet werden. Besonders interessant

wären auch Untersuchungen zur Adhäsivität von IP1/IP2 Co-Expressoren. Es ist nämlich für

88

das P0-Protein bekannt, daß die Fähigkeit zur Adhäsion durch Co-Expression einer in der

cytoplasmatischen Domäne trunkierten Proteinvariante zusammen mit einem vollständigen

P0-Protein inhibiert wurde. Die trunkierte P0-Variante übt also einen inhibierenden

dominant-negativen Einfluß auf die Adhäsion aus (WONG UND FILBIN 1996). Im

Forellenmyelin hingegen liegen eine „verkürzte“ und eine „vollständige“ IP-Splicevariante in

vivo gemeinsam im kompakten Forellenmyelin vor. Es wäre daher denkbar, daß durch die

Expression zweier putativ unterschiedlich adhäsiver Proteine die Kompaktierung des

Myelinmembran moduliert werden kann. Weiterführende Arbeiten mit entsprechenden

IP1/IP2 Co-Expressoren könnten Einblick in diesen interessanten Aspekt der Myelinogenese

ermöglichen.

Es ist an dieser Stelle interessant zu erwähnen, daß das IP-P0-Fusionsprotein im Westernblot

nur durch die Antikörper αIP1 bzw. 4C5 detektiert werden konnte. Diese Antikörper sind

demnach spezifisch für die extrazelluläre Domäne des IP-Proteins. Überaschenderweise

weicht das apparente Laufverhalten von IP-P0 von seinem kalkulierten Molekulargewicht ab.

Es wurde bereits mehrfach beschrieben, daß P0 äußerst empfindlich auf Proteolyse reagiert

(CAMMER ET AL., 1981; WONG UND FILBIN, 1996). Da die Zellyse von rIP-P0/CHO-Zellen

zur Probenvorbereitung ohne Proteaseinhibitoren durchgeführt wurde, ist es wahrscheinlich,

daß es sich hierbei um ein Proteolyseprodukt handelt. Da diese Proteolyse nur bei lysierten

Zellen auftritt, dürfte sie die Zelladhäsion der vitalen Zelle nicht beeinflussen.

Um weitere Hinweise auf die Funktion der unterschiedlichen cytoplasmatischen IP-Domänen

zu erhalten, wurden sie als Peptidfusionen in E. coli heterolog exprimiert. Hierzu wurden

vergleichend drei verschiedene Expressionssysteme eingesetzt. Es zeigte sich, daß nur das

pMAL-System geeignet war, um ausreichende Mengen der Peptidfragmente präparativ

aufzureinigen. Es konnte ein Protokoll entwickelt werden, welches die Aufreinigung von ca.

2 mg/l Kultur ermöglichte. Neben den IP1/2cyto-Maltosebindeproteinfusionen (MBP) wurde

stets ein ca. 42 kDa Protein co-präpariert, welches in subsidiären Westernblot-Analysen

immuno-negativ blieb, so daß es sich hierbei offensichtlich um degradiertes, nicht-fusioniertes

Maltosebindeprotein handelt. Durch die Westernblot-Analysen wurde auch deutlich, daß der

monoklonale Antikörper 7C4 spezifisch für die cytoplasmatische Domäne der IP1-Splice-

89

Variante ist, während sich der polyklonale Antikörper αIP2 im Westernblot spezifisch für die

cytoplasmatische Domäne der IP2-Isoform erwies. Es waren keine Kreuzreaktionen

detektierbar. Der monoklonale Antikörper 7C4 erkennt also ein Epitop, welches

offensichtlich mit der letzten freien Aminosäure (Glutamin) der IP1-Sequenz korreliert,

während der αIP2-Antikörper Epitope im IP2-spezifischen cytoplasmatischen Proteinbereich

erkennt.

Da sich das Laufverhalten der IP-MBP-Fusionen in einem nativen PAGE nicht von dem

Laufverhalten im SDS-PAGE unterscheidet, ist offensichtlich keine Tendenz zur

Oligomerisierung der cytoplasmatischen Domänen auszumachen. Ein inhibierender Einfluß

des Maltosebindeproteines hierbei ist eher unwahrscheinlich, da mit einem ähnlichen Ansatz

bereits Untersuchungen zur Dimerisierung des Blauzungen-Virus Nucleocapsid Protein VP4

ohne störende Einflüsse des Fusionsanteils durchgeführt werden konnten (RAMADEVI ET AL.,

1998). Für das P0-Protein ist bekannt, daß das Protein in großen Clustern in der

Zellmembran auftritt (D’URSO ET AL., 1990, FILBIN ET AL., 1990). Dieses Clustering ist

essentiell für die Funktion des P0 als Adhäsionsmolekül. In der cytoplasmatischen Domäne

trunkierte P0-Proteine clustern nicht und sind nicht adhäsiv. (WONG UND FILBIN, 1996). Es

ist bislang jedoch nicht bekannt, ob das Clustering von P0, wie von Shapiro et al. (1996)

aufgrund von Kristallstrukturuntersuchungen vorgeschlagen, auf Protein-Protein-

Wechselwirkungen zwischen den extrazellulären Domänen beruht, so daß eine Inhibierung

des Clustering durch eine trunkierte cytoplasmatische Domäne auf sterische Veränderungen

innerhalb des Proteinkomplexes zurückzuführen wäre, oder aber, ob die cytoplasmatische

Domäne selbst Sequenzmotive bzw. Proteinbereiche besitzt, die für die Interaktionen

verantwortlich sind. Für einen Vergleich der Funktionen der cytoplasmatischen Domänen von

IP1/2 und P0 wäre in der Zukunft daher ein oben beschriebenes Experiment mit P0-MBP-

Fusionen äußerst interessant.

Desweiteren wurden erste Experimente zur Detektion von putativen Protein-Protein-

Interaktionen zwischen den cytoplasmatischen Domänen von IP1 und IP2 durchgeführt. Es

war nicht möglich, durch Immobilisierung einer Splice-Variante als Köderprotein die andere

Splice-Variante zu binden und immunologisch zu detektieren. Zwar müssen weiterführende

Studien mit sensitiveren Detektionsmethoden und anderen Puffersystemen, sowie Studien mit

90

nicht-fusionierten IP-Peptidfragmenten abgewartet werden, doch ist vom derzeitigen

Standpunkt aus eine IP1 /IP2-Interaktion auf Seiten der cytoplasmatischen Domäne eher

unwahrscheinlich.

Wahrscheinlicher ist eine Interaktion der cytoplasmatischen Domäne von IP2 mit sauren

Phospholipiden der Zellmembran. Erste experimentelle Untersuchungen mit artifiziellen

Zellmembranen definierter Phospholipidzusammensetzung (Transil), ergaben eine Bindung

von IP2cyto/MBP an eine Oberfläche mit negativ-geladenem Phosphatidylserin, und in

verminderter Form auch an Phophatidylcholin. Aufgrund des stark basischen isoelektrischen

Punktes der IP2-Domäne dürften diese Wechselwirkungen elektrostatischer Natur sein. Der

Einfluß des Maltosebindeproteinanteils ist zur Zeit nicht genau quantifizierbar, doch stehen

die gefundenen Ergebnisse für IP2 in Einklang mit der für P0cyto gefundenen

elektrostatischen Wechselwirkung mit sauren Phospholipiden (DING UND BRUNDEN, 1994).

Es ist daher denkbar, daß auch die cytoplasmatische Domäne von IP2 an der Apposition der

cytoplasmatischen „major dense line beteiligt“ ist. Weiterführende Untersuchung mit

nichtfusionierten IP1 bzw. IP2 Peptidfragmenten wären diesbezüglich von großem Nutzen.

Hierfür könnte ein erst kürzlich speziell zur Expression von kurzen Peptidfragmenten unter

10 kDa entwickeltes heterologes Expressionsystem (Fa. Novagen) besonders hilfreich sein.

Aufgrund der im Rahmen dieser Dissertation neu gewonnenen Erkenntnisse wird folgendes

Modell zur Kompaktierung des Forellenmyelin in Anlehnung an das von Wong und Filbin

1996 für P0 entwickelte Adhäsionsmodell vorgeschlagen: IP1/2 sind typische Vertreter der

Ig-CAM Superfamilie und fungieren als Adhäsionsproteine innerhalb der extrazellulären

„intraperiod line“. Die cytoplasmatische Domäne dient als Membran-, bzw.

Cytoskelettverankerung und beeinflußt so die Adhäsion. Die in der cytoplasmatischen

Domäne längere IP2-Variante, welche in der Embryonalentwicklung der Forelle zuerst

exprimiert wird (JESERICH ET AL., 1990), ermöglicht die initiale starke Adhäsion der

Myelinmembranen. In diesem Entwicklungsstadium ist die Myelinmembran noch recht locker

um das Axon gewunden und das Cytoskelett der Zelle für die Membranproteine zugänglich.

Durch Interaktionen der cytoplasmatischen Domäne von IP2 mit sauren negativ-geladenen

Phospholipiden der Zellmembran und/oder mit dem Cytoskelett wird die Adhäsion gefestigt.

Im Zuge der weiteren Entwicklung kompaktiert das Myelin zunehmend, welches mit der

91

Expression der Myelinproteine 36K und IP1 korreliert. Da im kompakten Myelin kein

Cytoskelett mehr detektierbar ist, wird die gefundene Membranadhäsion durch eine

Cytoskelett unabhängige Adhäsion durch die kürzere IP1 Splice-Variante vermittelt.

In diesem Zusammenhang stellt sich die spannende Frage nach putativen Protein-

Bindungspartnern von IP. So konnte für das P0-Protein durch Co-

Immunpräzipitationsuntersuchungen eine Interaktion mit PMP22 nachgewiesen werden

(D’URSO ET AL., 1999). Für das Forellenmyelin wäre es daher denkbar, daß IP1/2 während

der Myelinogenese mit dem Basischen Myelinprotein und/oder dem 36K-Protein interagieren

und somit die Adhäsion der Myelinmembranen festigen. Darüber hinaus sind im kompakten

adulten Forellenmyelin Interaktionen von IP1/2 mit dem DM20 Protein denkbar. 1996

konnte nämlich von Yoshida und Colman durch immunologische Analysen eine Co-

Lokalisation von DM20 und IP1/2, im kompakten Goldfischmyelin nachgewiesen werden.

Tang et al. (1996) fanden DM20 auch im Hirn der Forelle. Die Funktion des DM20 im

Forellenmyelin ist bislang noch unbekannt, so daß über die Funktion einer denkbaren

IP/DM20 Interaktion nur spekuliert werden kann. Das Expressionsniveau von DM20 ist

während der Myelinogenese jedoch äußerst gering. Erst im jungadulten Zustand fünf Wochen

nach Eischlupf ist eine erhöhte DM20-Expression durch Northernblot-Analysen detektiert

worden. Eine mögliche Funktion der IP/DM20-Interaktion könnte weniger zur Festigung der

Adhäsion während der Myelinogenese, sondern vielmehr zur Modulation der Adhäsion im

kompakten Myelin der Forelle genutzt werden. Co-Immunpräziptationsstudien, Detektion

von Proteininteraktion mittels des Hefe-, oder Säuger-Two-Hybrid-Systems, sowie

Adhäsionsassays von entsprechenden Co-Expressoren wären diesbezüglich sehr hilfreich und

von großem Interesse in der Zukunft.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte die cDNA des zweiten

Hauptmyelinproteins aus dem ZNS der Forelle, dem 36K-Protein kloniert werden. Der

größte offene Leserahmen codiert für ein 320 Aminosäuren großes Protein. Die

untranslatierte 5‘ Region ist auffällig kurz, während die untranslatierte 3‘ Region mit über

1000 bp eine ähnliche Länge wie die 3‘UTR der IP1/2 Splice-Varianten aufweist. Wie bereits

oben für das IP-Protein ausführlich diskutiert, ist die physiologische Funktion der 3‘UTR des

36K-Proteins bisher noch unklar.

92

Vor Beginn der vorliegenden Arbeit waren bereits Teile der zugrundeliegenden 36K-

Genstruktur bekannt (STRELAU, DISSERTATION, 1997). Durch PCR an genomischer Forellen-

DNA konnten die Intron/Exon-Grenzen der zugrundeliegenden Genstruktur im bisher

fehlenden 5‘-Bereich identifiziert werden, so daß nunmehr die vollständige Genstruktur

aufgeklärt ist. Das 5‘ Ende des gDNA-Amplifikates entsprach exakt dem 5‘ Ende des

codierenden Bereiches der in dieser Arbeit isolierten cDNA-Sequenz. Es folgt ein ca. 1500

bp langes Intron I, welches in einen kanonischen 3‘ Splice Akzeptor endet. Strangabwärts

konnten ebenfalls die Intron/Exon-Grenzen exakt festgelegt werden. Alle gefundenen Splice-

Punkte des 36K-Genes unterliegen der GT/AG Regel von Breathnach et al. (1978).

Da die Expression des 36K Proteins nicht nur gewebespezifisch, sondern auch

entwicklungsabhängig reguliert wird (JESERICH ET AL. 1990), könnte die Entschlüsselung der

zugrundeliegenden Promotorregion interessante neue Einblicke in die differentielle

Genexpression ermöglichen. Daher wurde mit Hilfe der inversen PCR ein Genabschnitt

kloniert, der durch Sequenzvergleich mit der isolierten 36K cDNA als putativer Promotor

bzw. 5‘ UTR einzustufen ist. Die Existenz dieses Genabschnittes konnte durch unabhängige

gDNA-PCRs verifiziert werden. Es wurde deutlich, daß sich 15bp strangaufwärts neben dem

durch cDNA-Isolierung identifizierten Start-ATG ein weiteres potentielles Start-ATG im

gleichen Leserahmen befindet. Innerhalb des putativen 36K Promotors konnten TATA-Box-

ähnliche Sequenzmotive gefunden werden. Diese besaßen eine auffällige

Sequenzübereinstimmung mit der für das IP-Gen identifizierten TATA-Box (JESERICH,

STRELAU UND LANWERT, 1997). Die für viele Promotoren typischen TATA-Sequenzen

(Konsensus: TATAA/TAA/T) befinden sich in einem Abstand von annähernd 30 bp vom

Transkriptionsstart entfernt und stellen Bindesequenzen für das TATA-Bindeprotein TBP

bzw. TFIID dar (LATCHMAN, 1995). Alle gefundenen putativen TATA-Boxen sind im

Vergleich zur Konsensussequenz degeneriert, was für Myelinproteine typisch ist (FORS ET

AL.,1993; TAMURA ET AL., 1990; NAVE ET AL., 1991). Da der Transkriptionsstart, der die

Promotorregion und daher auch putative TATA-Boxen und alle weiteren putativen

regulatorischen Sequenzmotive definiert, für die 36K codierende mRNA bislang aber noch

nicht bekannt ist, ist eine weiterführende Interpretation dieser Sequenzmotive zur Zeit nicht

möglich. In weiterführenden Studien nach exakter Identifikation des Transkriptionsstart des

36K-Transkriptes durch Primerextension könnten Sequenzvergleiche mit verschiedenen

93

Myelinproteinpromotoren Aufschluß über etwaige gemeinsame putativ-regulatorische

Sequenzbereiche liefern. Die Transkriptionsaktivität des 36K-Promotors könnte weiterhin

durch progressive Deletionen in Reportergenassays quantifiziert und charakterisiert und so

eventuelle funktionelle und regulatorische Ähnlichkeiten mit dem bereits charakterisierten IP-

Promotor deutlich werden (JESERICH, STRELAU UND LANWERT, 1997).

Anhand der isolierten 36K cDNA konnte ein 320 Aminosäuren großes Protein abgeleitet

werden. Die gefundene Codonpräferenz entsprach der Präferenz von Knochenfischen.

(WADA ET AL., 1991) Das korrespondierende Molekulargewicht entspricht mit 35,7 kDa

annähernd dem apparenten Molekulargewicht des 36K Proteins in der SDS-

Gelelektrophorese (JESERICH, 1983). Der kalkulierte isoelektrische Punkt von pH 9,54 steht

in Übereinstimmung mit früher gewonnenen Resultaten aus 2-D-Gelelektrophorese-Analysen

(JESERICH UND WAEHNELDT, 1986). Es ist an dieser Stelle erwähnenswert, daß Strelau mit

Hilfe von gDNA-Fragmenten eine cDNA-Sequenz vorausgesagt hat, die sich von der in

dieser Arbeit isolierten Sequenz im N-Terminus unterscheidet (STRELAU, DISSERTATION,

1997). Diese unterschiedlichen N-Termini sind auf einen Sequenzierfehler innerhalb der für

die Vorhersage genutzten gDNA-Sequenzen zurückzuführen und haben offensichtlich keine

Auswirkung auf die vorhergesagte Sekundärstruktur des Proteins. Sekundärstrukturanalysen

mit der hier isolierten Sequenz nach dem Chou/Fasman Algorithmus, ergaben eine

charakteristische Abfolge von 6 β-Faltblätter und 6 α-Helices. Innerhalb dieser 6 β-

Faltblätter wurden außerdem Bereiche mit hohem β-Turn-Potential identifiziert. Diese

β6/α6-Struktur ist bereits 1974 von Rossman et al. beschrieben worden. Gestützt durch

Proteindatenbank-Sequenzvergleiche wurde deutlich, daß 36K eine signifikante Ähnlichkeit

zu klassischen Vertretern dieser charakteristisch strukturierten Proteine, den NAD/NADP-

abhängigen Oxido-Reduktasen aufweist. Charakteristisches Merkmal dieser Proteinfamilie ist

eine Konzentrierung der phylogenetisch konservierten Sequenzmotive auf die Dinukleotid-

und der substratbindenden Domäne. Das aktive Zentrum der Enzyme liegt dabei zwischen

beiden Abschnitten und ist äußerst variabel (SCRUTTON ET AL., 1990; PERSON ET AL., 1991).

Das 36K-Protein unterscheidet sich von allen bislang gefundenen Myelinproteinen, was gut

zu früheren Untersuchungen paßt, in denen der 36K-Antikörper keinerlei Kreuzreaktionen

gegen Myelinproteine der Säuger, Vögel, Reptilien und Amphibien zeigte (WAEHNELDT ET

AL., 1986B). Überraschenderweise ähnelt das 36K-Protein der Protochlorophyllid-Reduktase

94

aus der Thylakoidmembran der Erbse (STRELAU, DISSERTATION 1997). Die Gruppe der

Oxido-Reduktasen ist in Bezug auf ihre Funktionen äußerst heterogen (LABESSE ET AL.,

1994). Sie reichen von der Reduktion verschiedenster Carbonylverbindungen über die

Inaktivierung von Steroiden bis hin zu wichtigen Funktionen bei der Synthese von

Antibiotika (ALBALAT ET AL., 1992; CHEN ET AL., 1993; BAKER, 1994). Dieses weite

Aktivitätsspektrum und die großen Sequenzunterschiede im katalytischen Bereich der

Enzyme machen eine funktionelle Interpretation äußerst schwierig. Über eine mögliche

enzymatische Funktion der einzigartigen Myelinkomponente 36K kann daher bislang nur

spekuliert werden. Eine für das Myelinprotein 36K sehr naheliegende putative Funktion ist

jedoch, daß es aufgrund seines kalkulierten isoelektrischen Punktes von pH 9,54 wie oben

bereits detailliert für die cytoplasmatischen Domänen von IP beschrieben, an der Apposition

der „major dense line“ durch elektrostatische Wechselwirkung mit sauren

Membrankomponenten beteiligt ist. Durch eine NAD-, bzw. NADP-Abhängigkeit wäre eine

regulatorische Modulation dieser Apposition denkbar.

Um erste Hinweise auf die Funktion des 36K-Proteines zu erhalten wurde im Rahmen dieser

Dissertation verschiedene Ansätze zur heterologen Expression in Eukaryoten wie in

Prokaryoten vergleichend eingesetzt. Permeabilisierte CHO-Zellen zeigten 48h nach

Transfektion eine starke granuläre Immunfärbung im Bereich des Cytoplasmas. Durch

Oberflächenmakierung konnte keine 36K-Expression detektiert werden, was den

cytoplasmatischen Charakter des 36K-Proteines unterstreicht. Im Westernblot wies das

heterolog exprimierte 36K-Protein im Vergleich zur native Form aus dem Forellenmyelin ein

etwa 0,5 bis 1 kDa kleineres apparentes Molekulargewicht auf. Bei der im Rahmen dieser

Arbeit isolierten 36K-cDNA handelt es sich offenbar um eine nicht ganz vollständige

Sequenz. Wie bereits oben im Zuge der Promotorklonierung beschrieben, befindet sich auf

der zugrundeliegenden Genstruktur strangaufwärts vom 5‘ Ende der klonierten cDNA-

Sequenz ein weiteres putatives Start-ATG im gleichen Leserahmen. Es ist daher sehr

wahrscheinlich, daß die vollständige codierende Region der 36K-cDNA am N-Terminus um

5 Aminosäuren länger ist als der isolierte Klon, was die Diskrepanz im Laufverhalten erklären

würde. Die Existenz eines entsprechenden Transkriptes konnte durch unabhängige RT-PCR-

Analysen bereits verifiziert werden. Diese N-terminale „Verlängerung“ hat keinen Einfluß auf

die vorhergesagte Sekundärstruktur des 36K-Proteines. Leider sind alle Versuche stabile

95

r36K/CHO-Expressoren zu klonieren bislang erfolglos geblieben, so daß ein möglicher

Einfluß auf das Aggregationsverhalten der Zellen im Adhäsionsassay nicht untersucht werden

konnte. Weiterführende Studien, vorallem Co-Expressoren mit IP1 bzw. IP2 könnten

interessante neue Hinweise auf die putative Funktion des Proteines ermöglichen.

Weiterhin wurde das 36K Protein als His-Tag-Fusion (36KHT) in einem E. coli und einem

Baculovirus-System exprimiert und präparativ aufgereinigt. Es zeigte sich, daß das

bakterielle System weitaus höhere Proteinausbeuten ermöglichte als das Baculovirus-System,

und ist daher zur Produktion von rekombinantem Protein im großen Maßstab gut geeignet.

36K wird in E. coli hauptsächlich in Einschlußkörpern gebildet, so daß eine Aufreinigung nur

unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von chaotropen Salzen wie 6M Harnstoff

bzw. Guanidin-Hydrochlorid möglich war. Das elektrophoretische Laufverhalten des

präparierten 36KHT-Proteins weicht von dem des „nativen“ 36K aus dem Myelin der Forelle

aufgrund der „His-Tag“ Erweiterung durch zusätzliche Aminosäuren, davon 10 geladene

Histidine, in der erwarteten Weise ab. Interessanterweise war auch in dem Baculovirus-

System eine Aufreinigung nur im Gegenwart von chaotropen Salzen möglich. Da 36KHT

unter nativen Bedingungen stets zusammen mit unlöslichen Bestandteilen der Wirtszelle

durch Zentrifugation pelletiert wurde, könnte dieses ein erster Hinweis auf eine Membran-,

bzw. Cytoskelettassoziation sein, was jedoch in weiterführenden Untersuchungen geklärt

werden müßte. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation ist erstmals eine Methode etabliert

worden, die die Überexpression und präparative Aufreinigung eines Forellenmyelinproteins

ermöglichte. Diese erarbeitete methodische Basis dürfte vielfältige weiterführende Studien

zur funktionellen Bedeutung des Proteines ermöglichen. Es wären z.B. denkbar mit

renaturiertem 36KHT-Protein Bindestudien mit artifiziellen Lipidmembranen, wie oben für

die cytoplasmatische Domäne von IP2 beschrieben, durchzuführen. Darüberhinaus könnten

mit Hilfe der Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie Aussagen über die Sekundärstruktur

des renaturierten Proteins möglich sein. Hierbei wäre es von besonderem Interesse, ob eine

putative Konformationsänderung des 36K-Protein aufgrund von Interaktionen mit

Lipidvesikeln, ähnlich wie für das Basische Myelinprotein beschrieben, mit Hilfe der CD-

Spektren detektierbar wäre (KENIRY UND SMITH, 1978, CHEIFETZ ET AL. 1985). Die erzielten

Ausbeuten der heterologen Expression von 36KHT in E. coli würden es eventuell erlauben,

das Protein zu kristallisieren und seine Struktur durch Röntgenstrukturanalyse aufzuklären.

96

97

5 Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte die cDNA der IP2 Splice-Variante

vervollständigt werden. Es zeigte sich, daß der codierende Bereich exakt mit der IP1-

Splicevariante übereinstimmte, die cytoplasmatische Domäne ist jedoch um 90 bp verlängert.

Anschließend folgt eine IP2-spezifische 3‘ UTR von 133 bp Länge, die in eine beiden IP-

Splicevariante identische 3‘UTR mündet. Da den beiden IP-Isoformen der gleiche Promotor

zugrundeliegt, beide Proteine während der Myelinogenese jedoch unterschiedlich d.h.

entwicklungsabhängig exprimiert werden, ist ein Einfluß der 3‘ UTR auf die Regulation des

alternativen Splicings denkbar.

Die translatierte Aminosäuresequenz der verlängerten cytoplasmatischen Domäne der IP2-

Isoform wies, im Gegensatz zur IP1cyto-Domäne, eine auffällige Sequenzübereinstimmung

mit der cytoplasmatischen Domäne des P0-Proteins auf. Phylogenetisch konservierte

Aminosäuren sind meist basisch. Auch zwei PKC-Kinase-Stellen sind zwischen allen Spezies

konserviert, so daß man in diesem Bereich wichtige funktionelle Bereiche vermuten kann.

Beide IP Splice-Varianten konnten in CHO-Zellen exprimiert und durch Immunfluoreszenz,

sowie durch Westernblot detektiert werden. IP1/2 werden auch in der heterologen Wirtszelle

glykosiliert und in die Zellmembran integriert.

Es konnten ein Adhäsionsassay in einem mimetischen Zellsystem etabliert werden, mit dem

die adhäsive Funktion der extrazellulären Domäne der IP-Proteine charakterisiert werden

konnte. Nach Klonierung eines stabil-exprimierenden rIP1/CHO-Zellklones zeigte sich, daß

IP1 eine Adhäsion vermittelt, die zur Aggregation von bis zu zehn rIP1/CHO-Zellen führte.

Um zu untersuchen, ob die cytoplasmatische Domäne Einfluß auf die Adhäsion ausübt,

wurde eine Chimäre aus der extrazellulären und transmembranellen Domäne des IP-Proteins

und der P0cyto Domäne konstruiert und exprimiert. Stabile rIP-P0/CHO-Zellen waren im

Adhäsionsassay deutlich quantifizierbar adhäsiver. Sie bildeten Zellaggregate aus bis zu 35

Zellen. Die cytoplasmatische Domäne hat offensichtlich einen Einfluß auf die Adhäsion. Die

geringen, aber nicht-signifikanten Unterschiede im Oberflächenexpressionsniveau zwischen

rIP/CHO und rIP-P0/CHO-Zellen können die Unterschiede im Adhäsionsverhalten nicht

erklären. Die cytoplasmatischen Domänen von IP1 und vorallem von IP2 sind stark basisch,

98

d.h. positiv geladen und könnten somit durch Bindung an saure, d.h. negativ geladene

Phospholipide der Zellmembran die Apposition der cytoplasmatischen „major dense line“

unterstützen. Durch die Zugabe eines spezifischen Antikörpers gegen die extrazelluläre

Domäne von IP konnte die Adhäsion von rIP-P0/CHO-Zellen vollständig inhibiert werden.

IP ist daher als typisches Adhäsionsprotein der Immunglobulin-Superfamilie einzustufen. Die

cytoplasmatische Domäne hat Einfluß auf die Adhäsion des Proteins.

Die cytoplasmatischen Domänen von IP1/2 konnten in E. coli als Peptidfragmente heterolog

exprimiert und aufgereinigt werden. Es zeigte sich, daß hierzu nur ein von drei getesteten

Expressionssytemen geeignet war. Mit der aufgereinigten IP2cyto/MBP-Fusion konnten

Bindestudien mit artifiziellen Lipidoberflächen durchgeführt werden. Zwar ist der Einfluß des

zur Aufreinigung benötigtem MBP-Fusionsanteils nicht genau quantifizierbar, doch konnten

erste experimentelle Hinweise auf eine Bindung von IP2cyto an negativ geladene

Phophatidylserin-haltige Lipidoberflächen gewonnen werden, die die obige Theorie stützen.

Eine Protein-Protein Interaktion zwischen den IP1cyto-, und IP2cyto-Domänen ist zum

derzeitigen Standpunkt eher unwahrscheinlich.

Darüber hinaus konnte die cDNA des 36K-Proteines isoliert, der korrespondierende putative

Promotor bzw. 5‘ UTR durch invers PCR kloniert, sowie die Intron/Exon-Grenzen eindeutig

kartiert werden. Somit ist die vollständige Struktur des 36K-Genes aufgeklärt. Innerhalb des

putativen 36K-Promotors konnten putative TATA-Boxen identifiziert werden, die auffällige

Ähnlichkeit zur TATA-Box des IP-Genes aufwiesen.

Das 36K-Protein besitzt keine Ähnlichkeit mit Myelinproteinen, sondern ähnelt den

NAD/NADP-abhängigen Oxido-Reduktasen. Seine Funktion ist bislang noch unklar, doch

aufgrund seines basisch-positiven Charakters könnte es wie oben beschrieben als

Membrananker bei der Apposition der cytoplasmatischen „major dense line“ beteiligt sein.

36K konnte als His-Tag-Fusion sowohl mit Hilfe eines Baculoviren-Systems als auch mit

einem von drei getesteten E. coli Systemen exprimiert und präparativ aufgereinigt werden.

Weiterführende Studien mit artifiziellen Lipidoberflächen, sowie spektroskopische Ansätze

könnten neue Einblicke in die Funktion und Struktur des Proteins ermöglichen.

99

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7 Anhang

7.1 Klonierung von IP1/pIRES-neo

Die Klonierung der codierenden Region der IP1 cDNA ohne poly(A)-Signale erfolgte wie

folgt: IP1-cDNA wurde HindIII verdaut, anschließend gebluntet und mit EcoRI

nachgeschnitten. Der pIRES-neo Vektor wurde mit BamHI geöffnet, anschließend gebluntet

und mit EcoRI nachgeschnitten. So konnte IP1 EcoRI/blunt gerichtet kloniert werden.

7.2 Klonierung von IP2/pIRES-neo

Da die vollständige codierende Region der IP2 cDNA durch PCR mit den Primern IP-5F und

IP2 C3-R gewonnen und in pGEM-T easy subkloniert wurde, erfolgte eine ungerichtete

Ligation in pIRES-neo über die flankierenden Not I Schnittstellen.

7.3 Klonierung von IP-P0/pIRES-neo

Die cytoplasmatische Domäne von P0 wurde mit Hilfe der PCR mit den Primern P0-fus3 ,

der eine Xba I Schnittstelle trägt und T7 an pBK-CMV mod/P0 ohne 3‘ UTR amplifiziert

Das Amplifikat trägt am 5‘ Ende eine XbaI Schnittstelle von Primer P0-fus3 und am 3‘ Ende

kurz vor der T7 Sequenz ebenfalls eine XbaI Schnittstelle, die aus der Multicloningsite des

pBK-CMV mod/P0 ohne 3‘ UTR stammt. Es wurde XbaI verdaut und in den gleichermaßen

geöffneten pBK-CMV ligiert

Es befindet sich innerhalb der codierenden Region der IP cDNA (direkt an der Grenze

zwischen Transmembransegment und cytoplasmatischer Domäne) eine BspHI Schnittstelle.

Die cDNA wurde BspHI geschnitten und mit T4-Polymerase zu blunt-ends aufgefüllt.

Anschließend wurde der Extrazellulär- und Transmembrandomäne umfassende cDNA Teil

durch EcoRI Verdau abgetrennt. Der pBK-CMV/P0cyto Vektor, der bereits wie oben

beschrieben die P0cyto Domäne trägt, wurde durch EcoRI/ScaI geöffnet. Das EcoRI/ blunt

IP-Eluat konnte so in den pBK-CMV/P0cyto ligiert werden. Da sich der IP-Teil und P0-Teil

im gleichen Leserahmen befinden, entsteht eine Proteinfusion aus IP und P0 mit einer

Linkersequenz von nur 9 bp (3 AS). Die entstandene Fusionsstelle wurde durch

Sequenzierung verifiziert. Das vollständige IP-P0 Fusionskonstrukt wurde EcoRI/SmaI

verdaut und konnte so in den oben unter 7.1 beschriebenen pIRES-neo EcoRI/blunt ligiert.

111

7.4 Klonierung von IP1 in pFastbac

Die komplette IP1-cDNA wurde über seine flankierenden EcoRI/XhoI Schnittstellen aus

pBluescript in den gleichermaßen geöffneten pFastbac-Vektor ligiert.

112

7.5 Klonierung von 36K/pIRES-hygro

Die Klonierung der codierenden Region der 36K cDNA ohne poly(A)-Signale erfolgte über

seine flankierenden BamHI/ScaI Schnittstellen aus pBluescript. Der pIRES-hygro Vektor

wurde BstXI verdaut, anschließend gebluntet und mit BamHI nachgeschnitten. So konnte

36K BamHI/blunt gerichtet kloniert werden.

7.6 Klonierung von 36KHT/Dual Fastbac

Zur Expression wurde durch PCR Mutagenese mit den Primern 36K-mal F2/36K-mal R2 an

der isolierten 36KcDNA eine BamHI vor dem Start ATG und eine Xba I Schnittstelle hinter

dem Stop-TGA eingefügt. Das PCR-Amplifikat wurde mit diesen beiden

Restriktionsenzymen geschnitten und pFastbac-HTb-Vektors mit den gleichen Enzymen

geöffnet. Auf diese Weise konnte eine His(6)-Tag-36K Fusion kloniert werden. Parallel dazu

wurde die codierende Region des Grünfluoreszierenden Proteins (GFP) aus dem

pGreenlantern Vektor (Fa. Gibco) über seine flankierenden Not I Sequenzen

herausgeschnitten, gebluntet und in die Multicloningsite II (p10 Promotor) des mit Sma I

geöffneten pFastbac Dual Vektors kloniert. Das oben beschriebene His-Tag-36K-Konstrukt

aus pFastbac HTb wurde mit Hilfe einer weiteren PCR-Mutagenese mit den Primern HTb-

F1/ 36K-mal R2 in pGEM-T easy (2.2.11) subkloniert, anschließend über seine flankierenden

Not I Schnittstellen in die Multicloningsite I des auf gleiche Weise geöffneten pFastbac-

Dual/GFP kloniert und subsidiär durch Sequenzierung auf Richtigkeit und eventuelle

Nukleotidaustausche überprüft. Das entstandene Konstrukt erlaubt die Expression des His-

Tag-36K Fusionsproteines unter der Kontrolle des konstitutiven Polyhedrin-Promotors,

sowie zeitgleich die Expression des GFP-Reportergenes unter der Kontrolle des ebenfalls

konstitutiven p10-Promotors.

113

7.7 Klonierung von 36K/pET16b

Durch PCR-gerichtete Mutagenese mit dem Vorwärts Primer 36K-CL-F4, der eine NdeI

Schnittstelle trägt und direkt am Start ATG bindet und dem 36K2R Primer entstanden PCR-

Amplifikate, die nach blunten mit T4 Polymerase mit Nde I verdaut wurde. Der pET 16b

Vektor wurde mit BamHI geöffnet, anschließend gebluntet und mit Nde I nachgeschnitten.

So konnte Nde/blunt gerichtet kloniert werden. Es entstand eine His -Tag 36K Fusion, die

durch Sequenzieren auf Richtigkeit kontrolliert wurde.

7.8 Klonierung von IP1/2cyto/pMal-C2

Durch PCR-gerichtete Mutagenese mit dem vorwärts Primer IP-Cyto F1, der am Beginn der

cytoplasmatischen Domäne beider Isoformen bindet, in Kombination mit den reversen

Primern IP-4E-mal (für IP1) bzw. IP2-C3-malR (für IP2), entstanden PCR-Fragmente, die

114

am 5‘ Ende eine eingefügte EcoRI, am 3‘ Ende eine Hind III Schnittstelle besaßen. Diese

Amplifikate wurden EcoRI/Hind III verdaut, der Restriktionsansatz über Qiagen PCR

Purification Kit aufgereinigt und in den gleichermaßen vorbereiten pMAL-C2 Vektor

kloniert. Das entstandene Konstrukt wurde durch PCR und Restriktionsverdau, sowie durch

Sequenzierung auf Richtigkeit kontrolliert.

7.9 Abkürzungsverzeichnis% v/v Volumenprozente% w/v Gewichtsprozenteµ mikroADP AdenosindiphosphatAmp Ampicillinbp BasenpaarBSA RinderserumalbumincDNA komplementäre DesoxyribonukleinsäureDNA DesoxyribonukleinsäuredNTP 2’-DesoxyribonukleosidtriphosphatE. coli Escherichia coliEDTA Etylendiamintetraessigsäureg 1x ErdanziehungskraftHis-tag Histidin-„tag“ (engl. für Fortsatz, Anhang)IPcyto (bzw. IP2, P0) cytoplasmatische Domäne des IP1, bzw. IP2, P0-ProteinesIPTG Isopropylthiogalaktosidkb Kilobase(n)kDa Kilo-Daltonm milliM molarMBP Maltose-Binde-ProteinMCS „Multiple Cloning Site“ (multiple Klonierungsstelle)mRNA „Messenger“-RibonukleinsäureNAD(P) Nicotinamid-adenin-dinukleotid(-phosphat)OD600 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nmPAGE Polyacrylamid-GelelektrophoresePCR „Polymerase Chain Reaction“ (Polymerase-Kettenreaktion)PEG PolyethlenglykolPLP ProteolipidproteinPNS peripheres Nervensystemr ResistenzgenRif RifampicinrIP1/CHO bzw. IP-P0 rekombinant exprimiertes IP1 bzw. IP-P0 in CHO-ZellenRNA Ribonukleinsäurerpm Umdrehung pro MinuteSDS Natrium-(„Sodium“-)dodecylsulfatTCA TrichloressigsäureTet TetrazyklinTris Tris-HydroxymethylaminomethanUTR untranslatierte RegionZNS zentrales Nervensystem

115

7.10 Publikationen

Jeserich G, Strelau J, Lanwert C (1997): „Partial characterization of the 5‘-flanking region of

trout IP: a P0-like gene containing a PLP-like promotor“ J Neurosci Res 50:1-10

C. Lanwert und G. Jeserich: „Heterologous expression of fish myelin genes in mammalian

cell lines“ nacher presentation at Gordon Research Conference – „Myelin“ Ventura

California, (1998)

C. Lanwert und G. Jeserich: „Recombinantly expressed fish myelin proteins as tools to

mimick protein interactions at the major dense line“ nacher presentation at ISN Satellite

Meeting „Myelination and Myelin Disorders: New Vistas“ Rügen, Deutschland (1999)

116

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung.................................................................................................................... 1

2 Material und Methoden............................................................................................... 7

2.1 Material............................................................................................................................ 72.1.1 Bakterienstämme....................................................................................................................72.1.2 Plasmide.................................................................................................................................82.1.3 Larvenstadien und Jungfische der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss).........................82.1.4 Zellinien .................................................................................................................................82.1.5 Chemikalien ...........................................................................................................................92.1.6 Medien zur Anzucht von Bakterien.........................................................................................92.1.7 PCR Primer .......................................................................................................................... 10

2.2 Methoden ....................................................................................................................... 112.2.1 Bakterienkulturen/Kryokonservierung von Bakterienkulturen ............................................... 112.2.2 Plasmidpräparationen ........................................................................................................... 112.2.3 RNA/DNA-Quantifizierung durch Methylen-Blau-Spot-Test ................................................ 122.2.4 RNA/DNA-Quantifizierung durch Photometrie..................................................................... 132.2.5 Restriktion von DNA mit Restriktionsendonukleasen............................................................ 132.2.6 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................... 132.2.7 Gelextraktionsmethoden ....................................................................................................... 132.2.8 Klonierungen........................................................................................................................ 142.2.9 Herstellung von glatten Enden mit T4 Polymerase („blunting“) ............................................ 152.2.10 Reinigung von DNA Fragment aus wäßrigen enzymatischen Lösungen ................................ 152.2.11 Klonierung von PCR-Produkten / pGEM-T easy................................................................... 162.2.12 Plasmid Transformation........................................................................................................ 162.2.13 Polymerase-chain-reaction (PCR)-Techniken........................................................................ 172.2.14 Chemolumineszenzdetektion/ ECL-Kit (Fa. Amersham)....................................................... 202.2.15 Alkalische Phosphatase-NBT/BCIP-Farbreaktion ................................................................. 202.2.16 Alkalische Phophatasenachweis mit CSPD (Fa. Boehringer)................................................. 212.2.17 Peroxidasenachweis mit 4-Chloro-1-Naphtol (4CN) (nach Sambrock).................................. 212.2.18 Screening einer λ-UNI ZAP-cDNA Libary mit DIG markierten DNA-Sonden...................... 212.2.19 In vivo excision positiver cDNA/Phagen-Klone.................................................................... 222.2.20 Heterologe Expression in Insektenzellen mit Baculoviren / Bac-to-Bac-System (Fa.Gibco) ... 232.2.21 Heterologe Expression in E. coli /pMAL-System (Fa. NEB) ................................................. 262.2.22 Affinitätschromatographie mit Amylose-Beads (pMAL-System) ........................................... 272.2.23 Heterologe Expression in E. coli/pET-System (Fa. Novagen) ................................................ 272.2.24 Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose............................................... 282.2.25 Aufschluß von Einschlußkörpern (inclusion bodies).............................................................. 282.2.26 Affinitätschromatographie mit Farbsepharosen (reactive-red, Fa. Merck).............................. 292.2.27 Heterologe Expression in E. coli /IMPACT-System (Fa. NEB)............................................. 292.2.28 Proteinbestimmung (nach Bradford, 1979)............................................................................ 292.2.29 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel Test.............................................................. 302.2.30 Proteinfällung mit Aceton..................................................................................................... 302.2.31 Proteinfällung mit TCA........................................................................................................ 302.2.32 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli) .................................. 302.2.33 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Native-PAGE)...................................................... 312.2.34 Proteintransfer auf Nitrozellulosemembran (Westernblot) ..................................................... 312.2.35 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulosemembran................................. 312.2.36 Zellaggregations/Adhäsionstest............................................................................................. 322.2.37 Trypan-Blau-Ausschlußtest................................................................................................... 332.2.38 ELISA zur Quantifikation extrazellulärer IP-Proteindomänen............................................... 33

117

2.2.39 Protein-Phospholipid-Bindungstudien mit Transil-Kügelchen (Fa. Nimbus) ......................... 342.2.40 Protein-Protein-Bindungsstudien („overlay-assay“) ............................................................... 342.2.41 DNA-Transfer auf positivierter Nylonmembran (Southern-Blot) ........................................... 342.2.42 Radioaktive DNA-Kettenabbruch-Sequenzierungen (nach Sanger)....................................... 352.2.43 Auftragssequenzierungen...................................................................................................... 352.2.44 Computergestützte Sequenzanalysen..................................................................................... 352.2.45 Eukaryotische Zellkulturlinien .............................................................................................. 362.2.46 Subkultivieren („passagieren“) von Säuger-Zellkulturen ....................................................... 362.2.47 Subkultivieren („passagieren“) von Insektenzellen ................................................................ 362.2.48 Kryokonservierung von eukaryotischen Zellinien.................................................................. 372.2.49 Transfektionen von Säugerzellen /Transfectam Methode ...................................................... 372.2.50 Transfektion von Insektenzellen/ Cellfectin (Gibco).............................................................. 372.2.51 Hygromycin und G-418 („Geneticin“) Selektion /Stabile Transfektion mit pIRES-neo.......... 372.2.52 Dynabead oligo d(T)-mRNA-Isolierungen aus Hirngewebe................................................. 382.2.53 cDNA Erststrangsynthese (Reverse Transkription)................................................................ 392.2.54 Immunocytochemie/indirekte Immunfluoreszenz .................................................................. 40

3 Ergebnisse ..................................................................................................................42

3.1 Isolierung der vollständigen cDNA Sequenz für das IP2-Protein.................................. 423.1.1 Aminosäuresequenz der vollständigen cytoplasmatischen Domäne von IP2 .......................... 44

3.2 Untersuchungen zur Funktion von IP1/2 als Adhäsionsmolekül.................................... 453.2.1 Aufbau eines Adhäsionsassays .............................................................................................. 463.2.2 Heterologe transiente Expression von IP1 und IP2 in CHO-K1-Zellen .................................. 483.2.3 Klonierung von stabil-transfizierten rIP1/CHO-K1-Zellen .................................................... 503.2.4 Adhäsion von rIP1/CHO-Zellen unter definierten Bedingungen............................................ 503.2.5 Konstruktion einer IP-P0-Chimäre........................................................................................ 523.2.6 Stabile Expression und Adhäsionsverhalten von rIP-P0/CHO-Zellen .................................... 523.2.7 Vergleichende Quantifizierung der Oberflächenexpression ................................................... 553.2.8 Inhibierung der Zell/Zell-Adhäsion von rIP-P0/CHO durch Antikörper ................................ 563.2.9 Heterologe Expression und Adhäsion von IP1 in Insektenzellen............................................ 58

3.3 Heterologe Expression der cytoplasmatischen Domänen von IP1 und IP2 in E. coli .... 593.3.1 Bindestudien von MBP/IP2cyto an phospholipidbeschichteten Trägermatrices (Transil) ....... 603.3.2 Untersuchung zu Protein-Protein-Wechselwirkungen von IP1/2cyto..................................... 61

3.4 Isolierung der cDNA Sequenz für das 36K- Protein...................................................... 633.4.1 Aminosäuresequenz des 36K-Proteins................................................................................... 65

3.5 Untersuchungen zur 36K-Genstruktur durch PCR....................................................... 683.5.1 Diskrepanz zwischen isolierter und vorhergesagter 36K-Sequenz ......................................... 713.5.2 Klonierung einer putativen Promotorregion des 36K-Genes durch „inverse PCR“................. 72

3.6 Heterologe Expression der isolierten 36K cDNA in CHO-K1 ...................................... 74

3.7 Expression in E. coli (pET-System) ............................................................................... 753.7.1 Alternative Aufreinigung von His-Tag-36K durch Affinitätschromatographie mitFarbsepharosen .................................................................................................................................... 77

3.8 Expression in Insektenzellen / Baculovirus-System ....................................................... 77

4 Diskussion ..................................................................................................................80

5 Zusammenfassung .....................................................................................................97

6 Literatur .....................................................................................................................99

7 Anhang.....................................................................................................................110

7.1 Klonierung von IP1/pIRES-neo................................................................................... 110

118

7.2 Klonierung von IP2/pIRES-neo................................................................................... 110

7.3 Klonierung von IP-P0/pIRES-neo ............................................................................... 110

7.4 Klonierung von IP1 in pFastbac .................................................................................. 111

7.5 Klonierung von 36K/pIRES-hygro.............................................................................. 112

7.6 Klonierung von 36KHT/Dual Fastbac ......................................................................... 112

7.7 Klonierung von 36K/pET16b....................................................................................... 113

7.8 Klonierung von IP1/2cyto/pMal-C2............................................................................. 113

7.9 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ 114

7.10 Publikationen................................................................................................................ 115

119

&DUVWHQ�/DQZHUW

geboren am 30.6.70 in Osnabrückverheiratet

Schule und Grundwehrdienst

1976 - 1980 Grundschule Wallenhorst

1980 - 1982 Thomas-Morus-Schule Osnabrück

1982 - 1989 Angelaschule Osnabrück, Abschluß mit Abitur

1989 - 1990 Grundwehrdienst im Jägerbataillon 522 in Fürstenau

Studium

10/90 – 4/96 Immatrikulation an der Universität Osnabrück Fach: Biologie/Diplom

Diplomarbeit mit dem Thema: „Heterologe Expression vonMyelinproteingenen aus dem ZNS der Forelle in OLN- 93 Zellen derRatte“

23.4.96 Erfolgreicher Abschluß und Verleihung des akademischen Grades desDiplom Biologen

Promotion

5/96 bis 12/99 wissenschaftlicher Angestellter an der Universität Osnabrück imSonderforschungsbereich 171

5/96 bis 3/00 Doktorand in der Arbeitsgruppe Zoophysiologie, Anfertigung derDissertation unter der Leitung von Prof. Dr. G. Jeserich mit dem Thema:„Heterolge Expression und funktionelle Grundcharakterisierung vonMyelinproteinen aus dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncorhynchusmykiss)“

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Eidesstattliche Versicherung

Ich versichere, daß ich die vorliegende Dissertation entsprechend § 3 Absatz 2 der

Promotionsordnung selbständig und ohne unerlaubte Hilfe verfaßt und die benutzten

Hilfsmittel vollständig angegeben habe.

Ich versichere, daß ich weder an der Universität Osnabrück noch anderweitig versucht habe,

eine Dissertation einzureichen oder mich einer Doktorprüfung zu unterziehen.

Osnabrück, den 6.3.2000

Carsten Lanwert