Hibridación in situ

Nombre: Francisco Ortiz P. Profesora: Dra.Vasthy López Asignatura: Biología y Fisiología Molecular Fecha: 18 de Agosto del 2009.

Iquique - Chile

UNIVERSIDAD ARTURO PRATDEPARTAMENTO AGRICULTURA DEL

DESIERTO Y BIOTECNOLOGÍAINGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

Introducción La técnica de hibridación in situ está

basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.

Se diseña una sonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida), y marcada con un fluorocromo. o Isotopo radiactivo.

La utilización de esta técnica produce: La hibridación (unión), de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (si está presente) y posteriormente mediante técnicas específicas de detección (FISH), se obtiene la transformación de la secuencia en algo visible.

Introducción • Permite detectar secuencias especificas de ADN genómico o de ARNm en secciones de tejidos intactas o células dispersas.

• El tejido se trata con una proteasa para que la sonda pueda acceder al ADN nuclear que se desnaturaliza por calor.

• Se añade la sonda y la hibridación se produce cuando se halle presente cDNA.

• Con un lavado se separa la sonda marcada no unida y las secuencias mal apareadas.

Pasos generales de la metodología “no protocolo”

• Colocar células en filtro especial

• Lisar células para liberar el DNA

• Desnaturalizar el DNA

Aplicación y detección

Video

En esta animación se describe la técnica de hibridación in situ

Tipos de hibridaciones in situ

Hibridaciones in situ Tisular Hibridaciones in situ Cromosómica FISH(Fluorescent In Situ

Hybridization, Hibridaciones in situ con fluorescencia)

Hibridaciones in situ Cromosómica con sondas fluorescentes

Hibridaciones in situ Tisular Se realiza sobre cortes de tejidos, células intactas, núcleos aislados. De mayor manera se lleva a cabo en tejidos fijados en formalina,

incluidos en parafina, congelado, etc. Esta modalidad sirve para:

• Detectar virus patógenos• Diagnosticas células cancerosas• Para estudiar cambios en la expresión génica, detectando

secuencias en el ARN celular

Tras una fijación suave de la preparación se añaden sondas de cDNA, de hebra sencilla.

La detección se realiza por autoradiografia y examen de la película fotográfica bajo el microscopio, o por microscopia de fluorescencia (si se empleo este marcaje en la sonda).

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization, Hibridaciones in situ con fluorescencia)

1ª Fase. Región cromosómica de interés. Preparación de la sonda. Una sonda es un segmento de ADN marcado con fluorescencia, que es complementario.

2ª Fase. Hibridación. Los cromosomas desnaturalizados, fijos en el porta objetos del microscopio, son expuestos a la sonda marcada con fluorescencia. La hibridación (fusión) tiene lugar entre la sonda y el ADN cromosómico complementario (es decir, se acopla).

FISH(Fluorescent In Situ Hybridization, Hibridaciones in situ con fluorescencia)

3ª Fase. Visualización. Tras la hibridación, se examina el portaobjeto al microscopio con luz fluorescente. Las señales fluorescentes indican la presencia de ADN cromosómico complementario. La ausencia de tales señales implica que no hay ADN cromosómico complementario.

Estudio con aplicación de la Hibridación in Situ (FISH)

La Hibridación in situ orientada a rRNA con sondas fluorescentes de oligonucleótidos permite la identificación y cuantificación de células individuales, y ha demostrado una gran potencia en el análisis de la comunidad bacteriana.

En el presente trabajo se describe la composición de la comunidad de una determinada distribución vertical de sedimentos marinos utilizando la técnica de hibridación in situ.

El área de muestreo es una parte del Mar de Wadden en Alemania que forma la frontera meridional del Mar del Norte, que se extiende de los Países Bajos a Dinamarca.

 

Estudio con aplicación de la Hibridación in Situ (FISH).

Micrografías Epifluorescente en muestras de sedimentos del Mar de Wadden.

(a) Con sonda de hibridación EUB33 específico para las bacterias.

(b) Panel con excitación UV tinción DAPI.

(c, d) Idéntico campos microscópicos con sonda SRB385 (c) y (d)Tinción DAPI.

Estudio con aplicación de la Hibridación in Situ (FISH)

(e) hibridación con sonda DNMA657, específico para Desulfonema.

(f) Arcobacter específicas para hibridación con sonda ARC94.

Conclusiones Esta figura lo que trata de mostrar es la abundancia

expresada en porcentaje, este porcentaje depende del total de bacterias teñidas con DAPI.

Por lo tanto así se puede estudiar la composición de comunidades bacterianas presentes en el sedimento.

Las sondas son específicas y están marcadas con el fluorocromo Cy3 (indocarbocianina) en el extremo 5’

La hibridación es la base de muchas técnicas moléculares, como en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), Northern Blot, Southern Blot, microarrays de ADN, hibridación in situ o screening de genotecas.

http://www.medmol.es/termino.cfm?id=53 REFERENCIAS DE HIBRIDACION IN SITU CON ESQUEMA

  http://www.medmol.es/imprimir_pdf.cfm PDF TECNICAS DE HIBRIDACION EN SITU     http://soil.scijournals.org/cgi/content/abstract/71/2/620 PAPER “Fluorescent in Situ Hybridization and

Microautoradiography Applied to Ecophysiology in Soil” (FULL TEXT).   http://www.medmol.es/tecnica.cfm?id=35 VIDEO EXPLICATIVO HIBRIDACION IN SITU Y

TECNICAS MOLECULARES COMO VARIANTES DE LA HIBRIDACION IN SITU MISMA.   http://books.google.cl/books?

id=4OQXmnBnjH8C&pg=PA263&lpg=PA263&dq=sonda+de+un+amortiguador&source=bl&ots=5I5J4jAnNz&sig=z0J85aLvVWAh2iXnCLl3R4mmcts&hl=es&ei=XtaJSsHLO9G_tgekkOXnDA&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1#v=onepage&q=&f=false LIBRO GOOGLE CON INFORMACION RELAZINADA GUIAA.