High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression in isolated strains Diversité des Organismes

1

High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression

in isolated strains

Diversité des Organismes Marins UE 106

Bordeyne François Arias Ruiz Camilo

Etude de publications

Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS

Mar

ie B

eau

cham

p

2010

Terre-Neuve

500 nm

Jannaschia sp. CCS1

Procaryotes : Organismes majeurs de l’océan

Rhodobacterales : Classe des alphaprotéobactéries 1 famille et 26 genres

Importance dans la communauté du bactérioplancton

Role écologique majeur !

Présence d’Agents de Transfert de Gènes (ou GTAs)

Diversité DiscussionExpression g5 CritiqueIntroduction Conclusion

2

Bie

rs e

t al

., 20

08

50 nm 50 nm

GTAs chez Ruegeria pomeroyi DSS-3

Pourcentage de Rhodobacterales

10 20 30 40 50 600

800

600

400

200

0

Profondeur (m)

Bloom Nord Atl.

Ocean Pacifique côtier

Mer Méditerranée

Buchan et al., 2005

Ruegeria sp. TM1040500 nm

500 nm

Jannaschia sp. CCS1

3

GTAs : Que sont-ils et quel est leur rôle ?

Petites particules : environ 50 à 70 nm semblables à des bactériophages

Transferts de parties de génomes entre bactériesEnviron 4,5 kb

Rôle : flux majeur de gènes : adaptations aux conditions environnementales

=> Rôle écologique majeur

100 nm

Bactériophage lambda

Sch

no

s

GTA chez Reugeria mobilis 45A6

50 nm

McD

anie

l et

al.

Diversité DiscussionExpression g5 Introduction Critique Conclusion

4

Avantage : conservation des séquences

Marqueur

Objectifs

Estimation de la diversité en Rhodobacterales de la communauté bactérienne

Etude de l’expression de la protéine g5 chez différentes souches/espèces

Diversité DiscussionExpression g5 Introduction

Mise en évidence de 3 gènes : g2 : protéine terminase g5 : protéine majeur de la capside g9 : protéine majeure de la queue

Cluster GTA1 kb

10 kb

g2 g5 g9 CysEchprecG

Lang et Beatty, 2000, modifié

g5 : protéine majeur de la capside

Critique Conclusion

5

1000 km

USA

USA

Groenland

Canada

Terre Neuve

Pickatrail ®

Lieu de prélèvements


10 km

Go

og

le E

arth

, U.S

. Nav

y

N

N

6

Matériel et méthodes

Création d’OTUs 97 % d’identité nucléotidique

Phylogénie selon méthode de Neighbor-Joining

Identité nucléotidique inter-OTUs : 44 – 97 %

Diversité supérieure en été

Résultats


Séquence g5

Critique Conclusion

Paramètres Été Hiver Total Chesapeake Nombre Clones 127 45 172 158 Nombre d’OTUs 54 10 59 12

Indice de Shannon H’ 3,71 1,59 - H’ max = 2,39

Rhodobacter capsulatus

Ordre du µm

Sulfitobacter

Oceanibulbus

Roseobacter denitrificans OCh114

Octadecabacter

Loktanella

Ruegeria pomeroyi DSS-3

Roseobacter sp. MED193

Rhodobacter capsulatus SB1003

Citreicella sp. SE45

Groupe externe


Fu et al., 2010 modifié

7

Echelle non représentative

Critique Conclusion

Sulfitobacter sp. EE-36

Sulfitobacter sp. NAS-14.1

SulfitobacterLoktanella sp. CCS2

Loktanella

Oceanibulbus indolifex HEL-45

Oceanibulbus

Octadecabacter antarcticus 307

Octadecabacter

Ete

Hiver

8

Sulfitobacter sp. EE-36



Roseobacter denitrificans OCh114


Loktanella sp. CCS2

Rhodobacterales bacterium HTCC2150

Ruegeria pomeroyi DSS-3

Phaeobacter sp. Y4IRoseobacter sp. MED193


Groupe externeCitreicella sp. SE45




Sulfitobacter

Oceanibulbus

Octadecabacter

Loktanella

9

DML-w6DML-w13

DML-w12.1DML-w4.2

DML-w8


Roseobacter sp. GAI101Oceanilbulbus indolifex HEL-45Octadecabacter antarcticus 307CB1023CB1005CB1040Loktanella sp. CCS-2

Citreicella sp. SE45Roseovarius sp. HTCC2601Ruegeria pomeroyi DSS-3Phaeobacter sp. Y4I

Rhodobacter capsulatus SB1003Roseobacter sp. MED193

Matériel et méthodes

10 souches/espèces testées

+ 3 témoins


5 provenant de Terre-Neuve

3 provenant de la baie de Chesapeake

2 autres



Western blot

Critique Conclusion

Poids moléculaire :

g5 mature chez Rhodobacter capsulatus

10

DML-w6DML-w13

DML-w12.1DML-w4.2

DML-w8


Roseobacter sp. GAI101Oceanibulbus indolifex HEL-45


CB1023CB1005CB1040Loktanella sp. CCS-2

Citreicella sp. SE45

Roseovarius sp. HTCC2601

Ruegeria pomeroyi DSS-3Phaeobacter sp. Y4I


Roseobacter sp. MED193

Expression de la protéine dans 60 % des cas (6/10)

4/5 pour les échantillons de Terre-Neuve

2/3 pour ceux de la baie de Chesapeake

0/2 pour Loktanella


kDa

46

30

30

46

Rc

Rc

g5-

g5-

4.2 6 8 12.1 13 DSS

DSSY41 SE 05 23 40

Fu et al., 2010



Critique Conclusion

Résultats

Protéines matures

11

Adaptation aux environnements froids

Période du bloom phytoplanctonnique

Terre Neuve : de -1,5 à 16°C

Baie de Chesapeake : de 1 à 26 °C

Terre Neuve : mi Avril à fin Mai

Baie de Chesapeake : fin Février à fin Mars

Mer de Weddel, Antarctique

Jean

-Pie

rre

Mar

ro

50 km

N

Bloom phytoplanctonique, Terre Neuve

NA

SA


Diversité

Critique Conclusion

Existence de microdiversité Nouveaux groupes = nouvelles caractéristiques écologiques ?

12


Expression g5

g5 mature formation du GTAs

Mais aussi :

Mauvaises conditions de croissance

Seuil de détection trop élevé

Possibilité d’aucune expression

Acquisition de nouvelles caractéristiques : dégradation de molécules carbonées ou soufrés particulières, etc.

Critique Conclusion

Mo

nsi

eurb

en, m

od

ifié

50 nm

McD

anie

l et

al.

13


GLRGLSLEGKALNSAVAAEGGLRGLELEGKAMSTAVAGDGGLRGLVLEGKALSTAVAGDGALRGLELEGKSLSSAVAADGALRGLTLEGKAMSTAINSDGGLRGLELDSKSMSTAVNSDG



Phaeobacter sp. Y4ICitreicella sp. SE45

Octodecabacter antarcticus 307Ruegeria pomeroyi DSS-3

Zone de clivage

Une autre évidence

Conservation de la zone de clivage très importante

Fu et al., 2010

14


Phylogénie g5 vs phylogénie ARNr 16S : non congruence

Temps écoulé entre les 2 prélèvements

Mise en évidence de bloom phytoplanctonnique estival par la NASA

Critique Conclusion

Originalité du marqueur

Rhodobacterales affectées par une eau contaminée

Suivi de l’évolution de la communauté en Rhodobacterales

Eu

rop

e 1

NA

SA

12/08/2002

Terre-Neuve

N

15


Difficulté de culture des souches/espèces

Seulement 2 prélèvements, sans réplicats

Comparaisons + diminution du risque d’extrêmes

Vitesse d’évolution de la séquence g5

10 km

Go

og

le E

arth

, U.S

. Nav

y

N

Labrot ©

16


Diversité en Rhodobacterales importante à Terre Neuve

Mise en évidence d’une nouvelle partie de la grande diversité de cet ordre

Expression de protéines g5 matures chez plusieurs espèces

Transferts et acquisition de gènes peuvent être réalisés

Mais, de nombreux travaux restent à effectuer pour en connaitre encore et encore… 10

0

20

60

50

40

30

140120100806040200

Nombre d’OTUs

Nombre de clones

Eté

Hiver


Ordre du µm

50 nm

500 nm500 nm

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Bibliographie

Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS (2010) High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene transfer agent protein expression in isolated strains. Aquat Microb Ecol : 283 - 293

Zhao Y, Wang K, Budinoff C, Buchan A, Lang A, Jiao N, Chen F (2009) Gene transfer agent (GTA) genes reveal diverse and dynamic Roseobacter and Rhodobacter populations in the Chesapeake Bay. The ISME journal (3) : 364 - 373

Prabagaran SR, Manorama R, Delille D, Shivaji S (2007) Predominance of Roseobacter, Sulfitobacter, Glaciecola and Psychrobacter in seawater collected off Ushuaia, Argentina, Sub-Antarctica. FEMS Microbiol Ecol 59 : 342–355

Lang AS et Beatty JT (2000) Genetic analysis of a bacterial genetic exchange element: The gene transfer agent of Rhodobacter capsulatus. PNAS (97) : 859 –864

Ettema TJG et Andersson SGE (2009) The α-proteobacteria: the Darwin finches of the bacterial world. Biol. Lett. (5): 429 - 432

Google Earth (Version 6.0) [Software]. Mountain View, CA: Google Inc. (2010). Disponible sur http://www.google.fr/intl/fr/earth/download/ge/

NASA Earth Observatory (2010) Phytoplankton bloom off Newfoundland. http://earthobservatory.nasa.gov Novembre 2010

Buchan A, Gonzalez JM, Moran MA (2005) Overview of the marine Roseobacter lineage. Appl Environ Microbiol 71: 5665 –5677

Biers EJ, Wang K, Pennington C, Belas R, Chen F, Moran MA (2008) Occurrence and Expression of Gene Transfer Agent Genes in Marine Bacterioplankton. Applied and environmental microbiology : 2933 – 293

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second edition. Volume 2 : The Proteobacteria. Part c : The Alpha-, Beta-, Delta- and Epsilonproteobacteria. (2005)

http://www.google.fr/intl/fr/earth/download/ge/

http://earthobservatory.nasa.gov/

18

Merci de votre attention !

Terre-Neuve

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High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression

in isolated strains

Diversité des Organismes Marins UE 106

Bordeyne François Arias Ruiz Camilo

Etude de publications

Mar

ie B

eau

cham

p

Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS

2010

500 nm

Jannaschia sp. CCS1

Terre-Neuve

20

Cycles de PCR et primers utilisés

Pour la séquence g5 Cycle : 30 s à 98 °C puis 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C, avec pour finir 7 min à 72 °C

Primers : MCP-109F : 5’-GGC TAY CTG GTS GAT CCS CAR AC-3’MCP-368R : 5’-TAG AAC AGS ACR TGS GGY TTK GC-3’

Pour la séquence ADNr 16S Cycle : 30 s à 98 °C puis 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 58 °C et 30 s à 72 °C, avec pour finir 8 min à 72 °C

Primers : 27F : 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’1522R : 5’-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3’

Questions

21

Base ou type de bases code à une lettreAdénine AThymine TGuanine GCytosine CInosine IUracile UPurine : Adénine ou Guanine RFaible liaison (deux liaisons hydrogène) : Adénine ou Thymine

W

Fonction cétone dans le grand sillon de l'ADN : Thymine ou Guanine

K

Pas une Adénine BPas une Thymine V

Pyrimidine: Thymine ou Cytosine Y

Forte liaison (trois liaisons hydrogène) : Cytosine ou Guanine

S

Fonction amine dans le grand sillon de l'ADN : Adénine ou Cytosine

M

Pas une Cytosine DPas une Guanine HQuelconque N

Base azotée : abréviations

22

Expérience de neutralisation d'anticorps

TBST Tris-Buffered Saline Tween-20

Anticorps primaire

Incubé avec un excès molaire (~100 plis du peptide d'immunisation)2h en solution buffer (TBST) à T° ambient.

Anticorps Control(Non neutralisé)

Meme conditionssans adition de peptide

Pour confirmer la détection des bandes spécifiquement reconnues par les anticorps primaires du GTA.

Anticorps polyclonal dirigé contre un peptide synthétique correspondant à une région de la protéine majeure capsid (g5) GTA conservée à plus de 90 %.

Détection de la présence d'une protéine dans un tissu, évaluation de la taille et la concentration.

Avantage

Anticorps du g5

23

Pourcentage de recouvrement

Analyse de raréfaction

C = 1 – (N/n) x 100

N : nombre de séquences uniques

n : nombre total de clones

But : calculer la proportion de la diversité entre les séquences

Cette analyse permet d’estimer le nombre d’espèces présentent dans un échantillon à partir du nombre total d’individus.

24

Mécanisme de transfert de gènes chez les procaryotes

Conjugaison

Transformation bactérienne

25

Neighbor Joining

N’accepte pas l’exactitude de l’horloge moléculaire

But : établir les relations phylogénétiques entre différents taxons, à partir d’un indice de distance

Obtention d’un arbre non raciné

Méthode d’analyse phénétique

Ici : méthode des distances the Maximum Composite Likelihood Method

26

Cellule eucaryote : 20 µm

Bactérie : 2 µm

GTA : 50 – 70 nm

Taille moyenne des différentes structures

27

Position des alphaprotéobactéries dans le vivant

Archae

Eucaryotes

Bactéries

γ-protéobactéries

β-protéobactéries

α-protéobactéries

ε-protéobactéries

Cyanobactéries

Firmicutes

Planctomycètes

SpirochètesActinobactéries

28

Western blot

Permet d’étudier la synthèse (ou non) de protéine

utilisation de sonde : des anticorps

Northern blot : permet de quantifier l’expression du gène

Southern blot : permet de répondre à combien de gènes sont exprimés

29

Indice de Shannon H’

H’ = - ∑ pi ln(pi)

i = Espèce du milieu

pi = proportion de l’espèce I dans le milieu

0 < H’ < ln S

Mesure de la diversité d’un milieu.

Plus H’ est grand, plus la diversité est importante.

L’indice est max quand toutes les espèces sont à égale proportion

S = nombre d’espèces dans le milieu

Source : Grall J. et Hily C.

30

Roseobacter vs Rhodobacterales

Loktanella

Octadecabacter - Ruegeria

Sulfitobacter - Oceanibulbus

Roseobacter

Ruegeria

Rhodobacter capsulatus

Buchan et al., 2005

31

ORF : Open Reading Frames

Séquence d’ADN qui permet d’estimer la présence d’un gène

Commence par un codon d’initiation et termine par un codon stop.

Entre ces codons, on retrouve les codons codant pour la protéine la partie codante de l’ADN

32

ACIDE AMINE 3 lettres 1 lettre Codons Alanine Ala A GCA, GCC, GCG, GCTArginine Arg R CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGGAspartic acid Asp D GAC, GATAsparagine Asn N AAC, AATCysteine Cys C TGC, TGTGlutamic acid Glu E GAA, GAGGlutamine Gln Q CAA, CAGGlycine Gly G GGA, GGC, GGG, GGTHistidine His H CAC, CATIsoleucine Ile I ATA, ATC, ATTLeucine Leu L CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTGLysine Lys K AAA, AAGMethionine Met M ATGPhenylalanine Phe F TTC, TTTProline Pro P CCA, CCC, CCG, CCTSerine Ser S TCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGTThreonine Thr T ACT, ACC, ACG, ACTTryptophan Trp W TGGTyrosine Tyr Y TAC, TATValine Val V GTA, GTC, GTG, GTTSTOP - - TAG, TAA, TGA

Correspondance Acides aminés/abbréviations

33

Position phylogénétique non sûre

En se basant sur l’ARNr 16S, Lee et al., proposent une taxonomie différente de celle du Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.

This study BMSB

Order Caulobacterales Order Caulobacterales

Family Caulobacteraceae Family Caulobacteraceae

Family Hyphomonadaceae Order ‘Rhodobacterales’

Family ‘Rhodobacteraceae’ Family ‘Rhodobacteraceae’

The hierarchical system of the ‘Alphaproteobacteria’: description of Hyphomonadaceae fam. nov., Xanthobacteraceae fam. nov. and Erythrobacteraceae fam. nov.Lee et al., 2005

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