HIGH-MOBILITY GROUP BOX 1 PROTEIN (HMGB1). 1. of scientific papers IU.pdf · 2.3. HMGB1 и поправка на ДНК, увредена от антитуморният агент

Хабилитационна справка на доцент Ива Угринова

1

РАЗШИРЕНА ХАБИЛИТАЦИОННА СПРАВКА

Разширената хабилитационна справка е обобщение на основните ми научни

постижения, описани в публикации, които съм подбрала като „еквивалентен брой“ статии на

хабилитационен труд. Това са публикациите, с които се представям за покриване на

показателите от Група В на Приложение 1 от ППЗРАСРБ на ИМБ. Тези статии са посветени на:

HIGH-MOBILITY GROUP BOX 1 PROTEIN (HMGB1).

1. ВЪВЕДЕНИЕ – кратка справка за състоянието на изследванията към момента.

HMGB1 е нехистонов хроматинов белтък, открит преди повече от 45 години. Научният

интерес към белтъка нараства – за 2000 година в PubMed излязоха 62 публикации за HMGB1,

а през 2018-а те са над 823.

HMGB1 е широко разпространен и има двойствена функция. В ядрото белтъкът се

свързва с ДНК и действа като „архитектурен фактор“, който манипулира различни

нуклеопротеинови комплекси и по този начин влияе на процесите репликация,

транскрипция, рекомбинация, поправка, образуване и пренареждане на нуклеозоми 1-6.

Извън клетката HMGB1 има различна роля – там той действа като свързана с

увреждане молекула (damage-associated molecular pattern, DAMPs), сигнализираща „опасност“

(alarmin) и активира множество HMGB1-„компетентни“ клетки, предизвиквайки набор от

физиологични и/или патологични отговори 1, 2, 7-9. HMGB1 се освобождава пасивно от

некротичните тъкани или активно се секретира от стресирани клетки. Като алармин HMGB1

също има двойствена функция – той може да бъде освободен, за да предупреди съседни

клетки за застрашена хомеостаза на освобождаващата го клетка, или може да бъде

интернализиран чрез RAGE (Receptor for Advanced Glycation End Products) рецептор-

медиирана ендоцитоза и да задейства различни вътреклетъчни сигнални пътища например

да активира клетъчните инвазия и миграция, туморния растеж и метастазирането 10-12. Не

случайно HMGB1 е открит в различни видове тумори, където в сравнение с нормалните

тъкани, той е свръхекспресиран 9, 13, 14. Последните резултати, свързани с биологичните

функции на белтъка, както и моите постижения, са обобщени в излезлия наскоро

научен обзор:


2

17. Ugrinova, I., & Pasheva, E. (2017). HMGB1 protein: a therapeutic target inside

and outside the cell. In Advances in protein chemistry and structural

biology (Vol. 107, pp. 37-76). IF 3.783 Q3 Q2

2. HMGB1 КАТО „АРХИТЕКТУРЕН“ ФАКТОР НА ХРОМАТИНА. Модулиращата роля на

пост-синтетичните модификации и киселия С-край.

Като „архитект“ на хроматина HMGB1 е важен фактор за множество клетъчни процеси

като репликация, транскрипция, рекомбинация, поправка и ремоделиране. Ролята на

различните пост-синтетични модификации намери най-ярко изражение при т.н. „хистонов

код“, описващ различни пост-синтетични модификации при хистоните. При нехистоновите

белтъци ролята на тези модификации и техните взаимовръзки на практика не са

изучени. Нашата група показа, че пост-синтетичното ацетилиране на HMGB1 и киселият С-

край модулират тези негови основни функции 4, 5, 15-20. Показахме също, че циклин зависимата

киназа Cdk5, която специфично фосфорилира само in vivo ацетилиран HMGB1 и тази

„вторична“ модификация повлиява свойството на белтъка да стимулира олигомеризацията

на къси ДНК фрагменти в присъствие на ДНК лигаза, но няма ефект върху разпознаването на

дефекти в ДНК 21.

2.1. Пост-синтетично фосфорилиране на HMGB1 белтъка от протеин киназа C

(PKC).

Продължихме тези изследвания, фокусирайки нашето внимание върху

фосфорилирането на HMGB1 от протеин киназа C (PKC). За първи път показахме, че PKC

фосфорилира in vitro рекомбинантен HMGB1 на две места. Пост-синтетичното

фосфорилиране от PKC увеличава с порядък афинитета на белтъка към цис-

платинирана ДНК и повишава способността му да огъва малки ДНК фрагменти. В

заключение – тази пост-синтентична модификация може да служи като модулатор на

участието на HMGB1 в различни ядрени процеси.

30. Ugrinova I, Zlateva S, Pasheva E,(2012). The effect of PKC phosphorylation on the

"architectural" properties of HMGB1 protein. Molecular Biology Reports, 39(11):9947-

9953. IF 2.107 Q3 Q2


3

2.2. HMGB1 в структурата на хроматина.

Хроматинът с нуклеозомната организация на ДНК е най-сериозната бариера за

протичането на основни ядрени процеси. В предишни наши изследвания показахме ролята

на HMGB1 в ремоделирането. Установихме, че ефикасността на образуване на стабилен

комплекс между ремоделиращите активности SWI/SNIF, или RSC и нуклеозомата, се

увеличава в присъствие на HMGB1, като ефектът се засилва в резултат на пост-синтетичното

ацетилиране 5. Основната стратегия, която клетката използва, за да преодолее

нуклеозомната бариера, е правилното премахване и последващото възстановяване на

хистоновия октамер върху ДНК 22-24. Важни фактори в този многостъпален процес са

хистоновите шаперони, които могат да съберат нуклеозомни комплекси in vitro в отсъствието

на АТФ. HMGB1 е добър кандидат за шаперон, тъй като неговата молекула се състои от два

ДНК свързващи мотива Box A и Box B и дълга, неструктурирана силно кисела опашка. С

нашите експерименти за първи път показахме, че при in vitro формиране на нуклеозоми

чрез постъпателна диализа в присъствие на HMGB1, двукратно се увеличава

количеството на получените нуклеозоми. Още по-интересно е, че стимулиращият ефект

присъства и при in vitro експерименти без диализа, когато реконструкцията е възможна само

в присъствието на шаперон. Нашите резултати показват, че HMGB1 действа като шаперон

и стимулира сформирането на нуклеозомна частица, като механизмът на действие се

изразява в образуване на чупка в ДНК фрагмента, което улеснява депозирането на

хистоновия октамер. Пост-синтетичното ацетилиране на HMGB1 в лизин 2 намалява силно

стимулиращия ефект на протеина, както в постъпателна солева диализа, така и при

експеримент на директна реконституция (без диализа).

HMGB1 е един от най-мобилните протеини. Белтъкът преминава през ядрото за 1,5

секунди 25. Нашата хипотеза е, че HMGB1 се движи бързо, сканирайки целия обем на ядрото

и търси местата и процесите, където е необходим. С други думи подвижността на HMGB1 в

ядрото е важно свойство за комплексните функции на белтъка. Любопитно бе да

проверим какво е влиянието на пост-синтетичните модификации и киселия С-край.

Експериментите ни с Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) метода показаха, че

скъсеният протеин има значително по-ниска мобилност в сравнение с целия HMGB1 и

мобилността му допълнително намалява при внасяне на мутация (от лизин в аланин) в

местата за ацетилиране К2/А2 и К81/А81. Скоростта на целия HMGB1 също намалява когато

мястото за пост-синтетично ацетилиране се мутира (К2/А2). За първи път демонстрирахме


4

ролята на потенциалното пост-синтетично ацетилиране in vivo

за мобилността на HMGB1.

27. Osmanov T, Ugrinova I, Pasheva E, (2013). The chaperone like function of the nonhistone

protein HMGB1. Biochemical and Biophysical Research Communications, 432(2):231-235.

IF 2.55 Q2 Q1

26. Osmanov T, Ugrinova I, Pasheva E, (2013). Тhe effect of postsynthetic acetylation of

hmgb1 protein on its ability to stimulate end-positioned nucleosome reconstitution.

Comptes Rendus De L Academie Bulgare Des Sciences, 66(8):1129-1134. IF 0.211 Q4 Q2

27. Osmanov, T., & Ugrinova, I. (2017). HMGB1 mobility depends on the protein c-tail and the

postsynthetic acetylation. COMPTES RENDUS DE L ACADEMIE BULGARE DES

SCIENCES, 70(6), 813-818. IF 0.270 Q4 Q2

2.3. HMGB1 и поправка на ДНК, увредена от антитуморният агент цисплатинa

in vitro.

Цисплатината е най-известният ДНК-увреждащ химиотерапевтик. Ефикасността на

поправката на ДНК в раковите клетки е много важна за клиничния резултат. Свойството на

HMGB1 да разпознава различни дефекти в ДНК логично води до предположението, че участва

в тяхната поправка. В нашата лаборатория са проведени редица изследвания, свързани с

поправката на цис-платинирана ДНК – „гола“ суперспирална или пакетирана в нуклеозоми 3,

16, 20. Установили сме, че HMGB1 инхибира репарационния синтез от типа поправка с

изрязване на нуклеотид (NER). Интересно, отстраняването на С-края на белтъка изцяло

елиминира това негово свойство 3, 16, 20.

Изследвахме също афинитета на разпознаване и свързването на HMGB1 към ДНК,

модифицирана от паладиеви производни, оказа се, че белтъка има по слаб афинитет и

вероятно е по-слабо въвлечен в цитотоксичността на паладиевите съединения.

Постигнатите оригинални резултати при проведените експерименти in vitro ни

мотивираха да изследваме ролята на HMGB1 в поправката на ДНК на ниво живи клетки. За

целта изследвахме поправката на увредена ДНК в миши фибробласти от линията NIH – 3T3.

Оценихме ефекта на пост-синтетичното ацетилиране и киселия C-краен домен на HMGB1

посредством свръх-експресия на нативни и мутантни форми на белтъка слети с ЕGFP.


5

Резултатите от тези експерименти за първи път демонстрираха,

че HMGB1 подтиска поправката на цис-платинирана ДНК in vivo.

Нещо повече – заглушаването на HMGB1 в NIH-3T3 клетки увеличи потенциала им за

поправка на ДНК. Увеличените нива на поправка бяха върнати до изходните си стойности

чрез трансфекция на заглушените клетки с плазмиди кодиращи HMGB1 и HMGB1 K2A, т. нар

“rescue experiments”. В този случай скъсената форма на HMGB1 не показа подобен ефект.

На следващ етап изследвахме и влиянието на HMGB1 върху ДНК-поправката в

човешки ракови клетки. Експериментите бяха проведени с две белодробни ракови линии

Н1299 / негативни по р53, инвазивни/ и А549 /позитивни по р53, неинвазивни/. Eктопичната

експресия на HMGB1 инхибира ДНК поправката. Заглушаването на клетъчния HMGB1 чрез

трансфекция с еsiRNA (интерфериращи РНК) води до добре изразено повишение на ДНК

поправката само при клетките от линия H1299 (със заглушен р53). Нещо повече –

трансфекцията на тези клетки с функционален р53 доведе обратно до инхибиране на

поправката на ДНК. Клетки Н1299, свръхекспресиращи HMGB1 логично, се оказаха

значително по-чувствителни към третиране с цисплатина, демонстрирайки тясната връзка

между ролята на HMGB1 в поправката на cis-платинирана ДНК и ефикасността на веществото

като противораков агент. При клетките с функционален р53 (А549) поправката на ДНК се

определя от комплексното взаимодействие между HMGB1 и р53, като увеличаване в общия

капацитет на ДНК поправка бе наблюдавано само след заглушаване и на двата протеина

едновременно. С тази работа за първи път, на живи клетки, демонстрирахме

комплексната роля на HMGB1 в поправката на ДНК, увредена с цис-платина. Нещо

повече – показахме ключовата роля на р53 в този процес – индикация за сложните

взаимоотношения между р53 и HMGB1 in vivo.

HMGB1 и p53 взаимодействат помежду си и регулират не само поправката на ДНК, но

и разнородни процеси в клетката, като например сигнализация за ДНК увреждане, апоптоза

и автофагия. Изследвахме как промяната на нивата на експресия на единия белтък се

отразява на количеството на другия. Линии от недребно-клетъчен рак на бял на дроб – А549

с функционален р53 и Н1299 без р53 бяха използвани като експериментални модели.

Установихме, че свръх експресията на р53 потиска експресията на HMGB1.


6

23. S Yusein-Myashkova IUgrinova, E Pasheva,(2014). Non-histone protein

HMGB1 inhibits the repair of cisplatin damaged DNA in NIH-3T3 murine

fibroblasts. BMB reports. IF 2.838 Q2 Q1

18. Yusein-Myashkova, S., Stoykov, I., Gospodinov, A., Ugrinova, I., & Pasheva, E. (2016). The

repair capacity of lung cancer cell lines A549 and H1299 depends on HMGB1 expression level

and the p53 status. The Journal of Biochemistry, 160(1), 37-47. IF 2.275 Q3 Q1

19. S Yusein-Myashkova IUgrinova, E Pasheva, (2015). Interdependence of expression level of

high mobility group box protein 1 and tumour suppressor protein p53. Comptes Rendus De

L Academie Bulgare Des Sciences 2015, Vol 68, No12, pp.1541-1546 IF 0.270 Q4 Q2

11. Momekov, G., Ugrinova, I., Pasheva, E., Tsekova, D., & Gencheva, G. (2018). Cellular

Pharmacology of Palladinum (III) Hematoporphyrin IX Complexes: Solution Stability,

Antineoplastic and Apoptogenic Activity, DNA Binding, and Processing of DNA-

Adducts. International journal of molecular sciences, 19(8), 2451. IF 4.331 Q2 Q1

7. Momekov, G., Ugrinova, I., Pasheva, E., Tsekova, D., & Gencheva, G. (2019). Cellular

Pharmacology of Palladinum (III) Hematoporphyrin IX Complexes: Solution Stability. A

Commemorative Issue in Honor of Professor Nick Hadjiliadis Metal Complex Interactions

with Nucleic Acids and/or DNA, 19, 37.

3. ИЗВЪНКЛЕТЪЧНИ ФУНКЦИИ НА HMGB1. HMGB1 като сигнална молекула,

взаимодействие с рецептора RAGE, роля в туморогенезата.

Участието на HMGB1 в туморогенезата е комплексно: и вътреклетъчните/ядрени, и

извънклетъчните форми на белтъка участват във формирането на тумора, прогресията,

метастазирането и отговора на химиотерапевтици 26. Важно е да се отбележи, че в

туморогенезата HMGB1 се свързва най-вече с инвазивноста и метастазирането, като се

предполага, че ролята му за формиране на метастази се дължи на способността му да променя

адхезивните свойства на клетките. Счита се, че основният сигнален път на HMGB1 се

осъществява при взаимодействие с рецептора RAGE, когато белтъкът пасивно или активно се

секретира извън клетката на образуванието 1, 9, 27, 28.

В нашата лаборатория изследвахме експресията на HMGB1 белтъка и RAGE в различни

човешки тумори и установихме корелация между нивото на експресия и клетъчната

локализация на HMGB1 и RAGE и степента на диференциация и прогноза на тумора 9.


7

Продължавайки изследванията върху ролята на белтъка като

сигнална молекула установихме, че HMGB1 стимулира инвазията

на хормон-независимата клетъчна линия MDA–MBA-231, но няма влияние върху

хормон-зависимата MCF-7. Интересна находка е фактът, че скъсената форма на белтъка без

киселия С- край е неактивна. Друго интересено следствие от взаимодействието на HMGB1

с RAGE рецептора е наблюдаваната транслокация на транскрипционния фактор NF-κB

от цитоплазмата в ядрото в ракови клетки от млечна жлеза. NF-kappaB е прототипичен

транскрипционен фактор, реагиращ на стрес, който действа в сложна регулаторна мрежа.

Динамиката на сигнала на ендогенния NF-kappaB в единични клетки остава неизяснена. И в

този случай скъсената форма на белтъка не води до промяна на локализацията на NF-κB. В

момента са в ход експерименти, които да установят по-детайлно следващите елементи

(гени/белтъци) от сигналния път, както и функционалните промени в раковите клетъчни

линии, нарушения в цитоскелета, повишена подвижност и т.н.

p53 обикновено се разглежда като тумор супресорен белтък, но постоянното му

активиране може да доведе до про-туморогенно възпаление. Активирането на p53 може да

бъде провокирано от повишаване на концентрацията му в резултат на високо ниво на

транскрипция чрез трансформация на p53 в активна конформация, или чрез транслокация от

цитоплазмата в ядрото. Изненадващо установихме, че HMGB1 може да играе ролята на

сигнална молекула, която провокира натрупването на p53 в ядро, като наблюдаваният

ефект е почти равен на този, предизвикан от класическия p53-активатор актиномицин

D. И тук скъсената форма на HMGB1 няма ефект. Това подкрепи хипотезата, че киселият C

край играе важна роля за регулиране на свойствата от HMGB1.

Слетите флуоресцентни протеини революционизираха изследванията върху

локализацията и динамиката на белтъците в живите клетки. Наскоро HMGB1 беше открит

като един от ключовите регулатори на сложните взаимовръзки между автофагия и апоптоза.

Ролята на белтъка в двата процеса е свързана с неговата транслокация от ядрото в

цитоплазмата, където взаимодейства с р53 и Beclin1. За да изследваме ролята на HMGB1 в

автофагичния поток, ние създадохме две перманентни човешки клетъчни линии (А549 и

Н1299) постоянно експресиращи HMGB1 слят в C-края на зелен флуоресцентен протеин

(ЕGFP). Така полученият биосензор, базиран на HMGB1-ЕGFP, е подходящ инструмент за

наблюдение на динамиката на транслокация на HMGB1 от ядрото към цитоплазмата, което

се счита за отличителен белег за автофагия. Друго приложение на слетите белтъци е в


8

изучаване динамиката на натрупване на HMGB1 и различни негови

мутанти в места на контролирано предизвикани увреждания в ДНК.

24. Todorova JT, Ugrinova I, Osmanov TF, Pasheva EA, (2013). Expression and subcellular

localization of RAGE in normal mouse and tumor tissues. Current Opinion in Biotechnology,

24:S103-S103.

9. Pasheva, E., Schroder, M., Yusein-Myashkova, S., Todorova, J., & Ugrinova, I. (2018). The

HMGB1 C terminus is indispensable for the chemotaxis tested on breast cancer

cells. COMPTES RENDUS DE L ACADEMIE BULGARE DES SCIENCES, 71(10), 1331-1335. IF

0.321 Q4 Q2

5. Schröder, M., Yusein-Myashkova, S., Todorova, J., Pasheva, E., & Ugrinova, I. (2019). High

mobility group box 1 protein (HMGB1) stimulates the nuclear accumulation of

p53. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 1-6. IF 1.377 Q4 Q3

1. Pasheva, E., Petrova, M., Yusein-Myashkova, S., Todorova, J., & Ugrinova, I. (2019). The

cellular translocation of NF-kB in breast cancer cell lines is affected by HMGB1 protein but

not by its truncated form COMPTES RENDUS DE L ACADEMIE BULGARE DES

SCIENCES, Accepted. IF 0.321 Q4 Q2

2. Petrova, M., Schröder, M., Pasheva, E., Todorova, J., & Ugrinova, I. (2019) Generation of

stable cell lines expressing GFP-HMGB1 fused protein for studying autophagy form

COMPTES RENDUS DE L ACADEMIE BULGARE DES SCIENCES, Accepted. IF 0.321 Q4 Q2

4. ПЕРСПЕКТИВИ

Получените досега оригинални резултати са стабилна основа за продължаване на

изследванията в три основни насоки:

Роля на HMGB1 в процесите апоптоза (програмираната клетъчна смърт) и

автофагия (прживяемост на клетката). Балансът между двата процеса е от

изключително значение, тъй като резултатите от антитуморната терапия

зависят от това по кой „път“ ще тръгне раковата клетка. Тези изследвания са

подкрепени с проект от ФНИ, договор ДН01/10 2016 и тема: „Автофагия или


9

апоптоза - HMGB1 белтъкът като ключов регулатор определящ

клетъчната съдба в условия на стрес при модели на рак на бял дроб“.

По тази тематика вече имаме една излязла от печат и една приета работа, а в

момента се работи по още две.

Изследвания целящи да изяснят ролята на HMGB1 като сигнална молекула,

която чрез сигнализация през RAGE стимулира клетъчната мобилност,

понижава клетъчната адхезия и предизвиква изменения в цитоскелета,

изразяващи се в промени в организацията на виментиновите междинни- и

актиновите микрофиламенти, което е предпоставка за увеличаване

инвазивността на раковите клетки и води до развитие на метастази. По тази

тематика вече имаме натрупани резултати и се подготвя публикация.

Изучаване динамиката на натрупване на HMGB1 в места на

контролирано предизвикани ДНК увреждания. Искаме да изследваме

взаимодействието на HMGB1 и различни негови мутанти с други белтъци в

клетъчния отговор към УВ предизвикано увреждане в ДНК и да изучим

механизма на това взаимодействие чрез проследяване на кинетиката на

рекрутиране на HMGB1 и неговите мутанти към съответните ДНК лезии. По

тази тематика има една защитена дипломна работа и в момента се изработва

втора, а резултатите предстои да се обработват и подготвят за публикация.

5. ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА

1. Ugrinova, I. & Pasheva, E. HMGB1 Protein: A Therapeutic Target Inside and Outside the Cell. Advances in protein

chemistry and structural biology 107, 37-76 (2017).

2. Andersson, U., Antoine, D.J. & Tracey, K.J. The functions of HMGB1 depend on molecular localization and post-

translational modifications. Journal of internal medicine 276, 420-424 (2014).

3. Mitkova, E., Ugrinova, I., Pashev, I.G. & Pasheva, E.A. The inhibitory effect of HMGB-1 protein on the repair of

cisplatin-damaged DNA is accomplished through the acidic domain. Biochemistry 44, 5893-5898 (2005).

4. Topalova, D., Ugrinova, I., Pashev, I.G. & Pasheva, E.A. HMGB1 protein inhibits DNA replication in vitro: a role of

the acetylation and the acidic tail. The international journal of biochemistry & cell biology 40, 1536-1542 (2008).

5. Ugrinova, I., Pashev, I.G. & Pasheva, E.A. Nucleosome binding properties and Co-remodeling activities of native

and in vivo acetylated HMGB-1 and HMGB-2 proteins. Biochemistry 48, 6502-6507 (2009).


10

6. Wang, Y., Wang, L. & Gong, Z. Regulation of Acetylation in High Mobility Group

Protein B1 Cytosol Translocation. DNA and cell biology 38, 491-499 (2019).

7. Bianchi, M.E. et al. High-mobility group box 1 protein orchestrates responses to

tissue damage via inflammation, innate and adaptive immunity, and tissue repair. Immunological reviews 280,

74-82 (2017).

8. He, S.J. et al. The dual role and therapeutic potential of high-mobility group box 1 in cancer. Oncotarget 8, 64534-

64550 (2017).

9. Kostova, N., Zlateva, S., Ugrinova, I. & Pasheva, E. The expression of HMGB1 protein and its receptor RAGE in

human malignant tumors. Molecular and cellular biochemistry 337, 251-258 (2010).

10. Fages, C., Nolo, R., Huttunen, H.J., Eskelinen, E. & Rauvala, H. Regulation of cell migration by amphoterin. Journal

of cell science 113 ( Pt 4), 611-620 (2000).

11. Kuniyasu, H., Chihara, Y. & Kondo, H. Differential effects between amphoterin and advanced glycation end

products on colon cancer cells. International journal of cancer 104, 722-727 (2003).

12. Kuniyasu, H., Chihara, Y., Kondo, H., Ohmori, H. & Ukai, R. Amphoterin induction in prostatic stromal cells by

androgen deprivation is associated with metastatic prostate cancer. Oncology reports 10, 1863-1868 (2003).

13. Brezniceanu, M.L. et al. HMGB1 inhibits cell death in yeast and mammalian cells and is abundantly expressed in

human breast carcinoma. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for

Experimental Biology 17, 1295-1297 (2003).

14. Poser, I., Golob, M., Buettner, R. & Bosserhoff, A.K. Upregulation of HMG1 leads to melanoma inhibitory activity

expression in malignant melanoma cells and contributes to their malignancy phenotype. Molecular and cellular

biology 23, 2991-2998 (2003).

15. Pasheva, E. et al. In vitro acetylation of HMGB-1 and -2 proteins by CBP: the role of the acidic tail. Biochemistry

43, 2935-2940 (2004).

16. Pasheva, E.A., Ugrinova, I., Spassovska, N.C. & Pashev, I.G. The binding affinity of HMG1 protein to DNA modified

by cis-platin and its analogs correlates with their antitumor activity. The international journal of biochemistry &

cell biology 34, 87-92 (2002).

17. Ugrinova, I., Mitkova, E., Moskalenko, C., Pashev, I. & Pasheva, E. DNA bending versus DNA end joining activity of

HMGB1 protein is modulated in vitro by acetylation. Biochemistry 46, 2111-2117 (2007).

18. Ugrinova, I., Pashev, I.G. & Pasheva, E.A. Post-synthetic acetylation of HMGB1 protein modulates its interactions

with supercoiled DNA. Molecular biology reports 36, 1399-1404 (2009).

19. Ugrinova, I., Pasheva, E.A., Armengaud, J. & Pashev, I.G. In vivo acetylation of HMG1 protein enhances its binding

affinity to distorted DNA structures. Biochemistry 40, 14655-14660 (2001).

20. Ugrinova, I., Zlateva, S., Pashev, I.G. & Pasheva, E.A. Native HMGB1 protein inhibits repair of cisplatin-damaged

nucleosomes in vitro. The international journal of biochemistry & cell biology 41, 1556-1562 (2009).

21. Ugrinova, I., Pashev, I.G. & Pasheva, E.A. Cyclin-dependent kinase 5 phosphorylates mammalian HMGB1 protein

only if acetylated. Journal of biochemistry 149, 563-568 (2011).

22. Castillo, J., Lopez-Rodas, G. & Franco, L. Histone Post-Translational Modifications and Nucleosome Organisation

in Transcriptional Regulation: Some Open Questions. Advances in experimental medicine and biology 966, 65-92

(2017).

23. Clapier, C.R., Iwasa, J., Cairns, B.R. & Peterson, C.L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent

chromatin-remodelling complexes. Nature reviews. Molecular cell biology 18, 407-422 (2017).


11

24. Lai, W.K.M. & Pugh, B.F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene

expression and DNA replication. Nature reviews. Molecular cell biology 18, 548-562

(2017).

25. Scaffidi, P., Misteli, T. & Bianchi, M.E. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers

inflammation. Nature 418, 191-195 (2002).

26. Wu, T. et al. HMGB1 overexpression as a prognostic factor for survival in cancer: a meta-analysis and systematic

review. Oncotarget 7, 50417-50427 (2016).

27. Kang, R., Zhang, Q., Zeh, H.J., 3rd, Lotze, M.T. & Tang, D. HMGB1 in cancer: good, bad, or both? Clinical cancer

research : an official journal of the American Association for Cancer Research 19, 4046-4057 (2013).

28. Venereau, E. et al. HMGB1 as biomarker and drug target. Pharmacological research 111, 534-544 (2016).

Авторска справка на доцент Ива Угринова

1

АВТОРСКА СПРАВКА

Авторска справка наричам краткото обобщение на основните ми научни постижения,

описани в публикации, с които се представям за покриване на показателите от Група Г на

Приложение 1 от ППЗРАСРБ на ИМБ. Работите включени в тази група са в колаборация с други

лаборатории и в голямата си част са мултидисциплинарни изследвания.

1. НУКЛЕОЛИН (NCL)

Открит през 1973, нуклеолинът е един от най-разпространените ядърцеви фосфо-

протеини. Участието му в много клетъчни процеси е свързано със структурната му

организация и възможността да взаимодейства с много други протеини. Много от функциите

му са свързани с клетъчни процеси, въвлечени в онкогенезата. Например в рибозомалната

биогенеза, в поправката и ремоделирането на ДНК, в поддържане на геномната стабилност, в

клетъчното делене и оцеляване, в хемокиновите сигнални пътища, отговарящи на стимули

от страна на растежни фактори, в ангиогенезата и лимфангиогенезата, в епително-

мезенхимната транзиция и във функциите на стволовите клетки.

Моята работа по нуклеолина е свързана с една дългогодишна и много плодотворна

колаборация с групата на професор Philippe Bouvet (при когото проведох две пост-докторски

квалификации, три пъти бях гостуващ учен и успешно приключихме два съвместни проекта

по ЕБР и по програма „Рила“ на ФНИ). Имаме доста съвместни работи, част от които

представям тук, в които сме описали откритите от нас нови важни свойства и функции на

нуклеолина.

Всичко започна, когато за първи път установихме, че заглушаването на NCL чрез РНК

интерференция води до намалена пролиферация и засилена апоптоза и, чe в клетки със

заглушен NCL се наблюдава необичайнa амплификация на центрозоми по време на митоза1.

Последваха множество интригуващи открития. Показахме, че нуклеолинът е локализиран в

зрели центриоли, където участва в нуклеацията на микротубулите и взаимодействa с нинеин

и γ-тубулин. Демонстрирахме, че NCL е преференциално свързан с неметилирани рРНК гени

и неговото заглушаване води до натрупването на РНК полимераза 1 в началото на

транскрипционните единици и до понижаване на UBF в кодиращите и промоторните

региони. С това показахме значението на NCL за поддържане на еухроматина и елонгация на

транскрипцията на рДНК. С интегриран транскриптомен анализ открихме нови, неочаквани


2

роли за нуклеолина в метаболитната регулация и сигнални

пътища, като показахме, че заглушаването на NCL води до по-

ниски нива на холестерол и увеличени нива на мастни киселини. Този подход прокара път

към по-добро разбиране за глобалната функция на нуклеолина в клетката. Съвсем наскоро

показахме, че ацетилираният нуклеолин се ко-локализира със сплайсинг фактора SC35 и още

по-интересно с P-SF3B1, който е маркер за ко-транскрипционно активни сплайсеозоми. С

други думи, ацетилираният нуклеолин е свързан с активния сплайсинг.

Най-новите резултати, свързани с различните функции на нуклеолина в онкогенезата, чрез

неговите взаимодействия с други протеини и ролята на белтъка в поправката на

двойноверижни скъсвания в ДНК, са обобщени в два излезли наскоро научни обзора.

3. Ugrinova, I., Chalabi-Dchar, M., Monier, K., & Bouvet, P. (2019). Nucleolin Interacts and Co-

Localizes with Components of Pre-Catalytic Spliceosome Complexes. Sci, 1(2), 33.

8. Gospodinov, A., & Ugrinova, I. (2018). Chromatin control in double strand break repair.

Advances in protein chemistry and structural biology (In press). Academic Press. IF 3.783 Q3 Q2

12. Ugrinova, I., Petrova, M., Chalabi-Dchar, M., & Bouvet, P. (2017). Multifaceted Nucleolin Protein

and Its Molecular Partners in Oncogenesis. Advances in protein chemistry and structural

biology (In press). Academic Press. IF 3.783 Q3 Q2

13. Kumar, S., Gomez, E. C., Chalabi-Dchar, M., Rong, C., Das, S., I., ... & Bouvet, P. (2017).

Integrated analysis of mRNA and miRNA expression in HeLa cells expressing low levels of

Nucleolin. Scientific reports, 7(1), 9017. IF 4.525 Q1 Q1

20. Gaume, X., Tassin, A. M., Ugrinova, I., Mongelard, F., Monier, K., & Bouvet, P. (2015).

Centrosomal nucleolin is required for microtubule network organization. Cell Cycle, 14(6), 902-

919. IF 3.527 Q3 Q1

31. Cong R, Das S, Ugrinova I, Kumar S, Mongelard F, Wong JM, Bouvet P, (2012). Interaction of

nucleolin with ribosomal RNA genes and its role in RNA polymerase I transcription. Nucleic

Acids Research 2012, 40(19):9441-9454. IF 10.727 Q1 Q1

2. СЪЕДИНЕНИЯ С ПОТЕНЦИАЛ ЗА ФАРМАКОЛОГИЧНО ПРИЛОЖЕНИЕ.

В сътрудничество с колектив от ИОХЦФ на БАН бяха изследвани производни на

фенхона и производни на уреа, тиоуреа и ацилтиоуреа с изразена анти-туберколозна


3

активност. Определена бе общата цитотоксичност на панел от

нормални и ракови клетъчни линии и бяха подбрани

съединения с висок селективен индекс. Със същия колектив спечелихме съвместен проект от

ФНИ, договор ДН11/16 2017 и тема: „Нови фероцен съдържащи камфор сулфонамиди -

антитуморна активност и механизъм на действие“.

Химиотерапевтици, съчетаващи няколко активни групи в една молекула, могат да

модулират различни регулаторни пътища в клетката и така да достигнат по-висока

ефикасност от лекарства, повлияващи само един клетъчен процес. За да се разработи,

подобри и оцени като потенциален фармакологичен продукт, дадено съединение трябва да

има ясен или поне частично изяснен механизъм на действие. В работата ни по

гореспоменатия проект, беше тествана преживяемостта на различни видове ракови и

нормални клетъчни линии при широк спектър на концентрации на камфор-сулфонамидните

производни. Избрахме съединения, които демонстрираха селективност към ракови клетъчни

линии и проведохме редица изследвания целящи да се идентифицират сигналните пътища,

които се задействат, за да се намерят конкретни молекулни партньори. Да се определи типа

клетъчна смърт – апоптоза, некроза, митотична катастрофа или афтофагия. Да се изследва

какви изменения настъпват в клетъчния цикъл, дали се наблюдава задържане в дадена фаза.

Изследванията продължават в няколко посоки подобряване на разтворимостта на

селектирани камфор-сулфонамидни производни, включване на активни, но слабо

разтворими компоненти в полимерни носители, както и навлизане в по-финните механизми

на действие на активните компоненти.

До този момент резултатите от това сътрудничество са отразени в следните

публикации:

4. Schröder, M., Yusein-Myashkova, S., Petrova, M., Dobrikov, G., Kamenova-Nacheva, M., Todorova,

J., ... & Ugrinova, I. (2019). The Effect of a Ferrocene Containing Camphor Sulfonamide DK-164 on

Breast Cancer Cell Lines. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. IF 2.418 Q3 Q3

16. Kamenova-Nacheva, M., Schröder, M., Pasheva, E., Slavchev, I., Dimitrov, V., Momekov, G.,

Ugrinova, I. & Dobrikov, G. M. (2017). Synthesis of ferrocenylmethylidene and arylidene substituted

camphane based compounds as potential anticancer agents. New Journal of Chemistry, 41(17),

9103-9112. IF 3.069 Q2 Q1


4

21. Dobrikov GM VV, Nikolova Y, Ugrinova I, Pasheva E, Dimitrov V,

(2014). Enantiopure antituberculosis candidates synthesized from (-)-

fenchone. Eur J Med Chem, 77:243-247 IF 4.666 Q1 Q1

22. Slavchev, I., Dobrikov, G. M., Valcheva, V., Ugrinova, I., Pasheva, E., & Dimitrov, V. (2014).

Antimycobacterial activity generated by the amide coupling of (−)-fenchone derived aminoalcohol

with cinnamic acids and analogues. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 24(21), 5030-5033. IF

2.359 Q2 Q1

29. Dobrikov GM, Valcheva V, Nikolova Y, Ugrinova I, Pasheva E, Dimitrov V, (2013). Efficient synthesis

of new (R)-2-amino-1-butanol derived ureas, thioureas and acylthioureas and in vitro evaluation of

their antimycobacterial activity. European Journal of Medicinal Chemistry, 63:468-473. IF 4.666 Q1

Q1

3. СРЕЩИ НА МОЛЕКУЛЯРНАТА БИОЛОГИЯ С ПОЛИМЕРНАТА НАУКА.

Полимерната наука е една от най-бързо развиващите се. На полимерите се разчита за

разработването на все по-нови системи и технологии с най-различни приложения. В бъдеще,

лекарство-доставящи системи на основата на полимери ще играят все по-съществена роля

при лекуването на тежки заболявания. Полимерни носители ще предоставят възможност за

по-безопасна генна терапия в сравнение с вирусните вектори. Запленена от тези невероятни

нови възможности, започнах и постепенно развих редица колаборации с колеги от Иститут

по полимери на БАН, ФФ на МУ и ХТМУ.

Съществува теория, че ракът е болест на митохондриите. Незная дали теорията е

вярна, но определено прицелването в митохондриите на туморните клетки е перспективна

стратегия за високо ефективна противоракова терапия и е важна област от наномедицината.

Разработихме функционално смесена мицеларна система , базирана на два взаимосвързани

триблокови кополимера, която спомага доставянето на куркумин до минтохондриите.

Демонстрирахме високата проапоптотична активност на системата, суб-клетъчните

механизми на цитотоксичност и показахме успешната локализация на наноносителите в

митохондриите чрез флуоресцентна микроскопия, като за маркер на клетъчна локализация

използвахме DAPI (4’ 6-диамино-2-фенилиндол) и специфичен митохондриален маркер -

Mito-tracker.


5

Разработен е и многофункционален триблоков

кополимер, предназначен за целево доставяне на лекарства.

Мицелите, образувани от триблоковия съполимер във водна среда, притежават ключови

функции (разцепващ се „скрит“ щит, целеви групи), необходими за безопасен извънклетъчен

транспорт, успешна клетъчна интернализация и доставка на лекарства до целевите клетъчни

органели. И тук многофункционалните наноносители бяха заредени с куркумин, а in vitro

анализите разкриха много по-изразени цитотоксични, апоптогенни и NF-kB-инхибиторни

ефекти върху третирани клетки в сравнение със свободното лекарство и

нефункционализирани полимерни мицели. Освен това, доказахме и подобрената клетъчна

интернализация и митохондриалното натрупване на многофункционалните наноносители в

сравнение с техните нефункционализирани аналози. Получените резултати показват, че

представените мултифункционални мицели имат потенциал за приложение в наномедицина

за доставяне на специфични за даден органел лекарства.

Друга група колеги разработиха нов метод за приготвянето на поли(оксиетилен

фосфорамидат) и гликополимери, получава се биоразградим и биосъвместим нискотоксичен

полимер. Идеята е този полимер да служи за доставка на Конкавалин А. Изследвахме

цитотоксичността на свободен и натоварен с Конкавалин А полимер и установихме, че

жизнеспособността на човешката ембрионална бъбречна клетъчна линия HEK293 е само леко

повлияна след третиране с фосфорамидатния глюкоконюгат в широк концентрационен

диапазон. Получените резултати са обнадеждаващи за бъдещи изследвания над свойствата

клъстъриране и биоразпознаване на синтезираните гликополимери.

Изследвахме и иновативна система, създадена като високо водоразтворими

флуоресцентни мицели съдържащи FRET системата (RNI), които се включват към блок от

ясно дефинирани амфифилични диблок кополимери. Тази система може да служи като

високо сензитивна pH сонда във вода. Показахме, че мицелите навлизат успешно в HeLa и

НЕК клетки и проявяват клетъчна специфичност и значителна фотостабилност в сравнение

с контролната боя BODIPY. Ценните качества на тези новосинтезирани флуоресцентни

мицели показват висок потенциал за бъдещи биологични и биомедицински приложения.

Работата ми с различни лаборатории на Института по полимери продължава.

До този момент резултатите от това сътрудничество са отразени в следните

публикации:


6

4. Babikova, D., Kalinova, R., Momekova, D. B., Ugrinova, I.,

Momekov, G. T., & Dimitrov, I. V. (2019). Multifunctional polymer

nanocarrier for efficient targeted cellular and subcellular anticancer drug delivery. ACS

Biomaterials Science & Engineering. IF 4.513 Q2 Q1

10. Denitsa Momekova, Iva Ugrinova, Marta Slavkova, Georgi Momekov, Georgy Grancharov, Valeria

Gancheva, Petar Petrov (2018). Superior proapoptotic activity of curcumin-loaded mixed block

copolymer micelles with mitochondrial targeting properties. Biomaterials Science. IF 5.251 Q1 Q1

14. Todorova, Z., Koseva, N., Ugrinova, I., & Troev, K. (2017). Synthesis of poly (oxyethylene

phosphoramidate) s and glycopolymers via Staudinger reaction: Multivalent binding studies with

Concanavalin A. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 55(10), 1730-1741. IF 2.304

Q2 Q1

28. Georgiev NI, Bryaskova R, Tzoneva R, Ugrinova I, Detrembleur C, Miloshev S, Asiri AM, Qusti AH,

Bojinov VB, (2013). A novel pH sensitive water soluble fluorescent nanomicellar sensor for

potential biomedical applications. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 21(21):6292-6302. IF 2.903

Q2 Q1

Documents

HIGH-MOBILITY GROUP BOX 1 PROTEIN (HMGB1). 1. of scientific papers IU.pdf · 2.3. HMGB1 и поправка на ДНК, увредена от антитуморният агент