HIV pozitif hastalarda proteaz, revers transkriptaz ve integraz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençlerinin

Yeni Nesil Dizileme (YND-NGS) ile araştırılması

Duygu Tekin1, Rüçhan Sertöz1, Deniz Gökengin2, Selda Erensoy1

KLİMUD 2017 KONGRESİ SÖZLÜ SUNUM

1Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Tıbbı Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı,

İzmir2Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Ana Bilim

Dalı,İzmir

HIV Taksonomi ve ReplikasyonDöngüsü

• Aile• Retroviridae

• Alt aile• Lentivirinae

• Tipler • HIV-1 • HIV-2

• Gruplar• HIV-1 grup M,N,O,P

• Subtipler• A-K/CRF

• Subsubtipler• A1/A2 ve F1/F2

Ölümcül hastalık

Kronik hastalık

HAARTHighly Active Anti-Retroviral Therapy

Antiretroviral Tedavi

Hastaneye yatış ve ölüm

• %60-80 azalma

Hammer SM, Squires KH, Hughes MD, et al. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human

immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less. N. Engl. J. Med. 1997; 337(11): 725-33.

Antiretroviral Tedavi

HAART

Temel Prensip

2 NRTI + NNRTI 2 NRTI + PI 2 NRTI+ INSTI

Antiretroviral İlaç Direnci

En büyük engel –

antiretroviral ilaç direnci

İlaç direnç testleri !!!

Antiretroviral İlaç Direnci

•Direnç tanı testleri•Fenotipik yöntemler •Genotipik yöntemler•HIV-1’in genetik çeşitliliği !!!

•İlaç dirençli minör varyantlar antiretroviraltedavi etkinliğini

Evaluation of GS Junior and MiSeq next-generation sequencing technologies as an alternative to Trugene population sequencing in the clinical HIV laboratory. Ram D ve ark. J Virol Methods. 2015 Feb;212:12-6.

Antiretroviral İlaç Direnci

SANGER ZİNCİR SONLANDIRMA REAKSİYONU

• Altın standart

• >%20 viral popülasyondaki mevcut mutasyonlar

• Ticari kitler - Proteaz ve Revers transkriptaz

Antiretroviral İlaç Direnci

YENİ NESİL DİZİLEME

• %0,1 – %1 sıklığındaki varyantlar

• < %1 Klinik anlamlılık???

Multi-step inhibition against HIV lifecycle-underlying the "magic" of protease inhibitors. Poveda E. AIDS Rev. 2014 Jan-Mar;16(1):52.

GEREÇ VE YÖNTEM

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi • Etik kurul

• Onay tarihi: 15.02.2017 ve Onay numarası:17-2/15

• Bilimsel Araştırma Projesi• Onay tarihi:29.06.2017 Proje no:17-TIP-020

• Tez Danışmanı• Prof.Dr.Rüçhan sertöz

• Araştırmacılar• Prof.Dr.Selda Erensoy, Prof.Dr.Deniz Gökengin

• Teknisyen:Ergül Utkun

GEREÇ VE YÖNTEM

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbı Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Moleküler Viroloji Laboratuvarı

Sanger zincir sonlandırma temelliViroSeq

(Abbott/CeleraDiagnostics, ABD)

PROTEAZ RT

GEREÇ VE YÖNTEM

İlaç direnç mutasyonları ve genotipStanford Üniversitesi HIV-1 ilaç Direnci Veri

(http://hivdb.stanford.edu/)

GEREÇ VE YÖNTEMMiSeq (Illumina, ABD) SistemiFlow cell

GEREÇ VE YÖNTEMMiSeq (Illumina, ABD) Sistemi

GEREÇ VE YÖNTEMMiSeq (Illumina, ABD) Sistemi

BULGULAR

40 HIV-1 pozitif hasta (23.11.2016 - 8.07.2017)1 Kadın, 39 ErkekYaş aralığı: 21-82 yaş, ortanca yaş: 36 yaş,Naiv: 38, tedavi durumu bilinmeyen: 1, ART alan:1Ortalama HIV-RNA düzeyi 5.05 (aralık:4.09-6.34)

log10 kopya/ml

BULGULAR

• YND ile 2892 bç

• RT (1-560 kodon)• Proteaz (1-99 kodon) • İntegraz (1-288 kodon) gen bölge mutasyonları

• Veri analizi CLC Genomics Workbench versiyon 8.1• %1 ve %5 cut off

• Ortalama okuma sayısı 143.485

BULGULAR

Alttip B67%

B+CRF02_AG; 6; 15%

Alttip A; 3; 7%

G+J; 2; 5%CRF07_BC; 1; 3%

B+F; 1; 3%

Alttip B B+CRF02_AG Alttip A G+J CRF07_BC B+F

ALTTİP DAĞILIM ORANLARI

BULGULAR

Direnç mutasyonu oranı - %17,5

• NRTI- %5

• NNRTI -%12,5

• PI ve INSTI direnç mutasyonu ise saptanmadı

Tablo.1. YND Dizileme İlaç Direnç ve Genotip Sonuçları

BULGULAR

Tablo.2. YND Dizileme İlaç Direnç ve Genotip Sonuçları

BULGULAR

• 18 (%42,5) örnekte yardımcı mutasyonlar saptanmıştır;

• PI %20 (8/40),

• NNRTI-NRTI %27,5 (11/40)

• INSTI %5 (2/40)

Yardımcı Mutasyonlar Hasta Sayısı Direnç Etki Durumu

K20R

A71V/T

L10I/V

4 (%10)

1 (%2,5)

5 (%12,5)

PI polimorfik mutasyon

V179I 1 (%2,5)

Etravirin ve Rilpivirin baskısı altında

sık görülen NNRTI polimorfik

mutasyondur

S68G 6 (%15)K65R mutasyonu ile birlikteliği NNRTI

duyarlılığında azamaya neden olur

K20I 4 (%10)

Alttip G ve CRF02_AG dışındaki

alttiplerde NFV duyarlılığında azalmaya

neden olur

L74I/M 3(%7,5)RAL ve EVG tedavisi altında sık görülen

INSTI Polimorfik mutasyonudur

V118I 4 (%10)TAM ile birlikte NRTI’lara karşı

duyarlılığın azalmasına katkıda bulunur

Tablo.3.Yardımcı mutasyonlar ve Direnç Etki Durumu

BULGULAR

BULGULAR

YENİ NESİL DİZİLEME

• Majör ve yardımcı direnç mutasyonları açısından Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ile %100 uyum

• On örneğin RT bölgesinde

• 12 ekstra varyant kodon

• Beş örneğin proteaz bölgesinde

• 10 ekstra varyant kodon

BULGULAR

YENİ NESİL DİZİLEME

109 TL

SUT KOD

1480 TL

VİROSEQ

(ABBOTT, ABD)

1144 TL

SONUÇLAR

YENİ NESİL DİZİLEME

•RT, proteaz, İntegraz gen bölgesi

•Multipleks kullanım

•Maliyet düşüklüğü

•Duyarlılık yüksek

TEŞEKKÜR EDERİM