BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HOÀNG THỊ BÍCH

Nghiªn cøu sö dông kÕt hîp enzyme trong chiÕt t¸ch

vµ lµm giµu mét sè s¶n phÈm nguån gèc thiªn nhiªn

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất tự nhiên

Mã số: 62.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

HÀ NỘI - 2017

Công trình được hoàn thành tại

Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Lê Mai Hương

2. PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến

Phản biện 1: ................................................................

...............................................................

Phản biện 2:.................................................................

................................................................

Phản biện 3:.................................................................

................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ

cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Vào hồi...... giờ.....’, ngày..... tháng..... năm 201.....

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe người tiêu dùng đã

dẫn đến nhu cầu cấp thiết là tìm ra các phương pháp thu nhận các sản

phẩm có nguồn gốc thiên nhiên theo hướng “Xanh” nhằm tăng năng

suất, giảm thời gian, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu và giảm ô

nhiễm môi trường.

Nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam vô cùng phong

phú với hệ thực vật đặc trưng và nguồn sinh vật biển đa dạng, trong

đó phải kể đến cây Quế (nguồn dược liệu) và cá ngừ (nguồn lợi thủy

sản) là những mặt hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng và giá trị

xuất khẩu đầy tiềm năng. Sản phẩm dầu từ quế và cá ngừ ngày càng

được chú trọng bởi chúng có giá trị cao. Tuy nhiên trong công

nghiệp, quá trình sản xuất hai loại dầu này vẫn sử dụng các phương

pháp truyền thống (cất cuốn hơi nước, ép nhiệt) chưa phát huy được

hết hiệu quả chiết xuất, gây lãng phí nguồn nguyên liệu.

Ngày nay, những tiến bộ trong công nghệ sinh học, công nghệ

enzyme có khả năng sản xuất một lượng lớn enzyme có hoạt lực cao,

phổ cơ chất rộng... thì công nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ

quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên (enzyme assisted

extract- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay thế dung môi hữu cơ là vấn

đề cấp thiết. Nhằm mục đích phát triển hướng nghiên cứu mới- phân

lập và làm giàu các HCTN bằng enzyme hỗ trợ, chúng tôi lựa chọn

đề tài luận án:

“Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme trong chiết tách và

làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên”.

2

Mục đích

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme vào quá trình chiết

xuất và làm giàu các sản phẩm tinh dầu (từ lá và cành quế, vỏ quế

Cinnamomum cassia) và các axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá

ngừ nhằm làm tăng hiệu quả và phát triển hướng nghiên cứu

“XANH” trong khai thác các SPTN.

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh

dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia: tác

động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme được đánh giá qua hiệu

suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản phẩm tinh dầu (thành phần

hóa học, hoạt tính sinh học).

- Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-

Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu

Aquilaria crassna

- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid

và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus

albarcares: tác động của enzyme lên quá trình được đánh giá qua

thành phần axit béo n-3 PUFA

Những đóng góp mới của luận án

Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ enzyme hỗ trợ quá trình

chưng cất tinh dầu từ cảnh lá quế, vỏ quế C. cassia và gỗ gió bầu A.

crassna. Sự kết hợp enzyme laccase từ G. lucidum và enzyme Cellic

Htec2 cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn khi sử dụng riêng rẽ. Kết

quả đã làm gia tăng hiệu suất, nâng cao chất lượng tinh dầu, giảm

thời gian chưng cất.

Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ hỗ trợ quá trình phân lập

dầu và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ bằng

3

hệ enzyme kép Bromelain và Lipase CRL. Kết quả phân lập cho hiệu

suất 70% so với phương án dung môi song quá trình đã tạo ra sản

phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng

thời giảm thiểu dung môi hóa chất và ô nhiễm môi trường.

Bố cục của luận văn:

Luận án gồm có 153 trang (không kể phụ lục), gồm 55 hình,

32 bảng.

Nội dung chính của luận án được trình bày gồm 4 chương

chính (ngoài Mở đầu-2 trang, kết luận- 2 trang và kiến nghị-1 trang);

các chương chính bao gồm: Tổng quan tài liệu -38 trang, Nguyên vật

liệu và phương pháp nghiên cứu -11 trang, Thực nghiệm -11 trang và

Kết quả và thảo luận -63 trang.

PHẦN 1 - TỔNG QUAN

Trong phần này, đã tổng hợp tài liệu, chia làm 5 mục.

1.1. Tổng quan giới thiệu về ứng dụng công nghệ enzyme -

giải pháp “hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các hợp chất

thiên nhiên

1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ EAE để trích ly dầu

và làm giàu các axit béo n-3 PUFA

1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong

chiết xuất và làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước.

1.4. Giới thiệu về nguyên liệu sản xuất tinh dầu quế

1.5. Giới thiệu về nguyên liệu phụ phẩm cá ngừ sản xuất n-3

PUFA

4

PHẦN 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

- Cành lá quế, vỏ quế Cinnamomum cassiathu tại xã Tân

Đồng, huyện Trấn Yên, tỉnh Yên Bái.

- Phụ phẩm đầu cá ngừ:08 mẫu đầu cá ngừ (đã bỏ mắt và

mang) của 08 loài cá ngừ thu tại Nha Trang- Khánh Hòa và Tuy Hòa-

Phú Yên

- Enzyme sử dụng trong nghiên cứu

+ Enzyme Cellic Htec2 (Novozyme-Đan Mạch) là hỗn hợp đa

enzyme bao gồm cellulase và xylanase.

+ Enzyme laccase là enzyme thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm

Ganoderma lucidum (được cung cấp bởi Viện Di truyền nông nghiệp).

+ Nhóm enzyme protease từ vi sinh vật sử dụng hai enzyme

Protamex và Alcalase (Novozyme- Đan Mạch).

+ Nhóm enzyme Protease từ thực vật sử dụng hai enzyme

Bromelain và Papain, là enzyme trong nước, cung cấp bởi công ty

Biogreen.

+ Enzyme Lipase CRL (Novozyme- Đan Mạch) được sản xuất

từ quá trình lên men của nấm men Candida rugosa.

2.3. Phương pháp nghiên cứu: trong phần này NCS trình

bày các phương pháp xác định

- Các phương pháp phân tích hóa sinh

+ Nguyên liệu thực vật: phân tích hàm ẩm, cellulose,

hemicellulose, lignin, hàm lượng tinh dầu,...

+ Nguyên liệu sinh vật biển: xác định hàm lượng nước, hàm

lượng protein, hàm lượng tro, hàm lượng lipid, chỉ số axit, chỉ số xà

phòng hóa,...

5

- Phương pháp phân tích thành phần hợp chất bằng GC-MS.

+ Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng tinh dầu.

+ Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng axit béo.

- Phương pháp xác định sản phẩm quá trình thủy phân

+ Phương pháp định lượng đường khử bằng DNS (Miler, 1959).

+ Phương pháp định lượng protein- axitamin (Bradford, 1976).

- Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

+ Xác định hoạt độ enzyme Cellulase (Wood, 1987).

+ Xác định hoạt độ enzyme Xylanse (Bailey, 1992).

+ Xác định hoạt độ enzyme Laccase (Dinh, 2012).

- Các phương pháp thủy phân

+ Phương pháp thủy phân với dung môi là nước (áp dụng cho

enzyme cellulase, hemicellulase, protease...).

+ Phương pháp thủy phân trong hệ dung môi hai pha (áp dụng

cho enzyme lipase) theo (Fernádez Lorente G. và cs.;2011).

- Phương pháp xác định điều kiện tối ưu cho quá trình

thủy phân

+ Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân.

+ Xử lý số liệu thực nghiệm bằng phương pháp bình phương

tối thiểu.

+ Tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng bằng phương pháp qui

hoạch hóa thực nghiệm.

- Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học

+ Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định

(Vander Bergher & Vlietlinck, 1991).

+ Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào

(cytotoxicity) (Likhitayawuid, 1991) đang triển khai tại Viện nghiên

cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI).

6

+ Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm: thông qua khả

năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 (Lee et

al., (2009)).

+ Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóatrên hệ DPPH

theo phương pháp P. Yuvaraj et al., (2013).

PHẦN 3 - THỰC NGHIỆM

3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất

tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia

3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió

bầu Aquilaria crassna

3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất

lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng

Thunnus albarcares

PHẦN 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong

chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế

Cinnamomum cassia

4.1.1. Kết quả phân tích chất nền và tinh dầu cành lá, vỏ

quế C. cassia

Hàm lượng các chất nền của cành lá và vỏ quế C. cassia

Kết quả phân tích cho thấy mẫu cành, lá và mẫu vỏ quế mang

đặc trưng của nhóm cây thân gỗ với thành phần chủ yếu là

lignocellulose, chiếm hơn 60% khối lượng nguyên liệu. Hàm lượng

các thành phần cấu trúc gồm cellulose, hemicellulose và lignin xác

định được ở mẫu cành, lá có các giá trị tương ứng là 24,74%; 25,50%

và 16,28%; ở mẫu vỏ quế là 20,36%, 14,02% và 25,78%.

7

Hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu từ cành lá, vỏ

quế C. cassia

Hàm lượng tinh dầu cành lá quế, vỏ quế thu được bằng chưng

cất hơi nước tương ứn là 0,69 ± 0,02%, 2,87 ± 0,04% tinh dầu (tính

theo nguyên liệu khô gió).

Thành phần hóa học của tinh dầu cành lá quế và vỏ quế xác

định bằng GC-MS chỉ ra ở Bảng 4.2:

Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu cành lá

và tinh dầu vỏ quế C. cassia

Chất % trong

TD cành, lá

% trong

TD vỏ

Nhóm các hidrocarbon 3,87 38,26

Nhóm các HC chứa oxy 95,54 60,85

Tổng Phenylpropannoid 88,73 58,83

trans- Cinnamaldehyde 67,74 53,99

Tổng Sesquiterpenoid 2,42 40,38

Sesquiterpen hidrocarbon 1,99 35,87

Sesquiterpen chứa oxy 0,43 4,51

Một số thành phần trong tinh dầu quế C. cassia thu thập ở Văn

Yên, Yên Bái (hình 4.1a và 4.1b).

Benzenepropanal

(C9H10O)

trans-Cinnamaldehyde

(C9H8O)

cis-Cinnamaldehyde

(C9H8O)

Cinnamyl alcohol

(C9H10O)

Coumarin

(C9H6O2)

o-Methoxy

cinamaldehyde

Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid

8

Copaene

(C15H24)

Muurolene

(C15H24)

Calamenene

(C15H22)

Cadinene

(C15H24)

Caryophyllene oxide

( C15H24O)

Bisabolol

(C15H26O)

Bisabolene

( C15H24)

Nerolidol

(C15H26O)

Hình 4.1b. Một số thành phần sesquiterpen và sesquiterpenoid

Kết quả GC- MS phân tích thành phần hóa học của tinh dầu

cành lá quế và vỏ quế C. cassia cho thấy:

- Khoảng 28 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu cành lá quế C.

cassia, trong đó trans-cinnamaldehyde là hợp chất chính (69,74%), theo

sau là Cinnamyl acetate (17,2%), Benzofuran (5,9%), Benzaldehyde

(1,62%), Benzenepropanal (1,59%). Ngoài ra, một số các thành phần

khác cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1,00%.

- Khoảng 38 hợp chất được phát hiện trong tinh dầu vỏ quế C.

cassia, trong đó trans- cinnamaldehyde là hợp chất chính (53,99%),

theo sau là Copaene (13,86%), Cadinene (7,69%), Benzenpropanal

(2,39%). Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định

với hàm lượng nhỏ hơn 1,00%.

- Phenylpropanoid là nhóm hợp chất chủ yếu trong tinh dầu

cành lá quế và vỏ quế C. cassia thu từ Văn Yên, Yên Bái, trong đó

trans-cinnamaldehyde là thành phần chính. Tổng của các hợp chất

hydrocarbon, của các hợp chất chứa oxy, của các phenylpropanoid và

của các sesquiterpenoid có sự khác nhau rõ rệt giữa nguyên liệu cành

lá quế và vỏ quế.

9

4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên

quá trình chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất

thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của cành lá quế

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân và

tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành lá quế

Sự gia tăng của hiệu suất tinh dầu có tương quan tỉ lệ thuận với

sự gia tăng của hàm lượng đường khử (0-78,14 μg/ml) trong dung

dịch phản ứng cũng như sự giảm thiểu của hàm lượng lignin trong

nguyên liệu (17,43-13,01%).Kết quả cũng chỉ ra hệ enzyme Laccase

thô và Htec2 cho hiệu quả cao hơn khi sử dụng riêng rẽ từng enzyme

lên cành lá quế.

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian

chưng cất tinh dầu cành lá quế

Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu lá quế

10

Quá trình xử lý cành lá quế bằng hỗn hợp enzyme Laccase và

Htec2 đã làm giảm đáng kể thời gian cất tinh dầu so với đối chứng

không sử dụng enzyme. Tại các thời điểm khác nhau của quá trình

chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh dầu thu từ mẫu cành lá quế xử lý

bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme. Tinh dầu cất

bằng EAD, sau 2 h đầu đã thu được hơn 50% lượng tinh dầu, sau 5 h

lượng tinh dầu đạt đến cực đại (0,98%). Trong khi đó, đối với

phương pháp không sử dụng enzyme sau 2h đầu mẫu đối chứng chỉ

đạt 9 - 10%, sau 6 h lượng tinh dầu mới đạt đến cực đại (0,69%).

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thành

phần hóa học của tinh dầu cành lá quế

Thành phần hóa học tinh dầu cành lá quế C. cassia được phân

tích bằng GC-MS, được tổng hợp ở bảng 4.5

Bảng 4.5. Thành phần hóa học của các tinh dầu cành lá quế thu nhận

từ phương pháp enzyme kết hợp

Chất Không

enzyme Laccase Htec2

Laccase

+Htec2

Nhóm hidrocarbon 3,58 5,13 1,75 4,04

Nhóm HC chứa oxy 95,54 94,17 97,39 94,85

Nhóm Phenylpropanoid 88,73 88,38 94,03 91,25

trans-cinnamaldehyde 69,74 68,96 70,54 85,60

Nhóm Sesquiterpenoid 2,42 3,83 0,83 3,9

Sesquiterpen hidrocarbon 1,99 3,36 0,61 3,26

Sesquiterpen chứa oxy 0,43 0,47 0,22 0,64

11

So sánh kết quả phân tích GC-MS của cả 4 phương án xử lý

cho thấy, quá trình tiền xử lý cành lá quế bằng enzyme đã không làm

thay đổi bản chất của tinh dầu vỏ quế, các mẫu tinh dầu đều có thành

phần chính là cinnamaldehyde và có cùng số lượng các thành phần

quan trọng khác.

Nhóm phenylpropanoid (C6- C3) vẫn là nhóm chất chính trong

cả 4 phương án xử lý, trong đó trans-cinnamaldehyde là thành phần

chính có hàm lượng đạt từ 68,49% đến 86,83%.

Tinh dầu thu được bằng cách xử lý nguyên liệu với các

enzyme Laccase và HTec2 riêng rẽ không gây ra biến động lớn về

thành phần hóa học, nhưng việc xử lý nguyên liệu với hệ enzyme kết

hợp Laccase-Htec2 đã làm thay đổi rõ rệt nhất thành phần % của một

số chất quan trọng trong tinh dầu. Cụ thể như sau:

- Làm giàu một số chất mong muốn trong tinh dầu quế C.

cassia như: hàm lượngcinnamaldehyde tăng từ 69,74% lên 85,60%,

o-methoxy-cinnamaldehyde từ 0% lên 0,23%.

- Làm giảm hàm lượng một số chất khác, đặc biệt cinnamyl

acetat giảm từ 17,2% xuống 1,34%, cinnamyl alcohol giảm từ 0,57%

xuống 0,29%. Sự tăng và giảm của cinnamaldehyde và cinnamyl

acetat có thể có mối liên hệ mật thiết với nhau.

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hoạt tính

sinh học của tinh dầu cành lá quế

- Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Mẫu tinh dầu có sử dụng enzyme hỗ trợ (Tinh dầu EAD)

không có sự sai khác về hoạt tính kháng khuẩn so với mẫu chiết

thông thường. Các mẫu tinh dầu quế đều không có hoạt tính kháng

P.aeruginosa và F. oxysporum., có hoạt tính kháng S. aureus với

12

MIC = 100 μg/ml, A. niger với MIC = 200 μg/ml trong khi E. coli, B.

subtilis, S. cerevisiae, C. albicans là MIC = 400 μg/ml. Trong số các

vi sinh vật kiểm định, tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối

với S. aureus với MIC 100 µg/ml.

- Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào

Hai mẫu tinh dầuđều có hoạt tính gây độc tế bào với nồng độ

thử nghiệm ban đầu (40 g/ml). Ở các nồng độ thử nghiệm tiếp theo,

tinh dầu HD biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào với 02 dòng tế bào

ung thư gan và ung thư biểu mô liên kết (Hep-G2 và RD) với giá trị

IC50 lần lượt là 29,25 và 6,01 g/ml, trong khi tinh dầu EAD biểu

hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng tế bào ung thư (Hep-G2,

LU-1 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 12,89, 25,95 và 2,34 g/ml.

Đặc biệt, EAD có hoạt tính khá mạnh trên dòng ung thư biểu mô phổi

với giá trị IC50 2,34(g/ml).

- Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm

Cả hai mẫu tinh dầu đều thể hiện hoạt tính ức chế đại thực bào

sản sinh NO ở các khoảng nồng độ từ 6,25 đến 100 μg/ml (P < 0.05

với LPS đối chứng âm), tinh dầu EAD có biểu hiện hoạt tính kháng

viêm mạnh hơn tinh dầu HD.

- Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa

Hai mẫu tinh dầu thử nghiệm chưa thể hiện khả năng trung hòa

gốc tự do của DPPH ở nồng độ nghiên cứu.

4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên

quá trình chưng cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất

thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của vỏ quế

13

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân và

tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế

Kết quả cho thấy mối tương quan rõ rệt giữa mức độ thủy phân

thành tế bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế C. cassia. Lần lượt từ

phương án 01 đến 04, hàm lượng đường khử gia tăng từ 0 lên đến

38,34 µg/ml, còn hàm lượng lignin giảm từ 25,78 xuống còn 20,34%.

Phương án 04, kết hợp 2 enzyme Laccase và Htec2 cho hiệu quả thủy

phân cao nhất với hàm lượng đường khử là 38,34 µg/ml và tỷ lệ gia

tăng hiệu suất tinh dầu đạt 14,57%.

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian

chưng cất tinh dầu vỏ quế

Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu vỏ quế

14

Cũng tương tự như cành lá quế, kết quả khảo sát trên vỏ quế

cho thấy hệ enzyme Laccase + Htec2 có vai trò tích cực trong việc

giảm thời gian chưng cất tinh dầu quế. Tại các thời điểm khác nhau

của quá trình chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh dầu thu từ mẫu vỏ

quế xử lý bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme. Sau

6h chưng cất, lượng tinh dầu đạt cực đại (3,28%) trong khi đó sau 8h

mẫu không xử lý enzyme mới đạt cực đại (2,87%).

Kết quả đánh giá tác động của các hệ enzyme lên thành phần

hóa học tinh dầu vỏ quế

Bảng 4.9. Thành phần hóa học của các tinh dầu vỏ quế thu được từ

các nguyên liệu được xử lý với các hệ enzyme khác nhau

Chất Không

enzyme Laccase Htec2

Laccase

+Htec2

Nhóm hidrocarbon 38,26 26,52 26,29 27,26

Nhóm HC chứa oxy 60,85 71,47 70,35 72,02

Tổng Phenyl propanoid 58,83 65,97 65,73 70,98

trans-cinnamaldehyde 53,99 59,22 58,36 67,6

Tổng sesquiterpen 39,29 30,98 29,85 27,44

Sesquiterpen hidrocarbon 35,87 24,64 24,28 25,08

Sesquiterpen chứa oxy 3,42 6,34 5,57 2,36

So sánh thành phần GC-MS của cả 4 phương án xử lý cho thấy

quá trình tiền xử lý vỏ quế bằng enzyme đã không làm thay đổi bản

chất của tinh dầu quế, các mẫu nghiên cứu đều có thành phần chính

là cinnamic aldehyde và có cùng số lượng các thành phần quan trọng

khác, ít có sự biến động về tỷ lệ nhóm các hidrocarbon và các hợp

chất chứa oxy, tỷ lệ phenylpropanoid và sesquiterpen. Đặc biệt, quá

trình (Laccase + Htec2)- EAD có sự gia tăng của hàm lượng chất

chínhcinnamic aldehyde tăng từ 54,63% % lên 68,37%.

15

4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng

hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ

cành lá quế

Qua phân tích các yếu tố ảnh hưởng, chọn 5 yếu tố ảnh hưởng

gồm: pH, nhiệt độ T, thời gian t, tỷ lệ enzyme laccase/cơ chất, tỷ lệ

enzyme Htec2/cơ chất. Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 để xử

lý số liệu ta nhận được kết quả phương trình hồi qui:

= 79,73 + 0,48 x1 + 0,56x2 + 1,66 x3 + 2,19 x4 + 0,44 x1x5 -

0,44 x2x3 - 0,44 x2x4 - 0,69 x3x4 - 1,98 x12 - 1,84 x2

2 - 1,83 x32 - 1,26

x42 -1,29 x5

2

Bằng phần mềm trên đã tiến hành xem xét mô tả ảnh hưởng

của từng cặp tương tác, đều được mô tả dạng paraboloid tức có điểm

cực trị.

Hình 4.9. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của từng cặp yếu tố

Như vậy, điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân cành lá quế

bằng hệ enzyme Laccase + Htec2 là pH 5,2, nhiệt độ 440C,

Laccases/S = 0,42ml/g, Htec2/S= 1,15%, thời gian 5h30 phút

Đề xuất quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

(hình 4.10)

16

Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây

gió bầu Aquilaria crassna

Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu

A. crassna

Kết quả xác định các thành phần kiến tạo nên khung cấu trúc

của gỗ gió bầu cho thấy gỗ gió bầu mang các đặc trưng của nguyên

liệu chứa lignocellulose bao gồm cellulose 34,75%, hemicellulose

15,27% và lignin 29,10%.

Cành lá quế

Tiền xử lý

H2O/24h

Laccase/S 0,42 ml/g, Htec2/S

1,15%, nhiệt độ 440C, pH 5.2,

thời gian 5h30’, tốc độ 200 rpm,

Thủy phân

Tinh dầu+ Nước

Ủ

Xay, nghiền

Chưng cất tinh dầu

Bã nguyên liệu

Phân bón

Na2SO4

Tinh dầu Cassia

17

Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên

hàm lượng và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu

Aquilaria crassna

Dựa trên các kết quả thu được khi nghiên cứu ứng dụng enzyme

trong chưng cất tinh dầu quế, chúng tôi đã chọn hệ enzyme Laccase-

Htec2 để áp dụng cho việc chưng cất tinh dầu trầm hương. Kết quả sau

3 ngày chưng cất, mẫu đối chứng (mẫu không có enzyme) cho 0,024%

tinh dầu (tính theo khối lượng mẫu khô gió), mẫu nghiên cứu (mẫu có

enzyme) cho 0,032% tinh dầu, tỷ lệ gia tăng tinh dầu

Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu được xác định

bằng phương pháp GC-MS. Một số thành phần đặc trưng của tinh

dầu trầm hương.

Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương

- Hàm lượng của các thành phần có giá trị, mang mùi trầm

hương đặc trưng (Hình 4.11b) cũng tăng lên rõ rệt, cụ thể cis-

dihydroagarofuran (0,11%, đối chứng 0%), α-agarofuran (0,17%, đối

chứng 0%), agarospirol (0,72%, đối chứng 0,23%), hinesol (0,56%,

đối chứng 0,16%), valerianol (2,59%, đối chứng 0,89%),

neopetasone (0,76%, đối chứng 0,11%), tổng các terpen hydrocarbon

(3,70%, đối chứng 0%), tổng các terpen chứa oxy (24,76%, đối

chứng 8,78%).

18

- Các axit béo và dẫn xuất của chúng là các thành phần không

mong muốn trong tinh dầu trầm hương. Trong mẫu nghiên cứu, hàm

lượng của chúng chỉ còn 22,89%, ít hơn hẳn so với đối chứng là 59,85%.

- Tổng số các chất chưa được xác định (unknown) trong kết

quả phân tích tinh dầu trầm hương là rất cao, vì thế cần có các nghiên

cứu hóa học tiếp theo để làm rõ.

4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong

chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ

vây vàng Thunnus albarcares

4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit

béo của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam

Kết quả nghiên cứu các chất nền

Hàm lượng protein của các mẫu đầu cá ngừ dao động trong

khoảng 17 - 20%, tương ứng với 40 - 50% protein tính theo lượng

chất khô. Hàm lượng lipid của các mẫu dao động trong khoảng 4,5 -

14,8%, cao nhất là nhóm cá ngừ đại dương có kích thước lớn (500 -

2.000 mm) như cá ngừ vây vàng (14,8%), cá ngừ mắt to (14,2%).

Kết quả phân tích thành phần axit béo

Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu

một số loài cá ngừ của Việt Nam

Axit béo

(% / lipid tổng) Ngừ ồ

Ngừ

chù

Ngừ

chấm

Ngừ

vằn

Ngừ

bò

Sọc

dưa

Vây

vàng

Mắt

to

Tổng SFA 33,44 39,59 39,04 33,76 35,45 38,59 22,74 37,43

Tổng MUFA 35,05 24,78 25,97 29,65 24,21 22,63 28,86 19,33

Tổng PUFA 31,49 35,63 34,77 36,34 39,94 38,28 48,36 40,5

n-3PUFA 25,35 26,86 24,28 29,4 32,89 30,18 37,82 34,84

EPA+DHA+DPA 25,35 26,55 24,28 28,27 31,79 29,83 39,15 34,84

Hệ số đánh giá* 114,08 136,99 133,54 217,30 343,98 263,12 559,74 494,73

Qua hệ số đánh giá cho thấy 03 loài cá ngừ có triển vọng trong

việc sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất dầu cá chất lượng cao giàu n-3

19

PUFA: cá ngừ bò, cángừ vây vàng và cá ngừ mắt to có hệ số đánh giá

cao tương ứng là 343,98;559,74và 494,73; trong đó cao nhất là cá ngừ

vây vàng Thunnus albarcares được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

4.3.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất

lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T. albarcares

Tác động của việc xử lý enzyme lên hiệu suất phân lập lipid và

mức độ thủy phân nguyên liệu

Bảng 4.14. Sản phẩm của quá trình phân lập lipid

Phương pháp Sản phẩm

Lipid (%) Protein hòa tan (%)

Ép nhiệt 3,22 ± 0,34 Dạng thô

Blight& Dyer 14,80 ± 0,28 Loại bỏ

Protamex 9,19 ± 0,14 3,71 ± 0,14

Alcalase 7,84 ± 0,33 3,63 ± 0,26

Bromelain 10,23 ± 0,42 4,12 ± 0,15

Papain 6,71 ± 0,43 3,14 ± 0,34

Kết quả đánh giá bằng phương pháp sử dụng enzyme trên

Bảng 4.14:

- So với phương pháp truyền thống (ép nhiệt), phương pháp

thủy phân bằng enzyme protease đã cải thiện đáng kể quá trình tách

dầu từ 3,22% lên 6,71 - 10,23% (tăng 2 - 3 lần), đồng thời thu được

sản phẩm protein hòa tan giàu axit amin tự do có giá trị dinh dưỡng

cao hơn khi sử dụng phương pháp ép nhiệt.

- So sánh với phương pháp sử dụng dung môi (phương pháp

Blight & Dyer), phương pháp thủy phân bằng enzyme protease có

hiệu suất phân lập khoảng 45-70%, phụ thuộc vào từng loại

enzyme. Tuy nhiên, phương pháp enzyme tận thu được triệt để

nguồn nguyên liệu protein có giá trị cao trong khi phương pháp sử

dụng dung môi hữu cơ, protein bị loại bỏ trong quá trình chiết lipid.

Đặc biệt, về mặt cảm quan, dầu cá thu được bằng phương pháp thủy

20

phân enzyme có màu sắc (màu vàng sáng) đẹp hơn so với phương

pháp chiết xuất bằng dung môi (màu vàng nâu) và không có dư

lượng dung môi hữu cơ.

- So sánh 4 loại enzyme protease sử dụng trong nghiên cứu,

enzyme Bromelain cho hiệu suất phân lập cao hơn các enzyme còn lại.

Thành phần axit béo của lipid tách từ đầu cá ngừ vây vàng

Thunnus albacare bằng các phương pháp

Thành phần axit béo của lipid tổng chiết bằng phương pháp

khác nhau được xác định bằng GC-MS (Bảng 4.15).

Bảng 4.15. Thành phần axit béo bằng các phương pháp khác nhau

Axit béo Ép

nhiệt B&D Protamex Alcalase Bromelain Papain

Tổng SFA 51,35 22,69 33,54 40,39 36,56 47,19

Tổng MUFA 35,84 28,96 33,01 26,48 21,77 21,93

Tổng PUFA 12,80 48,35 32,20 32,10 40,11 30,88

n-3PUFA 10,82 40,98 27,15 21,86 31,42 19,56

EPA+DHA+DPA 10,82 39,22 25,51 21,86 30,20 19,56

Hệ số đánh giá 24,06 606,5 247,61 137,06 294,72 105,23

Kết quả phân tích nêu trên Bảng 4.15 cho thấy:

So với phương pháp chiết xuất truyền thống (ép nhiệt), phương

pháp tách dầu bằng enzyme đã làm tăng chất lượng dầu khi cho tỷ lệ

các axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA cao hơn gấp 2 - 3 lần (đạt

20 - 30%), trong khi phương pháp ép nhiệt chỉ đạt 12,82%. Có thể

thấy rằng, các axit béo không no đa nối đôi rất nhạy cảm với nhiệt

độ. Phương pháp ép nhiệt diễn ra ở nhiệt độ cao (trên 1000C) đã làm

biến đổi chất lượng của lipid, các axit béo no (SFA) chiếm 51,35%,

trong khi phương pháp thủy phân thực hiện ở nhiệt độ 500C nên ít

ảnh hưởng đến chất lượng của dầu. So với 3 enzyme còn lại,

Bromelain cho hệ số đánh giá cao nhất và được lựa chọn cho các

nghiên cứu tiếp theo.

21

4.3.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL

trong quá trình làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá

ngừ vây vàng T. albacares bằng phương pháp ure

Khảo sát điều kiện thủy phân lipid thành các axit béo tự do

bằng enzyme lipase CRL

Dầu dầu cá ngừ trước kết tinh ure được thủy phân bằng enzyme

lipase CRL từ nấm men Candida rugosa trong hệ dung môi hai pha: n-

hexan và nước. Sau quá trình thủy phân ở 400C, pH 7,5, tỷ lệ

enzyme/cơ chất là 0,8% và thời gian thủy phân là 10 giờ, chỉ số axit đo

được là 149,8 mgKOH/g, tỷ lệ % axit béo đã bị thủy phân là

77,42%.Số liệu thực nghiệm được đánh giá dựa trên phương pháp bình

phương tối thiểu. Kết quả tính hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm.

Thành phần axit béo sau làm giàu bằng kết tinh ure

Hình 4.13. Sắc ký đồ các axit béo giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây

Phương pháp kết tinh bằng ure nhờ enzyme lipase hỗ trợ đã

làm giàu n-3 PUFA từ 31,13% lên 58,30% (Hình 4.13)

Thay vì sử dụng kiềm (NaOH) để thủy phân lipid tổng thành

các axit béo tự do trước khi kết tinh ure, quá trình thủy phân lipid

tổng bằng enzyme Lipase CRL có lợi thế hơn phương pháp hóa học

là nhiệt độ thủy phân thấp (40oC), tốn ít dung môi hóa chất và giảm

thiểu sự nguy hại đối với môi trường. Quá trình kết tinh bằng ure sau

22

khi thủy phân bằng lipase CRL đã làm giảm các axit béo no (SFA) từ

36,56% xuống 5,5% và làm giàu n-3 PUFA từ 31,13% lên 58,3%,

trong đó EPA từ 5,47 lên 8,59%, DHA từ 22,9 lên 46,70% và DPA từ

1,83 lên 2,68%.

Đề xuất qui trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết

xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T. albacares

Hình 4.14. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong

chiết xuất lipid và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng

23

KẾT LUẬN

Trong luận án này, một số enzyme đã được nghiên cứu ứng

dụng nhằm hỗ trợ cho quá trình chiết xuất tinh dầu từ cành lá, từ vỏ

quế Cinnamomum cassia và từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna cũng

như quá trình chiết xuất dầu béo và làm giàu các axit n-3 PUFA từ

đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares. Các nội dung nghiên cứu và

kết quả thu được cụ thể như sau:

1. Luận án đã thành công khi sử dụng hệ enzyme Laccase-Htec2

để xử lý các nguyên liệu cành lá và vỏ quế trước khi chưng cất cho

hiệu suất thu hồi tinh dầu tăng lên rõ rệt, tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành lá

quế đạt 41,7%, vỏ quế đạt 14,57%, thời gian chưng cất tinh dầu được

rút ngắn. Đặc biệt, quá trình xử lý bằng hệ enzyme Laccase-Htec2 đã

làm gia tăng hàm lượng chất chính cinnamaldehyde trong tinh dầu

cành lá quế từ 69,74% lên 85,60%, tinh dầu vỏ quế từ 54,63% lên

68,37% và không làm thay đổi một số hoạt tính sinh học của tinh dầu

cành lá quế C. cassia so với đối chứng.

2. Luận án đã sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm để

tính toán điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân cành lá quế trước

khi chưng cất ở pH 5,2, nhiệt độ 44oC, tỷ lệ Laccase/cơ chất 0,42

ml/g, tỷ lệ Htec2/cơ chất 1,15%, thời gian thủy phân 5 giờ 30 phút.

Trên cơ sở các kết quả thu được, một qui trình công nghệ chưng cất

tinh dầu cành lá quế có enzyme hỗ trợ đã được đề xuất.

3. Luận án đã thử nghiệm thăm dò ứng dụng của hệ enzyme

Laccase-Htec2 hỗ trợ quá trình chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ

cây gió bầu Aquilaria crassna cho tỷ lệ gia tăng tinh dầu là 33,33%,

các thành phần có giá trị của tinh dầu (cis-dihydroagarofuran, α-

agarofuran, agarospirol, hinesol, và neopetasone) tăng lên, các thành

phần axit béo gây cản trở giảm đi rõ rệt.

4. Luận án đã thành công khi chiết xuất lipid và làm giàu n-3

PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares bằng hệ enzyme

kép Bromelain và Lipase CRL. Qui trình chiết xuất lipid bằng enzyme

24

Bromelain cho hiệu suất chiết xuất lipid 69%, hàm lượng n-3 PUFA

31,42%. Qui trình làm giàu n-3 PUFA bằng enzyme Lipase CRL kết

hợp kết tinh ure đã tăng hàm lượng n-3 PUFA từ 31,42% lên 65,08%.

Từ đó, cho phép đề xuất một qui trình công nghệ ứng dụng kết hợp hai

enzyme Bromelain và Lipase CRL trong việc chiết xuất lipid và làm

giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng. Ngoài dầu cá giàu axit béo n-

3 PUFA đạt chất lượng thương phẩm, qui trình này còn cho các sản

phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng thời

giảm thiểu dung môi hóa chất và ô nhiễm môi trường.

5. Các kết quả nghiên cứu nêu trên là các nghiên cứu ứng dụng

enzyme đầu tiên ở Việt Nam trong việc chiết xuất tinh dầu từ cành lá,

vỏ quế C. cassia và từ gỗ gió bầu A. crassna. Qui trình ứng dụng

Bromelain trong việc chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T.

albarcares đã được đăng ký giải pháp hữu ích.

KIẾN NGHỊ

1. Quy trình chưng cất tinh dầu có enzyme hỗ trợ mới chỉ dừng

lại ở qui mô thí nghiệm. Cần thử nghiệm ở qui mô sản xuất tại địa

phương nhằm ổn định công nghệ và chất lượng sản phẩm, đồng thời

đánh giá chi phí tiêu hao năng lượng lẫn giá thành nhằm nâng cao

tính ứng dụng khi áp dụng vào thực tiễn sản xuất.

2. Do nhu cầu cấp bách của thực tiễn sản xuất, phương pháp

xử lý gỗ gió bầu trước khi chưng cất cần được nghiên cứu gấp và

sâu hơn.

3. Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy việc ứng dụng

enzyme hỗ trợ các quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên mang

lại hiệu quả rõ rệt. Vì thế cần mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các

loại nguyên liệu khác như tảo biển và các lớp hợp chất thiên nhiên có

hoạt chất sinh học có ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, y học.

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Hoang Thi Bich, Le Tat Thanh, Tran Quoc Toan, Nguyen Huy Tung, Le Xuan

Duy, Nguyen Van Tuyen Anh, Dinh Thi Thu Thuy, Tran Thi Tuyen, Do

Trung Sy, Le Mai Huong,Nguyen Quyet Chien (2016), “Investigation of

enzyme treatments to assist extraction of essential oil from the leaves and

branches of Cinnamomum cassia collected in Yenbai province”, Journal

of Science and Technology, 54 (2C), 479-485.

2. Le Tat Thanh, Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Hoang Thi Bich, Pham

Thi Bien, Pham Thu Hue, Dinh Nguyet Thu, Pham Quoc Long

(2016), “Survey on total lipid content and composition of fatty acids

from head and viscera of tuna”, Journal of Science and Technology,

54 (2C),486-492.

3. Lê Tất Thành, Hoàng Thị Bích, Trần Quốc Toàn, Nguyễn Thị Biển,

Nguyễn Quang Tùng (2016), “Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá

trình thủy phân dầu đầu cá ngừ bằng enzyme lipase từ Candida

rugosa”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ-trường Đại học Công

nghiệp Hà Nội, (số 36-2016), 67-70.

4. Hoàng Thị Bích, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Phạm Minh Quân, Phạm Thu

Huế, Nguyễn Quang Tùng, Tô Xuân Thắng, Trần Quốc Toàn, Lê Tất

Thành (2017), “Xây dựng quy trình ứng dụng enzyme và các kĩ thuật

phối hợp để thu nhận dầu cá giàu các axit béo không no đa nối đôi EPA,

DHA, DPA từ phụ phẩm chế biến cá ngừ vây vàng Thunnus albacares”,

Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, tập 17, (số 01), 95-102.

5. Hoàng Thị Bích, Nguyễn Quyết Chiến, Lê Tất Thành, Đinh Thị Thu

Thủy1, Đỗ Thị Thảo, Hoàng Kim Chi, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị

Hồng Hà, Lê Mai Hương (2017), “Khảo sát hoạt tính sinh học tinh

dầu cành lá quế cinnamomum cassia thu nhận từ phương pháp

enzyme kết hợp cất cuốn hơi nước”, Tạp chí Dược học, tháng

5/2017, (số 493), 12-15.

6. Hoang Thi Bich, Le Mai Huong, Nguyen Quyet Chien, Dinh Thi Thu Thuy,

Le Tat Thanh, Đo Trung Sy, Pham Hong Hai, “Optimization of

lignocellulose hydrolysis by (Laccase and Cellic Htec2) enzyme system

assisted essential oil distillation from Cinnamomum cassia leaves and

branches”, Journal of Science and Technology (Acceped 02/2017).