BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

----------------------------- LÊ THỊ BẠCH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH

CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.)

VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP Cần Thơ – Năm 2020

Công trình được hoàn thành tại:

+ Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học và

Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ

+ Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản Học viện Khoa học và Công

nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: …

Người hướng dẫn khoa học 2: ….

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …

Phản biện 3: …

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại

Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học và Công nghệ

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’,

ngày … tháng … năm 20…

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Tính cấp thiết của luận án

Ngành thủy sản Việt Nam gần đây đã phát triển mạnh mẽ và

giữ vai trò quan trọng trong xuất khẩu. Tuy nhiên, đi đôi với việc

phát triển nuôi trồng thủy sản thì dịch bệnh cũng bùng phát mạnh mẽ

và gây thiệt hại đáng kể. Việc sử dụng thuốc và hóa chất sẽ gây ra

nhiều trở ngại cho nghề nuôi như sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày

càng nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, sự tồn lưu thuốc trên cá

thương phẩm ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng và cũng

là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy sản.

Để hạn chế dịch bệnh cũng như việc sử dụng thuốc và hóa chất trong

nuôi trồng thủy sản, một số giải pháp được nhiều người quan tâm và

áp dụng trong các mô hình nuôi thủy sản. Trong đó, sử dụng thảo

dược để thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho vật nuôi

và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thủy sản đang là hướng đi

mới cho ngành thủy sản hiện nay.

Với sự khác biệt lớn về khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp

vùng cận nhiệt đới, cùng với sự phân hóa cao về địa hình đã góp

phần tạo nên sự đa dạng về hệ sinh thái nói chung cũng như hệ thực

vật nói riêng ở Việt Nam. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong

những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại

thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Đây là nguồn

hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt

hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể

sử dụng làm thuốc phục vụ cho đời sống, hướng nghiên cứu này

đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.

2

Cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), theo Đông y có nhiều

tác dụng. Ngoài ra, theo kết quả sàng lọc ban đầu trên tác dụng tăng

cường hệ miễn dịch cá tra của 20 loài dược thảo, Cỏ sữa lá lớn thể

hiện hoạt tính khá tốt. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam chưa nhiều. Do

vậy đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích

hệ miễn dịch của Cỏ sữa lá lớn vùng Đồng bằng sông Cửu Long

trên đối tượng cá tra” được thực hiện nhằm đóng góp thêm những

hiểu biết về thành phần hóa thực vật cũng như tác dụng sinh học của

loài Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của Cỏ sữa lá lớn

nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa

học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm ứng dụng

trong thủy sản nói riêng hay cuộc sống nói chung.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1. Sàng lọc các loài dược thảo có hoạt tính tăng cường hệ miễn

dịch trên cá tra;

2. Phân lập các hợp chất từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn thu hái tại

thành phố Cần Thơ;

3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng

các phương pháp vật lý và hóa học;

4. Đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt

tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa và hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6

3

khỏi ER stress của các cao chiết và một số hợp chất sạch phân lập

được.

NỘI DUNG LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế

về các vấn đề:

Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của chi Euphorbia.

Đặc điểm thực vật, công dụng trong dân gian, thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia

hirta L.).

Tổng quan về miễn dịch.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1 Mẫu thực vật, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Mẫu thực vật

Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ

nông dân nuôi trồng thủy sản ở vùng ĐBSCL kết hợp với lược khảo

tài liệu, 20 loài thực vật đã được chọn để tiến hành khảo sát hoạt tính

tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra.

Toàn cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) được thu hái vào

cuối tháng 2 năm 2016 tại thành phố Cần Thơ. Tên khoa học được

TS. Đặng Minh Quân - Bộ môn Sinh, Khoa Sư phạm, Trường Đại

học Cần Thơ giám định và mẫu tiêu bản được lưu trữ tại đây.

4

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254 và bản mỏng pha

đảo RP-18 F254 (Merck). Silica gel pha thường và silica gel pha đảo

RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 (GE Healthcare). Dung môi

triển khai cột: n-hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, MeOH được chưng

cất lại trước khi sử dụng.

Thiết bị

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy

Bruker Avance 500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam và máy AV-600, Bruker BioSpin Inc.,

Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.

Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy:

SCIEX X500 QTOF tại Viện Hóa học TPHCM và Viện Công nghệ

Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy

MicroTOF, Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện

Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.

Phổ UV-Vis được đo trên máy Jasco V-730; Độ quay cực

được đo trên thiết bị ADP 440; Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy

Stuart Scientific SMP3. Các phân tích này đều được thực hiện tại Bộ

môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng

Đối với 20 mẫu thực vật, lấy 100 g bột nguyên liệu khô đã

nghiền nhỏ của mỗi loại, thực hiện quá trình ngâm dầm trực tiếp

5

trong dung môi ethanol (5 lần × 24 giờ mỗi lần). Dịch chiết ethanol

được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được

các cao chiết ethanol tổng tương ứng.

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột (CC).

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc và định danh

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp

các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như phổ tử ngoại (UV-Vis),

phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

(1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY,

NOESY) đồng thời kết hợp phân tích, so sánh tài liệu tham khảo.

2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.4.1 Hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus)

Nguồn cá thí nghiệm: Cá tra (50 ± 5 gram/con) được chuyển

về phòng thí nghiệm từ trại giống ở Vĩnh Long. Cá khi đem về trại

thực nghiệm được trữ trong bể composite có sục khí liên tục, cho ăn

bằng thức ăn công nghiệp theo nhu cầu của cá và thuần hóa hai tuần

trước khi tiến hành thí nghiệm. Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được

kiểm tra ngẫu nhiên về hình dạng, kí sinh trùng, vi khuẩn.

Bố trí thí nghiệm: Tế bào bạch cầu (5×106 tế bào/mL) thu từ

thận và máu ngoại vi cá tra dựa theo phương pháp của Boyum (1968)

và Pierrard et al. (2012). Ficoll Paque PLUS (1.077 g/mL, GE

Healthcare, Uppsala, Sweden) được sử dụng để phân lập tế bào bạch

cầu. Tế bào thu được đuợc nuôi trong môi trường L-15 (pH 7.4,

6

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) có bổ sung 5% huyết thanh

thai bò (fetal bovine serum-FBS, Invitrogen), 1% Hepes 20 mM và

1% kháng sinh streptomycin/penicillin 10 000 UI (Invitrogen) và

nuôi ở 28ºC.

Thí nghiệm bao gồm các nghiệm thức được bổ sung cao chiết

(tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung các loại

cao chiết tại 2 nồng độ 10 và 100 μg/mL) và 2 nghiệm thức đối

chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung

DMSO 1%), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau 24 giờ bổ sung các

cao chiết, tiến hành phân tích các chỉ tiêu miễn dịch: xác định hoạt

tính lysozyme, bổ thể và tổng kháng thể.

2.2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn

Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử (cao chiết và các chất

phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn) được xác định dựa trên khả năng ức

chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn thể hiện qua sự hình thành

vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch tạo ra trên đĩa petri và nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC).

Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử và kháng sinh

(Vancomycin HCl và Cefixim) được tiến hành đối với năm chủng vi

khuẩn gây bệnh trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas

dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và

Vibrio parahaemolyticus đươc cung câp tư Viện nghiên cứu nuôi

trồng thủy sản 2, thành phố Hồ Chí Minh.

2.2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa thông qua

khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS•+ đã được chọn sử dụng

7

để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết và các chất

sạch phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn. Ngoài ra, phương pháp đánh giá

khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 cũng đã được tiến hành.

2.2.4.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress

Thapsigargin (TG) 2 µM được dùng để gây chết tế bào. Tác

dụng của các cao chiết hay chất phân lập bảo vệ tế bào khỏi sự chết

được đánh giá bằng cách so sánh thống kê tỷ lệ sống của nhóm tế

bào được xử lý với TG sau đó xử lý thêm với cao chiết hay chất phân

lập so với nhóm chỉ được xử lý với TG. Tỷ lệ sống của tế bào được

đánh giá bằng phương pháp so màu dựa trên hoạt tính của enzyme

dehydrogenase.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt

tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra

Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ

nông dân nuôi trồng thủy sản kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài

thực vật đã được thu hái từ các tỉnh khác nhau của vùng ĐBSCL và

được tiến hành sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra.

Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được

STT Tên thực vật

Tên khoa học của mẫu thực vật

Địa điểm thu mẫu

Bộ phận

nghiên cứu

Hiệu suất điều chế cao

(%)

1 Dây vác Cayratia trifolia (L.) Domin

Sóc Trăng Phần trên mặt đất

7.51

2 Rau sam Portulaca oleracea L. Vĩnh Long Toàn cây 5.73

3 Tỏi Allium sativum L. Cần Thơ Củ 6.87

8

4 Húng quế

Ocimum basilicum L. Cần Thơ Phần trên mặt đất

5.15

5 Bình bát nước

Annona reticulata L. Sóc Trăng Lá 13.71

6 Cỏ sữa lá lớn

Euphorbia hirta L. Cần Thơ Toàn cây 8.38

7 Gừng Zingiber officinale Rosc.

Cần Thơ Củ 5.65

8 Rau má Centella asiatica (L.) Urb

Hậu Giang Toàn cây 5.41

9 Sài đất Wedelia chinensis (Osbeck) Merr.

Cần Thơ Toàn cây 5.76

10 Diệp hạ châu

Phyllanthus amarus L. Sóc Trăng Phần trên mặt đất

6.29

11 Sầu đâu Azadirachta indica A. Juss

Cần Thơ Lá 8.84

12 Ổi Psidium guajava L. Vĩnh Long Lá 10.41

13 Trầu không

Piper betle L. Hậu Giang Lá 5.47

14 Mướp đắng

Momordica charantia L.

Vĩnh Long Lá 5.98

15 Giấp cá Houttuynia cordata

Thunb. Vĩnh Long Phần trên

mặt đất 8.93

16 Mắc cỡ Mimosa pudica L. Cần Thơ Phần trên mặt đất

6.28

17 Tía tô Perilla frutescen (L.) Britt

Cần Thơ Phần trên mặt đất

5.42

18 Cỏ cứt lợn

Ageratum conyzoides L.

Hậu Giang Phần trên mặt đất

8.40

19 Rau dệu Alternanthera sessilis (L.) A. DC

Cần Thơ Phần trên mặt đất

6.10

20 Cỏ mực Eclipta prostrata (L.) L.

Cần Thơ Phần trên mặt đất

5.07

9

Dựa vào kết quả sàng lọc đạt được, loài cây Cỏ sữa lá lớn hứa

hẹn nhiều tiềm năng sẽ phân lập được các hợp chất có khả năng tăng

cường hệ miễn dịch trên cá tra, bổ sung dữ liệu về các loài dược liệu

có tác dụng hỗ trợ phòng và trị bệnh cho đối tượng nuôi trồng thủy

sản. Vì vậy, đề tài đã chọn Cỏ sữa lá lớn là đối tượng nghiên cứu tiếp

theo về thành phần hóa học, đồng thời cũng khảo sát thêm hoạt tính

sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập

được từ loài cây này.

3.2 Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn

3.2.1 Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn

3.2.2 Phân lập các hợp chất

Từ các cao phân đoạn được phân lập trên cột sắc ký với các hệ

dung môi thích hợp thu được 22 hợp chất. Phần này trình bày chi tiết

quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexan, ethyl acetate,

n-butanol và methanol của Cỏ sữa lá lớn.

3.2.3 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập

được từ Cỏ sữa lá lớn

Phần này trình bày chi tiết các đặc trưng vật lý, các dữ kiện

phổ của 22 hợp chất được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn.

3.3 Kết quả sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá

tra của 20 cao chiết

Từ kết quả sàng lọc của 20 cao chiết trên tế bào bạch cầu thu

từ máu và từ thận cá tra đã cho thấy các cao chiết Cỏ sữa lá lớn, Diệp

hạ châu thân xanh, Gừng, Sầu đâu, Tỏi… có nhiều tiềm năng cải

thiện đáng kể hệ miễn dịch trên cá tra khi so sánh với đối chứng. Tế

10

bào bạch cầu thu từ máu và từ thận đều tăng đồng thời cả ba chỉ tiêu

miễn dịch với thời gian tối ưu của thí nghiệm được chọn là 24 giờ, ở

hai loại nồng độ 10 và 100 µg/mL.

Kết quả sàng lọc đã hứa hẹn nhiều tiềm năng to lớn của Cỏ

sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra đặc

biệt là tế bào bạch cầu thu từ thận. Ngoài ra, Cỏ sữa lá lớn đã được

nghiên cứu ở một số nước trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam loài

cây này chủ yếu mọc hoang, chưa được sử dụng nhiều trong ngành

dược phẩm nước ta. Mặc dù loài Cỏ sữa lá lớn có nhiều tác dụng

chữa bệnh trong dân gian, nhiều hoạt tính sinh học đáng quý lại dễ

tìm kiếm nhưng còn rất ít công trình nghiên cứu ở Việt Nam. Với

những lý do trên, đề tài đã lựa chọn Cỏ sữa lá lớn để tiến hành

nghiên cứu thành phần hóa học, đồng thời đánh giá thêm một số hoạt

tính sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân

lập được từ loài cây này.

3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập

Từ loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), đề tài đã phân lập

và xác định được cấu trúc hóa học của 22 hợp chất sạch (Bảng 4.24),

trong đó có một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên

nhiên và bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài cây này. Cấu

trúc của các hợp chất này đã được xác định dựa trên các phương

pháp phổ nghiệm hiện đại.

11

Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn

Chất mới

Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid

12

13

Các hợp chất thuộc nhóm phenol

Hợp chất diterpenoid

Các hợp chất thuộc nhóm triterpenoid

14

Hợp chất steroid

15

Hợp chất khác

6'O OH

OH

HO

O

O

OHHO

HOH3C 1"

6"

O1

2

3

45

6

7

Eup18: 1'-O-benzyl-rutinoside

1'

3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên

cá tra

Tế bào bạch cầu phân lập từ thận cá tra, được nuôi trong môi

trường L-15 có bổ sung cao chiết Cỏ sữa lá lớn ở 2 nồng độ 10

µg/mL và 100 µg/mL và bổ sung các hợp chất sạch phân lập được ở

2 nồng độ 10 µg/mL và 50 µg/mL. Sau 24 giờ bổ sung mẫu thử, tiến

hành phân tích các chỉ tiêu: lysozyme, bổ thể, tổng kháng thể để

đánh giá ảnh hưởng của Cỏ sữa lá lớn lên đáp ứng miễn dịch của tế

bào bạch cầu cá tra.

Kết quả phân tích cho thấy các nghiệm thức sau 24 giờ bổ

sung cao tổng, cao MeOH và cao n-hexane Cỏ sữa lá lớn tại nồng độ

100 µg/mL có hoạt tính lysozyme tăng cao đáng kể so với đối chứng.

Trong đó, tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ sung cao MeOH (tăng

khoảng hơn 2 lần so với đối chứng) và khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với nghiệm thức đối chứng (p<0.01). Ngoài ra, cao EtOAc và cao

BuOH cũng làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme tại nồng độ thấp

(10 µg/mL) trên tế bào bạch cầu thận cá tra. Tại nồng độ 10 µg/mL,

quercitrin đã làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme; trong khi

16

taraxerol và rutin tuy cũng có làm gia tăng hoạt tính này nhưng khác

biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.

Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu thận tăng rõ rệt khi bổ

sung cao EtOAc, cao BuOH và rutin ở nồng độ 10 µg/mL (p<0.01).

Sau 24 giờ bổ sung các cao chiết hay hợp chất sạch phân lập

được, hàm lượng tổng kháng thể của các nghiệm thức bổ sung cao

tổng, cao MeOH và cao BuOH của Cỏ sữa lá lớn đều khác biệt rõ rệt

và có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, hàm

lượng tổng kháng thể ở nghiệm thức bổ sung 10 µg/mL cao BuOH

đã tăng 2.0 lần so với đối chứng. Hàm lượng tổng kháng thể đã tăng

đáng kể ở nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao n-

hexane ở nồng độ 100 µg/mL. Tuy nhiên, các chất phân lập khảo

nghiệm đều không có tác dụng tăng cường nhiều hoạt tính tổng

kháng thể sau 24 giờ bổ sung vào tế bào bạch cầu thận cá tra.

Như vậy, kết quả thí nghiệm đã cho thấy cao chiết Cỏ sữa lá

lớn có khả năng tăng cường hoạt tính lysozyme, hoạt tính bổ thể

cũng như cho thấy hàm lượng tổng kháng thể cũng tăng cao khi có

sự tác động của cao chiết Cỏ sữa lá lớn. Điều này chứng minh tiềm

năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn

dịch trên cá tra.

3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết và chất phân lập

từ Cỏ sữa lá lớn được khảo sát trên năm chủng vi khuẩn gây bệnh

trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D,

Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và Vibrio

parahaemolyticus.

17

Qua kết quả đánh giá cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có

khả năng kháng khuẩn đối với năm chủng vi khuẩn ở các nồng độ

khảo nghiệm ngoại trừ cao n-hexane (0.3125 mg/mL) đối với khuẩn

Aeromonas dhakensis-W (MIC = 625 µg/mL). Trong đó, cao chiết

EtOAc cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas dhakensis-D. và

V.parahaemolyticus cao nhất (MIC = 18 µg/mL) và rutin, taraxerol

lại cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas hydrophila -N mạnh nhất

(MIC = 1.5 µg/mL), tạo được vòng vô khuẩn lớn nhất ở tất cả các

nồng độ so với các chủng vi khuẩn khác.

Cao EtOAc có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn A. hydrophila -

D với đường kính vòng vô khuẩn 22.80 mm ở nồng độ 5 mg/mL và

có giá trị MIC = 39 µg/mL. Rutin cũng thể hiện khả năng kháng

khuẩn A. hydrophila-D mạnh với đường kính vòng vô khuẩn tăng

nhanh từ 13.60 đến 29.33 trong khoảng nồng độ khảo sát.

Cao tổng, các cao phân đoạn và chất phân lập khảo sát đều có

hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila-N. Cao

EtOAc có khả năng kháng A. hydrophila-N mạnh hơn cao MeOH thể

hiện qua đường kính vòng vô khuẩn của cao EtOAc tăng đáng kể từ

13.73 lên 23.20 mm với giá trị MIC = 78 µg/mL

Cao n-butanol có khả năng kháng Aeromonas dhakensis-W

cao nhất trong tất cả các loại cao chiết được khảo sát với giá trị MIC

= 18 µg/mL. Hiệu quả kháng A. dhakensis-W của các loại cao chiết

tăng dần theo thứ tự: n-hexane, MeOH, BuOH và EtOAc tại nồng độ

5 mg/mL.

Cao BuOH và MeOH đều có khả năng ức chế Aeromonas

dhakensis-D gần như là tương đương nhau và khác biệt có ý nghĩa về

18

mặt thống kê. Cao EtOAc có khả năng kháng A. dhakensis-D mạnh

hơn cả với giá trị MIC = 18 µg/mL.

Đối với khuẩn Vibrio parahaemolyticus: cao EtOAc, taraxerol

và kháng sinh thương mại Vancomycin HCl ức chế hiệu quả chủng

vi khuẩn này với giá trị MIC lần lượt là 18.0; 2.0 và 3.0 µg/mL.

Trong trường hợp này, chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

không nhạy cảm với kháng sinh cefixim.

3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa

3.7.1 Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH và

ABTS•+

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của Cỏ sữa lá lớn được

so sánh với chất chuẩn là vitmin C. Kết quả cho thấy, quercitrin và

rutin (IC50 = 5.32 và 6.43 µg/mL) trung hòa gốc tự do DPPH tương

đương Vitamin C (IC50 = 4.39 µg/mL). Cao BuOH và MeOH có khả

năng trung hòa gốc tự do DPPH cao với IC50 lần lượt là 11.43 và

12.69 µg/mL; chỉ kém vitamin C 2.6 và 2.9 lần.

Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ của quercitrin và rutin

cao (IC50 = 6.92 và 7.57 µg/mL) tuy vẫn thấp hơn so với chất chuẩn

trolox (IC50 = 2.90 µg/mL). Cao BuOH có khả năng trung hòa gốc tự

do ABTS•+ kém chất chuẩn trolox khoảng 4 lần.

3.7.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào

MIN6

3.7.2.1 Khảo sát độc tính của các cao chiết trên dòng tế bào MIN6

Ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy có cao chiết với

những nồng độ khác nhau đều có mật độ tế bào sống khác biệt không

19

có ý nghĩa về mặt thống kê đối với nghiệm thức đối chứng chỉ có

môi trường DMEM. Kết quả này cho thấy các mẫu cao chiết ở các

nồng độ khảo sát (0.01-10.00 mg/ml) không có độc tính đối với tế

bào MIN6.

3.7.2.2 Khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6

+ Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng tồn tại của tế bào

MIN6

Kết quả cho thấy khi xử lý với 0.1-0.5 mM H2O2 trong hai giờ

đã gây chết tế bào đáng kể so với đối chứng và số tế bào sống phụ

thuộc vào nồng độ H2O2. Trên cơ sở kết quả đã đạt được và một số

báo cáo trước đây, nồng độ H2O2 0.4 mM (gây chết 51% tế bào) đã

được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

+ Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các cao chiết

Việc bổ sung các cao chiết đã cải thiện đáng kể số lượng tế

bào sống so với các mẫu môi trường nuôi cấy chỉ có H2O2, ngoại trừ

cao n-hexane ở nồng độ 0.01 mg/mL. Ở nghiệm thức môi trường có

chứa cao EtOAc hiệu quả bảo vệ tế bào mạnh nhất và kết quả cho

thấy khả năng tồn tại của tế bào là 81% ở nồng độ 0.1 mg/mL so với

đối chứng dương vitamin E (84% ở 0.2 mg/mL). Cao tổng cho hiệu

quả bảo vệ tế bào cao nhất là 78% ở nồng độ 1.0 mg/mL, trong khi

nghiệm thức xử lý với cao MeOH và cao BuOH cho thấy khả năng

bảo vệ tế bào tương đối tốt và cao n-hexane kém hiệu quả nhất.

+ Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các chất phân lập

Các hợp chất khảo sát đều có khả năng bảo vệ các tế bào

MIN6 khỏi sự chết do H2O2 gây ra trong khoảng nồng độ khảo sát từ

20

1.0 đến 1000 µg/mL. Quercitrin (10 µg/mL) và rutin (100 µg/mL) có

khả năng bảo vệ tế bào khá mạnh, tương ứng với 65% và 70% tế bào

tồn tại (so với 49% tế bào sống sót khi không được xử lý với các mẫu

thử). Taraxerol không có hiệu quả bảo vệ tế bào đáng kể tại nồng độ

100 µg/mL và chỉ có tác động tại nồng độ 1000 µg/mL với khả năng

bảo vệ tế bào là 61%. Quercetin và luteolin ở nồng độ 100 µg/mL có

tác dụng bảo vệ tế bào mạnh nhất khi so sánh với vitamin E (0.2

mg/mL, 84%). Quercetin và luteolin có tác dụng tốt nhất ở 100

µg/ml (tương ứng với 82% và 78% tế bào sống sót), trong khi các

hợp chất khác cũng thể hiện khả năng bảo vệ tế bào nhưng kém hiệu

quả hơn.

3.8 Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress

Ở nghiệm thức tế bào được nuôi cấy trong môi trường có

thapsigargin (TG) và các cao chiết hay các chất phân lập được, phần

trăm tế bào sống cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức

môi trường nuôi cấy chỉ có TG. Cụ thể ở nghiệm thức môi trường có

chứa cao chiết MeOH Cỏ sữa lá lớn (0.1 mg/mL) số tế bào sống đạt

69%, cao hơn so với môi trường chỉ có TG (40%). Kết quả cho thấy

các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn (1.0 – 1000 µg/mL)

được thử nghiệm đều có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khi bị TG gây

ER stress dẫn đến chết tế bào. Hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất được

quan sát đối với quercitrin (78%, 10 µg/mL). Đối với rutin và

taraxerol, hiệu quả bảo vệ tế bào đạt được cao nhất là 70% và 64%

tại nồng độ 100 µg/mL. Tùy thuộc vào nồng độ (1.0–1000 µg/mL),

phần trăm tế bào sống sót của nhóm được bổ sung luteolin và

quercetin dao động tương ứng từ 66% đến 69%, và từ 62% đến 70%.

Như vậy, quercetin và luteolin đã chứng minh được tác dụng bảo vệ

21

tế bào MIN6 và cho thấy hiệu quả tối đa của chúng ở nồng độ 10

µg/mL và caffeic acid cũng cho thấy sự bảo vệ tế bào cao nhất (68%)

ở nồng độ này. Các kết quả thí nghiệm này chứng minh Cỏ sữa lá lớn

có khả năng bảo vệ các tế bào MIN6 chống lại sự chết do TG gây ra,

là ứng viên tiềm năng trong việc nghiên cứu thảo dược trong việc hỗ

trợ điều trị bệnh đái tháo đường.

* Nhận xét chung:

Các kết quả phân tích về hóa học cho thấy Cỏ sữa lá lớn thu

hái tại Cần Thơ cũng thừa hưởng các đặc điểm hóa thực vật của các

loài thuộc chi Euphorbia với các lớp chất chính là flavonoid,

triterpenoid; trong đó rutin, quercitrin, taraxerol chiếm hàm lượng

cao.

Từ các kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy: các cao chiết và

một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ sữa lá lớn thể hiện tốt các

hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt tính kháng khuẩn,

kháng oxi hóa và hoạt tính bảo vệ tế bào khỏi ER stress ở các mức

độ khác nhau.

Việt Nam với nguồn hệ thực vật rất phong phú và là một trong

những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại

thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Đây là nguồn

hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt

hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất ứng

dụng trong đời sống.

Nuôi trồng thủy sản đang từng bước trở thành ngành kinh tế

quan trọng của nước ta. Trong đó, cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) được xem là một trong những đối tượng nuôi chủ

22

lực ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, trong những năm

gần đây, nghề nuôi cá tra phát triển quá nhanh, không theo quy

hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều và

phức tạp, gây thiệt hại đáng kể. Kháng sinh và hóa chất đã được sử

dụng để phòng và trị bệnh, nhưng lại đưa đến hiện tượng kháng

thuốc. Nghiêm trọng hơn, sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm gây

độc, ảnh hưởng sức khỏe cho người và cũng là rào cản cho các doanh

nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy sản. Do đó, khuynh hướng

chung hiện nay là nghiên cứu tìm ra những thảo dược thân thiện thay

thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho cá. Với cách tiếp cận

như trên, kết quả của các nghiên cứu trên đã mở ra tiềm năng cho Cỏ

sữa lá lớn Việt Nam nhằm có thể tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức

khỏe cộng đồng, sử dụng thảo dược nhằm thay thế kháng sinh, tăng

cường miễn dịch trên thủy sản từ đó nâng cao chất lượng nuôi trồng

thủy sản ở nước ta.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ toàn cây của Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại

thành phố Cần Thơ đề tài đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa

học một hợp chất mới là sodium β-D-glucopyranosyl 12-hydroxy

jasmonate (Eup16) cùng 21 hợp chất đã biết bao gồm: 11 flavonoid:

quercitrin (Eup01), rutin (Eup02), avicularin (Eup04), astragalin

(Eup05), luteolin (Eup08), quercetin (Eup09), (+)-catechin

(Eup11), afzelin (Eup14), myricitrin (Eup15), hymenoxin (Eup19)

và cynaroside (Eup21); ba hợp chất phenol: caffeic acid (Eup10),

protocatechuic acid (Eup12) và gallic acid (Eup13); năm hợp chất

23

triterpen: taraxerol (Eup06), taraxerone (Eup07), 3β,7β,25-

trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03), cycloart-23-ene-

3β,25-dioltrifolin (Eup17) và campesterol (Eup20); một hợp chất

diterpen: 2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane (Eup23) cùng với một

hợp chất khác: 1-O-benzyl-rutinoside (Eup18). Trong đó, có bảy

hợp chất lần đầu được phân lập từ loài này, đó là: avicularin

(Eup04), (+)-catechin (Eup11), hymenoxin (Eup19), cynaroside

(Eup21), 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03),

cycloart-23-ene-3β,25-dioltrifolin (Eup17) và 1-O-benzyl rutinoside

(Eup18).

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy:

Cao chiết Cỏ sữa lá lớn có khả năng tăng cường hệ miễn

dịch trên cá tra thông qua việc gia tăng hoạt tính lysozyme, bổ thể và

tổng kháng thể.

Hợp chất Eup02 (rutin) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn A.

hydrophila-D tốt với giá trị đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là

29.33 ±0.35 mm tại nồng độ 64 µg/mL và hợp chất Eup06

(taraxerol) đạt 24.50±0.44 mm đối với khuẩn A. hydrophila-N cũng

tại nồng độ 64 µg/mL.

Hợp chất Eup01 (quercitrin) và Eup02 (rutin) và thể hiện

hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS•+ cao với giá trị IC50

tương ứng là 5.32; 6.43 và 6.92; 7.57 µg/mL khi so với chất đối

chứng dương vitamin C (3.66 µg/mL) và trolox (2.90 µg/mL). Khả

năng kháng oxi hóa còn được khảo nghiệm qua khả năng bảo vệ tế

bào β tụy tạng MIN6 trên mô hình sử dụng H2O2 gây chết tế bào và

so sánh với đối chứng dương là vitamin E (0.2 mg/mL), kết quả cho

thấy cao EtOAc (0.1 mg/mL) và hợp chất Eup09 (quercetin) với

24

nồng độ 100 µg/mL cho hiệu quả bảo vệ tế bào mạnh nhất với % tế

bào sống sót lần lượt là 81% và 82% đối chiếu với 49% tế bào sống

sót khi không có mẫu thử.

Cỏ sữa lá lớn đã thể hiện khả năng bảo vệ tế bào MIN6

chống lại sự chết do thapsigargin gây ra, trong đó hiệu quả bảo vệ tế

bào cao nhất là cao MeOH và hợp chất Eup01 (quercitrin) với tỉ lệ tế

bào sống sót đạt lần lượt là 69% và 78%; cao hơn so với môi trường

chỉ có thapsigargin (40% tế bào sống sót).

2. Kiến nghị

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của Cỏ sữa lá lớn đã cho thấy có nhiều hợp chất flavonoid

(11/22 chất) được phân lập cùng với sự ứng dụng sinh học đa dạng,

tiềm năng của loài cây này. Tuy nhiên hiện nay Cỏ sữa lá lớn vẫn

chưa được ứng dụng và khai thác nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, cần

thêm các nghiên cứu sinh học và dược học để khẳng định thêm giá trị

khoa học của loài cây này, góp phần trong việc tạo ra các sản phẩm

phục vụ cuộc sống, đặc biệt là trong thủy sản.

3. Những đóng góp mới của luận án

Lần đầu tiên cây Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam được nghiên cứu

khá toàn diện về hóa học và hoạt tính sinh học, kết quả cho thấy

ngoài các thành phần hóa thực vật đặc trưng cho chi và loài, loài

Euphorbia hirta L. mọc tại Cần Thơ cũng xuất hiện hợp chất có cấu

trúc riêng (Eup16 - hợp chất mới). Điều này cho thấy tuy thuộc cùng

một loài Euphorbia hirta L., với con đường sinh tổng hợp gần như

giống nhau, nhưng do sự thay đổi về điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng

nên giữa loài mọc ở những nơi khác nhau vẫn có sự sai biệt nhỏ về

25

thành phần hóa học. Đó chính là điều thú vị của các hợp chất thiên

nhiên, góp phần tạo nên sự đa dạng và phong phú về cấu trúc hóa

học của các hợp chất thứ cấp, thông qua đó giúp các nhà khoa học có

cơ hội phát hiện thêm và đánh giá các hoạt tính mới của chúng.

Từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại TP

Cần Thơ, cho thấy trong 22 hợp chất sạch phân lập được có một hợp

chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và bảy hợp chất

lần đầu tiên được phân lập từ loài cây này.

Lần đầu tiên thử nghiệm hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch

trên cá tra; hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh trên thủy sản; hoạt tính

kháng oxi hóa ngoài các phương pháp hóa học thường quy như

DPPH, ABTS•+ đề tài còn khảo nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa trên

dòng tế bào β tụy tạng MIN6 với mô hình dùng H2O2 gây stress oxi

hóa và dùng thapsigargin gây ER stress, sau đó theo dõi khả năng

bảo vệ tế bào của các cao chiết và một số hợp chất phân lập được từ

Cỏ sữa lá lớn. Các kết quả trên góp phần cung cấp thêm các cơ sở

khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn để khai thác các giá trị gia tăng

của Cỏ sữa lá lớn ứng dụng trong y dược và nuôi trồng thủy sản.

26

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Joëlle Quetin-Leclercq, Patrick

Kestemont, Marie-Louise Scippo, Nguyen Thanh Phuong, Nguyen

Le Anh Dao, Nguyen Trong Tuan, Le Thi Tuyet Nhi and Bui Thi

Buu Hue, The flavonoid isolation and antioxidant activity of

Euphorbia hirta L. extracts, Vietnam Journal of chemistry, 2017, 55

(5E3,4), 568-573.

2. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Quoc Chau Thanh, Nguyen

Trong Tuan, Nguyen Thanh Phuong, Patrick Kestemont, Joëlle

Quetin-Leclercq, and Bui Thi Buu Hue, Antioxidative activity of

some medicial plants in the Mekong delta of Vietnam via protection

of pancreatic MIN6 β-cells against hydrogen peroxide-induced

apoptosis, Journal of Analytical Sciences, 2018, 23 (2), 190-197.

3. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Thanh

Phuong, Joëlle Quetin-Leclercq, and Bui Thi Buu Hue, Protective

effect of pancreatic β-cells MIN6 by some medicinal plants in the

Mekong Delta, Vietnam Journal of chemistry, 2018, 56 (5), 636-640.

4. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Quoc

Chau Thanh, Joëlle Quetin-Leclercq, and Bui Thi Buu Hue, The

protective effect of some extracts and isolated compounds from

Euphorbia hirta on pancreatic β-cells MIN6, Vietnam Journal of

Science and Technology, 2018, 56 (4A), 163-170.

5. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Thanh

Phuong, Joëlle Quetin-Leclercq, and Bui Thi Buu Hue, Antioxidant

activity against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity of

27

Euphorbia hirta L., AIP Proceeding (SCOPUS), 2018, 2049

(000318), 1-6.

6. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Mai Van Hieu, Do Cong Minh,

Tong Thanh Danh and Bui Thi Buu Hue. Chemical investigation of

Euphorbia hirta L., Vietnam Journal of chemistry, 2019, 57 (4e3,4),

327-332.

7. Le Thi Bach, Bui Thi Buu Hue, Nguyen Thu Thu Tram, Do

Nguyen Anh Thu, and Le Tien Dung, Chemical constituents from n-

hexane and ethyl acetate extracts of Euphorbia hirta L. grown in

Vietnam, IOP Conference Series: Materials Science and

Engineering, 2020, 736 022083.

8. Le Thi Bach, Nguyen Trong Tuan, Tran Chi Linh, Đong Ngoc

Bich Ngan, Huynh Thị Ngọc Anh, Huynh Thi Ngoc Hong và Bui Thi

Buu Hue. Investigation of bioactivities from Euphorbia hirta L.

extract, Journal of Analytical Sciences, 2020, 25 (2), 41-45.

9. Truong Quynh Nhu, Bui Thi Bich Hang, Le Thi Bach, Bui Thi

Buu Hue, Joëlle Quetin-Leclercq, Marie-Louise Scippo, Nguyen

Thanh Phuong and Patrick Kestemont, Plant extract-based diets

differently modulate immune responses and resistance to bacterial

infection in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus), Fish

and Shellfish Immunology, 2019, 92, 913-924.

10. Truong Quynh Nhu, Bui Thi Bich Hang, Anais Vinikas, Le Thi

Bach, Bui Thi Buu Hue, Do Thi Thanh Huong, Joëlle Quetin-

Leclercq, Marie-Louise Scippo, Nguyen Thanh Phuong and Patrick

Kestemont, Screening of immuno-modulatory potential of different

herbal plant extracts using striped catfish (Pangasianodon

28

hypophthalmus) leukocyte-based in vitro tests, Fish and Shellfish

Immunology, 2019, 93, 296–307.