DOCUMENTOBORRADOR DE REFERENCIAPROTOCOLO DE MANEJO DE COLECCIONES DEHONGOS

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2CONTENIDOMACROHONGOS ....................................................................................................................... 4Recoleccin................................................................................................................... 4Descripcin ................................................................................................................... 4Preservacin ................................................................................................................. 9Cultivo ........................................................................................................................ 10Identificacin ............................................................................................................... 11Bases de Datos ........................................................................................................... 13Envo de especmenes................................................................................................. 14MICROHONGOS........................................................................................................................15Recoleccin................................................................................................................. 15Aislamiento.................................................................................................................. 16Medios de Cultivo ........................................................................................................ 17Identificacin: .............................................................................................................. 18Preservacin ............................................................................................................... 18Especmenes de Herbario............................................................................................. 19Mantenimiento de la coleccin ...................................................................................... 19Cultivos vivos.............................................................................................................. 20Base de Datos............................................................................................................. 21Envo de material......................................................................................................... 21LIQUENES .................................................................................................................................22Recoleccin................................................................................................................. 22Preservacin ............................................................................................................... 24Revisin...................................................................................................................... 24Identificacin ............................................................................................................... 25Mantenimiento de la coleccin ...................................................................................... 26Bases de Datos ........................................................................................................... 27Envo de material......................................................................................................... 27APENDICE I ...............................................................................................................................28

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3PROTOCOLO PARA LA RECOLECTA, DESCRIPCION, IDENTIFICACION YMANTENIMIENTO DE HONGOS- Elaborado por la Unidad Estratgica de Hongos, INBioMilagro Mata H.Loengrin Umaa T.Jose Luis Chaves C.Y la colaboracin del Museo Nacional de Costa RicaArmando RuzAgosto, 2006En Costa Rica los hongos constituyen un reino casi desconocido, a pesar de la grandiversidad que posee este pas y de la importancia que tienen por las funciones que desempeantanto en los bosques como en el entorno en general. En nuestro pas se conocenaproximadamente 2,000 especies, pero se calcula que podran encontrarse de 60 a 70,000especies.Tomando en cuenta la importancia que tienen los hongos, lquenes, microhongos,macrohongos principalmente dentro de los ecosistemas, y a los pocos estudios que se hanrealizado en nuestro pas al respecto, resulta muy importante establecer las pautas a seguir, paradar inicio a su estudio y as lograr una adecuada calidad cientfica en las recolecciones,descripciones, preservacin, identificacin y cultivo de los especmenes; as como un adecuadomanejo de las colecciones que se conservan en las diferentes instituciones del pas.Importante resaltar que existen muchas formas de recolectar, procesar y describir losespecmenes, principalmente en el campo, esto dependiendo de los grupos de hongos con los quese est trabajando; a continuacin se presenta una metodologa general para macrohongos,microhongos y lquenes.

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4MACROHONGOSSe les llama macrohongos, al grupo constituido por cuerpos fructferos que pueden serobservados a simple vista, entre ellos las orejas de palo, sombrillas, estrellas de tierra,hongos gelatinosos, tipo coral, lenguas de tierra, costras sobre madera, etc.RecoleccinResulta indispensable llevar a cabo el siguiente procedimiento para que las coleccionestengan valor cientfico:1. Tomar nota del sustrato, y cuando sea posible anotar datos sobre la vegetacin querodea el espcimen.2. Tomar fotografas de los especmenes.3. Utilizar una cuchilla o pual para remover el hongo. Es necesario introducir la cuchillaunos cuantos centmetros hacia abajo de la base del hongo para no cortar el estpite yla volva, cuando este est presente.4. Remover el hongo con una porcin pequea de sustrato en su base.5. Recolectar especmenes tanto jvenes como maduros, y en la mayor cantidadposible.6. Colocar los especmenes removidos sobre papel aluminio (nunca en bolsasplsticas), de manera que se puedan cerrar los extremos sin producir daos a lamuestras.7. Colocar las recolecciones dentro de una canasta adecuada (nunca dentro demochilas, bolsas plsticas o de papel), para su traslado al laboratorio o rea detrabajo.DescripcinLa descripcin macroscpica de los hongos debe realizarse en el laboratorio o rea detrabajo lo ms pronto posible, ya que la mayora de ellos pierden humedad en muy poco tiempo ypor lo tanto se producen cambios de tamao y color, aspectos muy importantes para efectostaxonmicos. Por tal motivo, es recomendable hacer las recolectas por la maana y describir losespecmenes por la tarde, siguiendo los siguientes pasos:

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51.Mapa esprico o esporadaLa esporada se hace colocando el pleo entero (cuando existen suficientes especmenes)o una porcin de ste (cuando existe uno o dos especmenes nicamente) con el himenio(lamelas, poros, dientes, venaciones, etc.) hacia abajo sobre un papel blanco o de otro colordependiendo del color del himenio. El papel blanco con el pleo se protege con papel cera o conuna caja de petri invertida y se deja reposar por algunas horas hasta que las esporas seandepositadas. Se anota el color de las esporas en masa cuando estn frescas y luego cuando laesporada est seca. Si el cuerpo fructfero no es pileado, la esporada se lleva a cabo colocandola superficie frtil del espcimen en contacto sobre un papel blanco, se protege con papel cera yse deja reposar por algunos minutos u horas, hasta que las esporas sean depositadas.2.Descripcin macroscpicaLa descripcin de las caractersticas macroscpicas se lleva a cabo nicamente con losespecmenes frescos o recin recolectados, tambin puede hacerse con los especmenes secos,e.g., los poros en los Polyporales. En las descripciones se menciona el color de estos cuandofrescos y secos. . Es muy importante tambin tomar 2 o 3 fotografas de los especmenes antesde describirlos, esto si no se tomaron fotografas directamente en el campo.Muchos de los cuerpos fructferos de los hongos que se recolectan pueden ser divididosen tres partes (pleo, himenio y estpite); sin embargo alguna de esas partes podra no estarpresente, o bien tratarse de un cuerpo fructfero totalmente diferente, esto dependiendo del grupode hongos que se haya recolectado. En este caso, la descripcin se hace anotando todas lascaractersticas de las partes presentes, o bien describiendo cuidadosamente todas lascaractersticas observables a simple vista y con lupa.

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6Generalmente, el orden para realizar una descripcin macroscpica es la siguiente:2.1.PleoEs la parte superior o sombrero de un ascocarpo o basidiocarpo.2.1.a. Tamao:Se mide el dimetro cuando es circular, o la longitud y ancho cuando nolo es, con una regla graduada en mm o cm. Es recomendable cortar el espcimenlongitudinalmente para facilitar la medicin. Cuando la coleccin est formada por ms de dosespecmenes, se establece un intervalo tomando en cuenta del ms pequeo al ms grande.2.1.b. Forma:Se anota la forma del pleo tanto en cuerpos fructferos jvenes comomaduros. Es recomendable tomar en cuenta todas las formas presentes y establecer mbitos.Entre estas formas podemos encontrar: convexos, campanulados, cnicos, planos, parablicos,cncavos, elevados, infundibuliformes, depresados, mamilados, umbonados, umbilicados, etc.2.1.c. Color:El color del pleo se anota tomando en cuenta especmenes jvenes y maduros,ya que algunos pueden cambiar con la edad. Es muy importante anotar el color del disco o zonacentral del pleo, o cualquier otra observacin de color en otra parte del pleo cuando sta seadiferente, y adems es importante anotar el color del margen. Tambin es importante describir sexiste algn cambio de color cuando el hongo es manipulado. Todos los colores descritos debenir respaldados por un cdigo standard de colores.2.1.d. Margen:El margen del pleo de un hongo puede variar dependiendo del grado deexpansin que ste haya alcanzado. Es recomendable cortar longitudinalmente el cuerpo fructferopara describir el tipo de margen, el cual puede ser: incurvado, decurvado, enrrollado, plano,elevado, etc.Si el pleo es observado desde arriba, es decir con una vista superior sin haber sidocortado, este puede ser: entero, erodado, rimoso, apendiculado, etc.La textura del margen del pleo es otra caracterstica que se debe anotar, la cual podraser, entre otras, estriada, tuberculada-estriada, plicada-estriada, traslcida-estriada, surcada, etc.2.1.e. Superficie:La textura y ornamentacin de la superficie a menudo varan con la edad,con las condiciones ambientales, etc., por ello es muy importante describir la superficie del pleoen todos los especmenes que integren una coleccin, la cual puede ser, fibrilosa, escamosa,escuarrosa, pruinosa, tomentosa, velutinosa, glabra o lisa, areolada, pubescente, entre otras.2.1.f. Contexto:El contexto es el tejido carnoso interno y estril que forma parte del pleo o delcuerpo fructfero en general, para lo cual se debe anotar consistencia y color.

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72.2.Himenio o Superficie frtilEs la superficie ya sea lisa, porosa, lamelada, dentada, verrucosa, reticulada, convenaciones, etc; que generalmente esta cubierta por estructuras reproductivas microscpicas talescomo esporangios, ascos, basidios, conidios, los cistidios y las parfisis son estriles cistidios,parfisis, esporas, etc.Cuando el himenio est constituido por lamelas, se debe anotar lo siguiente:2.2.a. Tipo de unin:Vara con la edad del especmen, puede ser: libre,decurrente, subdecurrente, adnadas, anexas, sinuadas, emarginadas, etc.2.2.b. Color:Anotar el color y los cambios de color, si son observados, tanto en especmenesjvenes como maduros.2.2.c. Espaciamiento:Se refiere al espacio entre una lamela y la siguiente, las cuales puedenser: distantes, subdistantes, prximas, apiadas, etc.2.2.c. Grosor:Anotar s las lamelas son angostas, anchas, moderadamente angostas o anchas,etc. Es importante medir el ancho de las lamelas en cm o mm.2.2.d. Margen:Observar y anotar si el margen de la lamela es liso, con ranuras, dentado, erodado, serrado,serrulado o marginado (el margen tiene color diferente al resto de la lamela, en este caso se debeanotar el color).2.2.e. Lamlulas:Lamelas muy pequeas que no alcanzan a unirse al estpite o al puntode unin al sustrato en los casos en que no hay estpite. En este caso se anota el nmero deseries observadas.Si el himenio esta constituido por poros, se debe tomar en cuenta lo siguiente: si es redondeado(con poros circulares), radialmente elongado (con poros alargados), daedaloide (con porosdistribuidos en forma de laberinto), irregular (con poros redondos, radialmente elongados adaedaloides), angular (con poros cuyo contorno no es redondeado, sino en forma de angulo).Tambin el nmero de poros por milmetro y el color.2.3.EstpiteEs el pie que sostiene el pleo de un basidiocarpo, o de un ascocarpo, para lo cual sedebe anotar:

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82.3.a. Tamao:a. Longitud (se mide en mm o cm de la base al pice).b. Ancho (generalmente se mide hacia el pice, es recomendablecortar el espcimen longitudinalmente).2.3.b. Forma:El estpite puede ser: igual o uniforme, bulboso, abruptamentebulboso, clavado, subclavado, con forma de tapn, radiculado,etc.2.3.c. Posicin:Se debe anotar s el estpite es: central, lateral o excntrico.2.3.d. Color:Anotar color y cambios de color tanto en especmenes jvenescomo maduros.2.3.e. Superficie:Puede ser hmeda, seca, o vscida. Las mismas caractersticasanotadas antes para la superficie del pleo se pueden utilizar parala superficie del estpite.2.3.f. Contexto:El tejido interno del estpite puede ser slido, semi-relleno vaco2.3.g. Otras caractersticas:a. Micelio en la base del estpite (Anotar color y abundancia).b. Prolongacin del estpite en el sustrato.c. Presencia de rizomorfos (semejantes a pequeas races quecorren en el sustrato, se debe anotar el color y la abundancia).2.4.AnilloEl anillo son remanentes de un velo parcial que cubre el hongo en estados tempranosdel desarrollo. Cuando este est presente, se debe describir la posicin, si es movible fijo y elcolor.2.5.VolvaLa volva son remanentes del velo universal que recubre todo el hongo en estados muytempranos de desarrollo. Cuando se encuentre presente, se debe describir si tiene forma de saco,u otras formas descriptibles. Adems si es membranosa, frgil, formando como parches ozonaciones en la base del estpite.

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92.6.Hbito de crecimientoEs la apariencia general externa y caracterstica, o manera de crecer de un hongo. Anotarsi crece en forma solitaria, esparcido, agrupado formando racimos.2.7.Sustrato2.8.a. Terrestre: sobre suelo.2.8.b. Coprfilo: sobre estircol.2.8.c. Ligncola: sobre madera2.8.d. Fungcola: sobre otros hongos.Tambin pueden encontrarse hongos creciendo de forma parastica sobre otros seresvivos.2.8.Pruebas MacroqumicasObservar y anotar de acuerdo con los diferentes grupos de hongos, el color o cambios decolor al agregar reactivos qumicos en la superficie del pleo, contexto, superficie frtil, superficie ycontexto del estpite, o bien en la superficie o contexto de hongos con otras formas de cuerpofructfero. Observar y chequear aproximadamente entre 15 y 20 minutos. Los reactivos a utilizarpueden ser uno o varios de los siguientes:Sulfato ferroso acuoso al 10%Hidrxido de Sodio acuoso al 10%Hidrxido de Amonio acuoso al 10%Fenol acuoso al 2%Formaldehdo acuoso al 40%Acido sulfrico, hidroclrico, ntrico, etc.PreservacinLos especmenes frescos se cortan longitudinalmente y se colocan en un secador(deshidratador de alimentos) a temperaturas entre 25 y 50 grados centgrados por varias horas, eltiempo de secado depende del grosor y consistencia del hongo. El material completamente seco ydebidamente etiquetado se coloca en bolsas plsticas con un poco de aire, para su posteriortransporte a la institucin correspondiente. La etiqueta debe incluir al menos la siguienteinformacin:Fecha:Sitio de recolecta:Nmero de recolector:Identificacin provisional (cuando se tiene)

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10CultivoEn el caso particular de los macrohongos, se realizan de forma espordica algunoscultivos y aislamientos, especficamente sobre Extracto de Malta y Agar, y algunas vecesutilizando Benomyl para evitar el crecimiento de hongos diferentes a los macrohongos. El mediode cultivo se prepara con 100 ml de agua destilada, 20 g de Extracto de Malta, 15 g de Agar, y 0.1g de Benomyl suspendidos en 100 ml de agua destilada y agregado al 0.5% al agar para obteneruna concentracin final de 5 ppm.Los tamaos de las cajas de petri utilizadas son de 100 x 15 y 60 x 15 mm, encondiciones totalmente estriles.Los cultivos practicados se llevan a cabo en el campo o en el laboratorio, utilizando tejidode los especmenes, o bien esporadas directas sobre el medio de cultivo. Tambin se utilizan lasesporadas en cajas de petri estriles, de las cuales se practican diluciones y se aplican al mediode cultivo, esto directamente en el Laboratorio.Los cultivos se revisan peridicamente, y cuando presentan contaminacin en alto grado,son descartados. Los que resultan sin contaminacin se mantienen en viales con medio de cultivoa temperaturas de 14 o 16 grados centgrados, o bien en viales con agua estril dentro de unrefrigerador a - 74 grados centgrados.

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11IdentificacinLa identificacin de los especmenes generalmente se lleva a cabo en dos pasos; uno esla identificacin provisional que se le da a los especmenes en el campo, o bien en el laboratorio yes revisada macroscpicamente por los curadores. Otra es la identificacin que se lleva a cabocon el estudio de las estructuras microscpicas y el uso de claves taxonmicas, lo cual puedellevar desde horas hasta das; dependiendo de la disponibilidad de literatura y otras coleccionesdisponibles, adems del estudio del material que hacen nuestros expertos tanto nacionales comointernacionales. Tambin por comparacin con muestras de herbario cuando el material es estril.El estudio microscpico incluye cortes longitudinales, radiales y tangenciales de lasdiferentes partes del hongo, as como la prueba con diferentes reactivos qumicos como KOH al3%, Amonio, reactivo de Melzer, entre otros; y de tinciones como Rojo Congo, Azul de Algodn,Azul de Crezil, Floxina, etc. Se debe estudiar entre otras cosas las hifas (tipo, grosor color), formay tamao de las esporas.Mantenimiento de la coleccinTodos los especmenes de macrohongos que ingresan a las colecciones deben estardebidamente preservados y con una identificacin, al menos provisional. Es importante aclarar,que para macrohongos, una recoleccin significa, una bolsa (cuando viene del campo) o una caja(cuando ya est en el Herbario) que contiene de uno a varios individuos pertenecientes a unamisma especie, recolectados en una determinada fecha y lugar, y con sus respectivas notasdescriptivas. Adems para macrohongos, cada recoleccin es un testigo, con datos de lugar ydescripcin totalmente aparte.Cada recoleccin, dependiendo del tamao, se coloca en cajas de cartn con tapa, cuyostamaos son principalmente (largo x alto x ancho en cm) de 9 x 5.5 x 3; 12 x 9.5 x 4; 15 x 9.5 x 5;

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1217.5 x 11 x 5; 19 x 14 x 5; 20 x 15 x 6.5; 23 x 16.5 x 5.5; aunque en casos especiales, puedenecesitarse un tamao adicional ms grande.Las recolecciones se pueden colocar directamente sobre la caja, envueltas en papel librede cido (A-F TISSUE PAPER - UNBUFF), o bien pasarlas a bolsas con cierre y colocarlos dentrode las cajas. Los tamaos de las bolsas con cierre (largo x ancho en cm) son 3 x 4; 3 x 5; 4 x 6; 5x 8; y de (largo x ancho en mm) 165 x 155; 170 x 200; y 270 x 285.Cuando los datos de los especmenes se encuentren en la base de datos, se obtienen lasetiquetas tanto pequeas (que se colocan dentro de la caja) como las grandes (que se pegansobre la tapa de la caja). Las etiquetas grandes deben ser hechas sobre papel PERMA-DURFOLDER STOCK.007 y con 5 - 6 cm de alto y 9 - 10 cm de ancho; con informacin de fecha, sitiode recolecta, recolector, nmero de colector, persona que identifica, especie, identificacin(preferiblemente que incluya hasta el nivel de orden), coordenadas, altitud, y cdigo de barras nmero consecutivo de herbario. Se debe utilizar tinta indeleble.Las etiquetas pequeas sern hechas sobre el mismo material y tinta que las etiquetasgrandes, y con un tamao aproximado de 1.5 - 2 cm de alto x 2.5 - 3 cm de ancho; donde seincluye el nivel taxonmico, fecha y sitio de recolecta y nmero de recolector.

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13Los especmenes, por el momento, se colocan clasificados por rdenes y rotulados en laparte externa de los anaqueles, las familias estn anotadas en la parte interna de las puertas, y encada espacio interno estn los gneros y las respectivas especies (cuando las hay). Los gabinetesson de metal, de 253 cm de alto, 54.5 cm de ancho y 110 cm de fondo.Los especmenes son revisados peridicamente, para evitar problemas de absorcin dehumedad, as como problemas de contaminacin por otros hongos, por caros, etc. Adems serealizan al menos 4 procesos de fumigacin por ao, dependiendo del tipo de sustancia utilizada,pueden ser menos al ao.Bases de DatosLas descripciones morfolgicas de los especmenes realizadas en el campo, soningresadas en un capturador de datos Estos datos ingresados al capturador, sern ms adelanteaccesados por medio de la base de datos institucional, la cual brinda informacin sobre lasidentificaciones y datos de sitios. Las identificaciones y datos de sitios y fechas de recolecta soningresadas por el tcnico a la base de datos institucional, la cual genera etiquetas, que luego soncolocadas sobre las cajas de cartn que contienen los especmenes.Las imgenes tomadas en el campo en el laboratorio, son seleccionadas segnenfoque, nitidez y representatividad, para ingresarlas a la Base de Datos de Imgenesinstitucional.

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14Envo de especmenesLa salida del material, depende de la aprobacin de los permisos de exportacin deexportacin, segn las necesidades y posible uso de las colecciones.a.Prstamo de especmenesLos especmenes podrn ser enviados en calidad de prstamo donacin para fines deidentificacin u algn otro tipo de estudio taxonmico. El nmero de colecciones que salgan de lainstitucin tendr que ser aprobada por el encargado, de manera que no se dae la coleccin,pero que tampoco limite el trabajo del especialista.El perodo de tiempo que el especialista retendr los especmenes, es de seis meses oresultar de un acuerdo entre el encargado y el especialista, sin embargo en caso de vencimientodel prstamo, el especialista podr solicitar una extensin del mismo, mediante una nota escrita ocomunicacin directa con el encargado.b.Donacin de especmenesEs tradicional entre algunos taxnomos, que su trabajo de identificacin searecompensado con la donacin de algunos especmenes de inters para ellos. En nuestro caso,es posible, que aunque el taxnomo no lo indique, podamos donarle algunos especmenes,retribuyendo y reconociendo de alguna manera la ayuda brindada. Por lo tanto, ser criterio delencargado, la cantidad y calidad de especmenes que sern donados, de manera que no se daenlas colecciones de la institucin.El especialista o institucin que recibe la donacin, deber devolver la frmula dedonacin de especmenesa la institucin, directamente a la Curadora, especificando el estadogeneral de dichos especmenes y con la firma de la persona que recibe la donacin.

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15MICROHONGOSLos microhongos forman parte del grupo de hongos que generalmente no sonobservables a simple vista, sino que deben usarse lentes de aumento para recolectarlos eidentificarlos. Dentro de este grupo se encuentran los Oomycetes que son hongos acuticos,terrestres y parsitos de plantas; las Royas, llamadas as debido al color rojizo de sus esporas, losCarbones, que forman masas pulverulentas de esporas negras, estos dos estos dos ltimospertenecen a los Basidiomycetes, otros los encontramos en los Ascomycetes (la mayora) y en loshongos imperfectos.Recoleccin Debido a que existe una gran diversidad de microhongos, estos los podemos encontrar enmuchos hbitats, por lo que no hay un mtodo nico de recolecta. Un factor importante en la recolecta de microhongos es dnde buscarlos. Debe tomarseen cuenta que, la mayora viven en hbitats hmedos. En su mayora los cuerpos fructferos de los microhongos son de vida corta, o bien crecenen pocas definidas. Debido a estas caractersticas, una mayor frecuencia de los viajesde recolecta, en la misma rea, podran proveer las mejores oportunidades paraencontrarlos. Algunos microhongos viven en hbitats especficos: folcolas (sobre hojas), otros seencuetran sobre insectos, hipgeos (bajo suelo), y otros con huspedes especficos. Cuando se recolecta microhongos, es indispensable una lupa 10X, tanto paraencontrarlos, como para observar detalles de los cuerpos fructferos. Adems se debe dedisponer de recipientes adecuados para transportar las colecciones al laboratorio como:bolsas de papel de varios tamaos, algunos recipientes con tapa que podran tambin sertiles para especmenes delicados, la lupa, una cortadora, un formn, mazo pequeo, unacuchilla y un serrucho rabo zorro, sern suficientes. Registrar los datos de recolecta es un aspecto muy importante:localizacin geogrfica,nombre del recolector, sustrato(identificar cuando es posible),yfecha. Los especmenes deben ser examinados lo ms pronto posible. Apuntes sobre la forma,color y textura pueden cambiar cuando el espcimen se seca. En algunos grupos demicrohongos si la revisin debe ser postergada, los especmenes debern mantenersefrescos en una cmara hmeda, que consiste en un recipiente limpio que puede ser cajasde petri o cajas plsticas con tapa, con papel toalla hmeda en el fondo del mismo, almenos por menos de 24 horas, ya que los especmenes pueden descomponerse.

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16AislamientoExiste una amplia variedad de tcnicas que pueden ser utilizadas para aislar los diferentesgrupos de microhongos. Algunos grupos, tales como los parsitos, no pueden crecer en medioartificial. Muchas especies de microhongos nunca crecen en cultivos, y si lo hacen no formancuerpos fructferos.Antes de comenzar a aislar los hongos, se debe esterilizar todo el material que va autilizarse; cajas de petri, tubos de ensayo, etc, mediante autoclave e instrumentos comoescarpelos, pinzas y agujas deben sumergirse en alcohol de 95% y flamearse, sin olvidarse delimpiar el rea de trabajo con cloro (hipoclorito de sodio al 5% o alcohol).Algunas de las tcnicas ms comunes para aislar microhongos son:+Aislamiento directo:Algunas especies con cuerpos fructfero superficiales, como los peritecios,pueden ser transferidos directamente a un medio con agar.+Cultivo de tejido:Algunos pueden ser aislados, colocando una porcin del cuerpo fructfero enun medio de cultivo. El tejido puede ser desinfectado y removrsele una capa externa con unacuchilla estril.+Descarga de esporas:En este caso el cuerpo fructfero o una seccin, se adhiere con vaselinaa la tapa de la caja de petri, de manera que las esporas sean depositadas sobre la otra tapa(que posee el medio con agar) de la caja de petri, se sella totalmente dicha caja con Parafilm.Cuando las esporas son depositadas, la tapa que tiene la seccin del hongo adherida esreemplazada por otra tapa totalmente estril, y la caja junto con el depsito de esporas sesella con Parafilm.+Transferencia de esporas:stas pueden recogerse con una aguja estril, (previamenteintroducida en agar para una mejor adhesin) y transferirlas directamente al agar.

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17+Hongos internos (endfitos):Semillas, hojas y tallos son buenas fuentes para tales hongos,donde se toma parte del sustrato como del hongo y son transferidos al medio de cultivo.Medios de CultivoLos medios de cultivo caen dentro de dos categoras: natural y sintticos.1. Los medios de cultivo naturales incluyen sustratos como trozos de madera, hierba, semillas,hojas, harina de maz, harina de avena, y germen de trigo.2. Los medios sintticos son deseables donde la composicin del medio puede ser conocida,stos son importantes en estudios fisiolgicosPara la preparacin de los medios de cultivo se deben llevar a cabo varios requerimientos:Esterilizacin de material de cristalera, que incluye cajas de petri, tubos de ensayo,pipetas, etc., mediante calor seco (de 150 a 160 C durante una hora) o autoclave.Es necesario que el vaciado del medio de cultivo en cajas de petri, tubos de ensayo, etc.,se lleve acabo lo ms aspticamente posible, ya sea en una sala de cultivo apartada o en un lugarlimpio y libre de corrientes de aire y polvo. La mesa de trabajo debe limpiarse con una solucin decloro, las manos de la persona deben estar limpias y el material de laboratorio, para impedir laintroduccin de microorganismos contaminantes.Los diferentes medios de cultivo (ver apndice I), previamente ya pesados y mezclados enagua estril, se preparan en erlenmeyers que posteriormente se tapan con algodn y papel dealuminio, se colocan en una autoclave a 120 C y a 15 libras de presin durante 25 minutos. Losmedios de cultivo esterilizados se dejan enfriar durante cierto tiempo y posteriormente se viertenen las cajas de petri. En caso de que al medio se le aada agar, se deber dejar que este ltimose solidifique para que el medio de cultivo pueda entonces ser utilizado para cultivar. Para que nose contamine con bacterias se le agrega al medio de cultivo una solucin antibitica, (ver apndiceI).

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18Para preparar los viales, el medio de cultivo es agregado al tubo de ensayo en unacantidad apropiada y son cerrados con tapn de algodn o una tapa. Los tubos no deben de estarms de la mitad llenos. Si se usan tapas con rosca estas deben estar flojas para permitir elintercambio de gases durante el autoclavado. Una vez sacados de la autoclave los tubos soncolocados sobre una tabla con la parte superior ligeramente elevada. Esto da como resultado unagar extendido que provee una mayor superficie de crecimiento para el hongo. Cuando esta fro,los tubos pueden estar en forma vertical.Identificacin:Se har una identificacin provisional de los especmenes, basndose en la descripcinrealizada por el recolector. Posteriormente para dar certeza de que la identificacin es llevada acabo en forma correcta y detallada de los especmenes, stos sern observados al microscopio yse utilizarn claves taxonmicas para su identificacin. El estudio de estructuras microscpicasincluye el uso de reactivos qumicos como el Hidrxido de Potasio al 3%, Reactivo de Melzer ytinciones como el Cotton Blue (Ver Apndice I). Se tomarn imgenes de los cuerpos fructferosas como de los caracteres microscpicos (ascas, esporas, parfisis, etc), para documentar larecolecta.La identificacin puede ser llevada a cabo por el Curador, o bien por los expertosinternacionales que visitan la institucin, o mediante el envo de especmenes a sus respectivosmuseos, universidades, jardines botnicos, etc.

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19PreservacinVarios mtodos han sido utilizados para preservar los hongos, pero no existe un nicoprocedimiento. El factor principal en la seleccin de un mtodo de preservacin es si losespecmenes son mantenidos como material seco en un herbario o como cultivos vivos.Especmenes de HerbarioEl mtodo ms comn para preservar hongos es secado al aire.Los especmenes deben estar completamente secos, ya que si permanecen hmedospermitiran el crecimiento de otros hongos y bacterias, adems de caros que podran destruir elespcimen.Los patgenos de plantas y otros hongos que se encuentran sobre hospederos vivos sonpreservados de igual manera de como se preservan sus hospederos. Por ejemplo las especiesfolcolas, son preservadas, prensando y secando las hojas en el secador de plantas, mientras quelos hongos sobre insectos son preservados, montando los insectos.Mantenimiento de la coleccinEl almacenaje de los hongos es usualmente hecho en sobres Glassine, stas a la vez secolocarn en sobres de papel bond y colocadas en cajas de madera que a su vez se colocan engabinetes bien cerrados, ordenados generalmente por Clase, Orden, Familia, Gnero y Especie.Cuando la informacin de los especmenes se encuentre en la base de datos, se obtienenlas etiquetas tanto pequeas (que se colocan dentro de los sobres Glassine) y las grandes (que sepegan al sobre de papel). stas contienen la siguiente informacin: de fecha, sitio de recolecta,,nmero de recolector, persona que identifica, identificacin, coordenadas, altitud, sustrato y cdigode barras nmero de herbario.

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20Los sobres Glassine tienen los siguientes tamaos: (alto x ancho en centmetros) 4.4 x4.3, 5.9 x 9.2, 8.9 x 8.9, 7.9 x 12.9. Las cajas tienen la siguiente dimensin (alto x ancho x largoen centmetros) 10 x 33.5 x 47.5.Las etiquetas grandes tendrn una dimensin de 8.0 x 4.5 cm y las pequeas de 5.0 x 3.0cm. Ambos tamaos de etiquetas deben ser hechas en papel PERMA-DUR FOLDER STOCK.007,y el tipo de cinta es ribbon.-non bleed alcohol resistant.Los gabinetes, tinta, etiquetas y tamaos de estas, son del mismo tipo utilizado enmacrohongos.Sin importar el mtodo utilizado, los especmenes deben ser almacenados en gabinetesbien cerrados y que puedan ser fumigados. Una amenaza para los especmenes de herbario es lahumedad. A menos que sean mantenidos secos, ellos se encuentran susceptibles al ataque deotros hongos, y caros los cuales pueden destruirlos.Cultivos vivos Los cultivos de microhongos que se hayan podido obtener, son colocados primero sobre cajasde petri (100 x 15 mm.) conteniendo el medio apropiado (ver Apndice I). De cada caja se obtienen rplicas, o sea se pasa un trocito de cultivo del hongo a otra caja, yas sucesivamente para ir obteniendo varias rplicas (unas 5) del mismo hongo. Las rplicas se mantienen en cajas de petri por un perodo de tiempo (1 a 2 meses), luego setransfieren a viales (9 ml.) con medio de cultivo. Los tubos una vez inoculados con los hongos, pueden ser almacenados en una incubadora auna temperatura de + - 25 C. Una vez que hayan crecido los hongos, estos pueden ser mantenidos a 15 C

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21 Tambin se puede hacer transferencia de rplicas a tubos conteniendo agua destilada. Loscambios de cultivo, se pueden realizar cada 6 a 8 meses. Otro mtodo utilizado es mantener los cultivos en un congelador a - 70 C Para la determinacin de contaminantes se utilizar Tripticasa de soya (ver Apndice I) Tanto las cajas de petri como los tubos deben estar bien identificados para evitar confusin.Indicando de donde fue tomada la muestra, as como medio de cultivo utilizado, fecha deinoculacin, usando etiquetas o marcados con tinta indeleble.Base de DatosLos datos de las recolectas sern ingresados a la base de datos institucional. Lasidentificaciones y datos de sitios y fechas de colecta son ingresadas por el tcnico a la base dedatos institucional, la cual genera etiquetas (del mismo tamao y forma que las usadas paramacrohongos y lquenes), que luego son colocadas sobre los sobres de papel que contienen losespecmenes.Las imgenes tomadas en el laboratorio, mediante el uso del Sistema Digital de Capturade Imgenes, son seleccionadas segn enfoque, nitidez y representatividad, para ingresarlas a laBase de Datos de Imgenes institucional.Envo de materialEl sistema de envo de material, como donacin prstamo, rige de la misma manera quela especificada para el grupo de macrohongos.

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22LIQUENESLos lquenes son una asociacin simbitica entre un hongo (micobionte) y uno o msorganismos auttrofos fotosintticos (fotobionte) que puede ser un alga verde o una cianobacteria;de esta unin resulta un talo morfolgicamente diferente a cada uno de sus componentes o seauna entidad totalmente nueva. El hongo determina la naturaleza y forma de la mayora de loslquenes y produce las estructuras reproductivas.RecoleccinResulta indispensable llevar a cabo el siguiente procedimiento para que las coleccionestengan valor cientfico:1. Recolecta de especmenes sobre una amplia variedad de sustratos (rboles, troncoscados, rocas, musgo, suelo, hojas, etc.); sta actividad se lleva a cabo con una cuchilla o pual,los cuales ayudan a retirar un fragmento del sustrato junto con el especmen, especialmente losque viven sobre corteza o suelo (crustceos).2. Para recolectar los que viven sobre rocas se necesita un cincel y un mazo, mientras queuna podadora es til para cortar ramas pequeas. Una lupa 10x es esencial para observar algunasde las caractersticas morfolgicas ms importantes.

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233. Cuando se trata de lquenes folcolas (sobre hojas), se deben tomar las hojas enteras ysometerlas al procesamiento habitual que se sigue para estos rganos vegetales4. Registramos los datos ecolgicos bsicos para cada espcimen, tal como tipo delsustrato, especie del hospedero (si sabemos el nombre cientfico o vulgar de la planta donderecolectamos el liquen), y exposicin o ndice de luz (en cinco categoras: si el especmen esrecolectado en un lugar totalmente sombreado le asignamos 1; si est semi-expuesto leasignamos 3 y si lo encontramos en un sitio completamente expuesto a la luz le asignamos 5).5. Tomar fotografas de los especmenes.6. Las muestras recolectadas se almacenan en bolsas de papel (nunca de plstico!).7. Durante la recolecta se deben tomar adems los siguientes datos:Localidad: pas, provincia, cantn, rea de conservacin, rea protegida, rea privada sendero,coordenadas geogrficas.Hbitat: Descripcin breve del tipo de bosque, orillas de camino, reas de pastoreo, iluminacin.

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24Sustrato: suelo, roca, corteza (en lo posible el nombre cientfico y/o vulgar del rbol), hojas (en loposible el nombre cientfico y/o vulgar del rbol, arbusto, hierba, liana, etc.).Altitud: Sobre el nivel del mar.Fecha: Cuando se realiz la coleccin; especificar da, mes y ao.Recolector y nmero de coleccin: Nombre y apellido del recolector o recolectores, y el nmero decoleccin.Preservacin -Los especmenes recolectados se deben secar al aire libre o con un deshidratador dealimentos a temperaturas no mayores de 40 grados centgrados. -Los lquenes crustceos deben ser prensados en una prensa de las mismas que seutilizan para plantas vasculares -A cada especmen es recomendable hacerle una descripcin breve (color, tamao,presencia de estructuras morfolgicas, forma, etc.) junto con los datos de campo. -Se guarda cada especmen en un sobre de peridico y se marca con el nmero decoleccin correspondiente al recolectorRevisin-Los especmenes trados del campo se revisan para ver si estn bien secos y si no tienenningn nivel de contaminacin -Cada especmen es guardado en un sobre de papel bond de aproximadamente 16 cm delargo x 11 cm de ancho y estos sobres llevan dentro una cartulina barnizable nmero 16de 14.3 cm de largo x 9.5 cm de ancho -Los lquenes crustceos son pegados con cola blanca sobre esta cartulina y semantienen fuera hasta que el especmen pegue bien y luego son guardados nuevamentedentro del sobre. -Todos los sobres deben tener por fuera la informacin correspondiente al recolector,nmero de colecta, sustrato e ndice de luz, asignado a cada especmen.

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25IdentificacinAl igual que en el grupo de los macrohongos, la identificacin de los especmenesgeneralmente se lleva a cabo en dos pasos; uno es la identificacin provisional que se le da a losespecmenes en el campo, o bien cuando llega a la institucin respectiva y es revisada por elCurador en el estereoscopio, observando las estructuras macroscpicas (color del talo, tamao,forma, cuerpos fructferos, presencia o ausencia de soredios e isidios, color de la superficie inferiory superior, presencia o ausencia de cilios, rizinas, cifelas, seudocifelas, mculas, etc.). Otra es laidentificacin final que se lleva a cabo con el estudio de las estructuras microscpicas y el uso declaves taxonmicas. El estudio microscpico incluye cortes verticales del talo y de los cuerposfructferos, los cuales pueden ser teidos con Lactofenol Azul o Azul de Algodn para observarmejor sus componentes. El estudio microscpico tambin es llevado a cabo por los expertosinternacionales que visitan la institucin.Los lquenes poseen una serie de componentes qumicos que nos ayudan a determinargrupos complejos de especies. Estas se estudian sistemticamente utilizando mtodos sencillos ocomplejos que permiten detectarlas en el tejido cortical del talo o en las paredes celulares.La quimiotaxonoma en lquenes se ha enfocado en el uso taxonmico de los datos demetabolitos a nivel de especie. Dentro de los compuestos se encuentran los llamados cidosliqunicos y otros tipos de sustancias. Las sustancias liqunicas nunca ocurren en grandescantidades, por lo cual su deteccin e identificacin involucran tcnicas especiales, como lo son:-Tests de coloracin: orientado exclusivamente a detectar macroscpicamente lapresencia de grupos de compuestos qumicos, evidenciando cambios de color (en el talo, cortezay mdula). Los cambios de coloracin se consideran positivos e indican la presencia de un grupode compuestos determinados; se considera negativo si no hay cambio de color.

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26-Test C: se emplea como reactivo una solucin acuosa saturada de hipoclorito de calcio.Como sustituto se usa un blanqueador lquido comercial con cloro activo.-Test K: se usa como reactivo una solucin acuosa de hidrxido de potasio. Esta solucinse prepara al 10-25% y es ms estable que el test C-Test KC: es una mezcla de hipoclorito de calcio con hidrxido de potasio. Primero seaplica K e inmediatamente C.Mantenimiento de la coleccinTodos los especmenes que ingresan a la coleccin deben estar debidamentepreservados, montados en los sobres de papel bond y con una identificacin, al menosprovisional, se colocan en un congelador a -4 grados centgrados por una semana, como parte dela cuarentena. Luego de esto pasan a formar parte de la coleccin general. Aqu sern guardadosen anaqueles de 1 m con 58.5 cm de largo x 69 cm de ancho.Los especmenes en la coleccin estn ordenados por orden alfabtico.Cuando los datos de los especmenes se encuentren en la base de datos, se obtienen lasetiquetas grandes (Ver Mantenimiento de la Coleccin. Macrohongos).

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27Bases de DatosEl ingreso de los datos de las recolectas e imgenes de lquenes sigue los mismosparmetros que lo anotado para Macrohongos (Ver Base de datos de Macrohongos.)Envo de materialEl sistema de envo de material, como donacin prstamo, rige de la misma manera quela especificada para el grupo de macrohongos.

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28APENDICE IMedios de CultivoHarina de Maz Agar (CMA)Harina de Maz20 gr.Peptona20 gr.Dextrosa20 gr.Agar15 gr.Agua Destilada1 lExtracto de Malta Agar (MEA)Extracto de Malta20 gr.Peptona1 gr.Dextrosa20 gr.Agar20 gr.Agua Destilada1.lLa peptona y la dextrosa pueden variar su proporcin o ser omitidas enteramente.Papa Dextrosa Agar (PDA)Papas peladas y troceadas200 gr.Dextrosa20 gr.Agar15 gr.Agua Destilada1.lJuego de Vegetales con Agar (V-8)Jugo V-8180 ml.Carbonato de Calcio2 gr.Agar20 gr.Agua Destilada1 lDeterminacin de contaminantesTripticasa de soya (TSA)TSA40 gr.Agua destiliada1 l.

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29Solucin antibiticaStreptomicina0.5-1.0 grChlorotetraciclina0.5-1.0 grAgua esteril50 mlSolucionesLactofenol:Fenol20 ml.Acido lctico20 mlGlicerina40 mlAgua Destilada 20 mlReactivo de MelzerCristales de iodo0.5 gm.Ioduro de Potasio1.5 gm.Chloral hydrate20 gm.Agua Destilada20 ml.Hidroxido de Potasio al 2-3%TincionesCotton blue (azul de algodn) y Floxina, ambas al 0.5% en solucin acuosaOtros mtodos de preservacin: Refrigeracin Almacenaje en Nitrgeno lquido Liofilizacin