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„HPLC-Analytik von Kohlenhydraten und Ethanol an Beispielen von Weinen und
Alkopops “
Manfred Gey a.D. (Hochschule Zittau/Görlitz)
10. Knauer-HPLC-Work-Shop 2018: FZ Dresden-Rossendorf
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
2M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
1. Ausgangspunkt und Einführung2. Problematik der LC‐Trennung und Detektion von Kohlenhydraten3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für KH/EtOH
3.1 „Historische“ Zuckertrennung3.2 Aminophasen3.3 HPAEC‐PAD3.4 Ligandenaustausch‐LC
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alkopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol4.2 Weingenuss versus Alkohol‐Abusus
5. Kleines Resümee
Schwerpunkte
3M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
‐ Zucker sind ernährungsphysiologisch wichtig (Energiehaushalt)‐ Andererseits sind Zucker oft Ursachen/“Mithelfer“ bei der
Entstehung von Erkrankungen (Diabetes, Lactoseintoleranz u.a.)‐ Glycane/Zuckersequenzen spielen eine wichtige Rolle in Glyco‐
proteinen bei biochemischen Reaktionen/Zell‐Zell‐Erkennung‐ Getränke mit hohem Zuckergehalt/Süßspeisen sind oft (Teil )‐
Ursachen für Übergewicht bereits bei Kindern und Jugendlichen‐ Bei Verzehr von Lebensmitteln/Getränken sind vor allem hohe
Zuckergehalte zu beachten!‐ Alkopops und süße Weine sind kritisch und ggf. zu meiden!‐ Analytische Methoden/HPLC sind sehr gut geeignet, monomere
und dimere Kohlenhydrate sowie den Ethanolgehaltin diesen Produkten zu bestimmen.
‐ HPLC‐Trennmechanismen basierend auf LEC und HPAEC‐PADsind dafür sehr gut geeignet
1. Ausgangspunkt und Einführung
4M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
2. Problematik der LC‐Trennung und KH‐Detektion
‐ Hexosen (Glucose, Galactose, Mannose) annähernd gleicheStrukturen – identische Molekulargewichte
‐ Zucker sind i.d.R. neutral/nicht ionisch‐ Durch starke Basen Überführung in Oxianionen möglich‐ Dann Trennung durch Ionenaustausch (IEC) gegeben
‐ Mono‐/dimere Kohlenhydrat‐Strukturen besitzen i.d.R. keinechromophoren Gruppen
‐ UV/VIS und Fluoreszenz wenig geeignet‐ RI‐Detektion möglich – wenig sensitiv‐ PAD ist relativ speziell (Equipment/Detektor)‐ MS nicht immer vorhanden
5
C
C
OH
OHKohlenhydrat
HO
HOB OH
Borsäure
C
C
O
OB
OH
OHH2O
Anionischer Zucker-Borat-Komplex
3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.1 „Historische“ Zuckertrennung
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
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nach D. Scott, in "Modern Practice of Liquid Chromatography", J.J. Kirkland ed.
Anionenaustauscher : Aminex A-27,10 µm;Säule : 150 cm x 6,2 mm,Gradientenelution mit Boratpuffer,je 1 µMol jedes Zuckers,
3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.1 „Historische“ Zuckertrennung
Zeit in Stunden!
7M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.2 Aminophasen
03 2 1
Zeit (min)
1
2
4
5
3
2 Rhamnose3 Glucose4 Cellobiose
5 Raffinose
Glassäule: 100 x 3,8 mm i.D.stat. Phase: Silasorb NH2, dp = 5 µmmobile Phase: ACN/Wasser 75:25 V/VFlussrate: 1,7 ml/minVordruck: 8 MPaDetektion: RI, 5 x 10‐5 I.I.U.Inj.‐volumen: 20 µl.
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.3 HPAEC‐PAD
8
dp = 5 µm SO3
Partikel der stationärenPhase auf Styren-Divinyl-benzen-Basis (S-DVB)
sulfoniert
dp = 0,1 µm
Latexpartikel
+ NaOHpH = 12-13
High pH anion‐exchange chromatography ‐ pulsed amperometric detection
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.3 HPAEC‐PAD
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High pH anion‐exchange chromatography ‐ pulsed amperometric detection
1
2
3
456
7
0 10 20 30 40 50
Zeit (min)
PA
D-R
esp
on
se
1234567
FucoseGalNAcGlcNAcGalactoseGlucoseMannoseNANA
Säule: 250 • 4 mm i.D.,stationäre Phase: CarboPak PA 100,mobile Phase: 21 mmol/l NaOH,Flussrate: 1,0 ml/min,Detektion: PAD (E1= 50 mV, E2= 650 mV, E3= ‐950 mV, t1= 300 ms, t2= 60 ms, t3= 60 ms),Injektionsvolumen: 20 µl.
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
3. Ausgewählte für Zucker3.3 HPAEC‐PAD
10
High pH anion‐exchange chromatography ‐ pulsed amperometric detection
0 10 20 30 40
504030
25
20
15
10
Zeit (min)
Chromatogramm von (1→4)‐a‐D‐Glycanen (kurzkettige Amylose EX‐1).Peak 1–50: DP 1 ... DP 50,Säule: 250 • 4 mm i.D.,stationäre Phase: HPIC‐AS6,mobile Phase: A: 150 mM NaOH undB: A + 500 mM NaAc (Gradienten‐Programm I), Flussrate: 1,0 ml/min,Detektion: PAD (E1= 100 mV, E2= 600 mV, E3= ‐800 mV, t1= 300 ms, t2= 120 ms, t3= 300 ms,Empfindlichkeit: 10 K nAInjektionsvolumen: 50 µl.
11M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.4 Ligandenaustausch‐LC
S-DVB
S-DVB
SO3-
SO3-
Ca2+H2OH2O
H2O hydrophile WW
OH-Glucose
Chromatographische
Bedingungen:
Säule: Polyspher CHCA
mobile Phase: Wasser
Flussrate: 0,4 ml/min
Druck: 5,2 Mpa
1 Glucose
2 Fructose
3 Glycerin
4 Ethanol
5 sec. Butanol als innerer Standard
Time
30 min
2 X
10
-6 R
IU
Start
1
2
3
4
5Ligandenaustauschchromatographie
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
Sample preparation?: is very easy!
- 100 µl wine in 10 ml deionized or bidestilled water (1:100 V/V)
- or 10 µl wine in 1 ml water, - or 1µl wine in 100 µl water,
- Injection of 20 µl of such a sample solution in to a HPLC apparatus.
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik
14M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
Trockner Rotwein
Glc: 1,4 g/lFru: 2,5 g/l
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte
Süßer Weißwein
Glc: 23,6 g/lFru: 25,3 g/l
15M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte
Moselwein
Glc: 6,4 g/lFru: 36,6 g/l
Süßer Weißwein
Glc: 24,1 g/lFru: 24,3 g/l
16M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte
Barcardi Alcopop
Glc: 49,1 g/lFru: 51,1 g/l EtOH: 9,8 %
Lemon Alcopop
Glc: 24,4 g/lFru: 24,5 g/l EtOH: 2,5 %
Alcopops
18M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte
„Rote Johanna“ (Likör)Glc: 88,8 g/lFru: 83,3 g/l EtOH: 17,8 %
„Stephanie‐Likör“Glc: 75,6 g/lFru: 92,5 g/l EtOH: 4,9 %
19
Abbau‐Vorgang: im Zytoplasma
H3C CH2 OHDehydrogenierung(Zytoplasma)
Ethanol Alkohol-dehydrogenase
H3C CO
H
Acetaldehyd
NAD+
NADH + H+
Acetaldehyd-dehydrogenase
NAD+ + H2O
NADH + H+
H3C CO
O
Acetat
H+
(Metabolisierung findet in der Leber und im GIT statt)
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol
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H3C CH2 OHMEOS(EndoplasmatischesRetikulum)
Ethanol
H3C CO
H
Acetaldehyd
NADP+NADPH + H+
O2 2 H2O
H3C CO
O
Acetat
H+
NADP+NADPH + H+
O2 H2O
MEOS: mikrosomales ethanol oxidierendes System
M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol
21M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.3 Weingenuss versus Alkohol‐Abusus
Formel nach Widmar:M: Masse des getrunkenen Alkohols [g]Km: Körpermasse [kg]r: Reduktionsfaktor, Männer: 0,7/Frauen: 0,6c: BAK in [ 0/00 ] , Blutalkoholkonzentration in Promille
M = Km . c . r c = M / c . r
22
Fall‐1:M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,
100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 110 [kg]r: Reduktionsfaktor, Mann: 0,7
c: BAK in [ 0/00] ? ,
c = M / Km . r = 80 g / 110 kg . 0,7c = 80 g / 77 g [0/00 ] = 1,04 Promille
in vino
veritas
Ein „Gedanken‐Experiment“!?
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Fall‐2:M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,
100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 60 [kg]r: Reduktionsfaktor, Frau: 0,6
c: BAK in [ 0/00] ? ,
c = M / Km . r = 80 g / 60 kg . 0,7c = 80 g / 36 g [0/00 ] = 2,22 Promille
in vino
veritas
Ein „Gedanken‐Experiment“!?
24
Fall‐2: “Normal‐Typ”M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,
100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 60 [kg]r: Reduktionsfaktor, Frau: 0,6c: 2,22 Promille
Alkohol‐Abbau: 0,15 Promille/Stunde:Die Frau ist nach 15 Stunden “clean”.
in vino
veritas
Ein „Gedanken‐Experiment“!?
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Fall‐1: “MEOS‐Typ”M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,
100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 110 [kg]r: Reduktionsfaktor, Mann: 0,7c: 1,04 Promille
Alkohol‐Abbau: 0,35 Promille/Stunde:Der Mann ist in 3 Stunden “clean”.
in vino
veritas
Ein „Gedanken‐Experiment“!?
26M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018
‐ LEC ist für einfache Zuckertrennungen von Weinen und Alcopos gut geeignet.
‐ HPAEC‐PAD und MS sind für sensitive Zuckerbestimmungen prädestiniert.
‐ Vorsicht vor Alcopops , süßen Weinen und „Zucker‐Likören“!
Bevorzugen Sie trockene Weine!
„In vino veritas“ – Vielen Dank!
5. Ein kleines Resümee