Upload
ilori
View
67
Download
2
Embed Size (px)
DESCRIPTION
HPLC High Performance Liquid Chromatography. Nejdokonalejší LC : ú činnost N > 10 4 ; R f = ≥ 10 -2 Detekční limit 1 : 10 9 -10 15 Použití: analytické - ng x preparativní – 100g Vysoká reprodukovatelnost Vyšší T I netěkavé látky Vznik Teorie - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
HPLCHigh Performance Liquid Chromatography
Nejdokonalejší LC:
• účinnost N>104; Rf = ≥ 10-2
• Detekční limit 1 : 109 -1015
• Použití: analytické - ng x preparativní – 100g • Vysoká reprodukovatelnost• Vyšší T• I netěkavé látky
Vznik • Teorie • Přístrojová technika (GC, detektory)• Sorbenty
Srovnání HPLC a LC
Průměr částice (silikagel) (μm)
3 ± 1; 5, 8 ± 2 5 – 500
Průtok (ml/min) 1 – 20 (30) 0,2
Tlak (MPa) 1- 40 (60) 0,1
Teplota ≤ 70o r.t.
Průměr kolony (mm) 2 – 8 (103 ) 10 – 40 (200)
HPLC chromatograf
Peristaltické čerpadlo
• Tok: 0.01 – 10.0 (max.30) ml/min• Tlak: 28 - 42 MPa
Výhody:• Jednoduchá konstrukce• Sterilita
• Ne styk FM s kovem
Nevýhody: • Tlakové rázy
Druhé čerpadlo s opačným rázem
Short Column Chromatography
Biotechnologické provozy
CoulArray – elektrochemický detektor
• 4,8,12 nebo 16 senzorů v serii• Potenciálový rozsah ± 2 V v 1 mV
krocích• Pracovní V 0,5 μl• Proudový rozsah 10 pA -1mA• Citlivost pg –ng ox./red. látky
na elektrodě
3D detekce
Příklad 3D-detekce 27 látekCoulArray ESA,Inc
T (min.)
Discovery Zr – High pH + High T HPLC
3 μm a 5 μm částice ZrO2
Zr vázané fáze:
• Zr-C18 - jako silicaC18
• Zr-PBD – polybutadien, jako silicaC18
• Zr-PS - polystyren
ZrO2 jako iontoměnič
Zr – elektrofil,
Lewisova HA
Váže Lewisovy BOH
(PO4 3- , F- ,citrát)
2 druhy interakce:
• ω nebo KD
• q
Rychlé dělení nesteroidních protizánětlivých léků na Zr-CarbonC18
Monolitické FS - nová éra LC
ChromolithTM - monolitický silikagel
Struktura:
• Makropóry – 2 μm, propustné pro FM
• Mikropóry – 13 nm, plocha adsorpce
Výhody:• Vysoké průtoky (9ml/min)• Rychlost (min)• Účinnost (N = 104)• Vysoká reprodukovatelnost
Chromolith – rychlost dělení
Testování účinnosti kolon Chromolithu
CIM monolytyConvective Interaction Media
IEC, RP, AfC
Analytické i preparativní, pro velké biomolekuly
CLC – (Conjoint LC) multidimensionální, 4 disky
Výhody:
• Rychlé
• Vysoké rozlišení
• Nízký tlak
• Vysoká reprodukovatelnost
• Jednoduché zacházení
• pH 1 - 14Polymer na bázi methakrylátu nebo polystyrenu
Příklad dělení oligonukleotidů na CIM
Použití HPLC
• Univerzální – preparativní i analytické • Všechny principy LC
Jediná podmínka - rozpustnost v FM
Výroba léků (inzulin, monoklonální protilátky, Ig)
Rutinní analýzy• Potravinářský průmysl (obsah vitaminů, pesticidů, transMK)• Farmaceutický průmysl (rutinní výstupní kontroly)• Klinická biochemie (kontrola metabolizmu, HC)• Doping sportovců• Ekologie (pitná voda, freony v ledovcích)
Monoklonální protilátky
FPLC (Fast Protein, Polypeptide, Polynucleotide LC)
Speciální silikagel pro IEC, agarosa pro AfC
MAbs• Čištění z ascitu• Čištění z malého množství bakteriální
kultury• Monitorování fermentace a produkce Protein A Sepharosa pro FPLC Výhody Protein A Superosy:• Vysoce specifické – v jednom kroku
požadovaná čistota• Snadno se čistí a regenerují
Výroba insulinu
Provozní kontrola obsahu proinsulinu
v kritických frakcích insulinu pomocí FPLC (Polyanion SI HR5/5)
SPESolid Phase Extraction
Příprava vzorků pro rutinní analýzu,náhrada vytřepáváníPro: HPLC, TLC, GC, ElFo, RIA, spektromerii
Princip:Selektivní adsorpce, μl – l, jednorázové
Výhody:• Rychlé• Práce v serii (12, 24, …)• Vysoká reprodukovatelnost• Levné , malé množství odpadu,
ekologické• databáze
Postup SPE
Použití
Univerzální• Farmaceutický průmysl• Potravinářský průmysl• Klinická biochemie
(narkotika v moči, HC, ..)