Réalisé par: ALI BOUH HOUSSEIN

& ABDILLAHI ABDIRAHMAN

Photographie d’un appareil de mesure de HPLC

GENERALITES  CHROMATOGRAPHIE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE

À HAUTE PERFORMANCE (HPLC) PRINCIPE COMPOSITION

PHASE STATIONNAIRE PHASE MOBILE  POMPE INJECTEURS COLONNES DETECTEURS CHROMATOGRAMME CONCLUSION

BIBLIOGRAPHIE

GENERALITES

CHROMATOGRAPHIE

La chromatographie permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification.

C'est un ensemble de procédés, applicables à des mélanges moléculaires ou ioniques, basés sur des différences de distribution des solutés entre une phase stationnaire, généralement dispersée, et une phase mobile continue, les deux phases étant mises en contact intime et à contre courant.

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE À HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n’étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse.

A l’origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre. Le liquide traversait la phase stationnaire par gravité ou sous faible pression. Puis pour augmenter le débit, des manipulations ont été réalisées sous pression plus forte. C’est ce que l’on a appeler la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Très rapidement le P de pression est devenu le P de performance lorsque l’on a optimisé la technique (diminution de la taille de particules de la phase stationnaire, régularité de cette phase…).

PRINCIPE D’abord il y a la préparation de l’échantillon

on le dissolvant dans un solvant, de façon à pouvoir l’introduire dans le système chromatographique, ici, le dispositif du HPLC.

Ensuite il y a la mise en contact avec l’éluant, qui constitue la phase mobile, entraîné par une pompe à l’intérieur d’une colonne (contenant des grains de fine granulométrie), appelée phase stationnaire. C’est dans cette colonne que va se faire la séparation proprement dite, car c est suivant leur affinité pour l’éluant ou pour la phase stationnaire que les différentes substances contenus dans l’échantillon qu’ils vont être retenu. Par conséquent, ils vont sortir les uns après les autres, et donc séparément.

À la sortie de la colonne, un détecteur va enregistré un signal en fonction de la ‘vitesse’ de sorties des différents substances, ce qui donnera un tracé appelé chromatogramme a partir duquel on pourra effectué des interprétations(quantités, abondances, etc.…)

PHASE STATIONNAIRE La phase stationnaire est constituée d’une colonne

qui est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Soit remplie par des grains soit d’un film (colonne capillaire). On distingue deux types de phase stationnaire :

Phase normale Phase inverse

Fig. 2 : constitution d’une colonne

- La phase normale:

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête. Les gels de silices, souvent utilisés, contiennent a leur surface des groupement silanols (-OH) et des groupements siloxanes (-O-) qui leur permettent de retenir les composés contenus dans l’échantillon par des liaisons hydrogènes. Cette phase sert ainsi principalement à séparer des composés polaires.

L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.

- La phase inverse :

La phase inverse est majoritairement composée de silices greffées par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.

Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante.

PHASE MOBILE L'interaction plus ou moins forte entre

la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés. La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :

- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie est dite en phase normale ;

- si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des composés.

Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec une phase greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases normales. Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu'un composé apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus.

On réalise des gradients d'élution en diminuant au cours de la séparation la polarité de l'éluant (ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration en acétonitrile va en croissant au cours de l'élution).

On peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase mobile.

Fig. 3 : pouvoir d’élution de la phase mobile en HPLC

POMPE Elle est munie d'un système de

gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler:

- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.

- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluants.

Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques µl à plusieurs ml/min.

INJECTEURS C'est un injecteur à boucles

d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser.

Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.

Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage d'une capacité fixe (10, 20, 50 µL…). Cette boucle permet d'introduire l'échantillon sans modifier la pression dans la colonne.

Vanne à boucle d'échantillonnage

Elle possède 2 positions. La première permet le remplissage de la boucle d'injection de volume fixe (load), la seconde permet la mise en circulation de l'échantillon dans le système chromatographique (inject). Le remplissage de la boucle d'injection se fait à l'aide d'une seringue.

Fig. 4a : phase de chargement (load.)

Fig. 4b: phase d’injection (inject)

COLONNE Une colonne est un tube construit dans un

matériau le plus possible inerte aux produits chimiques. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm. Au delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop élevées. Ils existent deux types de colonnes :

Une colonne granulée : c’est une colonne garnies de grains à l’intérieur de diamètre de l ordre de 6 à 10 µm de diamètre.

Une colonne capillaire : c’est une colonne constitué d’un film très fin de faible épaisseur.

Fig. 5 : différentes types de colonnes

QUE SE PASSE-T-IL DANS LA COLONNE? Les composés se repartissent selon la règle suivante: -Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus que les composés non polaires. -Si la phase stationnaire est apolaire, les composés apolaires seront plus retenus que les composés polaires. •Dans notre exemple, la phase stationnaire étant polaire, le produit 1 est plus retenu que le produit 2, lui aussi plus retenu que le produit 3.

DETECTEURS Le détecteur suit en continu l'apparition des

solutés. Pour détecter, on utilise différents phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps. Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la phase mobile seule.

Deux types de détecteurs sont classiquement utilisés:

- détecteur UV-visible: il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne.

- réfractomètre: il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du liquide.

Fig5. : Schéma du dispositif de détecteur UV-visible

CHROMATOGRAMME Analyse des chromatogrammes

Après leur passage dans la colonne dans laquelle ils se sont séparés, les différents constituant sortent les uns après les autres, avec en tête l’éluant. A la sortie le signal enregistré par le détecteur donne un graphe appelé chromatogramme. La clarté et la netteté de ce graphe dépendent des conditions sous lequel se sont déroulées les différentes étapes de la chromatographie, mais chaque chromatographie a ses caractéristiques :

- La composition de la phase mobile, très important qu’il faut préciser sur le chromatogramme car on avait vu qu’elle étais fonction de la polarité de la colonne. Préciser si c’est un mélange d’éluant.

- La composition de la colonne également a précisé sur le chromatogramme (car il y a la phase normale et la phase inverse).

Le débit d’injection de la pompe. La sensibilité et le type de détecteur.

Analyse qualitative Un bon chromatogramme se voit par ces pics : si

ils sont étroit et bien séparés les uns des autres, c’est plus facile à interprété que lorsqu’ils se chevauchent.

Le temps que chaque composé met pour être détecté après la sortie de l’éluant, appelé temps de rétention, est très caractéristique du composé dans des conditions opératoires données.

α=tr2/tr1 tr1 : temps de rétention du premier

composé ; tr2 : temps de rétention du second

composé ; α : Facteur de sélectivité entre les deux

solutés. -Si α est égal à 1, les pics coïncident ; -Si α est égal à 1.05, la séparation est

possible.

R : Résolution de la colonne pour la séparation de deux solutés bien déterminés.

R=2*(tr2-tr1)/(ω1+ω2) ω1, ω 2 : longueur a la base du pics,

fonction du temps des composés. Si R>1 : bonne séparation Si R<1 : mauvaise séparation, dans ce

cas, les paramètres appliqués a la colonnes ne sont pas bonnes.

Chromatogramme d’un additif de boisson gazeux

CONCLUSION

D’après tous ce qu’on a vu, on peut dire que la HPLC est une technique chromatographique qui est basée sur deux éléments fondamentale:

Le caractère polaire de la phase stationnaire, qui est la colonne car elle retient les composés de qui ont une polarité voisine à celle de la colonne.

Le caractère polaire de la phase mobile, qui est l’éluant, car elle va entraîné les composés de polarité voisine à celle de l’éluant.

MERCI DE VOTRE

ATTENTION