9
Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization Patrizia Pisarra, Raffaella Lupetti, Anna Palumbo,² Alessandra Napolitano,³ Giuseppe Prota,³ Giorgio Parmiani,* Andrea Anichini, and Marialuisa Sensi Human Tumors Immunobiology and *Human Tumors Immunotherapy Units, Department of Experimental Oncology, National Cancer Institute, Milan, Italy; ²Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, Zoological Station, Villa Comunale, Naples, Italy; ³Department of Organic and Biological Chemistry, University of Naples, Naples, Italy We previously reported that a melanoma antigen, recognized by tumor-speci®c cytotoxic T lympho- cytes, was encoded by intron sequences retained in a partially spliced transcript of the tyrosinase-related protein-2/DOPAchrome tautomerase gene. At difference with the mRNA encoding tyrosinase-related protein- 2, this anomalous transcript was not expressed in melanocytes. This study examined whether neo- plastic and/or normal cells of the melanocytic line- age could express additional forms of tyrosinase-related protein-2 mRNA. Screening of a melanoma-derived cDNA library with a tyrosinase-related protein-2 probe allowed identi®cation of two novel isoforms. The ®rst, tyrosinase-related protein-2-long tail, corresponds to the dominant transcript detected on melanomas and melanocytes by northern blot analysis. Tyrosinase-related protein-2-long tail is identical to the tyrosinase-related protein-2-encoding published cDNA sequence except for an extended 3¢-untrans- lated region and is originated by alternative poly- adenylation. This novel 3¢-untranslated region contains an alternatively spliced, tyrosinase-related protein-2 last exon in the second isoform (tyrosinase- related protein-2±8b). The protein encoded by tyrosi- nase-related protein-2±8b is identical to tyrosinase- related protein-2 in its ®rst 460 amino acids but possesses a different carboxyl-terminus devoid of transmembrane domain. Tyrosinase-related protein-2- long tail exhibited DOPA-chrome tautomerase activ- ity, when transiently transfected into COS-7 cells. On the contrary, no detectable activity was exhibited by tyrosinase-related protein-2±8b. Reverse transcrip- tion±polymerase chain reaction analysis indicated that tyrosinase-related protein-2-long tail and tyrosinase- related protein-2±8b are expressed by tyrosinase-related protein-2-positive melanomas and normal melano- cytes. Moreover all cell lines positive for tyrosinase- related protein-2 isoforms expressed tyrosinase and, all but one, tyrosinase-related protein-1. These data show that the human tyrosinase-related protein-2/ DOPAchrome tautomerase gene can yield different iso- forms by alternative poly(A) site usage or by alterna- tive splicing. The pattern of expression of these isoforms suggest that they might play a part in the normal pathway of melanin biosynthesis. Key words: alternative polyadenylation/alternative splicing/melanoma antigens/pigmentation. J Invest Dermatol 115:48±56, 2000 T he biosynthesis of melanins, the primary pigments of mammals, in melanocytes, is a highly complex process starting from tyrosinase-catalyzed oxidation of tyrosine and leading to different types of pigments ranging from black to dark brown eumelanin to reddish brown pheomelanins, depending on the environmental conditions (Prota, 1992; Prota et al, 1998). The process is primarily under genetic control, but is also regulated by a series of enzymatic and nonenzymatic factors, which intervene at many different levels (Hearing and Tsukamoto, 1991; Hearing, 1998). One of the most critical control points is the rearrangement of DOPAchrome, a labile intermediate that undergoes a spontaneous and smooth conversion to yield, as the major product, 5,6-dihydroxyindole (DHI), along with 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA), both of which further on in the process give rise to melanin by oxidative polymerization (Prota, 1992). The kinetic and course of DOPAchrome rearrangement is profoundly affected by a tyrosinase-related melanosomal protein named tyrosinase-related protein-2 (TRP-2) which has been extensively investigated (Pawelek, 1990; Tsukamoto et al, 1992). Similarly to some transition metal cations, most notably zinc and copper, this protein is able to produce a rapid nondecarboxylative rearrangement of 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 48 Manuscript received July 26, 1999; revised March 23, 2000; accepted for publication April 26, 2000. Reprint requests to: Dr. Marialuisa Sensi, Human Tumors Immuno- biology Unit, Department of Experimental Oncology, National Cancer Institute, Via Venezian 1, 20133 Milan, Italy. Email: sensi@istitutotumori. mi.it Abbreviations: DT, DOPAchrome tautomerase; TRP, tyrosinase-related protein; LT, long tail; 8b, exon 8b; UTR, untranslated region.

Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

����� �������� ��� ������� ����� ���� ����� ��� � ��� ������������ � ��� ���������������� ����� ����� ������� ��� �������� ��������������

�������� �������� ������ ������� ���� ��������� ���������� ������������ �������� ������� ������� ���������������� ��������� ��� ���������� ���������� ������ ������������ ��� ������ ������ ������������ !����� "��������� � #$���������� %������ � �������� &����� ����������

������ ���� ' � �������� � (���������� ��� ��������� (����� � )��������� �������� *���� &�������� ������� ���� ' �"��������� � %������ ���

(��������� &������� � !��+����� � ������� ������� ����

� ������ �� ������� ���� � ������� ����!��"��!����� #� ����$ ���% ����� & �����$��� " '� ����� #� ����� �(���� �������� �� ���������� ����� ���� ���� � ��� ����������� ���� ������������� �� ����� !���) �� ���������'��� ��� ���� �����! ��� ��� �$������� ������$*" ��� ������ ���� ���� '� �� ����� �� ���������� ) &�� ���� �������� '������ ��$��� �� ���+� ����� ��� � ��� �������� ����$�!� ��� ����� ��������� ��� � ����������� ���� ��� ����) ,������! � � �������$�������-�� ��#���� '��� � ����������� � ��� ��� ��#����'�� ������%���� � �' ���� � ��� ) &��%� �" ����������� � ��� ���$���� ���" ��� ��� � ��� ������� ���� ���� ������� � ������� ��� �������� #� ������� #�� ����� � )������������ � ��� ���$���� ��� � �������� � ������ ��� �$������� ������$*$�����! ��#�� ���-�� �(���� ����� �� �� �������� .�$������ $����� ��!�� ��� � ��!������ #� ����������� ���$����������) &�� ���� .�$������ ����� ��!������� �� ������������� �����" ����������� ���� ��� �� � ��� �� ��� ��� � ��� / ����������� � ��� ������0) &�� ������ ����� #� �����

������ � ��� ������ � �������� � ��� ��� �$������� ������$* �� �� %� � 123 ���� ��� #��� � � � ��������� ��#���$������� ����� ����� ���#���� �����) ������������ � ��� ���$���� ��� ����#���� -45�$���� �������� � ����$���" '��� ���� ������ ���� ����� ��� �4,$6 ��� )4� ��� ������" � ������#�� ������� '� ����#����#� ����������� � ��� ������) ����� � ���� ���$���7������� � ���� ������ ����� � ������������ ����������� � ��� ���$���� ��� ��� ����������� � ��� ������ ��� ����� �� #� ����������� ���� ���$� ����� ������� ��� ����� �����$��� ) ������ ��� ��� ���� � ����� �� ����������� � ��� ��� � ��� ����� �� �������� ���"��� #�� ��" ����������� � ��� ���) &�� � ���� �' ���� ��� ����� ����������� � ��� ������������� �� ����� !��� �� ����� ��������� � $��� #� ����������� ���/�0 ��� � �!� � #� �������$���� �����!) &�� ������� � ����� �� � ��� �� ��� �!!� � ���� ���� ��!�� ���� � ���� �� �������� ����'�� � ������� #� ����� � ) �� ������� ��� �! ���������� ������ ��� �! ������������������ ���������� � ���" # $�!� ���� �� ��%&'��%() �***

��� ���� ������� � ��������� ��� ������ �������� ��������� �� ������� ���� �� � ����� ������$������� �������� ��� � ��������,����� ��� �$�������� � ������ ��� ������� �� ������� � ��� � ��������������� ��� ����- �� ���- ���.� ��������� ��

������� ���.� ������������� ��������� �� ��� ��+�������������������� /������ 0112' ����� �� ��� 011345 ��� ������� �� ��������

����� ������� �������� ��� �� ���� ��������� � � ������ � ��� �������� ������ ����� ������� .���� �����+��� �� ��� ������� ��+���/������� ��� ���-������ 0110' �������� 011345 %�� � ��� ������������ ������� ������ �� ��� ������������� � "%��������� ������� ������������ ���� ��������� � ����������� ��� ���������+������ �� ����� �� ��� ��6�� �������� 7�8,��� ���$ ������/"��4� ����� .��� 7�8,��� ���$ ������,2,�����$ ��� ����/"��&�4� ���� � .���� ������ �� �� ��� ������� ��+� ���� ��������� � �$�����+� ��� ���������� /������ 011245 ��� -������ ��������� � "%�������� ������������� �� �������� ������ � �� ��������,������� ����������� ������� ����� � ��������,��������������,2 /��,24 .���� ��� ���� �$�����+�� ��+���������/��.���-� 0119' ���-����� �� ��� 011245 �������� �� �������������� ����� �������� ���� ������ ���� ��� ������� ���� ��������� ���� �� ������� � ����� ����������$ ����+� ������������� �

9922,292:;99;<07599 = &�� ����� � 2999 � ��� ������ �� ��+��������+� "��������� � ���5

18

���������� �����+�� >�� 28� 0111' ��+���� ����� 2?� 2999' �������� ������������� ����� 28� 29995

������ ��@����� ��A "�5 ���������� ������ ����� ������ ������,������ !���� "��������� � #$���������� %������ � �������� &��������������� *�� *������� 0� 290?? ������ ���� 5 #����A �����B��������������5��5��

�����+�������A "�� "%�������� �����������' ��� � ��������,��������������' �� ���� ����' 3�� �$�� 3�' !�� ������������ ������5

Page 2: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

"%�������� .��� ���+����� �������� � "��&� /������� �� ���011045 ���������� �������� �� ��� ��������� ���� � ��,2 �������� ��� ������� � ��+���� ������� ���.��� ���� ������� ��������������� � ���� ���������� � "��&�,����+�� ������ ����������� ����� ��� "��,���������� � ������� ���������������� � �� ���� �$������� � � ������ /���� 013845 ����������� ������� � ������������� ��+� ���� �����C�� � ���������C������ � ��+���� � ��� ��+��+�� ������ ��� ������������������� ������ ��� ���������� � ������� � ������� ��� ������������ ����������5 � ������ ����� �"�� �������� � �������.��� "%�������� ����������� ����+�� ��� ���� �� �� ��������� ��+���� ��+���������� /(������� �� ��� 011D' &����� ��� ������011D' E�-� ��� �� ��� 011D45 ��� ������������� ����� � ������� ��� � ��������,������� ���� ���� ��� ���� ������ �� �������������� ������ 0?@?2 .��� � ������ ������ ��+���� ���� ������$���� ��� � .���� ��������� ��� ���� ������� ���� � ���������� /(������� �� ��� 011D' ����� �� ��� 011745 ��,2 ������D9F ����� ���� ��@����� ������� .��� � �������� ��� ��,0 ����������� � ������ �� ��� ����� ������� � ��� ���� � ���������������� ������� ��������� � ������ �������� ������+�� � ��������������� �.� ������,������� ������� ��� � ������������� ������/(������� �� ��� 011D' &����� ��� ������ 011D' >��-��� �� ���011D' E�-� ��� �� ��� 011D' ����� �� ��� 01174

(����� ��� ��+��+����� �� ������������� �� ��� ���� �$�����+�� ���.� ���� ����������� �������� ��� �� ���������� � ��+�������������� � ��� ������ � ���� /%-����� �� ��� 0113' ��-�� �� ���011G' ����� �� ��� 0113' � ����� �� ��� 011345 �������� ����+����� ��� ����������� � � ��������,������� ����� ��� �� ������������ ����� ��� ����� ��������� � � ����$�� � � ����� ��� ����� �����$� � ������� � � ��������� /��-�� �� ��� 011G45 ���� ������ ��������� �������� .��� ���� �� �� ������� � ���������+�� ��������� ���� � ����� ����� /H��� �� ��� 0118�' ������ �� ���011G' ������ �� ��� 011345 �� ���������� .� ��+� ������� ������C���� � �,��83900,���������� ��������,�����C� � ���� �������������� � �� ������ ��@����� �������� �� � �������� ������� �� ���� ���������� / ������ �� ��� 011345 ���� C������ �������� .������ �+������ � �������� ���� ���� ��� ���� �������� ���������� ��� �$����� �� ����� �.� ����������� � �����$������ 25?��� D57 -� /��I���� �� ��� 0133' (������� �� ��� 011D' E�-� ��� �� ���011D' ����� �� ��� 01174 ��������� ����� ������ ��� ������ �� ��"�� ��������� �� �� ������������� �� ��� 25? -� �������� �������� ������� ����� �$���5 J������ ������� �� ���� � ��������.�� ���� ���+���� � ��� ���������� � ���������+� ����������.����� ��� ����� ��� ���� ����� ��� ������ ���������� ���������� ��� �� �� ��������+�� /��I���� �� ��� 0133' ������ �� ���0133' ������ ��� ������ 0110' ��������� �� ��� 01104 ��� .����� �������� ������� ���� ���� ������� ��� ����������� �����$�� ��������� ���� 0G;��099 /(����� �� ��� 011845 ���� .� ��������� ����������������� ��� � ����� �������� ���� ����� � �.���+�� ����������� � ����� ��������� ������� ������ ��������� ���!� ����� /�� ���4 ����5 ��� C���� ��������� ������� ������ � ��" ���� /�� � #4� ������� ��������� ����+�� ��� ���������� ����� �������� � ��� �.� ��6�� ��� ������� ������� ���������� ��� ������� ���5 �� ����� ��� ��� ��������� �� ��"�� �� �� �$������ 2?07 �� ���� ?�,������������ ������ /?�,!�45 ��� ������� �� �$%�� ��+��� � ����������"%�������� ����������� ����+�� � �� �� ���������+�� ������� ������� ���-� ��� � ��������� �������� ������� ������5 �� �� �$%�� ������� �$�� G �� ��� 6����� �� ��� �������� �$�� 3 ������� ������ �� � ��� �� � #� ��� �� � ���+����� ��������C�� �$��������� �� ��� ������ ������ � ��� ��. �$������ ?�,!���@�����5 (��� ���� ��� �$�������� �� �������� �� ��� ����������� �� ��� ��� �� ��������� ��� ���� �� ������ ������� ���5

���#�� � ��" �#��%"�

� ����� ��� ����� � � ��������� ���� -�� ������������������ /257� 0974 ��� � "�7,� �����C�� �"�� ������ � �������������� �������� ���� ���� ��03G?2 �� ���� ��� ��-�� ���� �$��������+����� ���&��'� / ������ �� ��� 01134� .��� ������ ��� ���������� �� �� �������+�� ������� � ��� �������� /� ���� �K� ��������� �����

&������� !L45 J������ .��� ���6����� �� � ������ � .����� .��� � ��� ����/09F ������ ����� � ������4� ���������� /057� ��&�� 957� ��%�4 ��������������� /D� ��&�� 957� ����M�&� ��G52� 957� ��� ���������������������� ����4 ��������� ��� .��� ���� �@���������� �� 2� ������ �������;�������� ����5 � ����������� .�� �������� �� 08 � .��� � /�,4�&��?2�,������� "�� ����� ������������� �� ��� C��� �.� �$��� � �� ������� ��@�����5 ��� C����� .��� ���� .����� �.��� �� 2� �������������;�������� ���� �� ���� ����������� �� 07��� ��� �.��� ��2� ������ �������;�������� ����� 950F ������ ����� � ������ �� 77�&�� ?9���5 �������� �$������� ��� ������+� �������� .��� ���6����� ������������� ��� �� ���� ���5 ��� ��@����� .�� ���������� .��� ����������� "�� ��@������ /�(� ����� ?GG "�� ��@������' ���-��#����� ���.��-� &�4 ����� ��� " � ���������� & ��� ��@������� ��� ������� -�� /���-�� #����4 ��� �����C� ��������������� �������5&������� ���� ��� �� ��@����� ������� .�� ���� .��� ��� �������J���� #�( ,���������� /������� ��� ������ 013345

���� ���� ��� �������� ���� ����� .��� ����������� ��� ����������/��03G?2� ��0287G� ��?9D8� ��7?93� ��01D09� ��0G933;04 ��������� /��293D24 ������� �������� ��� �������� ��������� � ���������������� �� ������ �� ��� �������� &����� ��������� /������ ���� 45 ����������� ����� �L2?,�# ��� (?? ��� ��� &%�,G ���� ���� .������+���� � ���5 �5 (��� / ��.�� ��������� �� &����� ��������(�������� (������45 ��� ��������� �L(? .�� �������� ��� ��������� �� &������ &��������� /��-+����� �"45 ��� ������ ����� ���������������� �� ����� /��#�4M2?00� ��#�,D723� ��#�,2D31 .����������� ��� &�������� /��� "����� &�45 ����� ���� ����� .������������� �� ��������� / ������ �� ��� 01134 ��� ���� �� ��� �$��������� �� ���;�� �������5

������� #�� ����� � ����� �� .�� �������� .��� ���� ���� -��/N���#� ���5� &����.����� &�4� ���6����� /09��4 �� ��������������� �� �0F ������� �������� �� ��� /����������$ -��� ������� ������� �:4����������� �� � ������+�� ������� � ��� �������� /� ���� �4 ���� �������� .��� ��� �"�� ������ ��������� �� ��� ��$�5 ����� ������ .����������������� ������� � ��������,(����� ���6����� /(��������� ��������,(����� ����������� ������� L��� ������45 ���� ����������� ���� ����������� .��� �������� �� ���� �����������;� ����������� ����/����������$ L��� ������4 �� D2�& �� ? � ��� 08 �� ��������+�� 5��������� .��� .����� �.��� �� 2� ������ �������;�������� ���� ������ ����������� �� 09��� ��� �.��� �� 2� ������ �������;������������� 950F ������ ����� � ������ �� 79�& �� 07���5 ��� ��������� �����.��� ���� ��������� ��������� �� ��� ����������� ������������� �����(�������� (�������� ����������� "�������� L�� /������45 ���������.��� �$����� �� :,�� C��� �� ���� �����������5

&��� ���� ���� ����� � �4,$6 ��� &%�,G ����� /G� 0984 .��������� �� ?7�� � "�������O� ����C�� #����O� ������ ���������� 09F���� ��+��� ����� ���� 227 ��2 P��- /&������ &������ ������ ��4 ��2D �5 &���� .��� ���� ���������� .��� D�� ����� ������� � �������������� .��� 0�� ����� � ���&��'��(���#��) ������� ������ �� �,������������� /��+�������� ��� "����� &�4 �� �������� �������� ����� ���"#�#,��$����,�����@���� ������ / ������ �� ��� 011345 J��� ,����� ��������� ������������ ����� .��� ������� ��� ���� �� ������� �$��������5

,��#�������� � ��� ��� '� ���� �����#�����! ��� ��������� ����� �� � ������������ �� ���������� &%�,G ����� .���������� �� �$�������� ���� /0F ������� �D9� 79�� ����M�&� ��G57�950�� ��� ����������� ����������� ����� �� G52� 0�� ����� ��������� ���099 �� ���� ����� ������ � P������4 �� ��� �� 0 �� ����.�� � ������������� �� 09�999� " �� 09���5 ������� ������� .�� �������������� ��� (��,�� ������� ���� /(��,��� ������� ������ 4 .������ �,������������� ����+�� .�� �������� �� ��������� /������� �� ��� 011345 J��.������ ��������� 29�� � �������� .��� ��������� � 09F ������ ����� ������� ��� ��������������� ��� ���� ���������� �� � �*"J ��������/� ����,�� ��������45 ��� C����� .��� ����-�� .��� 7F ��� �� �� ���- �� ����,������ ������� 950F �.��� 29 �� 08 � �� D�& ��� ���� ������ ��� ��������� � ������� ������+�� 5 ����� ��� ������ &,07 ������� .�� ��������� ������� ��� � ������� ������� �N""# H�LJJ,��&� ������� � �$��,2 ��@������ � �� � /����� ���� ������ ���� 45&������������ ��������� ����� .�� ���� �� ��� �������5 �� �����$���������� ��� ������ ��� ������ ������� �������� ������� �� �$��,3������� ������� /����,�#�,34 � ��� ������ ��,2 ������� /���-������� ��� 01124� -���� ���+���� � ���5 *5 �������� �������� ��������� �������� (�������� �"� ��� ����������� ���� ������ ��� ����� ���������.�� ���� ����5 ��� ���� .��� ���� �� 0A0999 �������� �� 7F ��+��� ������������� ����,������ ������� 950F �.��� 295 *������������ � �������

*% 5 007� �%5 0 >! E 2999 &���&�#�)���%� %J �%*# �� � ��� ��%J%�� 19

Page 3: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

������������ .�� �������� .��� ��� �������+����M������ � ���� ������� ����-����� ����������� ��� ����� ��� #& -��� /��������45

-45����� �������� � ������� � �� ,"%�������� .���������� � �$������� � ,"%�� .��� ���+�� �$���� �� ���+����� ��������� /������� �� ��� 011D4 ��� ���������� ���� �� -�������$���������5 "%�������� ��������� �� 9597� ��������� ���� �� 853�� �������������� � ����� 95?�� .��� ����.�� �� ��������� �� � ������,������ ��+���� �� � .���� ���� ������������� �� 2G�& ����� ������������������ �� ���+��� ����$������� � ��� �������� ��� ��� �������� .������.�� � ���������� ��� �������� �� ���������� �� DG7 �� .��� �(��-��� "!,87 �����������������5 H��� �������� � ���@���� � � �����.��� ����� �� ��� �������� ��$���� .��� � � ������ ���� ����� ��-�� �������� ����� ��� �������� ��$��� � ��������5 H��� ��� ��������������������� .�� ���������� �� 6����� � ��� ����� � ��� ��� �������������� ���@��� � ��� �������� .�� �����C�� �� ��? .��� 2� �&� ��� ������� ��6����� �� ����,���������� ��@��� ������������� ���� ��� � "�� ���"��&�5 ����,���������� ��@��� ������������� ���� ��� .�� ���������� �� � ������ ��������� ����� � ����������� %"�2 ������ /7���������� ����� D58� 279��� ���������$� ��������� &�4 ����� 9597������ ����� �� ?� �������� G7A27 +��;+�� �� ��� ������� �� P�. ���� � 0��������5 "�������� � ��� ��������� .�� ������� ��� �� 21G;?09 �� .���� ������ ����� 008 �����+����� ��������5 ����������� � ��������� �������� ���- ����� ��� ���������� .��� �$������ ����������� ���+�� �� "����� "��&� ����.�� @���������+� ���� ��� � ��� �������� ��$�����5

����� � ���� ������7������� � ���� ������ /����� ����� ������75��0 ����� � J����,������ �"�� .�� � ������������� ����� ��� ����� ��+���� ������������� /�����������' �����;( �������������� �"4� ��������� �� ��� �����������O� ������������5 �&�����C������ .�� �������� �� � "�� ������� � ���� /����� 1899 ������� �& � ����' ���-��,#����45 �� � # �"�� .�� �����C�� ���������� ������ QQ�OOA �&����&����&�������� ��� ����,����������� QQ�OOA ���&&��&���������&�� ��+��� �� �������� �373 ��' �� � .�� �����C�� ����� ����� ������ QQ�OOA ��&��&,����&��&&���&& ��� ����,����� ������ QQ�OOA ����&�����&�,��&�����& ��+��� �� �������� � 717 ��5 �� �$%� .�� �����C������� ��� ����� ������ QQ�OOA ���&��&&������&&���& ��� �������,����� ������ QQOOA ���&���&&�����&����� ��+��� ���������� � 2?9 ��5 *������������� � �������� ������"����� /*���(4���������� ��� �� � .��� �����C�� � �����C� ������� /����� �� ��� 0110'����� �� ��� 0118' H��� �� ��� 01174 ��+��� ��������� � 899� 839 ���8G0 ��� ��������+�� 45 ��� �������� ��$���� ��������� � 27�� ����������299�� � ���� ����� 953�� � ���� ������ ��� 257! � �������@���� ��� ������ /��� �������� ��� ���-��,#����45 �����C������ .����������� ��������� �� ��� ����,��.� �& ���������� /���-�� �����$� 01184� .��� ����� ����C������� / ������ �� ��� 011345 (���P � ������ ������� ������������� �� 17�& �� 07���� � ����� .�� ��+���� ���� C+�������� .��� � ������������ ���� � 29 � �� 17�& ��� �� ���������� ���� �0��� ?9 � �� G2�&5 ��� C��� ��� ������ ��������� � ������ ��$� ��$� ��� ��$� ���� �� � ����� � 20 � ����5 ��������� ������ D9 �� ������� �� ������������� 8D�& �� ��� C��� ������ � � ���� ��� ��������� � ?�& �� ���� � �������� ������5 ��� ���� ����� �������� � ���� �� �� C��� 22 /*���(4� 2D/�� �� �� � #� ���������� �� �4� ��� ?3 /�� �$%�45 ������� .������6����� �� � C��� ���������� �� G2�& �� G���5 �������� ���������� �� �� �� �$%�� ��� �� � # /09 �� � ����4 .��� ���� �����C�� � ����������� QQ�M�OO� QQ�M�OO� QQ�MOO �� ��� ���������� ��������� ���+� �$���� ���������C������ .�� ��������� �� � ����� � 27 � ����5 �����C������ ��������.��� ���� ����������� �� 0F ������� ��� ��� ������� .��� ���������������5

#�! ��

� ����� � ��������� ���� � ��� � ��� �������!��� �������� ���� ���� ��� � ����� �������� ������� ������� ���.� �� ������� � ���������� ������� � �� � �����������.��� � �������� ���� � D5?MD57 -�� ��������� ������� ����. 23���� � .��-�� �$�������� � � 25? -� ���������� ��� ��������������� ��� ������� /��I���� �� ��� 0133' (������� �� ��� 011D'E�-� ��� �� ��� 011D' ����� �� ��� 011745 ��!��� : /���� �4 ������ ���� ������� �������� .��� ��03G?2 ����� ��� ��-�� �� �������������+� �$������ .�� � �������� .��� � �"�� ������������� ��� C��� �.� �$��� � ��� ��������� �� � ��������@����� /(������� �� ��� 011D' &����� ��� ������ 011D'E�-� ��� �� ��� 011D45 %� ��� ����� � ��� ����� ��� 25? -�

���������� ����� ���������� �� ��� ������ �� � �"�� �� ��������C��5 �� ��+�������� ��� ������ � ��� �������� ���������� ����� ������ ���������� ��,2 ����������� �$������� � ����� � ���������� ��� �������� ��� ��03G?2 �"�� �$�������� ������ .���������� .��� �$�� 0M2 ?2�,������� �� � �����5

�������� ������+� �"�� ������ .��� �������� ��� ���6����� ������������� ��� �� ���� ���5 (���� �� ��� ��������� �� ���@����� /(������� �� ��� 011D+ &����� ��� ������ 011D'E�-� ��� �� ��� 011D4 ��� �� ���� � ���&��'�� �� .���� ��������� .�� ������� ��������� .��� ���� ������ �������� �������������A � 7 -� ������� ��������� ��� +����� ��� �� � 7�,���������� � 95G -� ������� ���������� ���� /�$��� 2MG4 � ��������� ��@������ ��� � 2 -� ������� ���� �������� ��� �$�� 3 ���?�,!� ������ � �� �� ������ ��� ��������� ���� � ��� +�����5�� �������� �� �"�� ������ .���� ������ �� � ������� ��������� ������ �$������ �� �� �� ����� � �� � ������� �.� ������������� /� ��� ( ��� &4 .��� ������C��� ���� ���.��� ���������,����� �� ��� C��� ��+�� �$��� � �� �� ��� ������� �� ��� ������� ��� ?�,��� ������ /���� ��� ���.�45

����� �� � ���� � ��� ; �������� � ��� ������ ��� ����������� ������������� ��� � �!� ��@��������� ��� � � �� � �"�� ���C���� ��� ������� �� ��� ����������� � �"�� ��� ���������� 8 �� �� ��� ��� /���� ��� ���.����������� ��������� �� E�-� ��� �� ��� 011D45 ��� � �� (���������� .�� D787 ����������� ���� ��� .�� ��������� �� ��� ������������ �� ��� ��������� �� � �"�� ��@����� /(������� �� ���011D' &����� ��� ������ 011D' E�-� ��� �� ��� 011D4� ��� �������$������ .��� � ��+�� ���������� 2?07 ����������� ���� ?�,!�������� �� ��� ��� � .���� ��� ��� /�4 ���� ���� 08 �������������������� ��� ������ ��������� ��@����� .��� ���������/��! *�45 ��� ������� � ���� ���� ��������� ����� �� � #��� ��������������� ������ �� �� ��! .� ��������� ���� �� �������������� ��� �� � ���������� ���� ��������� �$������� � �������� ���� �����5 ���� .�� ���C���� � �������� ���� ���� ���/��! :45 � ����������� � ��03G?2 ����� �� .��� � ��������������� ��� ��.� ������C�� ?�,!� � �� � # /����� 7���� ��! .4� ��+� ���� �� � ������ ������� ���� � D57 -� /��! :" ����,4� ����������� ����� ��� �������� ��� ������� �+�������.��� ��� ����� ������������� �� ��� C��� �.� �� � �$��� /��! :"���� �45

��� ��. ?� ��@����� ������ ��� �� ���������� 2?91� � &���������� ��@����� ��������+� � � ��� ���� ������ ���� �� ��� �������������� /(������ 013D4 /��! *�45 ���� � ��� ���� ������ ���� .��������C�� �� ��� ������ ���� �� �������� 201G � ��� ���������

��!��� :) ������� #�� ����� � � ���� ���� ���� �� ����)����� �� ��� ��03G?2 ���� ���� .�� � �������� .��� �.� ��������� � �"�� ������5 � ����������� .��� ��� ����� ���������� ��� ��.� ������C�� ?�,!� � �� � # /���� ,4 ��+����� � ������ ��� �������/D57 -� �� ������4 .������ �������� ����������� .��� �������� .��� � ��������������� �� � �$��� 0M2 /���� �45

<3 ����� � �# ��# >%!�� %J ��*#�������*# "#���% %�E

Page 4: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

��!��� *) ,�(���� � ����+� ��� ������� -��) ����� ��@������� .���� ��+� ������������� �� ��� #�( "��� (��- ����� ��� ��,������� ������� �>0?21?2M?? /�� � # ����� �$%�� ��������+�� 4� ��� �������� ��� ��� 7�,��� � ��,2 �$�� G5 ��������� �� ������+� ����� �� � ��@����� ��������� � E�-� ��� �� ���011D5 /�4 ��� ��. �� � # ?�,!� ������ ���� ����5 ��� �.� ��� ���� ������ ����� /������,����� 201GM2992 ��� D7DDMD7D14 ��� ��$��5 ���������+� ������������� ������ /�����������03?GM03374 �� ������ ����������5 ��� ������ ��,@����� �� ��� ���� ������ &���� /�����������2?91M2?0?4 ��� ��� ������ ����� ��@���������& /����������� ?033M?0104 ��� ���� ��������� ����������� ��������+�� 5 ��� ?�,��� ��$�� G �� ���������� 0G17 �� ��������� � � +����,��� ���5 ����.� ���������� �$�� 3� /������� ��,@������ ?22DM?2G245 /,4 ���������� ���������������� ����� ���� ��@����� � �� �$%�5��� 6������� ���� ���.��� �$�� G ��� �$�� 3� ����������� � � +������� ���5 ����.� ���������� �$��3�5 ��� �����$ �������� ������ ���� ������������� � ��� �� �$%� �� �� ����5

*% 5 007� �%5 0 >! E 2999 &���&�#�)���%� %J �%*# �� � ��� ��%J%�� <:

Page 5: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

��@����� /E�-� ��� �� ��� 011D4� � C����� ���C���� � ���������� ��� ��������� ��@����� �� � H�� ���� � ��� ����������� &������ (� ��� &������ � �������� /����A;;���5�����5,���5���5���A1??0;4 .���� �������� ��������� ?�,��� ����+��� ������ ���� ������ �������5 �������� .� ������� ���� ��� �� ��� ���� �������� �.� ��� ���� ������ ����� ���� ����� �� �����������������+�� ��+��� ���� �� ����������� � ������� ������� /�� � ���� � #4 ��� .��� ��������� ������ ���������5

����������� �����! � � ��' ��� � �� �� �#�� �� ���������� � ���� � ���� ���� ��@����� ���� ������������ ���� � �� & ���������� .�� ���������� �� ��� C��� 0G17����������� �� ���� �� � ��� �� � #� .��� ��� ������������ ������ �$�� G,������� ��@������� ��� ������ ��� ���� �� ������������ ���� /��! *,45 ��� ��������� � ��� ������ ��@����� ����� ���������� .��� �� � # ��������� ���� � �� & ��������� �� � D18 �� ��������� ������������ ��� .���� � �$�� 3 ������� � ?�,!�� �� �� ���������� ?22D5 "�.�������� ��� ��@����������������� �� ��� ?�,������ ������ � �� � # /��! *�� ,45��� ������� ��,���� ����� ���� ��@����� ��������� ���� ������ ������� ����� � � �� & ���������� .�� ��������� �� ��� -��.�

�� � �� ��� C��� D89 ����� ������ ������������� �� �$�� 0MG,������� ��@������� .������ ����� ������� � �$�� 3 .����������� � � ��. �����$ �,�������� 0G ����� ����� ��� /��! *,45

��� �������� � � ������ ������ ������ ��� ?�,!� ��@����� �� �� � # ���������� ��������� ���� �� ����� ��������� � ������+���. �$��� ��������� �� 3�� ���������+�� ������� ������� � ���-��.� �$�� 35 H� ���� ��� ��� ���������� ��@����� � ��� ��������� � # ������ �� ����� �� +��� ��� �������� � �����������@������ �������� �� �������� �� �����5 ��������� �� ��� �$��M������ 6������� ��@������� �������� � ����� �� �� /01174� ��� ?���� � �$�� G /&&��4 �� �������� ������+�� /��! *�45 �����+���.� ����� ������ ��� ������+�� ��@����� ����&� ������� �� �� �������,����� ��@����� /��� ��������� ��@����� �� ���� ������ ��E��E� .���� E ��� ��� � �������� ��� ������ �����������������+�� � ��� � �� �� ����������4� ?7 ����������� �� 7� � ���������+� ?� �������� ����� �� �������� ���������� .��� �������������� /���� 0118' &������� �� ��� 011G4 /��! *�45"�.������� ��� ��� ������,����� ��@����� �� ������� � .��-�

��!��� .) ,������ ����� ������� � �������� ��������� ��� � ���� ���� ���� )��� ������ ���� �� �������� ���� �$��������� ������������5

&�#�� �) -45����� �������� � ������� � ���� ������4,$6 ���

����� � "%��������������������� ����/� �DG7;���4;09M2 ���

"�� ����/F4���

"��&� ����/F4���

&%�,G ����� ���������� .����� � 75D 7? DG�� � # ?5? 87 27�� � %� 257 13 2���&��'� 258 11 0

&%�,G ����� 258 099

��03G?2 858 ?8 G?

�"��� ��� �$������� �� ���� +����� �� �� ����� �.� �$��������� .��� � ������������� ��� ������� ����� � &%�,G ����� ������������ �� ���������� .������&��'� ������� ����� �� �������� ��� ����� ��,2 �������5 ����� ���03G?2 ��� ����� �� ������+� �������5 �" ��� ��� �$���� 09F5 ���� .����������� � �������� � 25D �� ������� ��� �� � "%�������� ��������5

� ,"%�������� /95? ��4 ���������� �� � ���� � 257 /� �DG7 ��� ���4;09M2

��+��� "�� ��� "��&� �� 11F ��� 0F ������ ��������+�� 5������+� ����� � "�� ��� "��&� ��������� ������� �� ����� �������� ����5

��!��� 1) ������� ������������ #� '� ���� #�� ����� � )����� � ����� ��� &%�,G ����� ������������ /���� �4 �� ���������� .�����,2M3�,�������� /���� �4 �� ���� ���&��'� /���� �4 .����������������� .��� � ��������� ����� /&,07 ���4 �� .��� � ��� ������������� �������� ������� � �� � �$�� 0 ������� /&,0745 �� ������������� ��� 72 -"� ��,2M3� �������5

<* ����� � �# ��# >%!�� %J ��*#�������*# "#���% %�E

Page 6: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

������+�� � ��������,���� ����� /&������� �� ��� 011G45 J����� � �����+������ �� ������������ �� ��� ?� ������� � ��� ������� ��������� �������������� �� ��� ?� ������ ���� � ��� ������+� ��. �$��� ��������+�� /��! *�4 /���� 011845 ��� ����� �������� ������ ������������ ����+�� �� ���,��� ��������� ���� ���C����� ����������� � � ��. �$�� ��.������� ��� ����5 ��-�� ������������� C������ �������� ���� ��� � �� & ���������� ���������� � ��+���� � ��� ������ �������� � � �������� �+��� ���.��� ���7� ����� ���� � �$�� G ��� ?� �������� ���� � ��� ��. �$��� ���� ��6����� ������� � �$�� 35 ���� ���������+� ������� ��������������� ���.� �� ��! . .�� �������� ����� �� �� �$%�5

����+� ���� ���� ���� �� � �������� ������ ������� �� ������ .������ ��� ��+�� ���������� ������� ������� ����� �������� ����+� �������� ���&��'� �$�������� +����� ���� �� �������� ������ ��,2� ��,2, �� �� ��,2M3� .�������������� .��� � ������� ������� ���� ��� ��� � "��������������� ���� &%�,G �����5 ����� � ����� ��� ��� ���������� &%�,G����� ���.�� +�� ������� �,������������� ����+�� ��� .������6����� �� "%�������� ����������� ����+�� 5 ���� �� � ����� �������+� ���� ����� �� ������������������ ���������� � ������� � "%�������� ���������� �� DG7 ��� ������� .��� ����,���������� ��@��� ������������� @����������� � ��� ���������"�� ��� "��&�5 &�#�� � ���.� ���� ��� -������ � "%��������������������� ��� ������� ������������ .��� ��� �����C����� ����C�� � ��� �������� � ������������ ��� ���&��'����������� &%�,G ����� � �����5 &��+����� � � ����"%�������� ����������� ����+�� .�� �$������� � � ����� ��� � ���������� &%�,G ������ .��� � ������������� ���� ���������� ����� ���������� .��� ����� �������� �� ��� ��03G?2�������� ���� ����5 � ��.��� ��� ����� �����C���� ����+�� .�������+�� �� &%�,G ����� ����.��� ����������� .��� �� � #'�� "%�������� ����������� ����+�� .�� ���.� � ��������������� .��� �� �$%� �"��� �������� ��� �$�������� ���� ������������� ������� ����� �� ������ ������������ �� .���������� ���� ���5 ������� �� ���.� �� ��! 1� &%�,G ����� ����������.��� ��� �� �$%� ���������� �������� ��� ��� ������������ �����&��'� ���������� ������ �$������� � 72 -"� �������� ����������

� ��� ��� ������ ������� &07� �������� �� � ������� ������� �� ����,�������� ������ � ��,2 �������5 ��� ��,2M3� ������� .����� ���������� � ��� ������������� ��������� ����� /&,07 ���4/��! 14� ��� � ��� ����,�#�,3 ������� /���� ��� ���.�45 ��- �������+�� .��� ���� ������ ������� ���C��� ��� ������� � �$��,3������� ����� ���� ��@������ �� ��,2M3� �������5

&�5$*" ����+�" ��� ������� ���� ���� ��� ����� ���� ������� ��� �������� ��� ���� �� ���� ��� �������������+� ��� ���� ������ ��� �������� ��� ���@�� �� ����������03G?2 ��� �� ������ ��� ���������� � �� � # ��� �� �$%��� ���������� ��� ������ ����� � ��� ������� ��� �������� � ������ ���� ������ ���+����� ������������� �� �$�������� � ��� �� ����������� / ������ �� ��� 0113 ��� ����������� �������4 .�� ���� ����� ��� �$�������� � ���� ���������� ������' #$�������� ���������� ��� �� � ���� �������� .��� �� � ���������� �� ����������� � ��� �������� �� ������$ ��������� �� ������������� � ��������� ������������� /%���. �� ��� 011D'L��� ���� �� ��� 01134 ��� �$�������� � *���( �� � ������� ���� �������� .��� ���� ��� �� .��� �� ��� ���� �������5 ��.�� �������� ��� ��+���� ����������� ��� ���� ���������� ��+���� �,������+� /��������� ��03G?24 ��� �.� �� �,������+����� ����� �� �,������+� ������ ������� �� ����� ��� ��� ��� �,������+� ������ ������ ���� ���� ��� �����C�� ����� ��+�����������������M�&5 ��� �����C��� � ��� ������� �� � ����������� ���� �� �����C������ .�� C��� �������� �� �������� �����������"��� �� ���� � ��� ������� ��� �� ���.� �� ��! </,45 ��������� ���� �����C� �� ��� ������ �� � ������ ������ ���������� ��� �$������ ������� ��� �������� ���������� ��� ������"��� .������ ������ ����� �����C� �� �� � # ��� �� �$%������ ����� ��� �������� ���������� ��� ������������� �"��������5 �& �����C������ �� �� �� �� � #� ��� �� �$%������������ .�� ��$� �������� �� ��� ����� � �������� ���������� �� ���� �����5 �� � # ��� �� �$%� ������� .���������������� ������� �� ��� �� �,������+� /��! <�� ����� �$-4���� ��� �� �,������+� /��! <�� ����� % ��� .4 ���������5 ��� .��� ���� ������� �� ������ �� �,������+� ������� ��� /��! <������� �/$��4� �������� ��� ���� ������������� �� �� �$%� .��

��!��� <) ����� �� � ��� ��� ��� �$�������!��� ������ �� ������� ��� ����������� ���� ) /�4 �� �� �� � #� �� �$%�� ��� ������ /� �4� ��� �� � �$�������� .�� ��������� ��+���� �������������M�& �� �"�� ����������� ��������� -��.� �� �� ������ �� � ����,��+� /��03G?2� ��0287G� ��?9D8� ��7?93��L2?,�# � ��01D09� ��293D2� ����� �$-4 ���� � ������+� / (??� ��0G933;0� ����� % ���.4' ��� ������ ������� �� ���� ����� /��#�,2D31� ��#�,2?00� ��#�,D723� ����� �/$��4���� ��� �L(? ������ ������ ������ /���� ��45*���( �����C������ �� ���.� �� ������� ���������� �������� 5 ��@������ �� ��������� �� ���������� ���� ��� ������ �� 0�������� ��� 0�����5�� � .�� �����C�� .��� ����� ������ QQ�OO ��,����� �� �$�� 2 ��� ����,����� ������ QQ�OO ��������� �$�� 7� �� � # .�� �����C�� � ������QQ�OO ��� QQ�OO /��! .� ��������� 2??GM2?78 ���?01DM?0G7� ��������+�� 4� �� �$%� .�� �����C��� ������� QQ�OO� �����C� �� �$�� G;�$�� 3� 6���,���� ��� QQOO /��! .� �������� ?DD2M?D2?45 �����C,��� � ��� ������ ����� �� ��� ������� ��,2������� �� ������������ �� ����� (5 �� ���� � #� �� �$%� ������� "��� ��� ��� ��,���C�� � QQ�M�OO �� � �������� �����C� �� ��������� �� � ������ ������ .������ �� � # /QQ�M�OO4 ��� �� �$%� /QQ�MOO4 ������� �����, ��� ��� ������������� �������5

*% 5 007� �%5 0 >! E 2999 &���&�#�)���%� %J �%*# �� � ��� ��%J%�� <.

Page 7: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

���� �� ��#� 2D31� � ���� -��.� �� �$����� ��. ��+��� � �� �/ ������ �� ��� 011345 �����C������ .�� ���� �����+�� .��� �"������+�� ��� � ��������� �� .�� ���� �$������� ���������������� ������� ���,��� �������� /���� ��� ���.�45 ��� ������������ ������� ��� ������+� �� �� � ������� ���� �$���������������� .������ �� � .�� ��� �� ����� ���������� �� ����� �,������+�� ��������� ������+� ��������� ��03G?2 �����0287G /��! <�� ����� � ��� �45 �� ��� �� �,������+��������� 0G933 /��! <,� ���� .4� ���� ��������� ��� �� ������������ �������� �� �� ������� �� ��. ��+���5

"��&!���%�

���� ���� ������� ��� ���������������� � �.� ��+�� ����� �� ���� �������5 ��� C���� �� � #� ����������� �� ��� D5?MD57 -� ��� ���� ��������� �$������� � ��� ��6���� ��������� ������� �� �������� � �������� ���� ���� ��� /��I������ ��� 0133' (������� �� ��� 011D' E�-� ��� �� ��� 011D' ����� �� ���011745 �� � # ��������� �� �������� �� ��� -��.� �� ��"�� ��@������ .���� ���������� �� ��� ���������� � �����$�,����� 25? -� /(������� �� ��� 011D' &����� ��� ������ 011D'E�-� ��� �� ��� 011D4� � ��+�� 2?07 ����������� ���� ?� ������� ����� ��� � .���� �� ������� � ��� ���� ������ ����5 ���� ��.��@����� ���� ��������� �� �������� 2?91 � &���� ��@�����/(������ 013D4 ����� �������� .��� ��� ����� ��@����� ��������������� �� ��� ?�,��� ������� � ��� ��������� �� � �"��/(������� �� ��� 011D' &����� ��� ������ 011D' E�-� ��� �� ���011D4� ����.� ��� ��C������ � ��� ?� ����������� ���� � ��� 25? -��� � ����������5 ��� ��+�� �"�� ��@����� ��� ���� �������������� ��� #�( �������� /���� @��� � ����� 8� 29994 ������������� ������� ��� 17 �� 099F .��� ���� .��� ����� /���?99 �� 899 ��4 �$������� ��@����� ���� /����� �� ��� 01134 ������������ ������� �"�� ��������� ��������� ���� ����� ��� ����������� ���5 ����� ����� ��@������� � ��������C�� ���� ���������� ����������� �+�� ������ ��� ������ ��@����� .��� ������ ��������+������ ��� ����5 �� ���������� .��� ��� ������� � ����� ������������� ���� �� � ��� �� � # ���� ������ � ���������"%��������,����������� ����+�� � .��� ��� ���� ��������������������C��� �����+�� �� ����������� ��,2 ��� (08MJ09����� �������� /����� �� ��� 011045 ��� �������� � �.� ������������ ��� ���� ������� ��� ������� ��� �� ��� ������ � ?�,!� �������� ���� ��� ����� �� ��+��+�� �� ��� ��������� �������� "%�������� ����������� ����������5 % ���������� ���������?�,!� ��+� ���� ��+��+�� �� ��� ��������;������������������������� �������� � ��� �������������� /"��-� �� ��� 0133'���-��� �� ��� 011D' ���� 01174 ��� ����,��������������� �+������+� ���� ������ ���������� �� � ������ ��������� �� ��� �������� ������������ /��I���� �� ��� 0133' (������� �� ��� 011D' �����,����- �� ��� 0117' ���� �� ��� 0117' ������� �� ��� 011G' ��������,#������ �� ��� 011G45 �� �������� �� ��� �������� ��+��+����� � ���?�,��� �� ����,��������������� ������� � ��,2 �$��������� ���������+� ��������� � ������ �� � ���� ��� ��� � �� �������� �������� ����� ���� �� ������ � ��� ���������� ����������+� �� ��������� � ��������� ���� � �� ���������������� � ����� �� �$����� ����������� ��������� ��+����������� ���������� ��� ����,� ��,�����C� ������� ������� /(�������� �� ���013G45

#+������ � ���������+� �������� .����� ��� �� � ���� .�����+���� � ��� ��������� � ��� ������ ���������� ������5 ���� ��.������� �� �$%�� �� ��������� ���� �� ��� ���������� ��� �����,���� ��+�� �� �$�� 0MG �� � ��@������� ��� ������ � � ��. 0G����� ���� ���� �����$ �,�������� ������ ������� � �����������?22DM?2G2 � ��� �� � # ?�,��� ��@�����5 ���� ������ ������������ � ��@������ ��@����� �� ������� ���,��� ���������� ����� /���� 0118' &������� �� ��� 011G4� ���������� ���� �����. �$�� .� ����� 3�� �� ��������� .����� ��� �� � ���������� ��� ����� ������ ��������� � ����� �� ��� 0117' �������������� � ��� ��� /�4 ���� �� ��� ?�,��� � �� � # ����.� �$�� G,������ ��@������ �� �� ������� �� ������ �$�� 3 �� �$�� 3����������� �� ��� ����������� .���� ���� ������� ����� �����

������ � 701 �� � DGG ����� ���� �������� ��������+�� 5 ���������+�� ������� ���� ��+� ���� ��������� �� ������ ��,0 ���� �������� ���� /��I���� �� ��� 0133' ������ �� ��� 0133' ��������� ������ 0110' ��������� �� ��� 01104 ��� �� ��� ������������ ����� .���� ������� ���������� ������ �� ������ ����������+� ����� � �.� ������� ?� �������� ������ �.� ������������������� ����������� �����$ �������� � 880 /��0994 �� 883/����0G4 ����� ����� �� ������� ������� ��� �� �� ��,����20 �� ��������;��������� /(����� �� ��� 01184'

��� � ��������,������� ����� ��+� � ������+� ������������������� ���� ������� ��� �������� �� ��� ����������� ��������/������� ��� ���-������ 01104 .���� ��� ��� ��������� �� ���������� ��������� � ��� ����������� ����.� /%���. �� ��� 011D'L��� ���� �� ��� 011345 �� �� �$%� ���-� �$�� 3 ���� �������� ���������+� ������������� ������ /E�-� ��� �� ��� 011D' (��������� ��� 011D' &����� ��� ������ 011D4� �� ������ ��� �� ���� �� ������� ����������� �������� ��� ����� �������� ��������� � �������+������ � �� �5 �.� ������� ���� ��������� ������ � ����,������������� ������� ��� ����������� �� � ���������+� �������� ��+����� ��������� �� ��� ����� ��G7;��,0 /��������� �� ��� 0110':� �� ��� 011G4 ����� �������� ��� ��� ����� ��,0 �������/(���� �� ��� 01134 ��� ���� ���.� �� �������� �� �������� �� �� �������� ����������� ������� /L��� ���� �� ��� 01134� "��&��$����� ����+�� /L��� ���� �� ��� 011D45 (��� ���� ��� ��+��� ���� �������������,�������� ������ ��� ����� ������� ��� ������� ����������5 #���������� � ��� �������� ��������� �������� ������ +������� �� �� �$�����+�� ���� ������� �� ��� ����������� ������� ���� � ��+���� ��������� ��������� � ��-��� ��������������������� ��������� ��� �������� ��+��+�� �� ��������� ���� �����/&���� �� ��� 011D' ����� ��� ������ 0118' "������ �� ��� 011G')��� �� ��� 011345 "�������� �� ��� ������� ���� ��� ����� �$��������� ������ ��������� �� ������������ ����� /&���� �� ��� 011D'����� ��� ������ 0118' "������ �� ��� 011G' )��� �� ��� 011345

����� � &%�,G ����� ���������� .��� �� �$%� �"��� ��+������� .��� ����� � &%�,G ����� ���������� .��� �� � ����� � #� .��� ��+��� � "%��������,����������� ����+�� ��������� .������ ���� �$��������� ������� �� ��� �������� � ������������+�� ������� �� � �������5 �� ����� ��������� ����� ����� ������� �+������� ���� �$�� 3,������� ������������� ��� ��������� ���� ��� �������� �� ��� �$�������� � ��� "%������������������� ����+�� 5 ������������ � ��@������ �������� �� ������������������ �������� �������� ��� ��� ����������� ����������� ��� ���������;� ������� ����.� ��+� ���� ������C�� ������� ��,0 � ��������� ������ ��� ������� ���� ���- ���� ���������� �� �� �������� �� ��� ����������� ��������� ��� ������������ ������ /*�6� �������� �� ��� 011745 � ������������ ����������+�� �� ���� ���� ����� �� ��� ����� ������ � ����� �������� ��-�� �� ���+��� ������ ��,2 �������� ���������� ������ ������������ ���������� � ��� ������������� ������ �� ��� ������� ����� ������� /(��� ��� >��-���� 011745 �� ���� ����� �� ��� ����� ���������� ���� ��� ��������������� ����� ���� �� � ���������@��������� � ��,0 ��� � �������� �� � ���������������������� �������� ������+�� ��� /(��� ��� >��-���� 011745�� � # ��� �� �$%� .��� �������� � ��+���� ���������,

����M�& �� ��� �� �,������+� ��������� ������ ���������� ������� ��� ������������� �$������� .������ �� ������ .�� �����+���� ��,2,������+� ���� �����5 ��� .��� ���� ����������� �$�������� ��� ����� ������ ������� �� ����� ������� �������� �� ��� ����� �� � %� �� .�� ��� ����� ����������5 ( ������ .���������� ����� �� .���� �0���- ��� .�� �$������� �� ��.����+��� ���� "��// /(����� �� ��� 01184� �� ������� �� �� � ������+���������� � �� ��� ���� ����� �$������� ����� �� � ������� .����� � # ����� ��� ���� �������� ���������� ��� �� �$%� ������� �������� ���5 ������ �� ��03G?2 �"�� ������ � �� �$%��"�� ������ ����������� ���� ���� 07F � ����� ��,2,��������������5 ��� �� �$%� ���������� ���+�� �� �� ��C���� �� ���������� � �������� ���� ���� ��� �� ��� ���� ���� �������� �������� ��������� ����������� � "��// /"��// ��14 ��� �� � /�� � 2& �4 .���� ���������� �������� ����������� ��+�� ���� ��

<1 ����� � �# ��# >%!�� %J ��*#�������*# "#���% %�E

Page 8: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

�������� .����� ��������� �� ��� �����$� � � �,��83900� � �,�?0 ��� � �,��83900 ������� ��+� ���� ���.� �� ���+��� � �������� � � ����$�� � � ����� ��,��C��� ������ �������� ���������������� �������� /������ �� ��� 011G' ������ �� ��� 011345 ����������� � �����$ ,�������� ��,2;��,2, � ��� ��,2M3������ ���� ��@������ ��+����� ���� � ���� �� ���� � ����������������� ���� ������ �� ��������+� ������� ����� �� �������� � �������� ��������� ��� ���� ������ � �,��9290 ������/H�� ���� � ��� �������� ���������� � ������ /����A;;�����5����5,���5��+A39;������;� �R����;4 ����� ����� ��������� �� .���������� �� �$�������5 ��,2 ��� ���� ���.� �� ������� �� � �������� ��� ������ �������� �� �������� /H��� �� ��� 0118�' ������� ��� 0113' ������ �� ��� 0113' ���-����� �� ��� 0113' � ����� �� ���0113' (����� �� ��� 299945 �������� �� ���� �� ��� ��+�� ��� � ��� ������ ���������� ���� ����� ����� �� ���������� ������ �����.� �� � �������� �� ����� ��������� �� ���� ������ ���������� / � J�� �� ��� 011G4� ����� ������� ��P����� ����;����� ������������5

��+�� ��� �������� ��������� ����� ������� � ��� � ��������,������� ���� ���� ������� ��� @����� ��� @������ � ����������������� /%���. �� ��� 011D' L��� ���� �� ��� 01134� �$�������� ���������� ��� �� � .�� ��+��������� �� ��� �� �,������+� ����� �,������+� ���� �����5 �������� ��� ������� �� �����$������� ��� �� � ������� .��� ��� ������+� �� ��� �$��������� ��������� ��� ��� ��� ��� /��03G?24 �� �� � ���5 �� �����0G933 �� �,������+� ����� ��������� ��� �� � �����������.��� �������� �������� �� ����� ���������� ��+���5 ��� ���- � �� 0 �$�������� � ��03G?2 ���� �$����� �� � ��� ��������� �� ������+��� �� �� ���������� .��� ��� ����������� ���������� /J��� �� ���299945

��� C����� ���� ��� �� �;"� ���� ��� ��� ���������������� ���������� �� ��+� ���� �� ������� ������� .��� �������$������ ?�,!� �� ��+��� � ��� ������������� ������ .������� ����. �� �� �������� .������ ��,2 ����� ��� ����� ����+�� ��� ������� �� �������� �� �� �������� ������� ����� ������ �������� ������+� ������������ ��� ��������� ������������5 ������������������� �� ��� �� ����� ��������� ��� ���6����� �� � +����� � ��������� �� ��������� ������ ���� ����� ��� �� � ��������������� ��������� ������� ��� ��� ��������� � ��+�������������������� /����� �� ��� 0110' ���� �� ��� 0117' ��������,#�������� ��� 011G45 �� �������� ������ �+������ ��������� ���� ��� �������� ��,2 �� .��� �� � ��,0 �� �� �� ��� ����� .�������������� ����� ��� ����+�� 5 � ���� �� ��,2 �� �������� ����������� �� �����+����� (,������� ��������� ��� �� ���+��������� ���� ���������������� ������ �� ��������� �������� ��� ������������ /&�� �� ��� 2999' ������-� �� ��� 29994� �������� ������������ ���������� ��+��+�� ��� �������5 L��.����� � ���������� ������� � ��� ������ ����������� ���� ��� �� ������������ ��� �� ��� ���� ����� ���+��� ��. ����� �� � ������������������� � ��� ���� � ���� ������� �� ��� ���������� �������������� ��� ���+�+�� � ������ �� ���������� ����� � ���������� ��� �������5

3� �!�� ��4� � ����4 0�� *' &������ ��� 2' ,������ 5� �4���5!� ���������

����������6 0�� ,' 7���� 5� �������� ���������� ��� 0� 0��� �88��� 5�

�����4' ��� ��4 ��� ��������� �!������ �� ��� "����� 1�/'�.%'99� ���

1�/'�.%'%�� 5� �2�76 0����6 2����' �����8�� ������� �� ��������� 5 �

5�������� �� :2�76 0����6 2����'

#J##�&#�

�����,����- )� �.��� *(� ����-� �� �� ��A ��������� ��� ����������� ������������ ������ ����� ������� ��� � ������������ ��������5 ��� &��� ���� ���;�� 12A0G31M0G1?� 0117

���� �� ���� �� ������� E� ��������� �A &���������� ���.��� ��� ������ ������������� � �������� ��� ��+���� ��� � �������� ����+�� �� �������������� �������� ����� �� �������� �� +������ ������������� ��������� ������5< 7��� ������ 08?A893M80D� 0117

����� �� ������ � ������,(����� >&� ����� >�A �����C��� � ����������

����������� ��� ���������� � �����$ ����� �������5 &������������� �� ������ �� ����+� ����5 ,���� < 2GGA?1?M?1G� 0110

������� J�� (���� � L������� #� ���� ""� ������� >�� ����� >��� ������ LA7!����� ������ �� 0���!��� ,��"�5 >��� H��� S ���� ���5� ��. E��-�������������� ������� �������� ��� ���+��� ������� ������� 0113

(����� �� �� �,�� ������ �A ������� ������������ ��� ��@����� � �������/� ���-4� ��� ����� ��������� � ��� ����� ���+�� /��4 �����5 < 2����� ��� ���098A2DM2G� 0118

(����� ��A ��� !D ����� ������� ������������������ ��+��+�� �� ��� ���� ������T&��!�� ?91A0G1M032� 013D

(���� #� ��-�� &� )��� �� L��� ���� �� ������� *>A ����� � �������� ��������������,0 /��,04 ���� ��� ������� �� � "��&� �$����� ����+�� �� ���������� ������ ��,05 �=� ��� ��� GA013M29D� 0113

(������� (� "�� ������ *� >��-��� �>� &���� "� "�������� A ������������������������� � � ����� � ��������,�������,�������,2 �"��5 �������� ��$�������� �� ������� ��� �����5 �!� < ,���� 201A02GM0?D� 011D

(�������� #� ��������� �� �����,������ (A ���������+� ��������A � ���@��������������� �� ��� ���������� � �������� ������� ������� ��� ������ �����5���! ��� ,���� 78AD8GMD17� 013G

(����� *� �������� #� ���� � �� ��A ������� +���������� .��� QQ���OO � ��������,������� ������� 2 ������ �������� ����������� ��� ��� +�������5 7����� ���89A27?M273� 2999

(��� ��� >��-��� �>A ��������� � ��� ����� � ��������,������� �������,2;���������� ����������� /� ��;"��4 ���� ��� ��@����� � �.� ��+�� ���� �������5 *�� ��� 21A?7MD?� 0117

&����� >� ����� A ��@����� � ��� ����� ���������� �����������,����������,2 �"��5 *��� 0D?A217M213� 011D

&���� >� )��� �� �� &� �� ��A ���������� ��� J��,�������� ��������� � � ���������� � ��� J�� ��������5 ������� 28?A0G71M0G82� 011D

&�� H� ��- (>� (��� �� �� ��A � ��������,������� ������� 2 �� � �������� ��������� �����C� ���������� �� ���,������������������������ /��4A �����������������������5 ���"��� 01A?17MD92� 2999

&������� &>� ���� >� ������ >�A J��������� ���� ��� � ��� ��� � �������� ����� �����,��� ��������5 &!����� ����� ��� 27A333M318� 011G

"������ �� �����- L� ������ �� )���� :,�� �+����� �� (������� L� L���� (A&������ ��� �$�������� � �� ���������+�� ������� ��� �������� � ���������� � ��� ����� ��������-��,8 ������ ���������� ��0?95 :�,� #��� D02A?G1M?3D� 011G

"��-� J� H��� E,�� ����� �#� H������ ��� ����� #&A ��� ���������� � ���?�,������������ ������ �� ��� ������������� ������� � ������� ���5 < ,��7�� 28?A?9G0M?9GD� 0133

J��� "� �������� *A ��� � �������������� ������������� ����� �� ���������� �������� �� ������������� ���-�� ��,05 ,���� ,����� ��� 7 !�278A87GM88?� 0111

������� � &���� #� )���� E� �� ��A �������� ��������� � � �������� �� �������������� ��������� �������� ����������� ����������� � ��� ��� �� �������������� �� ��� �������������� ������ �� � ���������� �������� �����5��� &��� ���� ��� ;�� 1DA8209M8207� 011G

����� � � ����� "HA ������� � ��-��� ���������5 ,�� 3GA3DGM37G� 0118������� *>5 ��A �������� >>� (���� #� ������� *>� L��� �� %������ >� /���45

��������� � ������� ��������5 �� ��" ������ ����� 5 ��. E��-A %$���!��+����� ������ 0113� ��5 D??MD?3

������� *>� ���-����� LA #�� ����� ������� � ������������ �� �������5 :���,< 7A2192M2191� 0110

���-�� L�� ��$ L�A ���� ��� ��. ��������� ������������ �������� ���������C��� ��� ���� �� �������.� ��� ������.� �&5 ,�������>!�� 29ADG3MD37� 0118

���-��� >� &������� �� �������� - �� (�������� >�A ��������� � �,� � ��� ����,������ ������ ��@������ �� � ���-������,����� ��� ����� � �,� � ?������������� ������5 ,���� < 213A0D?M0D3� 011D

����� �L� %-����� �� ������ " � ���� "�A ������� ��������� �� ��������;������� �� ������������ �� �������� ��������5 < 2����� ��� ��� 000A882M88G�0113

����� )� J���� �>� L�����- A %����������� � "���� � ����+�� � �������������"�� ��� �� �� ��� �� @���������+� ��,�&5 ,�������>!�� 29A0902M0929� 0118

��� �A ��$��������� � ��� ��������� � ���������5 ,���� ,����� ���� 33?A077M080� 0138

>��-��� �>� (��� �� ���� >�� >������ � � ���� �� ����� LA �������� ������������ ������ � ����� ������������5 ��" ��� 7��� ��� GAG?M39� 011D

L��� ���� �� !���� L� H����� �� >���U���,&��+����� &� �� ��A � �������� �������������� 0 /��04 �������� �� � "��&� �$����� �� ������� ���� �������5�0,� < 0?A7303M7327� 011D

L��� ���� �� ���-�.� �� (������ "&� ������� *>A � �������� ������������� � � ��0 /��� ���.� ����� �������45 < ,�� 7�� 2G?A?0390M?0397� 0113

� J�� �� L������ �� ���+��� HL� ����� (A �������+� �������� �� �����C� ���������+������� +������� � � �������� �� ������ ���������A � ���6����� ����� �������������� 5 ��� &��� ���� ��� ;�� 1DA7??2M7??G� 011G

������ � ������� �� *��������� �� �� ��A ����������� � � �������� ������ �� � ��������,������� ������� /��4 2 ��� ��������� � ��. � ����$�� � � ����� ��/&� 4 ,��C��� ��� ������ ����� �������� ������� ��� �$������� �� ����������� � ��� ������� ��� �������5 < �=� 0�� 033A0997M0908� 0113

����� ��� ������ �� H������� �A #$������� ��@����� ����V������������ ����������.��� �������5 ����� *���� 0DADM1� 0113

��������,#������ �� >���U���,&��+����� &� (������� J� �������� �� ����� >��������,(����� >&A ����������� ���.�� �����,�0 �������� ����� �������������

*% 5 007� �%5 0 >! E 2999 &���&�#�)���%� %J �%*# �� � ��� ��%J%�� <<

Page 9: Human Melanocytes and Melanomas Express Novel mRNA Isoforms of the Tyrosinase-Related Protein-2/DOPAchrome Tautomerase Gene: Molecular and Functional Characterization

�� (08;J09 ����� �������� ����� � ���������� ��� ���� � ����������� �� �������� ��� � ��������,������� �������,05 < ,�� 7�� 2G2A?18GM?1G2� 011G

��I���� �� ������ �� ������ #� ����I�� �A J��������� ���� ��� � ���������+�� �������� �������� ���� �����������5 �0,� < GA2G2?M2G?9� 0133

������-� #� J�����-� E� L����� �� &��-������ �L� ������� E� ��������� �A#$�������� � � ��������� ��,0 ��� ��,2 �� �����+�����,���������� �������������� ��� ������� ���A ��,2 �������� �������� ����� ��� �����+�����( ������� ���������5 0���� � ��� 1AD??MDD?� 0111

%-����� �� ���� J� J�6�� �� ����� �L� ����� �>� ������ " � ���� "�A ����,� ��������,������� �������,2 ������ �������� �� +������� �������� ����������� �������� �����+��� ����+�,�����C� ������������ 5 < 2����� ��� ���000A09?DM09?1� 0113

%���. �>� )��� (,L� &��-������ �L� "���-�� �� ��-�,����� �� ��.���- >�A����,���������,.����� ���� � � �������� ��� � ��������,������� ��������A#+������ �� � ����������� ������$5 < 2����� ��� ��� 09?A018M290� 011D

������� �� ������ J� �������� �� ����� �� ������ (����� >&� ����� >�� ����� �A&��������+� ������ � ���������� ����������� ��� ����� ���� �� ���������������� � ����������5 ,���� ,����� ���� 0007A0M7� 0110

������� �� �O������ �� �������� �� "� ������� � ����� �A � ��. ����������,����������� ��� �� ��� ��� �6����� ��- � ��� ������C�� ����� 5?�������5,���� ,����� ���� 211A3?1M3DD� 011D

���-����� �� J��������� #(� �����.��� �� ����� �� �������� ��� L�.�-��� EA������C������ � � ������ � �,��9290,���������� �,���� ������� ��� ����������� ������� � ��������,������� ������� 2 /��245 7����� ��� 73AD317MD190� 0113

��.���- >�A "��������� ���+������ ����� �������� �� �� ���������5 ,���� ,����� ��� 7 !� 088A0?23M0???� 0119

������� H� ����� ">A �����+�� ����� �� ���������� ��@����� ����������5 ���&��� ���� ��� ;�� 37A2DDDM2DD3� 0133

������ �� ����� (A �������� ���������+�� ������� ����������� � ��� ����� � ��������,�������� ����5 *��� 1GA2GGM232� 0110

����� �A 0������� ��� 0����"������5 ��� "����� &�A �������� ������ 0112����� �� �O������ �� ���������� �5 ��� �������� � �������� ��� ��������

�����������5 ��A �������� >>� (���� #� ������� *>� L��� �� %������ >�/���45 �� ��" ������ ����� 5 ��. E��-A %$��� !��+����� ������ 0113� ��5?9GM?22

��� A ������� ������,���� ����������� ��� ������� ������ ���,��� ��������5 7!������ *��� ��� 8A207M229� 0118

� ����� �� &���� #� ����� �� �� ��A � �,����������� ������������ � &"3K ����� �������� �� ���#,?� �����,�;���,0� ��099� � ��������� �&0� �����,2 �� +������,������� �������� ��������5 < 2 !�� 080A81G9M81G8� 0113

������ �J� #�,����� �� � EJ� J��������� #(� L�.�-��� E� �������� ��A ����������� ������ � �� ����������� ������� ��099 ���� ���������� ������� ��

������� ���������� � ��������,������+� �����,��C�������� � ����� ���5 <2 !�� 071A?9?M?93� 011G

��� >A ��� �������� �� ��������� �����5 0������ ��� 71AD2?MD79� 0117������ �� ��I���� �� L.�� (� ����I�� �A �������� ����������� � ��� �����

� �������� ���� ��� ��������� � ���������+� ��������5 �0,� < GA2G07M2G22�0133

��-�� &� L�.�-��� E� �. H� J������� �� ������� *A ����������� �������� ����������,�����C� ������ �������5 0���� � ��� GA3?M17� 011G

��������� �� ������� �� ������ �� ������� L� &���� �� ������ E� ������ �A���������� ������������ � ��� ������� ����,�����C� ���� ������� �� ��� ���.������ �� �����5 ��� �������� ����+�� ��� ���������+�� ������� ����������5 < ,��7�� 288A07317M07190� 0110

����� (� ���� �� ��������� >� ������� L� (����� &� (���� �#A "�������� ��������� ����� �� ���������� ����� � ����� � ��+���� ������������� ����� ������ ����� ��������5 #����� ??3A022GM0221� 0110

����� �� %O�����+�� (>� (�$ �J� �� ��A &���������� ��������� � ��� ������E�0 ��� �E�2 ���� ��� ���������� � ��� � ��������,������� ����������� ���� 5 *�� ��� 21A2DM?D� 0117

���-����� L� >��-��� �>� !���� L� �������� ��� ������� *>A � ������ � ��������,������� �������� ��,2� �� � ����������� ��� �� ������ "%�������������������5 �0,� < 00A701M728� 0112

*�6� �������� �� :� E� (������� (� �������� ��A ������������� ������� ������������ � ����������� �������� ��������A ������C������ � ������� ��������� � ��� ����� ���.� ����� �������� ��G75 < 7��� ,�� 0?9A39GM329� 0117

H��� J� ������ �J� L�.�-��� E� L��� :N� �������� �A ������C������ � ����� �������� � �������� ����� ������� ���������� � � �,�?0 ���������������,��C�������� � ����� ���5 < �=� 0�� 030AG11M39D� 0117

H��� J� ������� #� L�.�-��� E� L��� :N� �������� ��A ������C������ ���,2 �� � ����� ����� ������� ���������� � � ����$�� � � ����� ���5 <�=� 0�� 03DA229GM2208� 0118�

H��� J� ���-����� �� L�.�-��� E� ������ �J� �������� ��A !���������� ��� ���������+� ���� ������� ���� � � ������ ���� �� ���������� � ��+������� ������ �������5 < �=� 0�� 03?A00?0M00D9� 0118�

:� E� *�6� �������� �� ��-���� E� �������� ��A ������� ��� ��������� � ����������� �������� �������� ��G7;��05 < 2����� ��� ��� 091AG33MG17�011G

E�-� ��� L� ����-� �� E������� L� ������ E� ��������� �A ��������� ���������� ��������� ���� ��� � � �"�� ������ �� ����� "%�������������������;� ��������,������� �������,25 ,���� ,����� ���� 020GA?0GM?20�011D

)��� �� "��� �"� ��&���� ��� &��� � (����� &�A � ��+�� ������ +������ � ������� �����,��������� ������� (�:5 < ,�� 7�� 2G?A001?9M001?8� 0113

<2 ����� � �# ��# >%!�� %J ��*#�������*# "#���% %�E