20S-Proteasom-InhibitorenDOI: 10.1002/ange.201106010

Hydroxyharnstoffe als nichtkovalente Proteasom-Inhibitoren**Nerea Gallastegui, Philipp Beck, Marcelino Arciniega, Robert Huber, Stefan Hillebrand undMichael Groll*

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)[1] wird mit vielenverschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunterauch das Multiple Myelom. Diese Krebserkrankung desKnochenmarks wird durch die Inhibition des 20S-Proteasoms(CP) als Kernenzym des UPS bereits erfolgreich mit dem„Blockbuster“-Medikament Velcade (Bortezomib) behan-delt.[2] Die Notwendigkeit der Entwicklung von CP-Inhibi-toren der zweiten Generation und der Entdeckung von Li-ganden mit neuartigen Wirkmechanismen ist hingegen groß.Sowohl das breite therapeutische Potenzial von Proteasom-Inhibitoren als auch Resistenzerscheinungen und Unwirk-samkeit von derzeit vermarkteten Arzneien gegen einigesolide Tumortypen belegen den Bedarf an neuen Leitstruk-turen.

Das eukaryotische CP setzt sich aus vier gestapeltenheptameren Ringen zusammen, bestehend aus a- und b-Un-tereinheiten mit a1–7b1–7b1–7a1–7-Stçchiometrie.[3] In diesen b-Untereinheiten befinden sich drei katalytische Zentren mitunterschiedlicher Substratspezifit�t, die Caspase(C)-, Tryp-sin(T)- und Chymotrypsin(CT)-�hnliche Aktivit�t aufweisen.Zwar ist das reaktive Nukleophil Thr1Og in den Unterein-heiten b1, b2 und b5 (C-, T- und CT-�hnliche Aktivit�ten)vorhanden; jedoch wird die Spaltpr�ferenz erst durch dasZusammenspiel von aktiven und umgebenden Untereinhei-ten der jeweiligen Substratbindetasche festgelegt.[4]

Alle bisher bekannten CP-Inhibitoren haben entwedereine peptid�hnliche Struktur, die ein antiparalleles b-Faltblattmit dem Substratbindekanal der aktiven Untereinheit bildet,und/oder eine reaktive Kopfgruppe, die kovalent an das ter-minale Threonin Thr1Og bindet.[5] Diese Charakteristika sindjedoch f�r �berm�ßige Reaktivit�t, Unspezifit�t und Insta-bilit�t bisheriger Proteasom-Inhibitoren verantwortlich.Zudem gibt es bisher keine Liganden, die gezielt nur eine derdrei Aktivit�ten des CP inhibieren. In Studien konnte jedochgezeigt werden, dass allein die Inaktivierung der b5-Unter-einheit ausreicht, um therapeutische Effekte zu erzielen.[6,7]

Um nichtpeptidische Inhibitoren der CT-�hnlichen Akti-vit�t der b5-Untereinheit mit reversiblem Bindungsmodus zuidentifizieren, wurde ein Screening-Experiment mit fluoro-genen peptidischen Substraten durchgef�hrt. Dieses Scree-ning nutzte eine Ligandenbibliothek der Firma Bayer Crop-Science.

Einer der dabei identifizierten „Hits“ war eine Verbin-dung mit einem N-Hydroxyharnstoff(HU)-Strukturmotiv (1,Tabelle 1). Interessanterweise ist diese Substanzklasse bereitsals Inhibitor der 5-Lipoxygenase bekannt (U.S.-Patent Nr.5,714,633) und strukturell verwandt mit ZyfloCR (Zileuton,

Tabelle 1: Inhibitorisches Profil von N-Hydroxyharnstoff(HU)-Derivatenmit IC50- und Ki-Werten gegen CT-�hnliche Aktivit�t.[a]

Verbindung R2 R1 IC50 [mm] Ki [mm]

0 H H keine Inhibition1 tBuCH2CH2O Me 229�22 23.1�2.22 CF3O Me >1000 –3 nPentO Me >1000 –4 tBuMe2SiO Me 48�2 4.8�0.25 (1-Ad)O H 12.0�1.3 1.02�0.136 (1-Ad)O Et 1.07�0.06 0.107�0.0067 (1-Ad)O iPr 10.6�3.7 1.06�0.378 (1-Ad)O Me 0.78�0.16 0.078�0.0169 (1-Ad)O Me (S)[b] 57�2.5 5.75�0.2510 (1-Ad)O Me (R)[c] 0.34�0.04 0.034�0.004

[a] Inhibition von T- und C-�hnlicher Aktivit�t wurde bei einer Konzen-tration von 200 mm nicht beobachtet (Abbildung S2). [b] C* mit S-Kon-figuration. [c] C* mit R-Konfiguration.

[*] M. Chem. N. Gallastegui, M. Sc. P. Beck, M. Sc. M. Arciniega,Prof. Dr. R. Huber, Prof. Dr. M. GrollTechnische Universit�t M�nchenLichtenbergstraße 4, 85747 Garching (Deutschland)E-Mail : michael.groll@ch.tum.de

Prof. Dr. R. HuberZentrum f�r Medizinische BiotechnologieUniversit�t Duisburg-Essen (Deutschland)undMax-Planck-Institut Biochemie, Martinsried (Deutschland)

S. HillebrandBayer CropScience AG, Monheim (Deutschland)

[**] Wir danken f�r die hilfreichen Beitr�ge und Diskussionen mit denMitarbeitern von Bayer CropScience GmbH: Dr. J. Vidal, Dr. A. Tuchund Dr. P. Schreier. Wir danken R. Feicht f�r die Aufreinigung vonHefe-20S-Proteasom, O. Ackermann f�r die Durchf�hrung vonHPLC an chiraler Phase und den Mitarbeitern des PXI-Strahlen-gangs am Paul Scherrer Institut, Swiss Light Source, Villigen,Schweiz, f�r die Unterst�tzung bei der Datenaufnahme. Ebenfallsmçchten wir den Studenten Martina M�ller und Christian Dubiellaf�r die Hilfe bei den Laborarbeiten danken. Diese Arbeit wurdeunterst�tzt durch den SFB 594 – A 11 (M.G.) und das DAAD-CO-NACYT-Stipendium (M.A.)

Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unterhttp://dx.doi.org/10.1002/ange.201106010 zu finden.

AngewandteChemie

251Angew. Chem. 2012, 124, 251 –254 � 2012 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Abbildung S1), einem weltweit verschriebenen Medikamentf�r die Behandlung von Asthma.[8] �berraschenderweisezeigte 1 nur eine Inhibition der CT-�hnlichen Aktivit�t mitIC50 = 230 mm (Ki = 23 mm ; Tabelle 1), ohne dabei Einfluss aufdie C- und T-�hnliche Aktivit�t zu nehmen, selbst bei Kon-zentrationen von 200 mm (Abbildung S2).

Dar�ber hinaus hat 1 keine strukturellen �hnlichkeitenzu bekannten CP-Inhibitoren und erf�llt die im Vorhineingestellten Bedingungen bez�glich Spezifit�t und Reversibili-t�t (Abbildung S2a und b). Besonders im Hinblick auf Zell-g�ngigkeit und Clearance-Rate weisen bereits durchgef�hrteklinische Studien auf die Eignung von 1 als potenzielle Leit-struktur hin (Abbildung S3a).[9]

Im Zuge dieser vielversprechenden Ergebnisse wurdeeine Kristallstruktur des CP:1-Komplexes bestimmt (Rfrei =

0.256; Tabelle ST1). Die 2FO�FC-Elektronendichte zeigt 1 inunmittelbarer N�he zum aktiven Zentrum der b5-Unterein-heit mit CT-�hnlicher Aktivit�t und offenbart einen neuarti-gen, nichtkovalenten Bindungsmodus (Abbildung S3a).

Die N-Hydroxyharnstoff-Kopfgruppe wechselwirkt hier-bei nicht mit dem reaktiven b5-Thr1Og-Nukleophil, wasbisher als grundlegendes mechanistisches Prinzip von CP-Inhibitoren angesehen wurde. Stattdessen stabilisieren Was-serstoffbr�cken mit den Hauptkettenatomen b5-Thr21NH/CO und b5-Gly47CO die Kopfgruppe in �hnlicher Weise wiedie antiparallelen b-Faltblattstrukturen von Substraten oderpeptidischen Inhibitoren, z. B. Calpain-Inhibitor 1 (CAL I;Abbildung 2).

Die Methylgruppe als R1 in 1 wird durch hydrophobeWechselwirkungen mit den b5-Seitenketten Met45 und Ala46stabilisiert, w�hrend die Propinylphenyl-Teilstruktur zu einerbisher nicht beobachteten sub-Bindetasche der CT-�hnlichenS1-Spezifit�tstasche (S1-sub-Bindetasche) zeigt, woraus eineF�lle von Van-der-Waals-Wechselwir-kungen mit Ser26, Val31, Met45 undAla49 resultieren (Abbildung S3a).Ferner ist die Bindung an das CPdurch die starre Propinylphenyl-Struktur entropisch beg�nstigt. Die3,3-Methylbutoxy-Seitenkette in R2

tritt mit den hydrophoben Seitenket-tenatomen von His98, Ser112, Glu122und Arg125 der b6-Untereinheit inWechselwirkung, die zusammen eineweitere bisher unentdeckte sub-Bin-detasche nahe der S3-Tasche bilden(S3-sub-Bindetasche; Abbildung S3a).Interessanterweise wird bei Ligandenohne meta-Substituent (0) keine inhi-bitorische Wirkung festgestellt, wasdie Bedeutung der oben genanntenWechselwirkungen f�r die CP:HU-Bindung unterstreicht. Die erhaltenenStrukturdaten best�tigen somit sowohldie Unentbehrlichkeit dieser besonderen Bindestelle bez�g-lich der Spezifit�t zur Untereinheit als auch ihre Notwen-digkeit zur enthalpischen Stabilisierung des Liganden.

Anschließend wurde eine konvergente Synthesestrategieder HU-Verbindungen entworfen, die unter Beibehaltung des

Propinyl-Hydroxyharnstoff-Ger�sts eine einfache Optimie-rung von R1 und R2 ermçglicht (Abbildung S4). Die N-Hy-droxyharnstoff-Kopfgruppe wird in drei Schritten syntheti-siert, beginnend mit der Methansulfonierung von But-3-yn-2-ol, anschließender nukleophiler Substitution des Mesylats

Abbildung 1. Kristallstruktur von CP im Komplex mit dem aktivstenInhibitor 10 (CP:10 ; PDB-Zugangsnummer: 3SHJ). a) Die N-Hydroxy-harnstoff-Kopfgruppe bildet ein Netzwerk von Wasserstoffbr�cken zub5-Thr21NH/CO und b5-Gly47CO (schwarze gestrichelte Linien).Reste, welche die S1-sub-Bindetasche bilden, sind dunkelgr�n darge-stellt und umklammern das starre Propinylbenzol-Ger�st, wobei dieS3-sub-Bindetasche (blau) mit R2 wechselwirkt. b) Eine �berlagerungvon Calpain-Inhibitor I (CAL I) und 10 veranschaulicht den neuartigenBindungsmodus von 1 und den sub-Bindetaschen. c) SchematischeDarstellung von (a) mit den Spezifit�tstaschen S1-sub und S3-sub desCT-Substratbindekanals und den entsprechenden Aminos�uren inschwarz bzw. grau.

Abbildung 2. Die Stereodarstellung einer �berlagerung von 10 und CAL I gebunden am CT-�hnli-chen aktiven Zentrum veranschaulicht den neuartigen Bindungsmodus von HUs im Vergleich mitpeptidischen Liganden. Peptidr�ckgrat-Wechselwirkungen zwischen CP und CAL I sind als grauegestrichelte Linien dargestellt, Wechselwirkungen von CP:10 mit der Proteinhauptkette in cyan.

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durch Hydroxylamin und abschließend Reaktion mit Kali-umcyanat. Im abschließenden Syntheseschritt werden ver-schiedene meta-substituierte Iodphenylderivate durch Sono-gashira-Kupplung mit der N-Hydroxyharnstoff-Kopfgruppegekoppelt (Pat. WO9530671).[10]

Derivatisierungen von R1 unterstreichen die Bedeutungeiner kleinen hydrophoben Seitenkette in dieser Position, dagrçßere Reste wie Ethyl- (6) oder Isopropylgruppen (7) zueiner bis zu 15fachen Erhçhung der IC50 auf 1 mm (Ki =

0.1 mm) bzw. 10 mm (Ki = 1.0 mm) f�hrten (Tabelle 1). DieseErgebnisse stimmen mit Modellierungsstudien �berein, dieauf einen sterischen Konflikt zwischen großen Resten in R1

und dem Peptidr�ckgrat der b5-Untereinheit hindeuten undbei der Synthese kleine hydrophobe Reste zur Stabilisierungdes Inhibitors nahelegen.

Kleine �nderungen bez�glich R2 zeigten bemerkenswer-ten Einfluss auf die IC50 der HU-Verbindungen: Die Ein-f�hrung kurzer halogenierter und langkettiger aliphatischerR2-Seitenketten resultierte in gegen�ber 1 mindestens f�nf-fach erhçhter IC50 (> 1 mm), wie am Beispiel des Trifluorm-ethoxy-Derivats 2 und des n-Pentoxy-Derivats 3 gezeigtwerden konnte. Interessanterweise f�hrte eine tert-Butyldi-methylsiloxy-Seitenkette in 4 zu einer erhçhten Affinit�t undf�nffach verbesserter IC50 (48 mm, Ki = 4.8 mm ; Tabelle 1). DieKristallstruktur dieser Verbindung im Komplex mit dem CPbei 3.2 � Auflçsung (Rfrei = 0.228) zeigt starke Wechselwir-kungen der hydrophoben Seitenkette innerhalb der S1-sub-Bindetasche mit Met45 und Ala46 (Tabelle ST1, Abbil-dung S3b). Basierend auf diesen kristallographischen Ergeb-nissen wurde eine Modellierungsstudie durchgef�hrt, umgeeignete Seitenketten f�r die R2-Position zu finden; hierbeizeigte eine 1-Adamantyloxy-Gruppe die besten Docking-Er-gebnisse (�10.7 in GlideScore[11]) innerhalb einer kleinenBibliothek von 50 Verbindungen (Abbildung S6). Das ent-sprechende HU-Derivat (8) ist mit einer IC50 von 700 nm (Ki

= 0.08 mm) gegen�ber der Ausgangsverbindung 1 320fachverbessert (Tabelle 1). Die experimentellen Daten der Kris-tallstruktur des CP:8-Komplex mit 2.9 � Auflçsung (Rfrei =

0.238, Tabelle ST1) best�tigten die Modellierungsergebnisse(0.8 � r.m.s.d. zwischen experimenteller und modellierterLigandstruktur (Abbildung S3c, S7) und offenbarten zudemdie Bedeutung von Ser118 der b6-Untereinheit; diese bildeteine starke Wasserstoffbr�cke zum Ether-Sauerstoffatom von8 und stabilisiert folglich die Position des Adamantyloxy-Rests in der S3-sub-Bindetasche (Abbildung 1c).

Als Folge der Einf�hrung von R1 kçnnen die HU-Ver-bindungen in zwei unterschiedlichen Konfigurationen vor-liegen; diesbez�glich wurden weitere Optimierungen vorge-nommen. Das R-Enantiomer (10) zeigte mit einer IC50 von300 nm (Ki = 34 nm) eine vielfach st�rkere Inhibition als dasS-Enantiomer (9, IC50 = 56 mm, Ki = 5.8 mm ; Abbildung 1 undTabelle 1). Die Ergebnisse der Rçntgenstrukturanalysen vonCP:9 bei 3.1 � Auflçsung (Rfrei = 0.231) und CP:10 bei 2.8 �Auflçsung (Rfrei = 0.262, Tabelle ST1) zeigen, dass allein dieOrientierung des Rests R1 des S-Enantiomers f�r die Ab-nahme der Bindungsaffinit�t durch destabilisierende Wech-selwirkungen mit den Hauptkettenatomen des Proteins ver-antwortlich ist (Abbildung S8b,c). Entsprechend dieser star-ken Enantioselektivit�t wurden nach Behandlung der Pro-

teasom-Kristalle mit racemischen HU-Verbindungen aus-schließlich CP:HU-Rçntgenstrukturen mit R-Enantiomerenerhalten (Abbildung S8a). Struktur�berlagerungen von 9 und10 zeigen, dass sowohl das R- als auch das weniger aktive S-Enantiomer hinsichtlich der N-Hydroxyharnstoff-Kopfgrup-pe und der Adamantyloxyphenyl-Struktur fast perfekt �ber-lagern (Abbildung S8b). In Anbetracht des nichtkovalentenBindungsmodus unterstreicht diese Beobachtung die St�rkedes Bindungsmotivs, da der Inhibitor trotz sterisch ung�nsti-ger Orientierung der Methylgruppe (als R1 in 9) in seinerPosition gehalten wird.

Zus�tzlich wurde in den meisten Elektronendichten derCP:HU-Komplexstrukturen ein 2-(N-Morpholino)ethansul-fons�ure(MES)-Molek�l beobachtet, das dem Kristallisati-onspuffer entstammt (Abbildung S5). MES wechselwirkt mitb5-Gly47N und besetzt das Oxyanion-Loch, das typischer-weise von reaktiven Kopfgruppen von Liganden ausgef�lltwird; dieses Ph�nomen wurde in der Literatur bereits be-schrieben.[12,13] HU und MES kçnnen somit als unabh�ngigeFragmente f�r ein zuk�nftiges fragmentbasiertes Wirkstoff-design genutzt werden.

Die Kombination von kristallographischer Charakteri-sierung, Molecular-Modelling-Studien, chemischer Syntheseund kinetischen Experimenten f�hrte zur Identifizierungeines starken inhibitorischen Bindungsprofils neuer Protea-somliganden, die bisher unentdeckte, wohldefinierte Spezifi-t�tstaschen adressieren.

HUs bilden somit eine neue Klasse von Proteasom-Inhi-bitoren, die sich durch ihren neuartigen, reversiblen Bin-dungsmodus auszeichnen. Die Verbindungsklasse repr�sen-tiert die kleinsten reversiblen, nichtkovalent gebundenen undUntereinheit-spezifischen Inhibitoren f�r das 20S-Proteasom,die keine hochreaktive elektrophile Kopfgruppe tragen.Zudem verf�gen die Hydroxyharnstoff-Verbindungen �berpharmakokinetisch wichtige molekulare Eigenschaften, dieneue Wege zur Entwicklung von Proteosom-Inhibitorenaufzeigen.

Eingegangen am 25. August 2011Online verçffentlicht am 21. November 2011

.Stichwçrter: Hydroxyharnstoffe · Inhibitoren · Lipoxygenase ·Proteasom · Proteinkristallographie

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