i. Forord · purpurfarvede blomster (Figur 4). Ekstrakter fra både planter og tudser indeholdende hjerteglycosider har længe været anvendt som gift i pile3. Figur 4. A: Bufo marinus

Speciale af Mira Steinicke Christiansen

— 1 —

i. Forord Denne afhandling er udarbejdet på baggrund af laboratoriearbejde i forbindelse med mit speciale,

hvilket er udført fra oktober 2008 til august 2009 i afdelingen for Bioorganisk Kemi, Kemisk Institut,

Aarhus Universitet. Arbejdet har været fordelt på to forskellige projekter og rapporten behandler

disse to projekter i et omfang, der så vidt muligt afspejler hvorledes laboratoriearbejdet har været

fordelt på hvert projekt. Rapporten er skrevet på dansk, men enkelte engelske vendinger er

anvendt, hvor det blev fundet nødvendigt. Den eksperimentelle del er skrevet på engelsk.

Jeg vil gerne takke min vejleder adjunkt Henrik Helligsø Jensen fra Kemisk Institut for at have

involveret mig i nogle spændende og udfordrende projekter og for at have ydet stor støtte og

kompetent vejledning. Derudover vil jeg gerne takke lektor Natalya Fedosova fra Institut for

Fysiologi og Biofysik for at udføre de biologiske test og for efterfølgende databehandling.

Det er ligeledes på sin plads at sende en kæmpe tak til Carlsbergs Mindelegat for at tildele mig

Carlsbergs Mindelegat Scholarship i 2008 på 75.000 kr. til gennemførelse af mit projekt, herunder

til dækning af egne leveomkostninger.

En stor tak skal også gå til tidligere og nuværende studerende og ansatte i gruppe 103, idet de i

den grad har medvirket til at skabe et sjovt og inspirerende miljø både i og uden for laboratoriet.

En særlig tak til Mikkel Due Petersen for gennemlæsning samt for gode råd til udarbejdningen af

rapporten.

En sidste tak skal gå til min kæreste Jonas for at have bidraget med en enorm støtte samt for den

uvurderlige sparringspartner han har været.

Århus

September 2009

Mira Steinicke Christiansen


— 2 —

Indhold i. Forord ........................................................................................................................................................... 1

ii. Forkortelsesliste ......................................................................................................................................... 4

iii. Resumé ....................................................................................................................................................... 6

iv. Summary .................................................................................................................................................... 7

DEL A: Syntese af selenmærket hjerteglycosidanalog til anvendelse i krystallografiske eksperimenter ................................................................................................................................................. 8

1. Introduktion ................................................................................................................................................. 8 1.1 Hjerteglycosider og –steroider ............................................................................................................... 8

1.1.1 Struktur og klassificering ................................................................................................................. 8 1.1.2 Oprindelse og tidlig anvendelse .................................................................................................... 10 1.1.3 Anvendelse som hjertemedicin ..................................................................................................... 12 1.1.4 Toksicitet ....................................................................................................................................... 13

1.2 Na+-K+-ATPasen .................................................................................................................................. 13 1.2.1 Struktur .......................................................................................................................................... 14 1.2.2 Funktion ........................................................................................................................................ 15

1.3 Bindingsmodel og SAR-studier ............................................................................................................ 16 1.4 Positiv inotrop effekt ............................................................................................................................. 18

1.4.1 Mekanisme .................................................................................................................................... 18 1.4.2 Hjertets kontraktion ....................................................................................................................... 19

1.5 Anticancerterapi ................................................................................................................................... 20 1.6 Proteinkrystallografi .............................................................................................................................. 21 1.7 Projektidé ............................................................................................................................................. 22

2. Resultater og diskussion ......................................................................................................................... 23 2.1 Nummerering af steroidskelet .............................................................................................................. 23 2.2 Bufalin .................................................................................................................................................. 23

2.2.1 Bromobufalin ................................................................................................................................. 23 2.2.2 Phenylselenylbufalin ..................................................................................................................... 25

2.3 Ouabain ................................................................................................................................................ 27 2.3.1 Selenorhamnosid – p-methylbenzoylmetode ................................................................................ 28 2.3.2 Selenorhamnosid – selenocyanatmetode ..................................................................................... 38 2.3.3 Modifikation af ouabagenin ........................................................................................................... 40

2.4 Digitoxin ................................................................................................................................................ 45 2.4.1 Methylselenyldigitoxigenin ............................................................................................................ 45

2.5 Fysiologisk aktivitet .............................................................................................................................. 49

3. Konklusion ................................................................................................................................................ 52


— 3 —

DEL B: Anvendelse af thioglycosiddonorer til direkte glycosylering af GlcNAc ...................................53

4. Introduktion ................................................................................................................................................53 4.1 Kulhydrater og deres syntese ...............................................................................................................53

4.1.1 Kemisk glycosylering .....................................................................................................................53 4.1.2 Glycosyldonorer .............................................................................................................................54

4.2 Anomer-effekten ....................................................................................................................................55 4.3 Thioglycosider .......................................................................................................................................57

4.3.1 Fremstilling.....................................................................................................................................57 4.3.2 Aktivering .......................................................................................................................................58

4.4 ”Armed” vs. ”disarmed” .........................................................................................................................60 4.5 GlcNAc i et biologisk perspektiv ............................................................................................................61 4.6 GlcNAc som glycosyldonor ...................................................................................................................62

4.6.1 Traditionel strategi .........................................................................................................................62 4.6.2 Oxazolinstrategi .............................................................................................................................62 4.6.3 Tidligere resultater .........................................................................................................................63

4.7 Projektidé ..............................................................................................................................................64

5. Resultater og diskussion ..........................................................................................................................66 5.1 Syntesen af donorer ..............................................................................................................................66

5.1.1 Syntese af ”disarmed” donor .........................................................................................................66 5.1.2 Syntese af ”armed” donor ..............................................................................................................67

5.2 Glycosyleringsreaktioner .......................................................................................................................68 5.2.1 Indledning ......................................................................................................................................69 5.2.2 Glycosylering med ”disarmed” donor .............................................................................................72 5.2.3 Glycosylering med ”armed” donor .................................................................................................73

5.3 Trisaccharid ...........................................................................................................................................76 5.3.1 Syntese af pentenylglycosid med donor- og acceptoregenskaber ................................................77 5.3.2 Trisaccharidsyntese .......................................................................................................................78

6. Konklusion .................................................................................................................................................80

7. Experimentals ............................................................................................................................................81 7.1 Abbreviations ........................................................................................................................................81 7.2 General methods ...................................................................................................................................82 7.3 Bufalin ...................................................................................................................................................83 7.4 Ouabain .................................................................................................................................................87

7.4.1 Rhamnose .....................................................................................................................................87 7.4.2 Ouabagenin ...................................................................................................................................97

7.5 Digitoxin ............................................................................................................................................. 102 7.6 Glycosyl donors .................................................................................................................................. 108 7.7 Glycosylations .................................................................................................................................... 112 7.8 Pentenyl glycoside ............................................................................................................................. 116

Appendiks: NMR-spektre ........................................................................................................................... 120


— 4 —

ii. Forkortelsesliste

Ac Acetyl ADP Adenosindiphosphat aq. Vandig Ar Aryl Asn Asparagin ATP Adenosintriphosphat Bn Benzyl Bz Benzoyl Cbz Carboxybenzyl CSA Camphersulfonsyre CTS Cardiotonic steroid DAST Diethylaminosvovltrifluorid DMAP 4-Dimethylaminopyridin DMF N,N-Dimethylformamid DMP Dess-Martin periodinan DMTST Dimethyl(methylthio)sulfoniumtriflat E Elektrofil Et Ethyl Fmoc Fluorenylmethyloxycarbonyl G Gibbs energi GlcNAc N-acetylglucosamin Gln Glutamin h Time(r) HG Hjerteglycosid His Histidin HRMS High Resolution Mass Spectrometry IBX 2-Iodoxybenzoesyre IDCP Iodoniumdicollidinperchlorat J Koblingskonstant kat. Katalytisk konc. Koncentreret LG Udtrædende gruppe Ln Lanthanid LRMS Low Resolution Mass Spectrometry Man Mannose Me Methyl min Minut(ter) M(OTf)x Metal(x)trifluoromethansulfonat, (metal(x)triflat) Ms Methansulfonyl, (mesyl) MS Massespektrometri NBS N-bromosuccinimid NCX Na+-Ca2+-exchanger


— 5 —

NIS N-iodosuccinimid NMR Nuclear Magnetic Resonance NOE Nuclear Overhauser Effect NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Pent 4-Pentenyl PG Beskyttelsesgruppe Ph Phenyl Phth Phthalimid ppm Parts per million PTSA p-Toluensulfonsyre Pyr Pyridin r Radius rt Stuetemperatur SAR Structure-Activity Relationship Ser Serin TBAB Tetra-n-butylammoniumbromid TCP Trichlorophthalimid Temp. Temperatur THF Tetrahydrofuran Thr Threonin TLC Tyndtlagskromatografi TM Transmembran segment TMS Trimethylsilyl Tol Toluyl Tr Triphenylmethyl, (trityl) Troc 2,2,2-Trichloroethoxycarbonyl Ts p-Toluensulfonyl, (tosyl) ækv. Ækvivalent(er)

De forkortelser der er anvendt for diverse tidsskrifter, er fra Caltech Library Service: http://library.caltech.edu/reference/abbreviations/


— 6 —

iii. Resumé

Den første del af afhandlingen omhandler hjerteglycosider og –steroider, der er en gruppe stoffer

med en række interessante farmakologiske egenskaber. Blandt andet anvendes de i

behandlingen af patienter, der lider af hjertesvigt. Desværre er disse stoffer ganske giftige, hvilket

selvsagt er en stor ulempe.

Projektet vedrører syntesen af en selenmærket analog af et hjerteglycosid, idet en sådan analog

potentielt vil kunne benyttes til krystallografiske eksperimenter. De tre stoffer bufalin, ouabain og

digitoxin har været brugt i syntesearbejdet, men kun arbejdet med digitoxin viste sig at være

succesfuldt. Den syntetiserede analog har efterfølgende været testet i biologiske forsøg, for at

verificere aktiviteten af dette nye stof.

* * * * *

Anden del af afhandlingen omhandler thioglycosider af N-acetylglucosamin (GlcNAc) og deres

anvendelse som glycosyldonorer. Traditionelt kræver glycosylering med GlcNAc beskyttelse af

kvælstof, idet tilstedeværelsen af acetamidogruppen har været ugunstig.

Fokus i dette projekt har været på direkte glycosylering med GlcNAc uden brug af en midlertidig

beskyttelsesgruppe. Grundet den oxazolin, som er det centrale intermediat i reaktionen, resulterer

disse glycosyleringer udelukkende i β-glycosider. Thioglycosider er blevet en yderst populær

gruppe af glycosyldonorer og de blev af denne grund afprøvet som donorer til denne type

glycosyleringer.


— 7 —

iv. Summary

The first part of the thesis deals with cardiac glycosides and steroids, which is a group of

compounds with a number of interesting pharmacological properties. Among other things they are

being applied in the treatment of patients who suffers from heart failure. Unfortunately these

compounds are quite poisonous, which obviously is a great drawback.

The project is concerned with the synthesis of a selenium labelled analogue of a cardiac

glycoside, since such an analogue potentially may be used for crystallographic experiments. The

three compounds bufalin, ouabain and digitoxin have been used in the synthetic work, but only the

work with digitoxin turned out to be successful. The synthesised analogue has subsequently been

tested in biological experiments to verify the activity of this new compound.

* * * * *

Second part of the thesis deals with thioglycosides of N-acetylglucosamine (GlcNAc) and their use

as glycosyl donors. Traditionally, glycosylation with GlcNAc requires protection of nitrogen, since

the presence of the acetamido group has been unfavourable.

The focus in this project has been on direct glycosylation with GlcNAc without the use of a

temporary protection group. Owing to the oxazolin, which is the central intermediate in the

reaction, these glycosylations will result exclusively in β-glycosides. Thioglycosides have become

an extremely popular group of glycosyl donors, and for this reason they were tested as donors in

this type of glycosylations.


— 8 —

DEL A: Syntese af selenmærket hjerteglycosidanalog til anvendelse i krystallografiske eksperimenter

1. Introduktion

1.1 Hjerteglycosider og –steroider

Hjerteglycosider og –steroider er en gruppe af naturligt forekommende stoffer, der har adskillige

farmakologiske egenskaber. Så vidt vides har planter indeholdende denne type stoffer, været

anvendt til medicinsk behandling allerede for flere tusind år siden i det gamle Egypten og de bliver

den dag i dag stadig brugt i flere henseender1. Hjerteglycosider og –steroider er derfor af stor

interesse, inden for bl.a. medicin, fysiologi og kemi.

1.1.1 Struktur og klassificering

Hjerteglycosider består kort beskrevet af et steroidskelet, en lakton og et kulhydrat, hvorimod

hjertesteroider blot består af et steroidskelet og en lakton, idet de ikke indeholder en

glycosidbinding (Figur 1).

Figur 1. Struktur af hjerteglycosider og –steroider

Udover at der skelnes mellem hjerteglycosider og –steroider, opdeles disse stoffer også i de to

grupper cardenolider og bufadienolider, hvor laktonen er hhv. 5-leddet (butyrolakton) og 6-leddet

(α-pyron). Cardenolider er hidtil kun isoleret fra planter, mens bufadienolider er fundet i både en

1 Kampmann, J. P.; Brøsen, K.; Simonsen, U., Basal og klinisk farmakologi, FADL’s Forlag, 2007, 3.udgave, 1.oplag, 260-265


— 9 —

række planter og i tudser1,2. For hjerteglycosider anvendes benævnelsen ”genin” om aglyconen,

som består af steroiddelen og af laktonen. I den resterende del af opgaven, vil termen

”hjerteglycosid” ofte blive anvendt som fælles benævnelse for både hjerteglycosider og –steroider.

Hjerteglycosider varierer i antallet og placeringen af substituenter på steroidskelettet, samt i typen

af kulhydrat såfremt der er en glycosidbinding i stoffet. Steroidskelettet indeholder ofte en eller

flere hydroxylgrupper, men også methyl, hydroxymethyl og O-acetyl er blandt de mulige

substituenter3. Der er altså ekstremt stor kemisk variation og forskellighed indenfor for denne

gruppen af hjerteglycosider.

I dette projekt er det målet at fremstille et hjerteglycosid indeholdende et tungt atom som selen. Til

syntesearbejdet anvendes tre forskellige af disse stoffer: bufalin (1), ouabain (2) og digitoxin (3)

(Figur 2).

Figur 2. Strukturen af bufalin (1), ouabain (2) og digitoxin (3)

I disse tre stoffer er de fire ringe i steroidskelettet (A – D, Figur 1) bundet sammen cis-trans-cis,

hvilket adskiller denne type steroider fra de mere alment kendte såsom galdesalte og

steroidhormoner, hvor ringene forholder sig hhv. cis-trans-trans og trans-trans-trans (Figur 3).

Figur 3. Generel struktur af steroidskeletterne for galdesalte og steroidhormoner

2 Navnet bufadienolider stammer fra forekomsten af disse stoffer i tudser af familien Bufonidae 3 Mijatovic, T.; Quaquebeke, E. V.; Delest, B.; Debeir, O.; Darro, F.; Kiss, R., BBA – Rev. Cancer, 2007, 1776, 32-57


— 10 —

1.1.2 Oprindelse og tidlig anvendelse

Bufalin er et bufadienolid, der bl.a. kan findes i den sydamerikanske padde Bufo marinus4, med

det danske navn Agatudsen, mens oaubain og digitoxin begge er cardenolider der stammer fra

planter. Ouabain, der også er kendt som g-strophanthin, findes i de afrikanske planter

Strophanthus gratus5 og Acokanthera ouabaio6, hvorfra dette hjerteglycosid blev isoleret første

gang7. Digitoxin findes i store mængder i planten Digitalis purpurea8, der på dansk kaldes

(Almindelig) Fingerbøl og som adskillige danske haveejere har i haven pga. dens smukke

purpurfarvede blomster (Figur 4). Ekstrakter fra både planter og tudser indeholdende

hjerteglycosider har længe været anvendt som gift i pile3.

Figur 4. A: Bufo marinus. B: Acokanthera ouabaio.

C: Strophanthus gratus. D: Digitalis purpurea.

4 a) Cress, L. W.; Fries, W.; Haddy, F.; Muldoon, S. M., Hypertension, 1991, 18, 516-522 5 Geiger, U. P.; Weiss, E.; Reichstein, T., Helv. Chim. Acta, 1967, 50, 179-193 6 Kaldes også Acokanthera oblongifolia 7 Jacobs, W. A.; Bigelow. N. M., J. Biol. Chem., 1932, 96, 647-658 8 Stoll, A.; Kreis, W., Helv. Chim. Acta, 1935, 18, 120-141


— 11 —

Den medicinske og farmakologiske anvendelse af hjerteglycosider blev beskrevet i 1785 af den

britiske læge og botaniker William Withering i hans bog ”An Account of the Foxglove and Some of

its Medical Uses: with Practical Remarks on Dropsy and other Diseases”9. I bogen skildrer

Withering sin behandling af 163 patienter med blade fra Fingerbøl, og hvordan denne behandling

kan skabe en vanddrivende effekt. Et eksempel herpå lyder som følger:

“March 15th. A poor boy, about nine years of age, was brought for my advice. His

countenance was pale, his pulse quick and feeble, his body greatly emaciated, except

his belly, which was very large, and upon examination, contained a fluid. The case had

been considered as arising from worms. He was directed to take the decoctation of

Digitalis night and morning. It operated as a diuretic, never made him sick, and he got

well without any other medicine.”9

I Witherings grundige rapportering, beskrives også nogle af de toksiske bivirkninger, indtagelsen

af Digitalis kan medføre:

”In this situation I gave him the Infusum Digitalis stronger than usual, viz. two drams to

eight ounces. Finding himself relieved by this, he continued to take it, contrary to the

directions given, after the diuretic effects had appeared. The sickness which followed

was truly alarming; it continued at intervals for many days, his pulse sank down to forty in

a minute, every object appeared green to his eyes, and between the exertions of retching

he lay in a state approaching to syncope”9

I mange år blev Digitalis anvendt i behandling af adskillige sygdomme, såsom tuberkulose, astma,

gigt og struma. Planten er sågar blevet afprøvet til behandling af mentale lidelser og man mener

at bl.a. den kendte hollandske maler Vincent van Gogh blev behandlet med Digitalis, idet han i et

portræt af sin franske læge Paul Gachet har tilføjet en kvist af planten10 (Figur 5).

9 Withering, W., An Account of the Foxglove and Some of its Medical Uses: with Practical Remarks on Dropsy and other Diseases, 1785, Birmingham 10 Erdmann, E.; Greef, K.; Skou, J. C., Cardiac Glycosides 1785-1985, Steinkopff Verlag Darmstadt, 1986, 11-15


— 12 —

Figur 5. Portræt af Paul Gachet malet af Vincent van Gogh 1890

1.1.3 Anvendelse som hjertemedicin

Effekten af Digitalis på hjertet og hjerterytmen, blev opdaget i det 19. århundrede10. Brugen og

doseringen af hjerteglycosider har siden været udsat for omfattende studier og de har vist sig at

være meget virkningsfulde i behandling af hjertesvigt. Tidligere brugte man ofte Folium digitalis,

som var et tørret pulver af bladene fra Fingerbøl, men i dag anvendes kun de rene aktive stoffer –

som oftest hjerteglycosidet digoxin, der stammer fra Digitalis lanata1 (Figur 6). Digoxin

markedsføres bl.a. på tabletform under varemærket Lanoxin11.

Figur 6. Digoxin samt et tegnet eksemplar af Digitalis lanata

Hjertesvigt kaldes også hjerteinsufficiens og er en betegnelse for de symptomer, der fremkommer

ved utilstrækkelig pumpefunktion i hjertet. De primære symptomer er træthed, åndenød og

11 Patrick, G. L., An Introduction to Medicinal Chemistry, Oxford University Press, 2005, 3. edition, 688


— 13 —

væskeophobninger i kroppen. Hjertesvigt forekommer oftest i venstre hjertekammer, hvilket

medfører ophobning af væske i lungerne og dermed åndenød12,13. Er højre hjertekammer

svækket, optræder væskeophobningerne i leveren, maven og benene, hvilket netop var blandt de

symptomer Withering behandlede9. Årsager til hjertesvigt kan bl.a. være en blodprop i hjertet,

forsnævring af kranspulsåren eller betændelse i hjertet13. Hjerteinsufficiens ledsaget af atrieflimren

er den klassiske indikation for behandling med digoxin1.

1.1.4 Toksicitet

Desværre er hjerteglycosider meget giftige og har et meget smalt terapeutisk indeks. Tidligere har

det terapeutiske interval for digoxin været på 0.8-2.0 μg/L, men i dag efterstræbes et interval på

0.5-1.0 μg/L ved behandling med digoxin14,15. Trods det efterhånden brede kendskab til digoxins

farmakokinetik, ses symptomer på digoxin-intoksikation relativt ofte1. Symptomer kan være arytmi,

bl.a. i form af bradykardi, hvilket er en meget lav puls, men også kvalme og opkastning kan ses

ved forgiftning. Tilmed kan digoxin have effekt på centralnervesystemet, hvilket kan give

bivirkninger som flimren for øjnene og kloropsi, også kaldet grønsyn, som det berettes af

Withering9, men symptomer af denne type er dog sjældne. Svære digoxin-intoksikationer kan

være livstruende, men der findes dog muligheder for behandling ved eventuel forgiftning1.

1.2 Na+-K+-ATPasen

Hjerteglycosider har en effekt mod hjertesvigt, grundet deres evne til specifikt at inhibere

transporten af Na+ og K+16, hvilket drives af Na+-K+-ATPasen. Denne pumpe; der også er et

enzym, idet den spalter ATP enzymatisk; er essentiel for cellernes funktion, idet den er ansvarlig

for at opretholde den elektrokemiske gradient, der eksisterer over cellemembranen17,18.

12 http://www.hjerteforeningen.dk/sw5745.asp 13 http://www.hjerteforeningen.dk/sw5450.asp 14 Tallene refererer til den gennemsnitlige serumkoncentration af digoxin. 15 Bauman, J. L.; DiDomenico, R. J.; Galanter, W. L., Am. J. Cardiovasc. Drugs. 2006, 6, 77-86 16 Schatzmann, H. J., Helv. Physiol. Acta, 1953, 11, 346-354 17 Stanfield, C. L.; Germann, W. J., Principles of Human Physiology, Pearson Education, 2008, 3. edition, 108-110 18 Erdmann, E.; Greef, K.; Skou, J. C., Cardiac Glycosides 1785-1985, Steinkopff Verlag Darmstadt, 1986, 19-25


— 14 —

1.2.1 Struktur

I 1997 modtog Jens Christian Skou Nobelprisen i kemi for sin opdagelse af Na+-K+-ATPasen – 40

år efter han publicerede sin første artikel om denne pumpe19 – og for nylig er krystalstrukturen

blevet fundet20. Na+-K+-ATPasen er et membranbundet protein, der består af en α-, en β- og en

γ-enhed (Figur 7).

Figur 7. Struktur af Na+-K+-ATPasen fra svinenyreceller ved 3.5 Å opløsning20.

α-, β- og γ-enhederne er farvet hhv. blå, beige og rød. α-helix er vist som cylindre og β-strenge som pile.

α-enheden udgøres til dels af 10 transmembrane segmenter (TM1-TM10) (Figur 7) og har en

molmasse på ~ 110 kDa21. α-enheden indeholder bindingslommer for Na+, K+, ATP og også for

hjerteglycosider3,21. β-enheden, der er et glycoprotein, har en molmasse på 31.5 kDa i sin

glycosylerede form21. Funktionen af β-enheden har at gøre med regulering af aktivitet, ligesom

den er involveret i translokationen af det aktive protein til plasmamembranen21,22.

Der er fire forskellige isoformer af α-enheden (α1 – α4) og tre forskellige isoformer af β-enheden

(β1 – β3). Alle α/β-kombinationer resulterer i aktive pumper, men α1/β1 er den mest

19 Skou, J. C., Biochim. Biophys. Acta, 1957, 23, 394-401 20 Morth, J. P.; Pedersen, B. P.; Toustrup-Jensen, M. S.; Sørensen, T. L.-M.; Petersen, J.; Andersen, J. P.; Vilsen, B.; Nissen, P.; Nature, 2007, 450, 1043-1048 21 Bagrov, A. Y.; Shapiro, J. I.; Fedorova, O. V., Pharmacol. Rev., 2009, 61, 9-38 22 Schwinger, R. H. G.; Bundgaard, H.; Müller-Ehmsen, J.; Kjeldsen, K., Cardiovasc. Res., 2003, 57, 013-920


— 15 —

forekommende kombination i humane celler3. I det menneskelige hjerte udtrykkes kun α1 – α3 og

β1 – β2, β2 dog kun i meget lille udstrækning22. De isoformer af pumpen, der findes i det humane

hjerte, udviser alle høj og meget ens sensitivitet over for ouabain og det er derfor vanskeligt at

tilskrive den hæmmende effekt til en bestemt isoform af Na+-K+-ATPasen3. Der er dog resultater

der viser at udtrykket af de forskellige α- og β-enheder påvirkes forskelligt ved svaghed i hjertet22.

1.2.2 Funktion

Na+-K+-ATPasen transporterer aktivt tre Na+-ioner ud af cellen og to K+-ioner ind i cellen. Dette

drives af hydrolysen af ATP til ADP og uorganisk phosphat, hvilket placerer proteinet i familien af

P-type ATPaser23. Energien, der frigives ved hydrolyse, er nødvendig idet Na+ og K+ transporteres

mod deres elektrokemiske gradient17. Pumpen gennemgår en cyklus, hvor binding og frigørelse af

ioner samt phosphorylering inducerer ændringer i konformationen (Figur 8).

Figur 8. Skematisk oversigt over Na+-K+-ATPasens transport af Na+- og K+-ioner ved hydrolyse af ATP24

23 Yatime, L.; Buch-Pedersen, M. J.; Musgaard, M.; Morth, J. P.; Winther, A.-M., L.; Pedersen, B. P.; Olesen, C.; Andersen, J. P.; Vilsen, B.; Schiøtt, B.; Palmgren, M. G.; Møller, J. V.; Nissen, P.; Fedosova, N., BBA – Bioenergetics, 2009, 1787, 207-220 24 Figur er kopieret fra: http://www.au.dk/en/nobelprize1997/thepump. Illustration Kjell Lundin


— 16 —

Cyklen kan beskrives ved17:

1) Binding af tre Na+-ioner fra cytoplasma

2) Ved phosphorylering gennem hydrolyse af ATP opstår konformationsændring

3) Na+-ionerne frigives ekstracellulært

4) Binding af to K+-ioner fra den ekstracellulære væske

5) Dephosphorylering af enzymet frembringer konformationsændring

6) K+-ionerne frigives intracellulært

Gennem denne aktive transport af Na+- og K+-ioner, dannes en elektrokemisk gradient over

cellemembranen, idet der både er forskel i ladningen25 og i den kemiske sammensætning26 af den

intracellulære og den ekstracellulære væske. Denne gradient er essentiel for en række biologiske

funktioner, bl.a. stimuleringen af nerveceller og aktiveringen af en række enzymer18. I hvile

anvendes 20-30 % af den totale mængde energi, der frigives ved ATP-hydrolyse, til at drive

Na+-K+-ATPasen27.

1.3 Bindingsmodel og SAR-studier

Hjerteglycosider hæmmer Na+-K+-ATPasen gennem interaktion med den ekstracellulære del af

proteinet. Tilsyneladende har genin-delen den absolut største betydning for stoffernes aktivitet,

mens glycosidet spiller en rolle i forhold til de farmakodynamiske og –kinetiske egenskaber1,28.

Mutagenesestudier har identificeret en lang række aminosyrer, der har indflydelse på bindingen af

hjerteglycosider. Bindingslommen findes i α-enheden21,29, der består af 1016 aminosyrer20.

Aminosyreresterne fra Gln111 til Asn122 udgør den vigtigste del af den formodede

bindingslomme. Disse aminosyrer befinder sig i den løkke, der findes mellem TM1 og TM221,23.

Herudover er løkkerne TM5-TM6 og TM7-TM8 samt aminosyrerester i TM1, TM2, TM3, TM4,

TM6, TM7 og TM10 blevet identificeret til at være involveret i bindingen3,21,23. Ud fra den fundne

krystalstruktur af pumpen og de foreliggende mutagenesestudier, er en model for binding af

hjerteglycosider til Na+-K+-ATPasen blevet fremsat, hvor der blokeres for passagen af kationer

gennem pumpen23 (Figur 9).

25 Membranpotentiale (Vm) = -70 mV i de fleste celler. (Stanfield, C. L.; Germann, W. J., Principles of Human Physiology, Pearson Education, 2008, 3. edition, 98) 26 [K+]intra = 140 mM, [K+]ekstra = 4 mM, [Na+]intra = 15 mM, [K+]ekstra = 145 mM. (Stanfield, C. L.; Germann, W. J., Principles of Human Physiology, Pearson Education, 2008, 3. edition, 95) 27 Jorgensen, P. L.; Pedersen, P. A., BBA – Bioenergetics, 2001, 1505, 57-74 28 Prassas, I.; Diamandis, E. P., Nat. Rev. Drug Discov., 2008, 7, 926-935 29 Paula S.; Tabet, M. R.; Ball, W. J., Biochemistry – US, 2005, 44, 498-510


— 17 —

Figur 9. Model for binding af ouabain til Na+-K+-ATPasen fra svinenyreceller23.

(CTS = cardiotonic steroid)

SAR-studier af interaktionen mellem Na+-K+-ATPasen og hjerteglycosider har været udført, bl.a. af

S. Paula et al., der har undersøgt 37 stoffer og deres relative bindingsaffinitet samt deres

inhibitoriske effekt29. Det mest dramatiske fald i affinitet kunne observeres ved mætning af den

5-leddede lakton i digoxin og ouabain, hvilket meget vel kunne skyldes at laktonens plane struktur

herved ophæves. Derudover blev affiniteten væsentligt lavere, når steroidskelettet i digitoxigenin

blev ændret fra cis-trans-cis til trans-trans-cis. Affiniteten af hjerteglycosider faldt generelt når

kulhydratdelen blev fjernet, ligesom udskiftning af en 5-leddet lakton med en 6-leddet lakton fik

affiniteten til at falde.

Hvad angår den inhibitoriske effekt, kunne der observeres de samme fald i inhibering, ved de

beskrevne manipulationer af hjerteglycosiderne. Dog havde det ingen indflydelse på den

inhibitoriske effekt, hvorvidt kulhydratdelen var fjernet i de testede hjerteglycosider29. Trods den

efterhånden brede viden angående bindingen mellem hjerteglycosider og Na+-K+-ATPasen

mangler der stadig mange detaljer om den eksakte mekanisme for inhibering.


— 18 —

1.4 Positiv inotrop effekt

Hjerteglycosider virker mod hjerteinsufficiens, da de yder en positiv inotrop effekt, hvilket betyder

en øgning i hjertets kontraktilitet og dermed lindring af symptomerne.

1.4.1 Mekanisme

Hjerteglycosiders positive inotrope effekt kan forklares ud fra den teori, der kaldes ”Na+ pump lag

hypothesis”30,31. Når hjerteglycosider binder til og hæmmer Na+-K+-ATPasen, øges

koncentrationen af Na+ intracellulært, idet pumpens transport af Na+-ioner fra cytosolet til den

ekstracellulære væske standses. Dette påvirker den transmembrane pumpe, der er ansvarlig for

udveksling af Na+- og Ca2+-ioner (NCX), og som under normale forhold, udnytter den

elektrokemiske gradient af Na+-ioner til at pumpe Ca2+-ioner ud af cellen. Stigningen i den

intracellulære koncentration af Na+-ioner medfører reduceret aktivitet af NCX og dermed en

ophobning af Ca2+-ioner intracellulært (Figur 10). Denne øgede tilgængelighed af Ca2+ øger

styrken af kontraktion i de følgende muskelsammentrækninger i hjertet22,31.

2 K+

2 K+ 3 Na+

3 Na+HG

Na+ Ca2+

Ca2+Na+

Ekstracellulært

Intracellulært

Na+-K+-ATPase NCX

Hæmning

[Na+]intra

[Ca2+]intra

Figur 10. Mekanisme for virkning af hjerteglycosider (HG) på cellulært niveau.

30 Langer, G. A., J. Mol. Cell. Cardiol., 1970, 1, 203-207 31 Wasserstrom, J. A; Aistrup, G. L., Am. J. Physiol – Heart C., 2005, 289, 1781-1793


— 19 —

1.4.2 Hjertets kontraktion

Kontraktion af hjertemuskulaturen er en kompliceret cyklus, der involverer en række begivenheder

i hjertets muskelceller. Det centrale for selve kontraktionen, er interaktion mellem de to proteiner

actin og myosin32. Det specifikke sted, hvor myosin skal binde til actin, er i afslappet tilstand

blokeret af et tredje protein, der hedder tropomyosin. Tropomyosin er koblet til proteinkomplekset

troponin. Når Ca2+-koncentrationen stiger intracellulært, binder Ca2+ til troponin, hvilket skaber en

ændring i konformationen af tropomyosin. Herved blottes den bindingslomme, hvor myosin skal

binde til actin (Figur 11). Bindingen mellem myosin og actin igangsætter muskelkontraktionen.

Generelt gælder det at jo højere koncentration af Ca2+, jo kraftigere sammentrækning33.

Figur 11. Effekten af Ca2+-ioner på troponin og tropomyosin34.

Kontraktion finder sted når myosin binder til actin, hvilket kræver en blottet bindingslomme.

Hjerteglycosiders effekt på hjertets kontraktilitet skyldes altså, at hæmning af Na+-K+-ATPasen

medfører en højere intracellulær Ca2+-koncentration, hvilket direkte påvirker hjertemuskulaturens

evne til kontraktion.

32 Stanfield, C. L.; Germann, W. J., Principles of Human Physiology, Pearson Education, 2008, 3. edition, 373-375 33 Stanfield, C. L.; Germann, W. J., Principles of Human Physiology, Pearson Education, 2008, 3. edition, 327-332 34 Figur er kopieret fra: http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/neuro/c8.50x28.tropomyosin.jpg


— 20 —

1.5 Anticancerterapi

Brugen af hjerteglycosider i behandlingen af cancer, er bl.a. kendt fra en ældgammel kinesisk

opskrift, der stadig anvendes den dag i dag. I opskriften indgår ekstrakter fra tudsen Bufo bufo,

der indeholder adskillige bufadienolider, bl.a. bufalin35. Den nyeste forskning inden for

anvendelsen af hjerteglycosider har i høj grad været med fokus på anticancerterapi og disse

stoffers effekt på cancercellers apoptose og på tumorvækst3,28,35.

Epidemiologiske data har vist tydelige indikationer på lavere dødsrate blandt cancerpatienter, der

har været behandlet med hjerteglycosider, sammenlignet med cancerpatienter, der ikke har

indtaget denne type medicin3,36.

I 1979 kunne B. Stenkvist et al. publicere resultater, der viste at blandt 142 kvinder med

brystkræft, havde de patienter der tog hjerteglycosider mindre tumorer og mindre grad af

spredning end de resterende patienter37. Ydermere har B. Stenkvist et al. observeret effekten af

hjerteglycosider blandt en gruppe kvinder, der havde gennemgået mastektomi. Raten af patienter,

hvor canceren var tilbagevendt, var 9.6 gange større hos de patienter, der ikke modtog

behandling med hjerteglycosider38. I en undersøgelse efter 20 år, var dødsraten som følge af

brystcancer, 6 % blandt patienter på Digitalis, og 34 % blandt de resterende39.

Hjerteglycosider har vist sig at have en effekt in vitro på talrige kræftformer udover brystkræft,

såsom prostatakræft, lungekræft og leukæmi28. Flere teorier peger på at Na+-K+-ATPasen er et

potentielt ”target” i anticancerterapi, hvilket bl.a. baseres på at aktiviteten af Na+-K+-ATPasen er

ændret i cancerceller sammenlignet med normale celler3,28. Der er et utal af teorier om hvilken

virkning interaktionen mellem hjerteglycosider og Na+-K+-ATPasen kan have i anticancerterapi,

idet Na+-K+-ATPasen har adskillige roller, bl.a. i forbindelse med signaltransduktion i cellen35,40.

Hvad angår brystkræft, har J.-Q. Chen et al. fremsat en hypotese om at hjerteglycosider muligvis

virker som antagonister mod østrogenreceptoren, idet hormonet østrogen (Figur 12) har vist sig at

være en faktor i udviklingen af brystcancer40.

35 Newman, R. A.; Yang, P.; Pawlus, A. D.; Block, K. I., Mol. Interv., 2008, 8, 36-49 36 Haux, J., Med. Hypotheses, 1999, 153, 543-548 37 Stenkvist, B.; Bengtsson, E.; Eriksson, O.; Holmquist, J.; Nordin, B.; Weatman-Naeser, S; Eklund, G., Lancet, 1979, 313, 563 38 Stenkvist, B.; Bengtsson, E.; Dahlqvist, B.; Eriksson, O.; Jarkrans, T.; Nordin, B., N. Engl. J. Med., 1982, 306, 484 39 Stenkvist, B., Oncol. Rep., 1999, 6, 493-496 40 Chen, J.-Q.; Contreras, R. G.; Wang, R.; Fernandez, S. V.; Shoshani, L.; Russo, I. H.; Cereijido, M.; Russo, J., Breast Cancer Res. Tr., 2006, 96, 1-15


— 21 —

Figur 12. Strukturen af østrogen

Der er på nuværende tidspunkt nogle få hjerteglycosidbaserede stoffer, som bliver undersøgt til

behandling af cancer gennem kliniske forsøg28,35, så det bliver uden tvivl interessant at følge

udviklingen inden for dette felt.

1.6 Proteinkrystallografi

Strukturbestemmelse gennem proteinkrystallografi er en mere og mere udbredt metode. I

databasen Protein Data Bank findes over 45.000 makromolekylære strukturer, hvoraf størstedelen

er bestemt ved krystallografi og 14 Nobelpriser i kemi eller medicin er blevet uddelt til

proteinkrystallografer41.

Krystaller af proteiner frembringes ved langsom udfældning fra en vandig opløsning under

betingelser, der ikke medfører denaturering. En ligand kan eventuelt være bundet til proteinet,

hvis man ønsker at bestemme strukturen af komplekset mellem protein og ligand. Der er flere

metoder, der kan anvendes til udfældning, men hvorvidt proteinet danner brugbare krystaller

afhænger af en række faktorer såsom temperatur og pH42.

I et krystallografisk eksperiment bestråles krystallerne med røntgenstråling. Strålerne spredes af

elektronerne i molekylet og får dermed en specifik retning, der afhænger af molekylets størrelse

og form. Placeringen af hvert atom i krystalstrukturen har indflydelse på intensiteten af de

afbøjede stråler. Det primære resultat af et krystallografisk eksperiment er et billede af

elektrontætheden i molekylet, hvilket dernæst kan fortolkes til en struktur som det ses i Figur 741.

For at opnå bedre resultater i krystallografiske eksperimenter, kan det være en stor fordel at

krystallerne indeholder et ”tungt atom”. Dette kan være metaller som kviksølv, bly eller guld, men

grundstoffer som selen og brom, der langt oftere findes i organiske molekyler, kan også

anvendes. I proteinkrystallografi kan man eksempelvis erstatte methionin med selenomethionin for

at inkorporere selen i proteinet. Fordelen ved disse ”tunge atomer” er deres evne til at skabe

”anomalous scattering”, altså en uregelmæssig spredning af de indkomne stråler, hvilket er til stor

nytte for eksperimentet. En metode, der kan anvendes, er at benytte en markør i form af en ligand, 41 Wlodawer, A.; Minor, W.; Dauter, Z.; Joskolski, M., FEBS J., 2008, 275, 1-21 42 Rhodes, G., Chrystallography Made Crystal Clear, Academic Press, 2006, 3. edition, 10-13


— 22 —

som indeholder et af disse tunge atomer. Krystallerne af et protein-ligand-kompleks med denne

mærkede ligand, vil da med fordel kunne anvendes43.

1.7 Projektidé

Idéen til dette projekt er opstået på baggrund af den nyligt fundne krystalstruktur for

Na+-K+-ATPasen samt af den voksende videnskabelige interesse for hjerteglycosider. Som

beskrevet har hjerteglycosider adskillige farmakologiske egenskaber, hvilket gør denne gruppe af

stoffer utroligt interessante i kemi, såvel som i medicin.

Formålet er at fremstille en eller flere analoger af et hjerteglycosid eller –steroid, der potentielt kan

anvendes i krystallografiske eksperimenter og det er af denne grund målet, at disse nye analoger

skal indeholde et ”tungt atom” som selen. Idéen er at installere selen på det kulstof, der i

hjerteglycosider er bundet til et kulhydrat, med samme stereokemi, som der ses i de naturlige

hjerteglycosider (Figur 13).

Figur 13. Overordnet struktur af steroidskelettet i de ønskede selenmærkede analoger

I projektet skal analogerne syntetiseres ud fra naturligt forekommende og kommercielt

tilgængelige stoffer, såsom bufalin, ouabain og digitoxin. En af de centrale idéer er, at udføre en

kobling mellem et aktiveret selenoglycosid og ouabagenin, således at produktet bliver en

ouabainanalog, der kun adskiller sig fra det oprindelige hjerteglycosid ved, at et iltatom er erstattet

med et selenatom, hvilket ikke burde påvirke aktiviteten af molekylet.

Det er idéen at de fremstillede selenmærkede analoger, skal anvendes til at danne krystaller med

Na+-K+-pumpen og at det dannede protein-ligand-kompleks skal analyseres med

proteinkrystallografi. Tilstedeværelsen af et ”tungt atom” som selen, skaber en kæmpe fordel i de

krystallografiske eksperimenter, hvilket øger muligheden for at få et meget eksakt billede af

komplekset mellem pumpe og ligand.

Dette kan give helt ny viden om interaktionen mellem hjerteglycosider og Na+-K+-ATPasen, hvilket

ville være enestående. Denne nye indsigt vil kunne danne grundlaget for udviklingen af nye

interessante hjerteglycosider med højere aktivitet og lavere toksicitet, hvilket kan blive

banebrydende indenfor brugen af hjerteglycosider som medicin.

43 Rhodes, G., Chrystallography Made Crystal Clear, Academic Press, 2006, 3. edition, 117-136


— 23 —

2. Resultater og diskussion

2.1 Nummerering af steroidskelet

Kulstofatomerne i genin-delen i cardenolider nummereres fra C-1 til C-23. Denne nummerering er

vist i Figur 14. Steroidskelettet i bufadienolider nummereres på samme måde med undtagelse af

laktonen. Disse numre vil i opgaven blive anvendt for at tydeliggøre hvilket carbon, der refereres

til.

Figur 14. Nummerering af kulstofatomerne i genin-delen i cardenolider

2.2 Bufalin

I denne del af syntesearbejdet, var idéen at anvende bufalin (1) (Figur 2) til at fremstille to

analoger indeholdende hhv. brom og selen, idet begge disse atomer kan være til stor nytte i

krystallografiske eksperimenter.

2.2.1 Bromobufalin

3-Epi-bromobufalin (4) blev fremstillet fra bufalin (1) via reaktion med carbontetrabromid og

triphenylphosphin44 (Skema 1), hvorved stereokemien af C-3 bliver inverteret. Denne type reaktion

er også kendt som en Appel-reaktion45.

44 Lee, J. B.; Nolan, T. J., Can. J. Chemistry, 1966, 44, 1331-1334 45 Appel, R., Angew. Chem. Int. Edit., 1975, 14, 801-811


— 24 —

Skema 1. Dannelse af 3-epi-bromobufalin (4) fra bufalin (1)

Reaktionstiden var særdeles lang, og det var tilmed nødvendigt at tilsætte en kilde til yderligere

bromidioner undervejs, i form af lithiumbromid, for at presse reaktionen mod det bromerede

produkt. Idet reaktionen blev udført på meget lille skala, blev der kun dannet 3 mg produkt, hvilket

svarede til et middelmådigt udbytte på 37 %.

Reaktionsforløbet starter med nukleofilt angreb af brom fra triphenylphosphin, således at

bromoform i sin deprotonerede version bliver den udtrædende gruppe. Alkoholen deprotoneres,

under dannelse af bromoform, og det dannede alkoxid reagerer med det oxofile phosphor. Ved

det efterfølgende angreb fra den dannede bromidion, inverteres det chirale kulstof og

triphenylphosphinoxid dannes45 (Skema 2). Dannelsen af den stærke P=O-binding er drivkraften

for reaktionen.

Skema 2. Mekanisme for Appel-reaktion45

Den dannede analog blev dog af flere grunde ikke afprøvet til krystallografiske forsøg. For det

første er bufalin ekstremt dyrt46 og for det andet var udbyttet i reaktionen lavt, og vi var derfor ikke

interesserede i at udføre reaktionen på større skala. Derudover er bromholdige molekyler langt

mere problematiske at arbejde med i proteinkrystallografi end selenholdige molekyler.

46 10.0 mg koster 1.663,20 DKK. (Pris fra Sigma-Aldrich i september 2009)


— 25 —

2.2.2 Phenylselenylbufalin

Det blev ligeledes forsøgt at fremstille en selenoanalog af bufalin. Som udgangsstof blev

3-epi-bufalin (5) anvendt, idet denne var syntetiseret tidligere47 og derfor var tilgængelig. Idéen til

syntesen var at tosylere OH-3 og derefter udføre en substitution af det dannede tosylat med et

selenid, således at selen ville blive installeret på C-3 med den ønskede stereokemi (Skema 3).

Skema 3. Synteseidé til dannelsen af selenoanalog af bufalin fra 3-epi-bufalin (5)

For at afprøve hvorvidt en sådan substitution var mulig, blev (-)-menthol (6) brugt som

modelsystem for den sekundære alkohol. Først blev alkoholen mesyleret under

standardbetingelser med methansulfonylchlorid og triethylamin i ether, hvor det dannede

triethylammoniumchlorid fælder ud. Dernæst indgik det dannede mesylat (7) i en SN2-reaktion

med phenylselenid, som blev dannet ved reduktion af diphenyldiselenid med natriumborhydrid i

ethanol (Skema 4). Udbyttet af selenidet (8) blev 61 % over to trin, hvilket var acceptabelt.

Skema 4. Dannelse af 1-phenylselenylneomenthane (8) fra (-)-menthol

Mesylchlorid reagerer omgående med triethylamin under elimination af hydrogenchlorid, hvilket

ses ved udfældning. Alkoholen angriber svovl hvorefter et protonskift finder sted, og mesylatet

bliver herved dannet48 (Skema 5).

Skema 5. Mekanisme for mesylering48 og

efterfølgende substitution med phenylselenid 47 Udført af Henrik H. Jensen 48 Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic Chemistry, Oxford University Press, 2001, 486


— 26 —

Næste trin, er en simpel nukleofil substitution. Phenylselenid dannes ved reduktion med

natriumborhydrid og denne ekstremt gode nukleofil angriber mesylatet, hvorved det chirale center

inverteres (Skema 5).

Dette testforsøg på den sekundære alkohol i (-)-menthol, bekræftede at metoden kunne benyttes

med et acceptabelt udbytte. Proceduren blev derfor forsøgt anvendt på 7.0 mg 3-epi-bufalin (5),

dog med tosylering i stedet for mesylering. Tosyleringen blev udført i pyridin med

p-toluensulfonsyreanhydrid (Skema 6), for at undgå at danne en nukleofil under reaktionen, som

det er tilfældet ved anvendelsen af p-toluensulfonylchlorid, hvor der dannes chloridioner.

Tosylatanionen (TsO-) er en væsentligt dårligere nukleofil end chlorid, da den negative ladning er

delokaliseret pga. resonans. Produktet fra reaktionen blev ikke oprenset, men TLC-analyse og et

uoprenset udbytte på 110 % indikerede kvantitativ omdannelse.

Skema 6. Tosylering af 3-epi-bufalin (5)

Pyridin fungerer i denne reaktion både som solvent, som base og som nukleofil katalysator.

Gennem nukleofilt angreb fra pyridin aktiveres p-toluensulfonsyreanhydrid, idet den positive

ladning gør pyridin til en særdeles god udtrædende gruppe (Skema 7).

Skema 7. Mekanisme for pyridinkatalyseret tosylering

Da tosylatet (9) var dannet, blev det forsøgt at substituere med phenylselenid gennem den

afprøvede metode (Skema 8). Det isolerede stof fra denne reaktion, som blev analyseret ved 1H-NMR og LRMS, svarede dog desværre ikke til det ønskede produkt. (Beregnet for

C30H38O380SeNa: 549.2; beregnet for C30H38O3

80SeK: 565.2; fundet: 624.1).


— 27 —

Skema 8. Forsøg på dannelse af 3-phenylselenylbufalin (10)

Produktet fra sidereaktionen blev ikke identificeret, men den 6-leddede lakton kunne tænkes at

være labil under disse betingelser, hvor en stærk nukleofil er til stede. Nukleofil acylsubstitution af

den 6-leddede lakton vil muligvis være irreversibel, i modsætning til den tilsvarende reaktion på

den 5-leddede lakton.

Der var altså ikke succes med at introducere selen på C-3 i bufalin. Denne strategi blev derfor

kasseret og andre metoder til fremstilling af en hjerteglycosidanalog indeholdende selen blev

afprøvet.

2.3 Ouabain

Målet med denne del af projektet var at fremstille selenoouabain (11), hvor ilt i den glycosidiske

binding er udskiftet med selen. I et retrosyntetisk perspektiv, kan dette udføres ved at danne et

α-selenorhamnosid, der kan aktiveres og anvendes som nukleofilt selenid og dermed deltage i en

SN2 reaktion på C-3 på ouabagenin, hvor en udtrædende gruppe (LG) skal være installeret

ækvatorielt og hvor alkoholerne om nødvendigt er beskyttet (Skema 9).

OHO

OH

Se

HOHO

HOHO

O

O

OH

HO OAcO

OAc

RORO

RORO

O

O

OR

AcO

LGR = H, PGLG = Br, OTs ...

SeX

X = COAr, CN ...11

Skema 9. Retrosyntetisk analyse af dannelsen af selenoouabain (11)


— 28 —

2.3.1 Selenorhamnosid – p-methylbenzoylmetode

Denne del af syntesen tog udgangspunkt i tidligere publiceret arbejde hvor glycosylhalider blev

anvendt til dannelsen af p-methylbenzoyl selenoglycosider. Udfra disse intermediater blev en

række forskellige selenoglycosider fremstillet49,50 (Skema 10).

Skema 10. Skematisk repræsentation af arbejde udført af Y. Kawai et al.

med α-glycosylbromider som udgangsstoffer49

Vi lod os inspirere af dette arbejde i håb om at danne et p-methylbenzoyl selenorhamnosid, der

kunne anvendes i syntesen af selenoouabain (11).

* * * * *

Til dannelsen af selenoglycosiderne, blev reagenset kalium p-methylselenobenzoat (13) fremstillet

fra p-methylbenzoylchlorid og molekylært selen via et symmetrisk diselenid (12) (Skema 11)49,51.

Skema 11. Dannelsen af kalium p-methylselenobenzoat (13)

Først reduceres Se(0) med natriumborhydrid til selenidioner Se2-, der deltager i en nukleofil

acylsubstitution af syrechloridet, og herved dannes p-methylbenzoselenoat. Denne anion oxideres

ved reaktion med iod til diselenidet (12) (Skema 12).

Skema 12. Mekanisme for dannelse af bis(p-methylbenzoyl)diselenid (12)

49 Kawai, Y.; Ando, H.; Ozeki, H.; Koketsu, M.; Ishihara, H., Org. Lett., 2005, 7, 4653-4656 50 Nanami, M.; Ando, H.; Kawai, Y.; Koketsu, M.; Ishihara, H., Tetrahedron Lett., 2007, 48, 1113-1116 51 Ishihara H.; Matsunami, N.; Yamada Y., Synthesis, 1987, 371-373


— 29 —

Diselenidet blev dernæst reageret med kaliumhydroxid i methanol, hvilket efter oparbejdning gav

en grøn-sort blanding af kalium p-methylselenobenzoat (13) og molekylært selen (Skema 13).

Skema 13. Mekanisme for reaktion mellem diselenid (12) og kaliumhydroxid

Denne blanding kunne anvendes direkte, som det rapporteres af Y. Kawai et al.49, men det er dog

også muligt at opnå det rene kaliumsalt gennem omkrystallisering.

* * * * *

Peracetyleret α-rhamnosylbromid (16) blev fremstillet fra L-rhamnose monohydrat (14) (Skema

14). Dette bromid skulle anvendes til dannelsen af et p-methylbenzoyl selenorhamnosid.

Skema 14. Dannelse af 2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosylbromid (16)

Det er kendt fra litteraturen at iod er en effektiv aktivator til per-O-acetylering af ubeskyttede

kulhydrater52,53 ligesom dannelsen af α-glycosylbromider fra disse per-O-acetylerede kulhydrater

med hydrogenbromid i eddikesyre også er en velkendt metode54,55. Det acetylerede

α-L-rhamnopyranosylbromid (16) blev isoleret i et højt udbytte på 96 % over to trin. Det er dog,

som så mange andre glycosylbromider, et noget ustabilt stof, der bør opbevares i fryser.

Ifølge R. A. Field og kolleger52 aktiveres eddikesyreanhydrid ved at iod koordinerer til en af

carbonylerne, hvorved det elektrofile kulstof bliver mere reaktivt (Skema 15).

52 Ravindranathan Kartha, K. P.; Field, R. A., Tetrahedron, 1997, 53, 11753-11766 53 Mukhopadhyay, B.; Ravindranathan Kartha, K. P.; Russell, D. A.; Field, R. A., J. Org. Chem., 2004, 69, 7758-7760 54 Karrer, P.; Nageli, E.; Smirnoff, A. P., Helv. Chim. Acta., 1922, 5, 141-146 55 I forbindelse med acetyleringsreaktionen, er det dog nødvendigt at være opmærksom på at der skal anvendes yderligere en ækvivalent eddikesyreanhydrid, idet rhamnose kun er tilgængeligt som et monohydrat.


— 30 —

Skema 15. Aktivering af eddikesyreanhydrid med iod52 og mekanisme for acetylering

Dannelsen af rhamnosylbromidet sker gennem en oxoniumion, som dannes når det anomere

acetat protoneres og udtræder. Herefter angriber bromid, hvilket grundet anomer-effekten56 giver

et α-glycosylbromid (16)57 (Skema 16).

Skema 16. Mekanisme for dannelsen af α-rhamnosylbromidet (16)57

* * * * *

Adskillige forsøg på at reagere α-rhamnosylbromidet (16) med kalium p-methylselenobenzoatet

(13) blev hernæst udført under forskellige reaktionsbetingelser (Skema 17).

Målet var at fremstille α-selenorhamnosidet (17α) fra α-bromidet (16), enten som den eneste

isomer, eller alternativt som den overvejende komponent i en blanding af de to diastereomere.

Idet ilt på C-2 er beskyttet med en ester i form af et acetat, kan der muligvis ske anchimerisk

assistance fra acetatet til C-1 under glycosyleringsforløbet, hvilket i så fald ville medvirke til

dannelsen af den ønskede stereokemi. Derudover var forhåbningen at den anomere effekt af

selen, ville resultere i den aksiale α-anomer.

Skema 17. Afprøvede reaktionsbetingelser til dannelsen af p-methylbenzoyl selenorhamnosider

56 Anomer-effekten er beskrevet i større detalje i Del B. 57 Boons, G.-J.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, 2000, 1. edition, Sheffield Academic Press, 105-107


— 31 —

Indledningsvist blev den simpleste procedure, introduceret af Y. Kawai et al.49, afprøvet med den

undtagelse at DMF blev erstattet af acetonitril som solvent (A, Skema 17). Dette forsøg gav efter

5.5 h en blanding af flere forskellige glycosider. 1H-NMR-spektret af den uoprensede blanding

indikerede ligeledes tilstedeværelsen af flere stoffer. For det første sås tilstedeværelsen af det

hydrolyserede rhamnosid, idet både rhamnosylbromidet og i særdeleshed produktet var tilbøjeligt

til at hydrolysere. For det andet var både α- og β-p-methylbenzoyl selenorhamnosid (17α/β) til

stede. De to diastereomere blev ved tre søjler forsøgt adskilt uden succes.

Idet begge anomerer dannes ved denne reaktion, må det formodes at mekanismen til dels går

gennem en oxoniumion (A, Skema 18), hvilket pga. anomer-effekten hovedsageligt vil give

α-konfiguration og til dels er en simpel substitution af bromidet (B, Skema 18), hvilket giver

β-konfiguration.

Skema 18. Formodet mekanisme A og B for dannelsen af

α- og β-p-methylbenzoyl selenorhamnosid (17α/β)

Derefter blev et to-fase system afprøvet, i tilstedeværelse af tetrabutylammoniumhydrogensulfat

som ”phase-transfer” katalysator (B, Skema 17). En reaktionstid på 27 h var nødvendig for at få

udgangsstoffet omdannet. Blandingen blev med møje kromatograferet i en eluent indeholdende

tre solventer, hvilket resulterede i ca. 25 mg (19 %) af en af de to diastereomere.

Der kan dog ikke umiddelbart ud fra et simpelt 1H-NMR-spektrum, skelnes mellem α- og

β-anomererne, idet H-2 i rhamnose er en ækvatorial proton (Figur 15), hvilket betyder at

koblingskonstanten J1,2 ikke kan angive hvorvidt H-1 er ækvatorial eller aksial.

Figur 15. α- og β-p-methylbenzoyl rhamnosid,

hvor ækvatoriale og aksiale protoner er medtegnet


— 32 —

Årsagen til dette kan findes i Karplusligningen og -kurven58 (Figur 16), hvor værdien af den

vicinale koblingskonstant er afbildet som funktion af den dihedrale vinkel mellem de to protoner.

Vinklen mellem to ækvatoriale protoner og vinklen mellem en aksial og en ækvatorial proton er

meget lig hinanden (~60°)59. Det kan derfor være svært at afgøre om en ækvatorial proton kobler

til en anden ækvatorial proton (Jee) eller til en aksial proton (Jea), idet koblingskonstanterne også er

meget lig hinanden.

Der er lavet studier af forskellige kulhydrater i deres stolkonformation, hvor værdien for Jee og Jea

er fundet til at ligge i intervallerne 0.6-3.5 Hz hhv. 1.5-5.8 Hz60. Disse to overlappende intervaller

viser ligeledes, hvor vanskeligt det er at afgøre om H-1 i rhamnosider er ækvatorial eller aksial.

Figur 16. Kapluskurve58b.

Den vicinale koblingskonstant afbildet som funktion af den dihedrale vinkel.

Udfra de optagne NMR-spektra, tyder det dog på at den isolerede isomer er α-p-methylbenzoyl

selenorhamnosidet, hvor H-1 er placeret ækvatorialt. Dette baseres for det første på, at H-1 i den

isolerede isomer har et højere kemisk skift end H-1 i den anden isomer, hvilket kan ses når 1H-NMR-spektret sammenholdes med 1H-NMR-spektret af den ikke oprensede blanding. Dette er

en god indikation på at den isolerede isomer er α-isomeren, idet ækvatoriale protoner generelt har

højere kemisk skift end aksiale protoner. Det er blevet vist at dette ligeledes gælder for H-1 i

hexopyranoser60, og i publicerede NMR-data for selenorhamnosider, kan denne sammenhæng

også observeres61.

58 a) Karplus, M., J. Chem. Phys., 1959, 30, 11-15; b) Karplus, M., J. Phys. Chem. US, 1960, 64, 1793-1798 59 Friebolin, H., Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2005, 90-92 60 Kotowycz, G.; Lemiuex, R. U., Chem. Rev., 1973, 73, 669-698 61 Mehta, S.; Pinto, B. M., J. Org. Chem., 1993, 58, 3269-3276


— 33 —

Der blev ligeledes optaget et NOESY-spektrum. I denne type spektre kan der ses signaler

svarende til korrelationen mellem protoner, der rumligt er forholdsvist tæt ved hinanden. Dette

skyldes at NOE-effekten afhænger af dipol-dipol interaktioner, som er proportionelle med 1/r6 og

derfor aftager kraftigt med stigende afstand mellem protonerne62. Idet afstanden mellem H-1 og

H-5 er 2.38 Å ± 0.2 i β-anomeren, og 3.69 Å ± 0.2 i α-anomeren63, ville man forvente at se et

signal for korrelation mellem H-1 og H-5, i fald den isolerede isomer var β-anomeren, men et

sådant signal kunne ikke observeres. Der var et tydeligt signal svarende til korrelation mellem H-3

og H-5, som er to aksiale protoner. Dette er altså endnu en indikation på at H-1 i den isolerede

diastereomer er en ækvatoriel proton.

Det er dog svært med sikkerhed at afgøre om den isolerede anomer er α-p-methylbenzoyl

rhamnosid, idet det ikke har været muligt at isolere den anden anomer. Havde det været muligt at

sammenholde spektrene for de to diastereomere, kunne man med stor sandsynlighed afgøre

hvilken, der var α-anomeren. 1H-NMR-spektrene af de uoprensede produkter fra de foregående forsøg indikerede at den

formodede α-anomer var den isomer, der blev dannet som den mindst forekommende. Derudover

var de to diastereomere som nævnt svære at adskille og isolere. Det blev derfor af endnu større

betydning at forsøge at finde reaktionsbetingelser hvor udelukkende α-anomeren blev dannet.

In situ-anomerisering64 med tetrabutylammoniumbromid blev afprøvet med dichlormethan som

solvent til at begynde med (C, Skema 17). I denne metode er idéen, at der ved tilstedeværelsen af

bromidioner – her fra TBAB – dannes en hurtig ligevægt mellem α- og β-glycosylbromiderne

(Skema 19). Idet α-anomeren er stabiliseret af anomer-effekten, er β-anomeren den mest

reaktive, og det må derfor forventes at substitutionen af β-glycosylbromidet vil foregå hurtigere,

hvorved α-selenoglycosidet vil være det overvejende, og forhåbentligt det eneste, produkt65.

Skema 19. Mekanisme for in situ-anomerisering65

62 Friebolin, H., Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2005, 276-280 63 Disse værdier er fundet gennem modellering udført af specialestuderende Anders Uhrenholt Christensen 64 a) Lemiuex, R. U.; Hayami, J.-I., Can. J. Chemistry, 1965, 43, 2162-2173, b) Lemiuex, R. U.; Hendriks, K. B.; Stick, R. V.; James, K., J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 4056-4062 65 Boons, G.-J.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, 2000, 1. edition, Sheffield Academic Press, 112-114


— 34 —

Der var dog også problemer med denne procedure. For det første var kaliumselensaltet (13) ikke

opløseligt i dichlormethan, hvorfor det blev nødvendigt at tilsætte DMF undervejs. For det andet

var udfaldet i dette forsøg ligeledes en blanding af diastereomere og af det hydrolyserede produkt.

Metoden blev for at løse opløselighedsproblemet forsøgt gentaget med DMF som solvent (D,

Skema 17), men udfaldet var det samme skuffende resultat.

* * * * *

En alternativ vej til dannelsen af α-selenorhamnosidet blev afprøvet ved at benytte et andet

beskyttelsesgruppesystem på rhamnosylbromidet, hvor en isopropyliden var installeret på O-2 og

O-3 (18). Dette ville formodentlig gøre bromidet yderligere reaktivt i forhold til den peracetylerede

donor, idet estre er mere elektrontiltrækkende end en acetal. I så fald, burde det medføre en

hurtigere dissociation af bromidet og dannelse af oxoniumionen, og anomer-effekten af selen ville

forhåbentlig resultere i en favorisering af dannelsen af α-anomeren (Skema 20).

Skema 20. Formodet mekanisme for dannelsen af α-selenoglycosid fra isopropylidenbeskyttet bromid (18)

Til fremstillingen af dette bromid, blev α-ethyl thioglycosidet (22) syntetiseret fra det

peracetylerede rhamnosid (15) (Skema 21).

Skema 21. Syntesen af ethyl 2,3-O-isopropyliden-4-O-acetyl-1-thio-α-L-rhamnopyranosid (22)


— 35 —

Brugen af bortrifluorid diethyletherat som katalysator i dannelsen af et thioglycosid fra et acetat er

en velkendt metode66. BF3 er en hård Lewis syre, der koordinerer til acetatet, som dermed bliver

en god udtrædende gruppe. Oxoniumionen dannes, hvorefter thioethanol reagerer med det

anomere kulstof i et nukleofilt angreb. I dette tilfælde gav det et acceptabelt udbytte på 80 %, dog

som en α/β-blanding (Skema 22). Det var muligt at separere de to anomerer uden problemer og

idet de spektrale data var tidligere publiceret67, kunne begge diastereomerer karakteriseres uden

problemer.

Skema 22. Mekanisme for bortrifluorid-katalyseret thioglycosiddannelse

En simpel Zemplen-afbeskyttelse med katalytisk natriummethoxid i methanol68 blev udført uden

problemer. Mekanisme for denne reaktion er en simpel nukleofil acylsubstitution af estrene med

methoxid under dannelse af methylacetat, der kan fjernes ved inddampning under reduceret tryk

(Skema 23).

OAcOAcO O

SEt

O

MeO +/- H

MeOAc19

OAcOAcO O

SEt MeOH

MeO

OAcOAcO OH

SEt

OHOHO OH

SEt

20 Skema 23. Mekanisme for Zemplen-afbeskyttelse med katalytisk natriummethoxid

Herefter blev isopropylidenen introduceret ved en syrekatalyseret transacetalisering med

2,2-dimethoxypropan under dannelsen af methanol69. Reaktionen foregår selektivt på den

1,2-cis-diol, der udgøres af hydroxygrupperne på C-2 og C-3 (Skema 24). Den dannede acetal er

herved mindre sterisk hindret i forhold til en 1,2-trans-diol eller en 1,3-diol.

66 Ferrier, R. J.; Furneaux, R. H., Carbohyd. Res., 1976, 52, 63-68 67 Borbás, A.; Lipták, A., Carbohyd. Res., 1993, 241, 99-116 68 a) Zemplen, G.; Kuns, A.. Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1923, 56, 1705-1710; b) Zemplen, G.; Pacsu, E., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1929, 62, 1613-1614 69 Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic Chemistry, Oxford University Press, 2001, 344


— 36 —

OHOHO OH

SEt

HO O

O +/- H

OHOHO O

SEtMeOH

OH

- H

MeOH SEt

OHOO O

20 21

Skema 24. Mekanisme for transacetalisering69

Til sidst blev O-4 acetyleret med eddikesyreanhydrid og triethylamin, hvor DMAP blev tilsat

undervejs i reaktionen i et forsøg på at øge hastigheden. Mekanismen for acetylering med

eddikesyreanhydrid er vist tidligere (Skema 15). Alternativt kan denne reaktion muligvis foregå

gennem en keten pga. triethylamins høje basestyrke70 sammenlignet med pyridin, der ofte bruges

i denne type reaktion71. Ketenen dannes i så fald ved deprotonering af en af α-protonerne i

eddikesyreanhydrid, hvor DMAP da kan tænkes at reagere med den dannede keten, hvilket giver

et meget reaktivt intermediat (Skema 25).

Skema 25. Alternativ mekanisme for acetylbeskyttelse med eddikesyreanhydrid og triethylamin

Over tre trin fra det peracetylerede thioglycosid (19α), gav dette et udbytte af det acetalbeskyttede

thioglycosid (22) på 65 %, hvilket er acceptabelt (Skema 21).

For at danne det ønskede α-bromid af dette beskyttede rhamnosid, blev thioglycosidet (22)

reageret med brom, hvilket er en kendt metode til dannelsen af glycosylbromider fra

thioglycosider72. Det dannede bromid (18) formodes at være meget ustabilt, og produktet blev

derfor anvendt direkte i næste reaktion uden oprensning og uden analyse ved NMR. Analyse med

MS af produktet fra bromeringsreaktionen tydede dog på at brom havde reageret både med det

anomere center og med en af methylgrupperne i isopropylidenen (Skema 26) og observation af

denne sidereaktion er da også beskrevet i litteraturen73.

70 pKa(Et3NH+) = 10.75. Værdien er fundet i Evans pKa-tabel: http://evans.harvard.edu/pdf/evans_pKa_table.pdf 71pKa(PyrH+) = 5.21. Værdien er fundet i Evans pKa-tabel: http://evans.harvard.edu/pdf/evans_pKa_table.pdf 72 a) Bonner, W. A., J. Am. Chem. Soc., 1948, 70, 770-772; b) Bonner, W. A., J. Am. Chem. Soc., 1948, 70, 3491-3497 73 Sundgren, A.; Lahmann, M.; Oscarson, S., J. Carbohyd. Chem., 2005, 24, 379-391


— 37 —

Den efterfølgende reaktion med kalium p-methylselenobenzoat (13) under in situ-anomeriserings-

betingelser (Skema 26) viste sig som i de tidligere tilfælde at være problematisk. Efter

søjlekromatografi kunne tilstedeværelsen af flere forskellige ikke-separerbare stoffer observeres,

hvilket kan skyldes dannelsen af begge anomerer samt at brom kan sidde på enten den ene eller

den anden af de to methylgrupper i isopropylidenen, således at der er mulighed for op til fire

forskellige stoffer.

Skema 26. Reaktion mellem thiorhamnosid (22) og brom

efterfulgt af forsøg på dannelse af α-selenoglycosid

Omdannelse fra et thioglycosid til et glycosylbromid gennem reaktion med brom, finder sted når

thioglycosidet aktiveres gennem nukleofilt angreb fra svovl på det elektrofile brom. Herved dannes

en god udtrædende gruppe - her i form af ethylsulfenylbromid (EtSBr). Bromidionen angriber den

dannede oxoniumion, hvorved glycosylbromidet er dannet.

Skema 27. Mekanisme for reaktionen mellem et thioglycosid og brom

Efter disse adskillige forsøg på at danne et α-p-methylbenzoyl selenorhamnosid, stod det klart at

dette ikke var vejen frem. Skulle denne metode benyttes til dannelsen af selenoouabain, ville det

umiddelbart være nødvendigt at anvende p-methylbenzoyl selenorhamnosiderne som en

uoprenset blanding af diastereomere, idet det ikke var muligt at isolere α-selenoglycosidet. Det

ville dog være uhensigtsmæssigt, idet dette ville resultere i en blanding af produkter, hvoraf kun

det ene var ønsket, ligesom disse produkter ikke nødvendigvis ville være separerbare.


— 38 —

2.3.2 Selenorhamnosid – selenocyanatmetode

For at afprøve en anden metode til dannelsen af selenoglycosider, lod vi os inspirere af tidligere

publiceret arbejde omhandlende glycosylthiocyanater74, idet glycosylselenocyanater umiddelbart

er et uberørt område. Et peracetyleret rhamnosylselenocyanat (23α/β) blev dannet fra det tidligere

fremstillede α-L-rhamnopyranosylbromid (16) (Skema 28). Kaliumselenocyanat blev anvendt til

dette og 18-krone-6 blev tilsat for at udnytte denne etherforbindelses evne til at kompleksere

kaliumioner gennem ion-dipol-interaktioner75. På denne måde bliver selenocyanationen yderligere

nukleofil.

OAcOAcO OAc

Br

OAcOAcO OAc

SeCNKSeCN18-krone-6

Acetonert, 4h

1. NaBH4, EtOH0 oC til rt, 1h

2. BnBr, EtOHrt, 15 min

OAcOAcO OAc

SeBn

19 %, 1:116 2423

Skema 28. Dannelse af benzyl selenorhamnosid (24α/β) fra rhamnosylbromid (16)

Rhamnosylselenocyanatet dannes som en α/β-blanding hvilket antyder at mekanismen, ligesom

for dannelsen af p-methylbenzoyl selenorhamnosidet, delvist er substitution af bromidet og delvist

går gennem oxoniumionen (Skema 18, R=CN).

Da thiocyanater (R-SCN) kan isomerisere til de tilsvarende isothiocyanater (R-NCS)76, måtte det

forventes at også selenocyanaterne kunne være ustabile. Idet separation af de to diastereomere

selenocyanater ved søjlekromatografi ikke umiddelbart var succesfuldt, blev den uoprensede

blanding anvendt direkte til dannelsen af benzyl selenorhamnosid, der blev brugt som testsystem.

Selenocyanatgruppen blev reduceret med natriumborhydrid i sprit, hvorefter benzylbromid blev

tilsat (Skema 28). Ved reduktionen dannes et natriumselenid, der deltager i nukleofil substitution

af benzylbromid (Skema 29).

74 a) Kochetkov, N. K.; Klimov, E. M.; Malysheva, N. N.; Demchenko, A. V., Carbohyd. Res., 1991, 212, 77-91; b) Somsák, L.; Czifrák, K.; Deim, T.; Szilágyi, L.; Bényei, A., Tetrahedron-Assymmetr., 2001, 12, 731-736 75 a) Pedersen, C. J., J. Am. Chem. Soc., 1967, 89, 7017-7036; b) Greene, R. N., Tetrahedron Lett., 1972, 18, 1793-1796 76 a) Billeter, O., Ber., 1875, 8, 462-466; b) Smith, P. A. S.; Emerson, D. W., J. Am. Chem. Soc., 1960, 82, 3076-3082


— 39 —

Skema 29. Formodet mekanisme for dannelsen af benzyl selenorhamnosid (24)

Denne reaktionsrække gav en α/β-blanding i forholdet 1:1 med et udbytte på 19 %. Dette er

desværre lavt, men trods alt havde vi nu fundet en metode til at danne et α-selenorhamnosid. De

to diastereomere kunne adskilles ved søjlekromatografi.

For at afgøre hvilken diastereomer der var α-anomeren og hvilken der var β-anomeren, blev de

spektrale NMR-data for disse to stoffer analyseret. De karakteristiske forskelle mellem de to

diastereomere kommer til udtryk i det kemiske skift for H-1 og i koblingen mellem C-1 og H-1, idet

disse to værdier påvirkes af hvorvidt H-1 er ækvatorial eller aksial. H-1 har, som før nævnt,

generelt højere kemisk skift når den er ækvatorial60 ligesom JC-1,H-1 i langt de fleste tilfælde er

højere når H-1 er ækvatorial77. Ydermere kunne de spektrale data for benzyl

selenorhamnosiderne (24α/β) sammenlignes med publicerede data for de to tilsvarende

acetylbeskyttede phenyl selenorhamnosider61. Fra disse tilgængelige informationer, var det muligt

at identificere og skelne de to diastereomere. De specifikke data ses i Tabel 1.

Tabel 1. Data for de syntetiserede acetylerede benzyl selenorhamnosider (24α/β) sammenlignet med data for de acetylerede phenyl selenorhamnosider

Phenyl selenorhamnosider61 Benzyl selenorhamnosider

α β α β

δ H-1 (ppm) 5.65 5.09 5.34 4.66

JC-1,H-1 (Hz) 171 156 172 150

77 Bock, K.; Lundt, I.; Pedersen, C., Tetrahedron Lett., 1973, 14, 1037-1040


— 40 —

2.3.3 Modifikation af ouabagenin

Et α-selenorhamnosid skulle udgøre den ene bestanddel i selenoouabain, mens den anden del

skulle udgøres af ouabagenin, hvor en udtrædende gruppe skulle installeres ækvatorielt på C-3

og hvor de frie alkoholer kunne være beskyttet (Skema 9). Flere strategier blev afprøvet.

Idet udgangsstoffet var kommercielt tilgængeligt ouabain octahydrat (2), var første trin i syntesen

at hydrolysere glycosidbindingen i ouabain. Dette blev, med udgangspunkt i en procedure omtalt

af E. J. Corey og kolleger78, udført med koncentreret saltsyre i acetone, hvilket samtidig førte til

dannelsen af en isopropyliden mellem de to alkoholer på hhv. C-1 og C-19 (Skema 30).

Skema 30. Hydrolyse af ouabain octahydrat (2)

under dannelse af ouabagenin 1,19-monoacetonid (25)

Der var adskillige problemer med at finde den rette metode til oprensning og oparbejdning af det

dannede stof ouabagenin 1,19-monoacetonid (25). Den syrelabile acetal havde tendens til at blive

ødelagt ved søjlekromatografi og opløseligheden i gængse organiske solventer var meget lav,

hvilket også vanskeliggjorde ekstraktion. Problemet blev løst ved at lade det dannede produkt

bundfælde efter endt reaktion og derefter vaske og bundfælde adskillige gange for at blive fri for

resterende syre, vand og biprodukter. Denne procedure gav produktet i et udbytte på 86 %, hvilket

var yderst tilfredsstillende.

Isopropylidenen dannes ved reaktion mellem en 1,3-diol og acetone katalyseret af syre. I

reaktionen fraspaltes vand under dannelse af en oxoniumion, som reagerer intramolekylært med

den anden frie alkohol69.

78 Hong, B.-C.; Kim, S.; Kim, T.-S.; Corey E. J., Tetrahedron Lett., 2006, 47, 2711-2715


— 41 —

Skema 31. Mekanisme for reaktion mellem en 1,3-diol og acetone69

Glycosidbindinger er acetaler og hydrolyseres derfor i vandig syre med en oxoniumion som

intermediat (Skema 32).

OHO

OH

O

HOHO

HO

HO

H

OHO

OH

HO

HOHO

HO

HO

HO

HOHO

HO

OHO

HO OH

H2O

- HOHO

OHHO

OH

2 Skema 32. Mekanisme for hydrolyse af den glycosidiske binding i ouabain (2)

Ud fra dette stof, blev forskellige manipulationer afprøvet. Indledningsvist havde ideen været at

udføre en Appel-reaktion44,45 i THF, ligesom det blev udført med bufalin (Skema 1), men pga.

dårlig opløselighed blev denne ide bortkastet.

En anden ide var at tosylere OH-3 og derefter substituere med eksempelvis et bromid for på

denne måde at indføre en udtrædende gruppe, der var placeret ækvatorialt. Det dannede

acetonid havde resulteret i beskyttelse af den primære alkohol og af en af de sekundære, men der

var stadig to frie sekundære alkoholer, hvoraf kun den ene skulle tosyleres. For at tosyleringen

skulle være en succes, var det altså vigtigt at reaktiviteten af OH-3 var højere end af OH-11,

således at produktet blev et monotosyleret stof.

Tosyleringen blev udført i pyridin med p-toluensulfonsyreanhydrid, ligesom tosyleringen af

3-epi-bufalin (Skema 6). DMAP blev brugt som katalysator (Skema 33). Reaktionen gav et ringe

udbytte på kun 16 % efter 7 dage.


— 42 —

Skema 33. Tosylering af ouabagenin monoacetonid (25)

Udfra 1H-NMR kunne det fastslås at det var OH-3 og ikke OH-11, der var blevet tosyleret. I

udgangsstoffet (25) optræder H-3 og H-11 ved hhv. 4.05 og 3.98 ppm (se Appendiks). H-3 er en

ækvatorial proton, hvilket betyder at signalet er smalt, idet den har små koblinger, og summen af

koblingskonstanterne derfor bliver lille. H-11, som er aksial, har større koblingskonstanter og giver

dermed et bredere signal. I spektret for produktet, ses det tydeligt at det brede signal for H-11 er

nogenlunde uændret (3.81 ppm), mens signalet for H-3 er betydeligt forskubbet til et højere

kemisk skift (4.90 ppm) (se Appendiks).

DMAP virker som nukleofil katalysator ved at aktivere p-toluensulfonsyreanhydrid, således at der

dannes en ekstremt god udtrædende gruppe, som forlader svovl, ved angreb fra alkoholen

(Skema 34). Pga. resonansstabilisering fra det exocykliske kvælstof i DMAP, er det endocykliske

kvælstof en bedre nukleofil end kvælstof i pyridin, hvilket forklarer den forøgelse i hastigheden,

som tilsætning af DMAP medfører.

Skema 34. Mekanisme for DMAP-katalyseret tosylering

Det lave udbytte i denne reaktion, kan til dels forklares med dannelsen af et biprodukt, som blev

isoleret med et udbytte på 38 %. Dette produkt blev ud fra HRMS og NMR identificeret som et

monotosyleret produkt, indeholdende en dobbeltbinding, idet en dehydrering havde fundet sted.

Både OH-3 og OH-11 er altså blevet tosyleret i en del af udgangsstoffet, hvorefter en

eliminationsreaktion har fundet sted ved et af disse centre. Umiddelbart peger 1H-NMR på at

eliminationen er sket mellem C-11 og C-12 eller mellem C-11 og C-9 (Figur 17), idet det

karakteristiske brede signal fra H-11 ikke kan observeres (se Appendiks).


— 43 —

Figur 17. Mulige biprodukter fra elimination ved C-11

For tosylatet på C-3 som sidder aksialt, er der potentiale for E2-elimination idet den udtrædende

gruppe og protonen her er placeret i en antiperiplanar konformation, hvilket giver et positivt

orbitaloverlap, som muliggør en E2-mekanisme. Hvis eliminationen er sket som formodet ved det

ækvatoriale tosylat på C-11, kræver det at eliminationen har fundet sted ved en E1-mekanisme,

hvilket er en smule usædvanligt, når den dannede carbokation er sekundær (Skema 35)79. Der er

dog i litteraturen rapporteret eliminationer af denne art mellem C-11 og C-9 i sådanne steroider80.

Skema 35. Mekanisme for E1- og E2-elimination for hhv. et ækvatorialt og et aksialt tosylat

Idet udbyttet af det ønskede produkt var meget lavt, og det dominerende produkt var et uønsket

biprodukt, blev denne syntesestrategi forkastet.

* * * * *

Inspiration til en ny syntesestrategi kom fra E. J. Coreys artikel78, hvori det rapporteres at OH-3 i

ouabagenin 1,19-monoacetonid kan inverteres ved oxidation med Dess-Martin periodinan

efterfulgt af reduktion med natriumborhydrid. Dette ville skabe muligheden for at tosylere den

inverterede hydroxylgruppe, hvorved en god udtrædende gruppe ville være installeret på C-3 med

den ønskede stereokemi. Oxidationen blev udført med 1.2 ækv. oxidant i dichlormethan, hvilket

desværre gav en blanding af en monoketon (27), hvor OH-3 var oxideret og en diketon (28), hvor

både OH-3 og OH-11 var oxideret (Skema 36).

79 Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books, 2006, 581-592 80 a) Rosenkranz, G.; Mancera, O.; Sondheimer, F., J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 2227-2230; b) Purdy, R. H.; Morrow, A. L.; Blinn, J. R.; Paul, S. M., J. Med. Chem., 1990, 33, 1572-1581


— 44 —

Skema 36. Oxidation af ouabagenin monoacetonid (25) resulterende i en blanding af produkter

Første skridt i mekanismen for DMP-oxidation er substitution af iod, således at et acetat erstattes

med den hydroxylgruppe, der skal oxideres. Dernæst deprotoneres kulstof, hvorved

C=O-bindingen dannes. Eddikesyre bliver udtrædende gruppe og iod reduceres fra oxidationstrin

V til III.

Skema 37. Mekanisme for oxidation med Dess-Martin periodinan

Udover problemet ved at oxidationen resulterede i mere end et produkt, gav det et meget ringe

udbytte på kun 14 % af det ønskede produkt, så alt i alt var det et meget skuffende udfald af

denne reaktion. Oxidation med IBX, som er en anden iod(V)-forbindelse (Figur 18), der er en

ikke-acetyleret udgave af DMP, blev også afprøvet, men heller ikke dette gav det ønskede

resultat.

Figur 18. 2-Iodoxybenzoesyre (IBX)

Forsøg på syntesen af selenoouabain, havde alt i alt givet en række skuffende resultater og kun

meget få positive resultater. Det havde vist sig at være vanskeligt at danne og isolere et

α-selenorhamnosid, og erfaringerne fra de få reaktioner, der blev udført med ouabagenin


— 45 —

1,19-monoacetonid, viste tydelige vanskeligheder med henblik på at opnå selektivitet mellem

OH-3 og OH-11. Ambitionerne om at danne denne selenmærkede analog af et hjerteglycosid blev

derfor opgivet.

2.4 Digitoxin

I de sidste forsøg på at fremstille en brugbar selenoanalog af et hjerteglycosid, blev digitoxin

anvendt. Der havde været problemer med bufalins 6-leddede lakton og med ouabains høje

hydroxyleringsgrad, så det kunne potentielt være gunstigt at anvende digitoxin, som har en

5-leddet lakton og en lav hydroxyleringsgrad. Idéen var at introducere et simpelt selenid på C-3,

således at denne nye analog ikke indeholdt en glycosidbinding. Produktet ville altså blive en

analog af digitoxigenin (29), der er genin-delen af digitoxin, og som ligeledes udviser aktivitet

overfor Na+-K+-ATPasen (Figur 19).

Figur 19. Strukturen af digitoxigenin

2.4.1 Methylselenyldigitoxigenin

Med udgangspunkt i en publikation af J. M. Langenhan et al.81 fik vi inspiration til syntesen af en

selenoanalog fra digitoxin (3). I dette arbejde rapporteres hvordan digitoxin kan hydrolyseres

under oxidation af den fremkomne sekundære alkohol. Til denne reaktion anvendes chromtrioxid

og svovlsyre i vand og acetone. Oxidation under disse betingelser er bedre kendt som en Jones

oxidation82. Denne reaktion gav et respektabelt udbytte på 66 % af 3-digitoxigenon (30) (Skema

38).

81 Langenhan, J. M.; Peters, N. R.; Guzei, I. A.; Hoffmann F. M.; Thorson, J. S., P. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 12305-12310 82 Bowden, K.; Heilbron, I. M.; Jones, E. R. H.; Weedon, B. C. L., J. Chem. Soc., 1946, 39-45


— 46 —

O

O

OH

OO

OH

OH

3 3

CrO3H2SO4, H2O

Acetone0 oC til rt, 5h

O

O

OH

30O

66 % Skema 38. Hydrolyse og oxidation af digitoxin (3)

De sure vandige betingelser medfører hydrolyse af glycosidbindingerne. Mekanisme for denne

hydrolyse er vist for ouabain (Skema 32). I oxidationen dannes først en chromatester, der

efterfølgende nedbrydes under dannelse af den oxiderede forbindelse. Chrom er herved blevet

reduceret fra oxidationstrin VI til IV. Den dannede chrom(IV)-forbindelse reagerer med en

chrom(VI)-forbindelse, hvorved der dannes chrom i oxidationstrin V, som ligeledes kan oxidere en

alkohol og herved blive reduceret til en chrom(III)-forbindelse. Chrom(III) er grønt, hvorimod

chrom(VI) er orange, så reaktionen kan følges via observation af farveskift83 (Skema 39).

Skema 39. Mekanisme for Jones oxidation83

Reduktionen af denne keton (30) med natriumborhydrid er en kendt reaktion84,85, ligesom

tosylering84 såvel som mesylering85 af den dannede ækvatoriale alkohol er tidligere publiceret.

Reduktionen blev udført i dioxan og vand. Selvom reaktionen foregik ved lav temperatur, blev

digitoxigenin (29) stadig dannet som biprodukt, dog i væsentligt lavere udbytte (6 %) end det

ønskede produkt (31) (68 %) (Skema 40).

83 Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic Chemistry, Oxford University Press, 2001, 638 84 Sawlewicz, L.; Weiss, E.; Linde, H. H. A.; Meyer, K., Helv. Chim. Acta, 1972, 55, 2452-2460 85 Gobbini, M.; Benicchio, A.; Padoani, G.; Torri, M.; Melloni, P., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7, 469-472


— 47 —

Skema 40. Reduktion af digitoxigenon med natriumborhydrid

De anvendte referencer nævner umiddelbart intet om dannelsen af den aksiale alkohol, så

forekomsten af dette biprodukt var en smule uventet84,85. Reduktion af 4-t-butylcyklohexanon med

lithiumaluminiumhydrid resulterer dog i ca. 10 % af den aksiale alkohol86, så denne type

hydridreduktioner med en ”lille” nukleofil, er altså ikke altid 100 % stereoselektiv.

At det i så høj grad er den ækvatoriale alkohol, der dannes, kan bl.a. forklares ved den såkaldte

Cieplak-effekt87. I denne model tages der højde for orbitalinteraktioner mellem de eksisterende

bindinger og den binding der dannes. Elektrondonation fra de aksiale σCH-orbitaler ind i den

aksiale σCH*-orbital, der dannes, er den dominerende interaktion og resulterer i stabilisering af den

overgangstilstand, der leder til den ækvatoriale alkohol (Figur 20).

HH3BO

CH

CH

CH

Figur 20. Cieplak-effekt87.

Stabiliserende orbitalinteraktioner, der leder til den ækvatoriale alkohol.

Den ækvatoriale alkohol (31) blev tosyleret og efterfølgende substitueret med et selenid, som det

blev forsøgt med 3-epi-bufalin (5) uden succes (Skema 6, Skema 8). Da de to reaktioner blev

udført med 3-epi-digitoxigenin (31) var omdannelsen succesfuld og gav et moderat udbytte af

3-methylselenyldigitoxigenin (33) på 45 % over to trin (Skema 41).

86 a) Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic Chemistry, Oxford University Press, 2001, 472; b) Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books, 2006, 563-568 87 Cieplak, A. S., J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 4540-4552


— 48 —

Skema 41. Tosylering og efterfølgende substitution med methylselenid af 3-epi-digitoxigenin (31)

Mekanismen for disse to reaktioner er vist og forklaret tidligere (Skema 34, Skema 5). Dette

positive resultat underbygger, at de problemer, der opstod i substitutionen af 3-epi-O-tosylbufalin

(9), hvor samme reaktion blev forsøgt, sandsynligvis skyldtes den 6-leddede lakton, idet størrelsen

af laktonen er den eneste forskel mellem digitoxigenin og bufalin.

Reaktionen gav udover det ønskede produkt ligeledes et biprodukt, som ud fra 1H-NMR og MS,

blev identificeret som 17-epi-3-methylselenyldigitoxigenin (34). Udbyttet af dette biprodukt var dog

blot 15 %. Dette produkt formodes dannet ved deprotonering af H-17, idet denne proton er

forholdsvist sur, hvorefter epimerisering har fundet sted (Skema 42).

O

O

OH

OH

MeSe34

OO

H

H

OEt O

O

OH

H

Skema 42. Formodet mekanisme for dannelsen af 17-epi-3-methylselenyldigitoxigenin (34)

Når reaktionen mellem tosylatet (32) og methylselenid blev fulgt ved TLC-analyse, kunne der

under reaktionsforløbet observeres, at forekomsten af den uønskede diastereomer (34) steg med

tiden. Dette kunne indikere at det epimeriserede biprodukt er det termodynamisk mest stabile,

hvilket umiddelbart kan forklares med at der er færre ufavorable steriske interaktioner, når

laktonen og methylgruppen (C-18) er placeret ”trans” som det er tilfældet i 34.

Der er i litteraturen redegjort for hjerteglycosider og –steroider isoleret fra naturen, som er af

denne type, hvor stereokemien på C-17 er inverteret88.

88 a) Yamauchi, T.; Abe, F.; Santisuk, T., Phytochemistry, 1990, 29, 1961-1965; b) Laphookhieo, S.; Cheenpracha, S.; Karalai, C.; Chantrapromma, S.; Rat-a-pa, Y.; Ponglimanont, C.; Chantrapromma, K., Phytochemistry, 2004, 65, 507-510


— 49 —

2.5 Fysiologisk aktivitet

En række inhiberingsforsøg blev udført for at verificere at den syntetiserede selenmærkede

digitoxigeninanalog (33) formåede at inhibere Na+-K+-ATPasen89. For at analogen kunne

anvendes til krystallografiske eksperimenter, var det essentielt at den udviste inhibitorisk effekt og

affinitet på niveau med de klassiske hjerteglycosider, eksempelvis ouabain (2).

De relative affiniteter for Na+-K+-ATPasen blev estimeret ud fra den resterende aktivitet, som

enzymet udviste, efter præinkubation med de pågældende inhibitorer. Isoleret Na+-K+-ATPase fra

svinenyrer90, blev gennem et forløb på 30 minutter ved 4°C inkuberet med inhibitor ved varierende

koncentration. Eftersom dissociationen mellem inhibitor og enzym er meget lav, vil den resterende

ATPase-aktivitet svare til den mængde enzym, der ikke bindes af den tilsatte mængde inhibitor.

Aktiviteten (”steady-state”) blev estimeret ud fra raten hvormed phosphat blev frigivet gennem

spaltning af ATP ved 37°C under optimerede betingelser (130 mM NaCl, 20 mM KCl, 4 mM

MgCl2, 20 mM His, pH 7.4). Reaktionen blev initieret ved tilsætning af 3 mM ATP. Den specifikke

aktivitet af enzymet uden tilsat inhibitor var omkring 30 μmol hydrolyseret ATP pr. mg protein pr.

min. (100 %).

Den resterede aktivitet angives som en procentdel af den specifikke aktivitet og dette afbildes mod

den inkuberede mængde af inhibitor. Resultaterne for analogen 33 samt for 34 er vist i Figur 21

ligesom de tilsvarende målinger for ouabain (2) også er vist for at kunne sammenligne med de

syntetiserede stoffer.

89 Disse forsøg blev udført under Natalya Fedosova, lektor ved Institut for Fysiologi og Biofysik 90 Det oprensede enzym er stadig membranbundet, og renheden vurderes, ud fra proteinindholdet i mediet, til at være 70-80 %. 90-95 % af ATPase-aktiviteten stammer fra Na+-K+-ATPasen, men kun ouabainfølsom ATPase-aktivitet måles og fortolkes


— 50 —

1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

0

20

40

60

80

100

Res

idua

l Na,

K-A

TPas

e ac

tivity

(%)

Inhibitor (μM)

Figur 21. Inhibering af ATPase-aktivitet målt for Na+-K+-ATPase fra svinenyre.

Regression er foretaget med udgangspunkt i den hyperbolske funktion. ●: ouabain (2) (Ki = 3.1 μM)

□: 3-methylselenyldigitoxigenin (33) (Ki = 1.3 μM) ■: 17-epi-3-methylselenyldigitoxigenin (34) (Ki = 15.3 μM)

Det ses af kurverne og de angivne Ki-værdier91 (Figur 21), at den inhibitoriske effekt af

3-methylselenyldigitoxigenin (33) (Ki = 1.3 μM) overfor Na+-K+-ATPasen, er sammenlignelig med

ouabains inhibitoriske effekt (Ki = 3.1 μM) og sågar en smule højere. Dette resultat bekræfter, at

vores selenmærkede analog 33 har høj nok affinitet overfor Na+-K+-ATPasen, til at den vil kunne

anvendes som markør i fremtidige krystallografiske eksperimenter.

Idet 17-epi-3-methylselenyldigitoxigenin (34) har inverteret stereokemi på C-17, var forventningen

om at observere en inhibitorisk effekt af dette stof overfor Na+-K+-ATPasen ikke ret stor. Ikke

desto mindre viste de udførte aktivitetsforsøg, at også denne selenmærkede analog var i stand til i

nogen grad at inhibere ATPase-aktiviteten (Ki = 15.3 μM), dog med lavere affinitet som forventet.

Det interessante ved dette stof, er at ATPase-aktiviteten ikke inhiberes fuldstændigt. Aktiviteten af

enzymet mindskes, men der kan stadig observeres ~30 % aktivitet, hvilket afviger fra den normale

observation, at der ved maksimal inhibering er 0 % aktivitet. Det lader altså til at denne

91 Ki er dissociationskonstanten for dissociationen af komplekset mellem enzym og inhibitor. Den kaldes også ”apparent inhibition constant”, idet den i høj grad også beskriver hæmningen af enzymet.


— 51 —

17-epi-analog (34) kun hæmmer enzymet delvist. Dette er en interessant egenskab, idet

inhibering af denne art muligvis vil kunne give de samme positive virkninger som de traditionelle

hjerteglycosider uden at udvise toksiske effekter.


— 52 —

3. Konklusion Målet med projektet var at fremstille en hjerteglycosidanalog indeholdende et ”tungt atom”, for at

kunne anvende analogen som ligand i proteinkrystallografi. Forskellige metoder blev afprøvet til at

danne en brom- eller selenholdig analog af de tre naturligt forekommende stoffer bufalin, ouabain

og digitoxin.

Hvad angår arbejdet med bufalin, blev der dannet en meget lille mængde bromeret bufalin, men af

flere grunde blev denne analog ikke afprøvet i krystallografiske eksperimenter. Den strategi, der

blev afprøvet til at introducere selen i bufalin, viste sig at være vanskelig, hvilket antageligvis

skyldtes for høj reaktivitet af den 6-leddede lakton.

Forsøg på at danne selenoouabain var ligeledes problematisk. Med hensyn til kulhydratdelen,

blev der udført adskillige forsøg på at fremstille et p-methylbenzoyl selenoglycosid, men denne

fremgangsmåde var ikke vejen frem. Det lykkedes derimod at fremstille en anomer blanding af to

rhamnosylselenocyanater, der kunne anvendes i substitution, hvilket resulterede i dannelsen af to

diastereomere benzyl selenorhamnosider. Hvad angår steroiddelen var det hurtigt tydeligt, at

syntesearbejdet med ouabagenin bød på store problemer, hvilket bl.a. skyldtes tilstedeværelsen

af flere frie hydroxylgrupper, idet det var vanskeligt at opnå selektivitet.

Det var anvendelsen af digitoxin med en 5-leddet lakton og med et begrænset antal

hydroxylgrupper, der førte til en succesfuld syntese. Med ganske få trin var det muligt at fremstille

en digitoxigeninanalog indeholdende selen i et fint udbytte.

Analogen er blevet testet i inhiberingsforsøg og udviser høj affinitet overfor Na+-K+-ATPasen som

ønsket. Det er vores store forhåbning at et kompleks mellem denne analog og Na+-K+-ATPasen

kan forme krystaller og at disse i den nærmeste fremtid vil kunne anvendes til krystallografiske

eksperimenter.

I arbejdet med digitoxin blev en selenoanalog med inverteret stereokemi på C-17 isoleret, idet den

blev dannet som biprodukt. Da denne analog blev testet i inhiberingsforsøg, udviste den partiel

inhibering af Na+-K+-ATPasen. Denne egenskab kunne være interessant at udforske i højere grad.


— 53 —

DEL B: Anvendelse af thioglycosiddonorer til direkte glycosylering af GlcNAc

4. Introduktion

4.1 Kulhydrater og deres syntese

Kulhydrater er en ekstremt vigtig kategori af stoffer ud fra et biokemisk perspektiv. Først og

fremmest eksisterer kulhydrater i form af polymerer som cellulose, stivelse og glycogen, der alle er

opbygget af monosaccharidet glucose. Derudover findes kulhydrater i glycolipider og –proteiner

ligesom de er involveret i adskillige fysiologiske processer, eksempelvis cellulær genkendelse,

blodkoagulation og immunologisk beskyttelse92,93,94. Denne brede vifte af kulhydraters vitale

egenskaber, betyder at glycosylering er en væsentlig og interessant disciplin indenfor organisk

syntesekemi.

I de følgende afsnit, vil en række betragtninger og begreber vedrørende glycosylering blive

gennemgået og forklaret inden den egentlige projektidé bliver præsenteret. Bl.a. vil forskellige

donorer blive omtalt og koncepter som anomer-effekten og ”armed”-”disarmed”-strategien vil blive

beskrevet.

4.1.1 Kemisk glycosylering

I glycosyleringsreaktioner dannes en kovalent binding mellem en glycosyldonor og en

glycosylacceptor. Donoren udgøres af et fuldt beskyttet kulhydrat med en potentiel udtrædende

gruppe (X) på det anomere carbon. Ved aktivering med en promotor (P), udtræder X, og den

dannede kation kan stabiliseres gennem resonans fra det endocykliske ilt, hvorved en

oxocarbeniumion dannes. Dette aktive intermediat kan reagere med acceptoren, som kan være et

kulhydrat med en fri hydroxyl eller en anden alkohol, og herved bliver et glycosid fremstillet. Den

dannede glycosidiske binding kan være aksial (α-glycosid) eller ækvatorial (β-glycosid).

92 Boons, G.-J.; Hale, K. J.; Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press, 1.edition, 2000, 1-2 93 Garegg, P. J., Adv. Carbohyd. Chem. Bi., 1997, 52, 179-205 94 Dwek, R. A., Chem. Rev., 1996, 96, 683-720


— 54 —

ORO

X P

ORO

X

Promotor (P)

ORO

ORODonor

ORO

R'OH

Acceptor

-glycosid

-glycosid

ORO

OR'

OR'

Skema 43. Generel glycosyleringsreaktion

For at kunne betegne en glycosyleringsreaktion som succesfuld er det væsentligt at der i

reaktionen er høj kemoselektivitet, høj stereoselektivitet og at udbyttet er tilfredsstillende.

4.1.2 Glycosyldonorer

En lang række glycosyldonorer har fundet anvendelse i kemisk glycosylering. De mest benyttede

typer af donorer omfatter følgende93 (Figur 22): O

ROX

X = Cl, Br, F

ORO

O

NH

CCl3

ORO

O

Glycosylhalid Trichloracetimidat 4-Pentenylglycosid

ORO

SR'

R' = Alkyl, aryl

Thioglycosid Figur 22. Mest anvendte glycosyldonorer

Glycosylhalider (bromider/chlorider), der blev introduceret af W. Koenigs og E. Knorr i 190195, og

som traditionelt aktiveres med et halofilt metal som sølv eller kviksølv. Alternativt kan de aktiveres

med en Lewis syre som tintetrachlorid (SnCl4) eller med et alkylammoniumhalid, hvilket kaldes

halidkatalyseret glycosylering eller in situ-anomerisering64. Glycosylfluorider kan også anvendes

som donorer og kræver aktivering med et fluorofilt reagens, eksempelvis siliciumtetrafluorid (SiF4)

93,96,97.

Trichloracetimidater, der blev indført som glycosyldonorer i 198098, og som ganske enkelt

aktiveres med en Lewis syre. Mest anvendt er bortrifluorid diethyletherat (BF3 ▪ Et2O) og

trimethylsilyltriflat (TMSOTf)93,99.

4-Pentenylglycosider, der blev anvendt som donorer første gang i 1988 af B. Fraser-Reid og

kolleger100. Denne type donorer skal aktiveres med en haloniumion, i form af eksempelvis

95 Koenigs, W.; Knorr, E., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1901, 34, 957-981 96 Boons, G.-J.; Hale, K. J.; Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press, 1.edition, 2000, 105-107 97 Toshima, K.; Tatsuta, K., Chem. Rev., 1993, 93, 1503-1531 98 Schmidt, R. R.; Michel, J., Angew. Chem. Int. Edit., 1980, 19, 731-732 99 Boons, G.-J.; Hale, K. J.; Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press, 1.edition, 2000, 107-108


— 55 —

iodoniumdicollidinperchlorat (IDCP) (Figur 23) eller N-iodosuccinimid og trifluormethansulfonsyre

(NIS-TfOH)97,101.

Figur 23. Struktur af iodoniumdicollidinperchlorat (IDCP)

Under studierne af dette donorsystem blev en kemoselektiv glycosyleringsstrategi udviklet, som

udnytter at reaktiviteten af en donor kan justeres gennem valg af beskyttelsesgrupper

(”armed”-”disarmed”)102.

Endelig er der thioglycosider, som vil blive omtalt i et afsnit for sig.

4.2 Anomer-effekten

I cykliske systemer, er der ofte mulighed for flere forskellige konformerer, hvoraf nogle er mere

stabile and andre. Det er en generel observation at substituenter på cyklohexan i

stolkonformation, foretrækker en ækvatorial position frem for en aksial. Dette forklares primært

med de destabiliserende steriske vekselvirkninger, der opstår mellem en aksial substituent og de

andre aksiale bindinger i molekylet og som kaldes 1,3-diaksiale interaktioner103.

Et centralt fænomen i kulhydratkemien er blevet beskrevet af J. T. Edward104 og er af R. U.

Lemieux og N. J. Chü blevet kaldt anomer-effekten105. Dette er en stereoelektronisk effekt, som

har indflydelse på orienteringen af substituenten på det anomere center, og dermed på

konfigurationen af selve kulhydratet106. I modsætning til den trend, der ses for substituenter på

cyklohexan, vil en elektronegativ substituent på det anomere kulstof i pyranoser ofte foretrække

en aksial position (Skema 44)107.

100 Fraser-Reid. B.; Konradsson, P.; Mootoo, D. R.; Udodong, U., Chem. Commun., 1988, 823-825 101 Boons, G.-J.; Hale, K. J.; Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press, 1.edition, 2000, 135-139 102 Mootoo, D. R.; Konradsson, P.; Ududong, U.; Fraser-Reid, B., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 5583-584 103 Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books, 2006, 102-107 104 Edward, J. T., Chem. Ind. – London, 1955, 1102-1104 105 Lemieux, R. U.; Chü, N. J., Chemical Abstracts, Am. Chem. Soc. Meeting, 1955, 1102-1104 106 Anomer-effekten gælder generelt for systemer af typen R-X-A-Y, hvor R er C eller H, X er et atom med et eller flere lone-pair, A er et atom med middelhøj elektronegativitet og Y er et atom, der er mere elektronegativt end A. 107 a) Juaristi, E.; Cuevas, G., Tetrahedron, 1992, 48, 5019-5087; b) Boons, G.-J.; Hale, K. J.; Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press, 1.edition, 2000, 10-14


— 56 —

OAcOAcO

AcO

OAc

OAcOAcO

AcO

OAcOAcO

AcOOAc

OAcOAcO OAc

AcO AcO

G = 0.94 kcal/mol G = 1.48 kcal/mol Skema 44. Favorisering af α-anomeren i ligevægte for peracetyleret xylose og lyxose107

Der er flere forklaringer på årsagen til anomer-effekten, hvoraf de mest anerkendte er baseret på

hhv. dipol-dipol interaktioner og orbitalinteraktioner. I den første af disse modeller, bygger teorien

på at det dipolmoment, der genereres af uparrede elektroner på det endocykliske ilt, interagerer

med dipolmomentet, der dannes af den polære C-X binding. Denne interaktion er ufavorabel i den

ækvatoriale anomer, idet de to dipolmomenter her er næsten parallelle (Figur 24).

Figur 24. Anomer-effekten illustreret ved dipol-dipol interaktioner107

Denne model forklarer hvorledes præferencen for aksial konfiguration falder i solventer med en

høj dielektrisk konstant. Disse mere polære solventer stabiliserer i højere grad de repulsive

dipol-dipol interaktioner i den ækvatoriale anomer, og jo mere polært solventet er, jo mindre

favoriseret bliver den aksiale anomer107.

I den anden model betragtes interaktionerne mellem en lonepair-orbital (n) fra det endocykliske ilt

og den antibindende orbital i C-X-bindingen (σ*). Med aksial konfiguration er de to orbitaler

antiperiplanare, hvilket muliggør en stabiliserende elektrondelokalisering. Dette er ikke muligt med

en ækvatorial anomer substituent, hvor orbitalerne ikke har den rette indbyrdes orientering (Figur

25).

Figur 25. Anomer-effekten illustreret ved orbitalinteraktioner107

Denne hyperkonjugation kan forklare en række observationer for den aksiale anomer:

C-X-bindingen er længere end normalt, C-O-bindingen har en højere grad af

dobbeltbindingskarakter og er derfor kortere end normalt og O-C-X-bindingsvinklen er for aksiale

glycosylhalider større end den normale tetrahedrale værdi, grundet større sp2-karakter af det

anomere kulstof107.


— 57 —

Anomer-effekten betyder at α-anomeren i langt de fleste tilfælde er det termodynamisk mest

stabile produkt og dermed er mindre reaktiv i forhold til den tilsvarende β-anomer. Det er dog ikke

altid muligt at opnå α-anomeren, idet en deltagende gruppe på C-2 vil resultere i en glycosidisk

binding af typen 1,2-trans. Den anomere substituent, vil således blive ækvatorial når der ydes

anchimerisk assistance fra en ækvatorial substituent på C-2.

4.3 Thioglycosider

Thioglycosider har vundet stor anvendelse som glycosyldonorer, idet de udviser en generel høj

stabilitet og er meget inerte overfor mange kemiske manipulationer, herunder de betingelser der

anvendes ved beskyttelsegruppemanipulation. Grundet den høje stabilitet, kan thioglycosider

også anvendes som acceptorer i syntese af oligosaccharider. Ydermere kan thioglycosider

omdannes til en række andre glycosyldonorer (Skema 45), hvilket gør alkyl og aryl

thiofunktionaliteten til en god anomer beskyttelsesgruppe108,109.

Skema 45. Omdannelse af thioglycosider til andre donorer108,109

4.3.1 Fremstilling

Der er flere strategier til fremstilling af thioglycosider fra forskellige udgangsstoffer93, hvoraf de to

mest anvendte omtales her. I den klassiske metode fra 1909 udviklet af E. Fischer og K. Delbrück,

anvendes et acetyleret glycosylhalid og et thiolat, dannet fra en thiol ved tilstedeværelse af

base110 (Skema 46). Denne substitutionsreaktion er stadig ganske udbredt til fremstilling af

thioglycosider. Det kan dog ved anvendelse af alkylthiolater, være nødvendigt at reacetylere

hydroxylgrupperne, idet der kan ske afbeskyttelse af acetylerne under disse forhold.

108 Levy, D. E.; Fügedi, P., The Organic Chemistry of Sugars, CRC Press, 1. edition, 2005, 102-110 109 Boons, G.-J.; Hale, K. J.; Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press, 1.edition, 2000, 109-110 110 Fischer, E.; Delbrück, K., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1909, 42, 1476-1482


— 58 —

Skema 46. Traditionel fremstilling af thioglycosid fra glycosylhalid

I en anden meget anvendt metode, anvendes et peracetyleret glycosid, der aktiveres med en

Lewis syre, og som herefter reagerer med en thiol (Skema 47). R. U. Lemieux viste dette i 1951

med brugen af zinkchlorid (ZnCl2)111, men i dag anvendes ofte andre Lewis syrer, som bortrifluorid

diethyletherat (BF3 ▪ Et2O)93.

Skema 47. Fremstilling af thioglycosid fra anomert acetat

4.3.2 Aktivering

Der er adskillige måder at aktivere thioglycosider på, hvilket ligeledes er en egenskab, som gør

dem gunstige at anvende som donorer. De mest anvendte metoder til aktivering af thioglycosider

er med tunge thiofile metaller, ved alkylering af svovl, med bløde svovl- eller selenoelektrofiler

eller med haloniumioner108. Dannelsen af glycosidet foregår ved samme mekanisme uanset

aktiveringssystem (Skema 48).

Skema 48. Generel aktivering af thioglycosider. (E = elektrofil)

Allerede i 1956 blev det observeret, at methanolyse af et ethyl β-thioglycosid af GlcNAc under

tilstedeværelse af kviksølvchlorid (HgCl2) gav det tilsvarende methyl β-glycosid112. R. J. Ferrier et

al. var dog i 1973 de første, der rapporterede reel brug af thioglycosider som glycosyldonorer. De

viste anvendelsen af kviksølv(II)salte (Hg(OAc)2, HgCl2, HgSO4) som aktivatorer til glycosylering

med phenyl 1-thio-D-glucopyranosider113. Denne aktiveringsmetode har ligeledes været anvendt i

111 Lemieux, R. U.; Can. J. Chemistry, 1951, 29, 1079-1091 112 Hough, L.; Taha, M. I., J. Chem. Soc., 1956, 2042-2048 113 Ferrier, R. J.; Hay, R. W.; Vethaviyasar, N, Carbohyd. Res., 1973, 27, 55-61


— 59 —

totalsyntese af mere komplicerede glycosider, eksempelvis i totalsyntesen af digitoxin114, hvor

kviksølvchlorid anvendes som aktivator. Andre thiofile metaller som kobber, sølv og bly har også

vist sig at være effektive aktivatorer108.

Hvad angår alkylering af det anomere svovl, er methyltriflat (MeOTf) det klassiske reagens at

anvende. Denne form for aktivering blev introduceret af H. Lönn til syntese af oligosaccharider115.

Når det anomere svovl methyleres, dannes en god udtrædende gruppe, hvorved glycosylering

kan finde sted (Skema 48, E = Me). Methyltriflat er dog for det første meget giftigt og for det andet

så reaktivt, at der kan ske uønsket O-methylering i donor og/eller acceptor93. Det mindre reaktive

reagens methyliodid (MeI) kan alternativt anvendes116.

Af svovl- og selenoelektrofiler, er især DMTST117 (Figur 26) og phenylselenyltriflat (PhSeOTf)118

meget anvendt. Denne type af reagenser har den egenskab at de indeholder et blødt elektrofilt

center i form af svovl eller selen, som dermed kan aktivere det nukleofile svovl på det anomere

center (Skema 48, E = SePh, SMe).

Figur 26. Struktur af dimethyl(methylthio)sulfoniumtriflat (DMTST)

Brugen af haloniumioner som elektrofil aktivator har fundet bred anvendelse (Skema 48, E = X+).

N-bromosuccinimid (NBS) blev introduceret som aktivator af S. Hanessian et al.119 og metoden

blev nogle år senere videreudviklet til mere generel brug120. NBS er senere blevet brugt sammen

med en lang række additiver, heriblandt forskellige Lewis syrer108. Den første iodoniumkilde, der

blev benyttet til aktivering af thioglycosider var IDCP121. Brugen af N-iodosuccinimid i

tilstedeværelse af en katalytisk mængde trifluormethansulfonsyre (TfOH) blev introduceret samme

år122 og dette er et meget effektivt aktiveringssystem. Som alternativ til TfOH kan mange andre

forskellige Lewis syrer anvendes108, blandt andet er brugen af NIS og lanthanidtriflater (Ln(OTf)3)

til aktivering af thioglycosider blevet rapporteret123.

114 Tsai, T. Y. R.; Jin, H.; Wiesner, K., Can. J. Chemistry, 1984, 62, 1403-1405 115 a) Lönn, H., Carbohyd. Res., 1985, 139, 105-113; b) Lönn, H., Carbohyd. Res., 1985, 139, 115-121 116 Reddy, G. V.; Kulkarni, V. R.; Mereyala, H. B., Tetrahedron Lett., 1989, 30, 4283-4386 117 a) Fügedi, P.; Garegg, P. J., Carbohyd. Res., 1986, 149, C9-C12; b) Andersson, F.; Fügedi, P.; Garegg, P. J.; Nashed, M., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 3919-3922 118 Ito, Y.; Ogawa, T.; Tetrahedron Lett., 1988, 29, 1061-1064 119 Hanessian, S.; Bacquet, C.; Lehong, N., Carbohyd. Res., 1980, 80, C17-C22 120 Nicolaou, K. C.; Seitz, S. P.; Papahatjis, D. P., J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 2430-2434 121 Veeneman, G. H.; van Boom, J. H., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 275-278 122 a) Veeneman, G. H.; van Leeuwen, S. H.; van Boom, J. H., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 1331-1334; b) Konradsson, P.; Udodong, U. E.; Fraser-Reid, B., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 4313-4316 123 Chung, S.-K.; Park, K.-H., Tetrahedron Lett., 2001, 42, 4005-4007


— 60 —

4.4 ”Armed” vs. ”disarmed”

Et meget vigtigt koncept indenfor glycosyleringskemi blev udviklet af B. Fraser-Reid og kolleger,

og bygger på hvordan valget af glycosyldonorens beskyttelsesgrupper kan være afgørende for

donorens reaktivitet102. Ved glycosylering dannes en positiv ladning når den anomere gruppe

udtræder (Skema 43) og jo mere stabiliseret den dannede kation er, jo højere reaktivitet udviser

donoren. Idet ether-beskyttelsesgrupper er mindre elektrontiltrækkende end

ester-beskyttelsesgrupper, vil kationen være mere stabiliseret når hydroxylgrupperne er beskyttet

med ethere end når de er beskyttet med estre. Donorer klassificeres derfor som ”armed” og

”disarmed” afhængig af om de er beskyttet med hhv. ethere eller estre.

Ved at ”arme” eller ”disarme” donoren, er det dermed muligt at udføre kemoselektiv glycosylering.

Dette er på elegant vis vist med 4-pentenylglycosider, hvor en perbenzyleret donor (”armed”)

aktiveres med IDCP og kobles til en acceptor i form af et delvist acetylbeskyttet 4-pentenylglycosid

(”disarmed”) (Skema 49). Der observeres i reaktionen ingen spor af produktet fra kobling mellem

to ”disarmed” glycosider, hvilket bekræfter at den perbenzylerede donor er væsentligt mere reaktiv

end den acetylerede.

Skema 49. Kemoselektiv glycosylering med 4-pentenylglycosider102

Denne metode er også blevet anvendt med ethyl thioglycosider og med IDCP som aktivator, hvor

en perbenzyleret donor udviste højere reaktivitet end en delvist benzoyleret donor med samme

anomere gruppe121 (Skema 50). Klassificeringen af donorer som ”armed” og ”disarmed” gælder

altså ligeledes for thioglycosider.

O

BnOBnO

BnO

OBnOHO

BzOBzO

OBz

+IDCP

"Armed" "Disarmed"

SEt SEt

O

BnOBnO

BnO

OBn

OOBzO

BzO

OBz

SEt

91 % Skema 50. Kemoselektiv glycosylering med thioglycosider121


— 61 —

4.5 GlcNAc i et biologisk perspektiv

N-acetylglucosamin (GlcNAc) (35) (Figur 27) er en naturligt forekommende 2-acetamido-2-deoxy

sukker, som optræder i adskillige biologisk relevante forbindelser og syntesen af O-glycosider af

GlcNAc er derfor en yndet og udfordrende disciplin i kulhydratkemien. Derudover er det

konstateret at GlcNAc er den hyppigst forekommende monosaccharidenhed i pattedyr124

Figur 27. GlcNAc

GlcNAc indgår i en række vigtige glycokonjugater, eksempelvis i peptidoglycanlag i bakteriers

cellevægge, i bakterielle antigener, hvor de findes i epitoperne, ligesom de optræder i de

antigener, der definerer de humane blodtyper. Ydermere findes de i glycosaminoglycaner, som

bl.a. udgør vigtige komponenter i bindevæv125 og i noduleringsfaktorer produceret af

rhizobiumbakterier94,126,127. Som en del af den posttranslatoriske modifikation af peptider og

proteiner, kobles GlcNAc specifikt til adskillige aminosyrerester i form af Ser, Thr (O-glycosylering)

eller Asn (N-glycosylering). Alle N-glycosylerede oligosaccharider indeholder en bestemt kerne i

form et pentasaccharid, og to af monosacchariderne i dette kulhydratskelet er GlcNAc128 (Figur 28).

Figur 28. Pentasaccharid koblet til Asn ved N-glycosylering

Endelig findes GlcNAc i chitin, som er en polymer udelukkende opbygget af GlcNAc-enheder

koblet til hinanden via β-1,4-bindinger. Chitin er en strukturel komponent og findes bl.a. i

exoskelettet på en række skaldyr og insekter.

124 Werz, D. B.; Ranzinger, R.; Herget, S.; Adibekian, A.; von der Lieth, C.-W.; Seeberger, P. H., ACS Chem. Biol., 2007, 2, 685-691a 125 Glucosamin har vist sig at være et effektivt middel mod slidgigt, idet et tilskud af glucosamin øger dannelsen af netop glycosaminoglycaner, hvilket styrker ledbrusken. (http://www.netdoktor.dk/fokus/glucosamin_slidgigt.htm) 126 Banoub, J.; Boullanger, P.; Lafont, D., Chem. Rev., 1992, 92, 1167-1195 127 Bongat, A. F. G.; Demchenko, A. V., Carbohyd. Res., 2007, 342, 374-406 128 Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L., Biochemistry, W. H. Freeman and Company, 5. edition, 2002, 306-307


— 62 —

4.6 GlcNAc som glycosyldonor

Der er flere metoder til dannelsen af glycosider af GlcNAc. Den mest ønskværdige strategi, er at

anvende en donor, der allerede er N-acetyleret, men dette har gennem tiden voldet problemer.

Den mere traditionelle strategi er at beskytte eller camouflere kvælstof på anden vis126,127.

4.6.1 Traditionel strategi

Som nævnt anvendes der i den traditionelle strategi en glycosyldonor, hvor kvælstof i glucosamin

er beskyttet med en anden gruppe end acetyl. Ligesom for andre glycosyleringer ønskes en

deltagende gruppe på C-2 for at opnå et 1,2-trans glycosid (β), mens det er nødvendigt at

installere en ikke-deltagende gruppe for danne et 1,2-cis glycosid (α). Der findes talrige

deltagende beskyttelsesgrupper til kvælstof, som benyttes i glycosyleringer, eksempelvis

N-phtalimido (N-Phth), som er den mest anvendte, forskellige carbamater (bl.a. N-Troc og N-Cbz)

samt flere halogenerede beskyttelsesgrupper (bl.a. N-TCP, mono-, di- og trichloroacetamido). Af

ikke-deltagende substituenter, er azidfunktionaliteten (N3) den eneste, der i højere grad har fundet

anvendelse127.

Den åbenlyse ulempe ved metoder af denne art, hvad enten subsituenten er deltagende eller ej,

er at flere trin er påkrævet i syntesen for at introducere og fjerne den pågældende

beskyttelsesgruppe på kvælstof og til sidst indføre den ønskede N-acetylfunktionalitet, hvilket ofte

vil sænke det totale udbytte.

4.6.2 Oxazolinstrategi

Den mere direkte metode til glycosider af GlcNAc, er at anvende en donor hvor kvælstof er

acetyleret, idet glycosyleringsproduktet da vil indeholde den ønskede acetamidofunktionalitet.

Denne strategi kaldes undertiden også oxazolinmetoden126, idet der dannes en oxazolin når den

anomere gruppe udtræder. Oxazolinen kan potentielt anvendes som donor med de rette

aktiveringsbetingelser, hvilket giver et β-glycosid grundet anchimerisk assistance (Skema 51).

Skema 51. Glycosylering med GlcNAc under dannelse af oxazolinintermediat


— 63 —

Denne fremgangsmåde har været anvendt flere gange til at fremstille glycosider af GlcNAc. I den

oprindelige metode, blev oxazolinen dannet fra det tilsvarende glycosylchlorid og herefter isoleret

og aktiveret med PTSA, hvilket resulterede i koblinger med en række kulhydratbaserede

acceptorer129. Andre Lewis syrer har senere vist sig at være egnede til aktivering af

oxazolindonorer, såsom jern(III)chlorid (FeCl3)130 og trimethylsilyltriflat (TMSOTf)131 og inden for de

seneste år har også kobber(II)salte132 (særligt kobber(II)chlorid), ytterbium(III)triflat133 og PTSA

samt CSA134 været benyttet. De to sidstnævnte organiske syrer blev i denne forbindelse anvendt

til aktivering af en furanosyloxazolin.

M. Kiso og L. Anderson viste for tredive år siden, hvorledes peracetyleret GlcNAc kan anvendes

som donor, ved aktivering med jern(III)chlorid til direkte dannelse af β-glycosider, hvor oxazolinen

formodes at optræde som det reaktive intermediat130. Dette er en stor fordel, idet oxazoliner er

ustabile og derfor ofte er vanskelig både at isolere og opbevare.

4.6.3 Tidligere resultater

Sidste år kunne vores gruppe præsentere en veludviklet metode til direkte glycosylering af

GlcNAc. Peracetyleret GlcNAc blev anvendt som donor og en række metaltriflater blev anvendt i

katalytisk mængde til aktivering af både det anomere acetat og oxazolinintermediatet, hvilket gav

gode udbytter med benzylalkohol som acceptor135 (Skema 52).

Skema 52. Direkte glycosylering af peracetyleret GlcNAc

med benzylalkohol som acceptor og aktivering med metaltriflater

Mere komplicerede acceptorer blev ligeledes afprøvet i dette glycosyleringssystem. Sc(OTf)3 blev

anvendt som katalysator i disse glycosyleringer, hvilket bl.a. resulterede i kobling mellem GlcNAc

og en aminosyrebaseret acceptor og ligeledes mellem GlcNAc og flere kulhydratbaserede

acceptorer135 (Skema 53, Tabel 2).

129 Zurabyan, S. E.; Volosyuk, T. P.; Khorlin, A. J., Carbohyd. Res., 1969, 9, 215-220 130 a) Kiso, M.; Anderson, L., Carbohyd. Res., 1979, 72, C12-C14; b) Kiso, M.; Anderson, L., Carbohyd. Res., 1979, 72, C15-C17 131 Ogawa, T.; Beppu, K.; Nakabayashi, S., Carbohyd. Res.,1981, 93, C6-C9 132 Wittmann, V.; Lennartz, D., Eur. J. Org. Chem., 2002, 1363-1367 133 Crasto, C. F.; Jones, G. B., Tetrahedron Lett., 2004, 45, 4891-4894 134 Cai, Y.; Ling, C.-C.; Bundle, D. R., Org. Lett., 2005, 7, 4021-4024 135 Christensen, H.; Christiansen, M. S.; Petersen, J.; Jensen, H. H., Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3276-3283


— 64 —

Skema 53. Direkte glycosylering af peracetyleret GlcNAc med forskellige acceptorer og aktivering med Sc(OTf)3

Tabel 2. Tidligere opnåede resultater for glycosyleringer med peracetyleret GlcNAc. (Udvalgte resultater). Reaktionerne blev udført med dichlormethan som solvent, ved reflux og med Sc(OTf)3 som katalysator.

4.7 Projektidé

Idéen til projektet kommer primært fra de tidligere opnåede resultater i gruppen, hvor direkte

glycosylering af GlcNAc er blevet udført med aktivering fra en række metaltriflater under dannelse

af β-glycosider.

På baggrund af disse fremragende resultater, og ud fra den stigende popularitet thioglycosider har

fået som donorer i løbet af de seneste årtier, skal thioglycosider af GlcNAc i dette projekt afprøves

som donorer til direkte glycosylering. I projektet skal der fremstilles to phenyl thioglycosiddonorer

af GlcNAc med forskellige beskyttelsesgrupper, hhv. acetyler og benzyler, således at både et

”disarmed” og et ”armed” thioglycosid kan blive udforsket som donor (Figur 29).

Nr. Donor Acceptor Produkt D/Aa Tid Udbytteb

1

1:1.5 72 h 50 %

2

2:1 24 h 78 %

3 OAcOAcO

AcHN

OAc

OAc

OAcOAcO

AcHN

OAc

OBnOBnO

BnOOMe

O4:1 72 h 85 %

a Donor/acceptor-forhold. b Isoleret udbytte


— 65 —

Figur 29. Thioglycosiddonorer af GlcNAc, der vil blive fremstillet og anvendt i projektet

Disse donorer skal anvendes i en række glycosyleringer med aktivering fra N-iodosuccinimid og et

metaltriflat. Forskellige parametre kan varieres, såsom typen af metal, donor/acceptor-forhold og

temperatur, for at optimere reaktionsbetingelserne. Donorerne skal anvendes i direkte

glycosylering, hvor der dannes et oxazolinintermediat, som kan aktiveres af metaltriflaterne.

Herved undgås overflødige trin, hvor kvælstof beskyttes og afbeskyttes, hvilket er yderst gunstigt i

syntese af større molekyler såsom oligosaccharider og dermed er en af fordelene ved at anvende

denne metode.

I de seneste år har der været eksempler på succesfuld glycosylering med thioglycosider af

GlcNAc, men de publicerede resultater indeholder udelukkende koblinger med primære

acceptorer136. Brugen af disse donorer i glycosyleringer, er altså et forholdsvist uudforsket område

og tilsyneladende har ingen afprøvet kombinationen af NIS og en Lewis syre som

aktiveringssystem. Tilmed foreligger der umiddelbart ingen resultater, hvor et benzyleret

thioglycosid af GlcNAc er blevet anvendt som glycosyldonor.

Formålet med projektet er at udforske disse thioglycosiders evne som donorer med aktivering fra

NIS og et metaltriflat. De optimale reaktionsbetingelser for glycosylering skal bestemmes og målet

er at opnå resultater, som er på niveau med de resultater, der i gruppen er opnået med andre

donorer af GlcNAc.

136 a) Deng, S.; Gangadharmath, U.; Chang, C.-W. T., J. Org. Chem., 2006, 71, 5179-5185; b) Bongat, A. F. G.; Kamat, M. N.; Demchenko, A. V., J. Org. Chem., 2007, 72, 1480-1483; c) Crich, D.; Cai, F.; Yang, F., Carbohyd. Res., 2008, 343, 1858-1862


— 66 —

5. Resultater og diskussion

5.1 Syntesen af donorer

For at udforske anvendelsen af GlcNAc-thioglycosider som donorer, skulle to thioglycosider

fremstilles. Begge donorer var simple phenyl thioglycosider, hvor den ene var beskyttet med

acetylgrupper og den anden med benzylgrupper, således at de to fremstillede donorer var

henholdsvist ”disarmed” og ”armed”.

5.1.1 Syntese af ”disarmed” donor

Det peracetylerede phenyl thioglycosid (37) blev fremstillet fra GlcNAc (35). GlcNAc blev

behandlet med acetylchlorid, hvorved det peracetylerede α-glycosylchlorid (36) dannes i et pænt

udbytte på 74 %137. Når dette blev reageret med thiophenol og triethylamin i acetonitril138,

fremkom det ønskede produkt i 80 %, hvilket var glimrende (Skema 54).

Skema 54. Syntese af peracetyleret thioglycosid (37) fra GlcNAc (35)

Mekanismen for første trin er en nukleofil acylsubstitution mellem et syrechlorid og en alkohol,

hvorved estergrupperne dannes139. Det anomere acetat udtræder ved protonering under dannelse

af en oxoniumion. Denne angribes af chlorid og pga. anomer-effekten, som er høj for chlor, bliver

det endelige produkt et α-glycosylchlorid, idet eventuelt dannet β-glycosylchlorid er i ligevægt med

α-anomeren57 (Skema 55).

137 Horton, D., Org. Synth., 1966, 46, 1-4 138 Guilbert, B.; Davis, N. J. Pearce, M.; Aplin, R. T.; Flitsch, S. L., Tetrahedron – Asymmetr., 1994, 5, 2163-2178 139 Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic Chemistry, Oxford University Press, 2001, 280-281


— 67 —

Skema 55. Mekanisme for reaktion mellem GlcNAc (35) og acetylchlorid57,139

Dannelsen af thioglycosidet sker ved nukleofilt angreb fra det dannede thiolat140. Thiolatet er en

god nukleofil og reaktionen vil primært forløbe som en SN2-reaktion, hvorved man får en høj grad

af inversion på det anomere carbon (Skema 56). Phenylthiolat er dog ikke en stærk nok nukleofil

til at reagere med acetylerne, så disse beskyttelsesgrupper påvirkes ikke af reaktionen.

Skema 56. Formodet mekanisme for dannelsen af

acetylbeskyttet thioglycosid (37) fra glycosylchlorid (36)

5.1.2 Syntese af ”armed” donor

Til fremstilling af det tri-O-benzylerede phenyl thioglycosid (39) blev det netop syntetiserede

peracetylerede thioglycosid (37) anvendt som udgangsstof. Simpel deacetylering under

Zemplen-betingelser68 efterfulgt af benzylering under standardbetingelser med natriumhydrid og

benzylbromid, gav den ønskede donor i et godt udbytte på 80 % over to trin (Skema 57).

Skema 57. Syntese af benzyleret thioglycosid (39) fra peracetyleret thioglycosid (37)

140 Da thiophenol er en stærkere syre (pKa ≈ 7) end triethylammoniumionen (pKa = 10.75), vil thiolen eksistere i sin deprotonerede form. (pKa-værdier fundet i Evans pKa-tabel: http://www2.lsdiv.harvard.edu/labs/evans/pdf/evans_pKa_table.pdf)


— 68 —

Mekanismen for afbeskyttelse med katalytisk natriummethoxid er vist tidligere (Skema 24).

Acetylgruppen på kvælstof påvirkes ikke af disse betingelser, da dette er et amid, hvori kulstoffet i

carbonylen er mindre elektrofilt end i en ester. Benzylering af alkoholerne sker ved nukleofilt

angreb af det benzyliske kulstof. Natriumhydrid er en ekstremt stærk base141, der er i stand til at

deprotonere en række organiske stoffer, bl.a. alkoholer på trods af deres forholdsvist lave

syrestyrke142. Herved dannes en god nukleofil, der deltager i en SN2-reaktion med benzylbromid

(Skema 58).

O

AcHNHO

HO

O

38

SPh

HNa H

H2

O

AcHNHO

HO

O

SPh

NaPh Br

O

AcHNBnO

BnO

OBn

SPh

Br Na 39 Skema 58. Mekanisme for benzylering med natriumhydrid og benzylbromid

Når denne type benzylering udføres på glycosider af GlcNAc-typen, er der risiko for uønsket

benzylering af kvælstof. Protonen i amidet, er dog mindre sur143 og man kan derfor undgå

deprotonering af kvælstof ved at være nøjagtig med tilsætning af base og kun tilsætte den

mængde, der er nødvendig for at opnå deprotonering af alkoholerne. På trods af dette potentielle

problem, blev et udbytte på 80 % opnået over to trin (Skema 57), hvilket var yderst

tilfredsstillende.

5.2 Glycosyleringsreaktioner

En række glycosyleringsreaktioner blev udført under forskellige betingelser, for at undersøge de to

syntetiserede thioglycosiders anvendelse som donorer. For at vurdere donorernes effektivitet,

skulle de fremkomne resultater sammenlignes med resultater opnået gennem lignende

glycosyleringsreaktioner.

141 pKa(H2) ≈ 35. Ref: Buncel, E.; Menon, B., J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 4457-4461 142 pKa(alkohol) = 16-18. Ref: Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books, 2006, 279-281 143 pKa(amid) ≈ 25. Ref: Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books, 2006, 279-281


— 69 —

5.2.1 Indledning

Som nævnt er der tidligere i gruppen udført glycosyleringer med en ”disarmed” donor i form af

peracetyleret GlcNAc135 (Skema 52, Skema 53, Tabel 2). Det var gennem disse forsøg erfaret at

der ved glycosyleringer med denne type donor, var behov for reflux. I glycosyleringer udført af

specialestuderende Jonas Krag med 4-pentenylglycosider, var det ligeledes nødvendigt at

anvende reflux i glycosylering med en ”disarmed” donor (40), hvorimod glycosylering med en

”armed” donor (41) kunne foregå ved stuetemperatur (Skema 59, Tabel 3). Disse erfaringer lå til

grund for valget af temperatur i glycosyleringer med thioglycosiddonorerne.

For at kunne sammenligne vores resultater med de glycosyleringer, der sideløbende blev udført

med 4-pentenyldonorer, var det nødvendigt at anvende tilsvarende reaktionsbetingelser. I de

indledende testglycosyleringer var 1-octanol og (-)-menthol blevet anvendt som acceptorer.

Dichlormethan havde vist sig at være et godt valg af solvent og den optimale mængde katalysator

(M(OTf)x) var blevet bestemt til 15 % (i forhold til mængden af donor), mens et overskud af

N-iodosuccinimid var blevet anvendt. De fem metaller, der var blevet afprøvet og havde givet

succesfulde resultater var Sc, Yb, Cu, Zn og Mg (Skema 59, Tabel 3).

Skema 59. Reaktionsbetingelser for glycosylering af pentenylglycosiddonorer


— 70 —

Tabel 3. Reaktionsbetingelser og resultater for glycosyleringer med 4-pentenylglycosider.

Udført af Jonas Krag

* * * * *

Disse glycosyleringsreaktioner og tilhørende resultater, var altså fundamentet for den række af

glycosyleringer, som blev udført med de to syntetiserede phenyl thioglycosider af GlcNAc, 37 og

39. Det generelle reaktionsskema for glycosylering med thioglycosiddonorerne er vist i Skema 60.

Nr. Donor Acceptor Produkt D/Aa Aktiveringb Temp. Tid Udbyttec

1 O

AcHNAcO

AcO

OAc

OPent

40

1-octanol

1:3 Sc(OTf)3 NIS Reflux 3 h 50 %

2

1-octanol

2:1 Sc(OTf)3 NIS rt 16 h 84 %

3 41 1-octanol 44 2:1 Yb(OTf)3 NIS rt 16 h 81 %

4 41 1-octanol 44 2:1 Cu(OTf)2 NIS rt 16 h 84 %

5 41 1-octanol 44 2:1 Zn(OTf)2 NIS rt 16 h 88 %

6 41 1-octanol 44 2:1 Mg(OTf)2 NIS rt 16 h 85 %

7 41 (-)-menthol

2:1 Cu(OTf)2 NIS rt 25 h 76 %

a Donor/acceptor-forhold. b 15 % M(OTf)x (i forhold til donor). 2 ækv. NIS (i forhold til donor). c Isoleret udbytte (angivet i forhold til den begrænsende faktor: donor (nr. 1), acceptor (nr.2-7))


— 71 —

Skema 60. Reaktionsbetingelser for glycosylering af thioglycosiddonorer

I disse reaktioner dannes en oxazolin som intermediat. Reaktionen påbegyndes når det nukleofile

svovl reagerer med det elektrofile iod. NIS aktiveres formodentlig gennem koordination til den

tilstedeværende Lewis syre144. Oxazolinen kan dannes direkte ved anchimerisk assistance fra

amidet på C-2 eller dannelsen kan alternativt ske gennem en oxoniumion. I reaktionen dannes

phenylsulfenyliodid (PhSI) som biprodukt (Skema 61).

Skema 61. Mekanisme for dannelse af oxazolinintermediat i glycosyleringsreaktionerne

Det dannede oxazolinintermediat bliver hernæst aktiveret af metalkatalysatoren (M(OTf)x).

Bindingen mellem det anomere kulstof og ilt i oxazolinen er aksial, hvilket medfører at den nye

glycosidbinding, der dannes ved angreb fra acceptoren, kun kan blive ækvatorial, og dette giver

de ønskede β-glycosider (Skema 62).

+/- H

M(OTf)x

O

AcHNOR'RO

ORO

ON

ORO

ON(OTf)xM

M(OTf)x

R'OH

42-45

Skema 62. Aktivering og glycosylering af oxazolinen145

144 a) Jayaprakash, K. N.; Radhakrishnan, K. V.; Fraser-Reid, B., Tetrahedron Lett., 2002, 43, 6953-6955; b) Jayaprakash, K. N.; Fraser-Reid, Synlett, 2004, 2, 301-305 145 Dette forslag er stærkt inspireret af mekanismen foreslået af C. F. Crasto og G. B. Jones (Ref. 133)


— 72 —

5.2.2 Glycosylering med ”disarmed” donor

Indledningsvist blev en række glycosyleringer med den acetylerede donor (37) udført.

Reaktionsbetingelser og resultater fra disse reaktioner kan ses i Tabel 4.

Tabel 4. Reaktionsbetingelser og resultater for glycosyleringer med

”disarmed” thioglycosiddonor (37)

De første forsøg (Tabel 4, nr. 1-5) skulle fastslå, hvilke af de fem afprøvede katalysatorer, der var

mest effektiv mht. reaktionstid og udbytte. Den simple alkohol 1-octanol blev anvendt som

acceptor og donor/acceptor-forholdet blev fastholdt på 1:3, således at donoren var den

begrænsende faktor. Oxazolinen, som hurtigt blev dannet i starten af reaktionsforløbet, kunne

observeres med TLC. Glycosyleringerne blev derfor standset når der ikke var mere oxazolin til


1 O

AcHNAcO

AcO

OAc

SPh

37

1-octanol

1:3 Sc(OTf)3 NIS Reflux 2 h 67 %

2 37 1-octanol 42 1:3 Yb(OTf)3 NIS Reflux 3 h 65 %

3 37 1-octanol 42 1:3 Cu(OTf)2 NIS Reflux 4.5 h 76 %

4 37 1-octanol 42 1:3 Zn(OTf)2 NIS Reflux 4.5 h 52 %

5 37 1-octanol 42 1:3 Mg(OTf)2 NIS Reflux 9.5 h 67 %

6 37 1-octanol 42 1:3 Sc(OTf)3 NIS Reflux 16 h 69 %

7 37 (-)-menthol

43

O

AcHNAcO

AcO

OAc

O

1:2 Yb(OTf)3 NIS Reflux 23 h 54 %

8 37 (-)-menthol 43 1:2 Sc(OTf)3 NIS Reflux 23 h 46 %

9 37 (-)-menthol 43 1:2 Cu(OTf)2 NIS Reflux 23 h 50 %

a Donor/acceptor-forhold. b 15 % M(OTf)x (i forhold til donor). 2.5 ækv. NIS (i forhold til donor). c Isoleret udbytte (angivet i forhold til den anvendte mængde donor).


— 73 —

stede i reaktionsblandingen. Sc(OTf)3, Yb(OTf)3 og Cu(OTf)2 gav de bedste resultater med høje

udbytter (65-76 %) og lave reaktionstider (2-4.5 h), mens Zn(OTf)2 kun gav et middelmådigt

udbytte (52 %) og Mg(OTf)2 krævede betydeligt længere reaktionstid (9 h). For at undersøge

hvorvidt forlænget reaktionstid ville resultere i forøget udbytte, blev en glycosylering med

Sc(OTf)3-katalyse udført over 16 timer, men dette resulterede ikke i nogen betydelig ændring

(Tabel 4, nr. 1 vs. nr. 6).

De tre mest lovende katalysatorer blev afprøvet i glycosyleringsreaktioner med den mere sterisk

hindrede sekundære alkohol (-)-menthol (Tabel 4, nr. 7-9). Alle disse tre glycosyleringsreaktioner

blev udført med en reaktionstid på 23 timer, for at sikre fuld omsætning af donoren. Udbytterne

(46-54 %) var acceptable i betragtning af den anvendte acceptor.

5.2.3 Glycosylering med ”armed” donor

De testglycosyleringer, der sideløbende var blevet udført med 4-pentenylglycosider, havde vist en

betydelig forbedring i udbytte når en ”armed” donor var blevet anvendt frem for en ”disarmed”

donor (Tabel 3, nr. 1 vs. nr. 2), på trods af ændringer i temperatur og donor/acceptor-forhold.

Resultaterne fra glycosylering med det ”disarmed” thioglycosid (37) gav derfor forhåbninger om at

glycosyleringer med det ”armed” thioglycosid (39), ville give endnu bedre resultater.

Det næste skridt var altså at anvende den benzylerede thioglycosiddonor (39) i en række

glycosyleringsreaktion. Et benzyleret thioglycosid af GlcNAc har ikke tidligere været anvendt som

donor, og det var af denne grund ekstra interessant at se hvilke resultater, der kunne opnås i

disse glycosyleringer. Indledningsvist var det oplagt at afprøve de samme reaktionsbetingelser,

som dem, der var anvendt med det benzylerede pentenylglycosid (41), idet der var opnået gode

udbytter med disse betingelser (Tabel 3). Resultater opnået med det ”armed” thioglycosid kan ses

i Tabel 5.


— 74 —

Tabel 5. Reaktionsbetingelser og resultater for glycosyleringer med

”armed” thioglycosiddonor (39)

De første fem forsøg (Tabel 5, nr.1-5) skulle ligeledes for denne donor, vise hvilke katalysatorer,

der var mest effektiv. 1-octanol blev igen benyttet som acceptor. Reaktionstiden blev fastholdt på

16 timer, idet dette havde vist sig at være den optimale reaktionstid for de tilsvarende

glycosyleringer med det benzylerede pentenylglycosid (Tabel 3). Et donor/acceptor-forhold på 2:1

blev anvendt dels for at have acceptoren som den begrænsende faktor, idet den benzylbeskyttede

oxazolin ikke kunne observeres med TLC; dels fordi glycosyleringerne med det benzylerede

pentenylglycosid havde vist gode resultater under disse forhold (Tabel 3).


1

1-octanol

2:1 Sc(OTf)3 NIS rt 16 h 39 %

2 39 1-octanol 44 2:1 Yb(OTf)3 NIS rt 16 h 49 %


4 39 1-octanol 44 2:1 Zn(OTf)2 NIS rt 16 h 43 %

5 39 1-octanol 44 2:1 Mg(OTf)2 NIS rt 16 h 54 %


7 39 1-octanol 44 1:3 Cu(OTf)2 NIS Reflux 16 h 70 %

8 39 (-)-menthol

2:1 Cu(OTf)2 NIS rt 23 h 28 %

9 39 (-)-menthol 45 1:2 Cu(OTf)2 NIS rt 23 h 67 %

a Donor/acceptor forhold. b 15 % M(OTf)x (i forhold til donor). 2 ækv. NIS (i forhold til donor). c Isoleret udbytte (angivet i forhold til den begrænsende faktor: donor (nr. 6-7, 9), acceptor (nr. 1-5, 8)


— 75 —

Resultaterne fra disse glycosyleringer med det fremstillede ”armed” thioglycosid (39) var dog

skuffende med lave udbytter (39-54 %) sammenlignet med udbytterne for de tilsvarende

glycosyleringer med den ”armed” pentenylglycosiddonor (41) (81-88 %, Tabel 3 nr. 1-5).

I et forsøg på at optimere reaktionsbetingelserne og opnå bedre udbytter, blev

donor/acceptor-forholdet ændret til 1:3 (Tabel 5, nr. 6), således at acceptoren var til stede i

overskud, ligesom det var tilfældet i glycosyleringerne med den ”disarmed” thioglycosiddonor (37).

Ydermere blev en glycosylering udført med en kombination af overskud af acceptor og

opvarmning til reflux (Tabel 5, nr. 7), for at se om varmen havde en indflydelse på udbyttet. Disse

to reaktioner gav begge høje udbytter på hhv. 70 og 71 %, hvilket skulle sammenlignes med et

udbytte på 50 % fra de indledende testglycosyleringer (Tabel 5, nr. 3). Det kan derfor umiddelbart

konkluderes at bedre udbytter kunne opnås ved at have et overskud af acceptor, men at forøget

reaktionstemperatur tilsyneladende ikke havde nogen indflydelse.

To glycosyleringsreaktioner med (-)-menthol som acceptor og Cu(OTf)2 som katalysator blev

ligeledes udført. Med et donor/acceptor-forhold på 2:1 (Tabel 5, nr. 8), var resultatet som forventet

et lavt udbytte (28 %) sammenlignet med den samme reaktion med den ”armed”

pentenylglycosiddonor (76 %) (Tabel 3, nr. 7). Når acceptoren var til stede i overskud (Tabel 5, nr.

9), kunne der dog igen observeres en forøgelse af udbyttet (67 %), hvilket blot bekræftede den

konklusion, at overskud af acceptor havde en positiv effekt på udbyttet i disse glycosyleringer. Det

var dog selv med de optimerede betingelser ikke muligt at opnå ligeså gode udbytter, som i de

tilsvarende reaktioner med den ”armed” pentenylglycosiddonor.

* * * * *

Den eneste forskel mellem glycosyleringsreaktionerne med henholdsvis det benzylerede phenyl

thioglycosid (39) og det benzylerede 4-pentenylglycosid (41) var det biprodukt, der fremkom ved

dannelsen af oxazolinen. Det forekom derfor sandsynligt at de lave udbytter med

thioglycosiddonoren, kunne skyldes indvirkning fra dette biprodukt.

Når svovl aktiveres med NIS, dannes phenylsulfenyliodid (PhSI) (Skema 61). Der sker hurtigt en

redoxreaktion mellem to af disse molekyler, hvorved der dannes diphenyldisulfid og molekylært

iod146 (Skema 63).

Skema 63. Dannelsen af diphenyldisulfid

146 Dannelsen af iod ses tydeligt ved reaktionsblandingens voldsomme røde farve


— 76 —

For at undersøge om diphenyldisulfid, havde indvirkning på udbyttet af glycosyleringerne, blev en

testreaktion udført med det tri-O-benzylerede pentenylglycosid (41) og 1-octanol

(donor/acceptor-forhold: 2:1), hvor 0.5 ækvivalent diphenyldisulfid blev tilsat (Skema 64).

Skema 64. Testreaktion med pentenyldonor (41) og 1-octanol.

0.5 ækv. diphenyldisulfid tilsat.

Denne glycosylering gav et udbytte på kun 28 %, hvilket var en væsentlig forringelse, idet den

tilsvarende reaktion uden diphenyldisulfid tilsat gav 84 % (Tabel 3, nr. 1). Resultatet gav altså en

indikation af, at det dannede diphenyldisulfid kunne have en effekt på udbyttet. Dog havde det

været muligt at opnå tilfredsstillende udbytter med thioglycosiddonorer, men dette havde krævet

overskud af acceptor, hvilket kunne lede til den formodning at disulfidet påvirker acceptoren.

Præcis hvilken virkning dette biprodukt har, er stadig meget uvist, men det tyder ikke desto mindre

på, at tilstedeværelsen af diphenyldisulfid har en effekt på glycosyleringsreaktionerne.

Overordnet set var resultaterne med phenyl thioglycosiderne ikke ligeså lovende som de

tilsvarende resultater med 4-pentenylglycosider. Det var tilsyneladende nødvendigt at anvende

overskud af acceptor for at opnå gode resultater. Der blev derfor ikke gjort nogle forsøg på at

udforske systemet med mere komplicerede acceptorer, såsom kulhydratbaserede acceptorer.

5.3 Trisaccharid

Adskillige testglycosyleringer udført af specialestuderende Jonas Krag havde fastslået at

NIS/M(OTf)x var et godt aktiveringssystem til glycosyleringer med ”armed” 4-pentenylglycosider af

GlcNAc (Tabel 3). Reaktionerne gav tilmed forholdsvist høje udbytter selv når kulhydratbaserede

acceptorer blev anvendt. Derudover er det velkendt, at disse glycosider er særdeles stabile

overfor kemisk manipulation med beskyttelsesgrupper. Dette gav anledning til en idé om at

fremstille et pentenylglycosid, der havde både donor- og acceptoregenskaber for derefter at

anvende dette i syntesen af et trisaccharid. Syntesestrategien for dannelsen af trisaccharidet er

vist i Skema 65, hvor det ønskede pentenylglycosid er indrammet. Det skal altså først anvendes

som acceptor og det dannede disaccharid skal derefter fungere som donor.


— 77 —

Skema 65. Strategi for syntese af trisaccharid

5.3.1 Syntese af pentenylglycosid med donor- og acceptoregenskaber

Det peracetylerede pentenylglycosid af GlcNAc (40) blev anvendt som udgangsstof til syntesen af

et di-O-benzyleret pentenylglycosid (48). Først blev estrene afbeskyttet med

Zemplen-betingelser68, hvorefter en tritylgruppe blev introduceret på den primære alkohol med

triphenylmethylchlorid i pyridin147. DMAP blev tilsat undervejs i et forsøg på at øge hastigheden.

De to resterende frie alkoholer blev beskyttet med benzyler under standardbetingelser, og til sidst

blev tritylgruppen på 6-OH fjernet igen med syre148, her i form af PTSA (Skema 66).

Skema 66. Syntese af di-O-benzyleret pentenylglycosid (48)

Mekanismen for Zemplen-afbeskyttelse af acetyler er tidligere vist (Skema 24). Beskyttelse med

trityl foregår ved en SN1 subsitution, da triphenylmethylkationen er ekstremt stabil pga.

resonansstabilisering fra de tre phenyler. Alkoholen angriber og deprotoneres efterfølgende af

pyridin149. Idet det elektrofile carbon er meget sterisk hindret af de tre aromater, vil det kun være

den primære alkohol på C-6, der bliver trityleret (Skema 67).

147 Helferich, B.; Speidel, P. E.; Toeldte, W., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1923, 56, 766-770 148 Helferich, B.; Koester, H., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1924, 57, 587-591 149 Boons, G.-J.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, 2000 (1st Ed.), Sheffield Academic Press, 37-38


— 78 —

Skema 67. SN1-mekanisme for tritylering af primær alkohol149

Det næste trin i syntesen af 48, er benzylering med natriumhydrid og benzylbromid. Som nævnt

tidligere, kan man i dette trin risikere at acetamidofunktionaliteten benzyleres, og netop dette

uønskede biprodukt, kan muligvis forklare det knap så gode udbytte (45 %) af det

di-O-benzylerede produkt (47). Der blev dog ikke isoleret noget af det N-benzylerede produkt.

Mekanismen for benzyl-beskyttelse, er vist tidligere (Skema 58). Alkoholen på C-6 afbeskyttes

med katalytisk syre, her PTSA, i et nukleofilt solvent, her methanol. Bindingen mellem ilt og det

benzyliske kulstof kløves efter protonering af ilt, hvorved alkoholen frigives. Den dannede

carbokation fanges af en nukleofil, hvorved en ny tritylether dannes. Methanol fungerer herved

som ”scavenger” af den dannede kation149 (Skema 68).

Skema 68. Mekanisme for syrekatalyseret detritylering149

5.3.2 Trisaccharidsyntese

I syntesen, som blev udført af Jonas Krag, blev et peracetyleret β-acetat af GlcNAc (49) anvendt

som donor i den første glycosylering. Som det er omtalt i et af de foregående afsnit, har denne

donor tidligere været studeret, og en række metaltriflater havde vist sig at være effektive

aktivatorer135. Det fremstillede pentenylglycosid med en fri 6-OH (48), agerede acceptor i denne

glycosylering, som pga. anchimerisk assistance fra acetamidofunktionaliteten på C-2 gav et

β-glycosid (50). Da der endnu ikke var NIS til stede, blev den anomere pentenylgruppe ikke

aktiveret og pentenylglycosidet fungerede dermed udelukkende som acceptor i det første trin.

Da første glycosylering havde fundet sted, blev NIS tilsat sammen med en ny acceptor i form af et

methyl glycosid med en fri 6-OH (51). M(OTf)x havde blot virket katalytisk i aktiveringen af acetatet


— 79 —

og var derfor stadig til stede i reaktionen. Hermed blev pentenylglycosidet (50) aktiveret og den

næste glycosylering kunne finde sted (Skema 69).

Skema 69. Syntese af trisaccharid udført af Jonas Krag

Denne syntese blev udført succesfuldt, idet tilstedeværelsen af det ønskede trisaccharid (52) blev

bekræftet både ved NMR og MS. Det har dog endnu ikke været muligt at isolere helt rent

trisaccharid og et egentligt udbytte er derfor ikke rapporteret. Umiddelbart vurderes udbyttet til at

være omkring 20 %, hvilket bestemt ikke er dårligt, idet syntesen at dette store molekyle udføres

”one-pot” uden nogen form for oprensning eller isolering mellem de enkelte trin. Der er

sandsynligvis behov for mindre justeringer for at optimere syntesen, men resultatet er allerede på

nuværende tidspunkt lovende.

Produktet i denne ”one-pot”-reaktion er et trisaccharid indeholdende to β-1,6 glycosidiske

bindinger, og hvor de to af kulhydraterne er GlcNAc-enheder. Det burde være muligt at anvende

et glycosid af GlcNAc som acceptor i den sidste glycosylering, hvorved der ville blive dannet et

trisaccharid bestående udelukkende af GlcNAc. Ydermere kunne det være interessant, at

fremstille og anvende acceptorer med en fri 4-OH, frem for en fri 6-OH, idet dette potentielt ville

resultere i tre GlcNAc enheder forbundet med β-1,4 glycosidiske bindinger, som det ses i chitin.


— 80 —

6. Konklusion Målet med projektet var at fremstille to forskellige phenyl thioglycosider af GlcNAc, for at

undersøge deres evner som glycosiddonorer og optimere de anvendte reaktionsbetingelser.

De to thioglycosiddonorer blev syntetiseret succesfuldt fra GlcNAc. Det ene thioglycosid blev

beskyttet med acetyler, og det andet med benzyler, således at de to donorer var hhv. ”disarmed”

og ”armed”. Begge donorer blev anvendt i en lang række glycosyleringsreaktioner, hvor

N-iodosuccinimid i kombination med et metaltriflat blev anvendt til aktivering. Fem forskellige

metaller blev afprøvet og andre parametre som donor/acceptor-forhold og reaktionstid blev

ligeledes varieret.

Hvad angår den ”disarmed” donor, var resultaterne af de udførte glycosyleringer tilfredsstillende,

dog var to af de fem afprøvede metalkatalysatorer noget ringere end de resterende tre. Under

reflux og med et overskud af acceptor, var det muligt at opnå gode udbytter med de to acceptorer

1-octanol og (-)-menthol.

Med hensyn til den ”armed” donor, var de indledende resultater mere skuffende. Optimering af

betingelserne viste dog, at det var muligt at opnå en væsentlig forbedring af udbyttet ved at

anvende acceptoren i overskud, hvilket dog ikke er hensigtsmæssigt, når man har at gøre med

mere kostbare acceptorer. Forøget reaktionstemperatur havde umiddelbart ingen effekt på

glycosyleringsreaktionerne med den benzylerede donor.

De resultater der blev opnået, indikerede at tilstedeværelsen af diphenyldisulfid, havde en stærk

tendens til at forringe udbyttet. Tilsyneladende blev acceptoren påvirket af disulfidet, men denne

effekt bør undersøges yderligere.

Endelig blev et pentenylglycosid med både acceptor- og donoregenskaber syntetiseret med

succes. Dette glycosid blev efterfølgende anvendt i en ”one-pot”-syntese af et trisaccharid, som

dog endnu kræver optimering.

Det var altså muligt at anvende såvel en ”disarmed” som en ”armed” thioglycosiddonor af GlcNAc.

Idet sidstnævnte type donor, tilsyneladende ikke før har været anvendt i glycosyleringer, er dette

et glimrende resultat. Der er ligeledes stort potentiale i den udførte trisaccharidsyntese.


— 81 —

7. Experimentals

7.1 Abbreviations

Ac Acetyl aq. Aqueous Ar Aromatic Bn Benzyl br s Broad singlet calcd. Calculated Carb Carbohydrate cat. Catalytic conc. Concentrated d Doublet D Deuterium db Double bond dd Double doublet ddd Double double doublet DMAP 4-Dimethylaminopyridine DMF N,N-Dimethylformamide DMSO Dimethylsulfoxide dq Double quartet dsp Double septet dt Dobbelt triplet dx Number (x) of deuterium atoms in the solvent eq Equivalents ES+ Electrospray, positive ionization Et Ethyl gem Geminal h Hour(s) HRMS High Resolution Mass Spectrometry J Coupling constant LRMS Low Resolution Mass Spectrometry m Multiplet Me Methyl min Minute(s) mol. sieves Molecular sieves Mp Melting point Ms Methanesulfonyl, (mesyl) MS Mass Spectrometry NMR Nuclear Magnetic Resonance org. Organic


— 82 —

Ph Phenyl q Quartet Rf Retention factor rt Room temperature s Singlet sat. Saturated sp Septet t Triplet THF Tetrahydrofuran TLC Thin layer chromatography Tol Toluyl Tr Triphenylmethyl, (trityl) Ts p-Toluenesulfonyl, (tosyl) vic Vicinal

7.2 General methods

Anhydrous solvents, which were used when needed, were dried by standard procedure150. TLC

was performed on aluminium sheets coated with silica gel (Merck 60 F254). They were visualized in

UV-light or by staining with Cmol151, KMnO4152 or PMA153. Flash chromatography was done using

Fluka silica gel 60 (230-400 mesh) as stationary phase. 1H-NMR spectra were recorded at 400 MHz and 13C-NMR spectra were recorded at 100 MHz on a

Varian Mercury 400 spectrometer. Optical rotation was measured on a PE-314 polarimeter with

the unit deg ▪ cm2 / g and concentrations were reported in g / 100 mL. Melting points were

measured on a Büchi B-540 instrument and are uncorrected. Mass spectra were recorded at a

Micromass LC-TOF (ESI) instrument.

Bufalin, ouabain octahydrate and digitoxin were purchased from Sigma-Aldrich. Rhamnose

monohydrate and N-acetylglucosamine was purchased from Carbosynth.

150 Perrin, D. D.; Armarego, W. L. F., Purification of Laboratory Chemicals, 1988, 3. Edition, Butterworth-Heinemann Ltd. 151 Cmol: (NH4)6Mo7O24 ▪ 4H2O, Ce(SO4)2, H2SO4 in water 152 KMnO4: KMnO4, NaOH in water 153 PMA: (MoO3)12PO(OH)3 in absolut EtOH


— 83 —

7.3 Bufalin

3-Epi-bromobufalin (4) Bufalin (1) (7.0 mg, 0.018 mmol) was co-evaporated with toluene twice and was then dissolved in

dry THF (0.7 mL). ~10 Mol. sieves were added and the solution was allowed to stir at rt for 1 h

under an atmosphere of nitrogen. Triphenylphosphine (7.1 mg, 0.027 mmol) was added and the

mixture was placed on ice. Carbon tetrabromide (9.1 mg, 0.027 mmol) was then added and the

ice-bath was removed. The mixture was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 24

h, TLC-analysis showed incomplete conversion of starting material, so additional

triphenylphosphine (4.7 mg, 0.018 mmol) and carbon tetrabromide (6.0 mg, 0.018 mmol) were

added. This was repeated after 2 days. After 3 days, LiBr (3.1 mg, 0.036 mmol) was added. After

a total of 8 days, TLC-analysis still showed remaining starting material. The mixture was diluted

with Et2O and filtered through a pipette with cotton. Purification by column chromatography

(EtOAc/pentane 3:7) gave the brominated steroid (4) as a white powder (3.0 mg, 37 %).

Rf (EtOAc/pentane 1:1) 0.43. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.84 (d, 1H, JHC=CH 9.6 Hz, HC=CH), 7.23 (s, 1H,

OCH=C), 6.26 (d, 1H, JHC=CH 9.6 Hz, HC=CH), 5.21 (d, 1H, J 4.4 Hz, OH), 3.92-3.80 (m, 2H), 0.92

(s, 3H, CH3), 0.70 (s, 3H, CH3), 2.45-1.15 (m, 24H)154

154 It was not possible to obtain a value for this compound by MS


— 84 —

(-)-Menthylmethanesulfonate (7) (-)-Menthol (6) (207.7 mg, 1.33 mmol), was dissolved in dry Et2O (3 mL) and it was placed on ice.

Triethylamine (0.15 mL, 1.93 mmol) and mesyl chloride (0.32 mL, 2.30 mmol) were added and the

mixture was left to stir under an atmosphere of nitrogen and allowed to heat to rt. After 1 h,

analysis by TLC showed full conversion. The mixture was diluted with CH2Cl2, washed with aq.

HCl (0.5 M), water, sat. aq. NaHCO3, dried (MgSO4), filtered and concentrated to give the

mesylated compound (7) as a clear oil (362.0 mg crude). This crude product was pure enough to

be used without further purification.

Rf (pentane/CH2Cl2 1:3) 0.33. 1H-NMR (CDCl3): δ 4.51 (dt, 1H, J1,2 = J1,6a 11.6 Hz, J1,6e 4.4 Hz,

H-1), 2.98 (s, 3H, SO2CH3), 2.46 (m, 1H, H-6e), 2.04 (dsp, 1H, J7,CH3 6.4 Hz, J7,2 2.4 Hz, H-7),

1.72-1.64 (m, 2H, H-3e, H-4e), 1.48-1.36 (m, 2H, H-2, H-5), 1.24 (q, 1H, J1,6a = J6a,6e 11.6 Hz,

H-6a), 1.03 (dq, 1H, J2,3a = J3a,4a = J3a,3e 12.8 Hz, J3a,4e 3.2 Hz, H-3a), 0.91 (d, 3H, J 6.4 Hz, CH3),

0.90 (d, 3H, J 6.4 Hz, CH3), 0.87-0.83 (m, 1H, H-4a), 0.81 (d, 3H, J 6.4 Hz, CH3). 13C-NMR

(CDCl3): δ 83.6 (C-1), 47.6 (C-2 or C-5), 42.4 (C-6), 39.3 (SO2CH3), 34.0 (C-4), 31.8 (C-5 or C-2),

26.0 (C-7), 23.3 (C-3), 22.1, 21.0, 15.9 (CH3). HRMS (ES+): Calcd. for C11H22O3SNa: 257.1187;

found: 257.1179155.

155 Spectral data in accorcance with previously published: Yamashita, M.; Soeda, Y.; Suzuki, N.; Yamada, M.; Tsunekawa, K.; Oshikawa, T.; Inokawa, S., B. Chem. Soc. Jpn., 1983, 56, 1871-1872


— 85 —

8

SePh

1-Phenylselenylneomenthane (8) Diphenyl diselenide (526.3 mg, 1.69 mmol) was dissolved in EtOH (99.9 %, 10 mL) and sodium

borohydride (192.6 mg, 5.09 mmol) was added. After 5 min, the solution was colorless, and the

mesylate (7) (362.0 mg (crude)) dissolved in EtOH (99.9 %, 5 mL) was added. The reaction was

heated to reflux and left to stir under an atmosphere of nitrogen. After 1.5 h, TLC-analysis showed

remaining starting material, so additional sodium borohydride (199.5 mg, 5.27 mmol) was added.

After 3 h total, TLC-analysis showed full consumption of starting material. The mixture was diluted

with Et2O, washed with water, brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated. Purification by

column chromatography twice (hexane) to give the phenylselenide (8) as a clear oil (237.9 mg, 61

% over two steps)

Rf (hexane) 0.53. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.60-7.57 (m, 2H, Ar), 7.27-7.25 (m, 3H, Ar), 3.74 (br s, 1H,

H-1), 2.05-1.99 (m, 2H, H-5, H-6e), 1.87-1.70 (m, 3H, H-3e, H-4e, H-7), 1.36 (ddd, 1H, J1,6a 3.2 Hz,

J 12.0, J 14.8 Hz, H-6a), 1.19 (m, 1H, H-3a), 1.06 (m, 1H, H-2), 0.91 (m, 1H, H-4a), 0.97 (d, 3H, J

6.4 Hz, CH3), 0.92 (d, 3H, J 6.4 Hz, CH3), 0.91 (d, 3H, J 6.4 Hz, CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 134.4,

131.1, 129.1, 127.2 (Ar), 50.7 (C-1), 49.9 (C-2), 42.2 (C-6), 35.6 (C-4), 31.6 (C-7), 28.0 (C-5), 27.5

(C-3), 22.4, 21.3, 21.0 (CH3). [ ]296Dα +86.9º (c 1.0, CHCl3)156,157.

156 Spectral data in accorcance with previously published: Malik, S.; Moeller, S.; Duddeck, H.; Choudhary, M. I., Magn. Reson. Chem., 2002, 40, 659-665 157 It was not possible to obtain a value for this compound by MS


— 86 —

3-Epi-O-p-toluenesulfonylbufalin (9) 3-Epi-bufalin (5) (7.0 mg, 0.018 mmol) was dissolved in dry pyridin (0.5 mL) and the mixture was

placed on ice. Tosylic anhydride (15.8 mg, 0.048 mmol) was added. It was left to stir under an

atmosphere of nitrogen and allowed to heat to rt. After 24 h, TLC-analysis showed full conversion.

A drop of water was added and it was stirred for 10 min. The mixture was diluted with CH2Cl2 and

washed with sat. aq. NaHCO3. The aqueous phase was extracted with CH2Cl2 and the combined

org. phases were washed with brine, dried (MgSO4) and filtered. Co-evaporation with toluene

several times gave the mono-tosylated steroid (9) as a white powder (crude yield 10.7 mg).

Rf (EtOAc/pentane 1:1) 0.29. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.82-7.79 (m, 3H, HC=CH, 2 Ar), 7.34 (d, 2H,

Jortho 8.0 Hz, 2 Ar), 7.22 (s, 1H, OCH=C), 6.25 (d, 1H, JHC=CH 9.6 Hz, HC=CH), 4.46 (sp, 1H, J 4.8

Hz), 2.45 (s, 3H, SO2C6H4CH3), 0.88 (s, 3H, CH3), 0.68 (s, 3H, CH3), 2.45-1.15 (m, 24H). LRMS

(ES+): Calcd. for C31H40O6SNa: 563.2; found: 563.2.


— 87 —

7.4 Ouabain

7.4.1 Rhamnose

Bis(p-methylbenzoyl) diselenide (12)158 Selenium powder (7.998 g, 101 mmol) was suspended in EtOH (99.9 %, 100 mL) and it was

placed on ice and under an atmosphere of nitrogen. Sodium borohydride (4.503, 119 mmol) was

added in small portions over 30 min. p-Methylbenzoyl chloride (13.2 mL, 100 mmol) dissolved in

dry THF (10 mL) was added drop wise over 20 min. The mixture was left stirring on ice for 60 min.

Iodine (12.503 g, 49 mmol) and potassium iodide (3.310 g, 20 mmol) was dissolved in EtOH (99.9

%, 40 mL) and this was added over 45 min. The mixture was left stirring on ice for 30 min. Then

the mixture was diluted with CH2Cl2, washed with sat. aq. NaHCO3, water and brine. The organic

phase was dried (MgSO4), filtered and concentrated. Recrystallization in CH2Cl2/hexane gave the

diselenide (12) as orange crystals (14.477 g, 37 %).

Rf (EtOAc/pentane 1:4) 0.71. Mp 112-115 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.91 (d, 4H, Jortho 8 Hz, Ar), 7.30

(d, 4H, Jortho 8 Hz, Ar), 2.43 (s, 6H, CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 187.0 (C=O), 145.7, 134.5, 130.0,

128.5 (Ar), 22.1 (CH3). LRMS (ES+): Calcd. for C16H14O280Se2Na: 420.9; found: 420.9159.

158 This experiment was performed according to previously published procedure (Ref. 49) 159 Spectral data was in accordance with previously published: Koketsu, M.; Nada, F.; Hiramatsu, S.; Ishihara, H., J. Chem. Soc. Perk. T. 1, 2002, 737-740


— 88 —

13

SeK

O

Potassium p-methylselenobenzoate (13)158 A solution of KOH (1 M in dry MeOH) (11.0 mL, 11.0 mmol) was added to a solution of diselenide

(12) (3.653 g, 9.2 mmol) in benzene (30 mL). This was left to stir at rt under an atmosphere of

nitrogen for 15 min. The mixture was concentrated and hexane was added to the resulting solid.

The suspension was filtered and the solid was washed with hexane to give a mixture of the

potassium selenide (13) and elemental selenium as green/black crystals (4.143 g). This could be

used without further purification.

Rf (EtOAc) 0.56. Mp > 400 °C. (Not melted at a temperature of 410 °C). 1H-NMR (D2O): δ 7.66 (d,

2H, Jortho 8 Hz, Ar), 7.18 (d, 2H, Jortho 8 Hz, Ar), 2.26 (s, 3H, CH3). 13C-NMR (D2O): 175.9 (C=O),

142.3, 133.5, 129.2, 129.1 (Ar), 20.7 (CH3)160.

Alternative procedure for work-up and purification:

After concentration of the mixture, it was dissolved in dry MeOH (25 mL) and the selenium was

allowed to precipitate. The mixture was then filtered through Celite and the resulting filtrate was

concentrated and recrystallized in benzene/hexane.

160 It was not possible to obtain a value for this compound by MS


— 89 —

16

OAcOAcO OAc

Br

2,3,4-Tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl bromide (16) L-Rhamnose monohydrate (14) (5.002 g, 27.5 mmol) was added in portions to a solution of iodine

(0.248 g, 1.0 mmol) in acetic anhydride (25 mL, 264.5 mmol) and it was left to stir at rt under an

atmosphere of nitrogen. After 30 min., the reaction was finished and the mixture was poured into

aq. Na2S2O3 and ice. Stirred for 30 min. NaHCO3 (solid) was added until neutrality was obtained.

The mixture was extracted with CH2Cl2 and the organic phase was washed with brine, dried

(MgSO4), filtered and concentrated to give the crude per-acetylated rhamnoside (15) as a clear

oil/syrup (9.393 g crude). Obtained as an α/β-mixture, which was used without further purification.

Rf (EtOAc/pentane 1:2) 0.34. 1H-NMR (major diastereoisomer) (CDCl3): δ 6.00 (d, 1H, J1,2 1.8 Hz,

H-1), 5.29 (dd, 1H, J2,3 3.6 Hz, J3,4 10.0 Hz, H-3), 5.24 (dd, 1H, J1,2 1.8 Hz, J2,3 3.6 Hz, H-2), 5.11

(t, 1H, J3,4 = J4,5 10.0 Hz, H-4), 3.93 (m, 1H, H-5), 2.16, 2.15, 2.05, 1.99 (s, 12H, COCH3), 1.23 (d,

3H, J5,6 6.4 Hz, H-6).

The crude product (15) was placed on ice and HBr (33% in AcOH) (30 mL, 173 mmol) was added.

Ice-bath removed and the reaction was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 2.5

h, the mixture was diluted with CH2Cl2, washed with sat. aq. NaHCO3 and ice, then washed

repeatedly with sat. aq. NaHCO3 until neutrality was obtained. The organic phase was dried

(MgSO4), filtered and concentrated to give the glycosyl bromide (16) as a brown syrup (9.370, 96

% over two steps). Crystallization could be observed when the syrup was cooled.

Rf (EtOAc/pentane 1:4) 0.65. Mp 63-65 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 6.24 (d, 1H, J1,2 1.2 Hz, H-1), 5.64

(dd, 1H, J2,3 3.4 Hz, J3,4 10.2 Hz, H-3), 5.42 (dd, 1H, J1,2 1.2 Hz, J2,3 3.4 Hz, H-2), 5.13 (t, 1H, J3,4 =

J4,5 10.2 Hz, H-4), 4.08 (m, 1H, H-5), 2.13, 2.05, 1.97 (s, 9H, COCH3), 1.25 (d, 3H, J5,6 6.4 Hz,

H-6). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.0, 169.9, 169.8 (COCH3), 84.0 (C-1), 72.6 (C-2), 71.3 (C-5), 70.5

(C-4), 68.1 (C-3), 21.0, 20.9, 20.8 (COCH3), 17.2 (C-6)161,162.

161 Spectral data was in accordance with previously published: Zhao, Y.; Biggins, J. B.; Thorson, J. S.; J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 12986-12987 162 It was not possible to obtain a value for this compound by MS


— 90 —

OAcOAcO OAc

Se

O

17

p-Methylbenzoyl 2,3,4-tri-O-acetyl-1-seleno-α/β-L-rhamnopyranoside (17α/β)

Conditions A: Per-acetylated rhamnosyl bromide (16) (115.0 mg, 0.33 mmol) was dissolved in

dry MeCN (8 mL), it was placed on ice and potassium p-methylselenobenzoate (13) (162.3 mg,

0.68 mmol) was added. The mixture was allowed to stir at rt under an atmosphere of nitrogen.

After 5.5 h, TLC-analysis showed full consumption of starting material. The mixture was diluted

with CH2Cl2 and washed with brine. The aqueous layer was extracted again with CH2Cl2 and the

combined org. phases were dried (MgSO4), filtered and concentrated. Column chromatography

three times (1: EtOAc/pentane 1:2, 2: EtOAc/pentane 1:4, 3: pentane/CH2Cl2 1:7 → CH2Cl2),

resulted in no pure products.

Conditions B: Per-acetylated rhamnosyl bromide (16) (98.4 mg, 0.28 mmol) was dissolved in

EtOAc (5 mL). Potassium p-methylselenobenzoate (13) (134.2 mg, 0.57 mmol) and

tetra-n-butylammonium hydrogen sulphate (190.3 mg, 0.56 mmol) was added. The reaction

mixture was left to stir at rt. After 27 h, TLC-analysis showed full consumption of starting material.

The mixture was diluted with EtOAc and washed with water. The aqueous layer was extracted

with EtOAc and the combined org. phases were washed with brine and concentrated. Column

chromatography (Acetone/CH2Cl2/pentane 1:3:16) gave one diastereoisomer (17α or 17β) pure as

a colourless oil (25.4 mg, 19 %).

Rf (EtOAc/pentane 1:3) 0.38. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.73 (d, 2H, Jortho 8.2 Hz, Ar), 7.28 (d, 2H, Jortho

8.2 Hz, Ar), 6.25 (d, 1H, J1,2 2.0 Hz, H-1), 5.45 (dd, 1H, J2,3 3.6 Hz, J3,4 10.0 Hz, H-3), 5.41 (dd, 1H,

J1,2 2.0 Hz, J2,3 3.6 Hz, H-2), 5.19 (t, 1H, J3,4 = J4,5 10.0 Hz, H-4), 4.21 (dq, 1H, J4,5 10.0 Hz, J5,6 6.0

Hz, H-5), 2.43 (s, 3H, COC6H4CH3), 2.20, 2.08, 2.03 (s, 9H, COCH3), 1.24 (t, 3H, J5,6 6.0 Hz, H-6). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.3, 170.1, 170.1 (COCH3), 164.2 (SeCOTol), 145.0, 130.3, 129.6, 126.3

(Ar), 91.3 (C-1), 70.8 (C-4), 69.2, 69.1, 60.1 (C-2, C-3, C-5), 22.0 (COC6H4CH3), 21.0, 21.0, 20.9

(COCH3), 17.7 (C-6). LRMS (ES+): Calcd for C20H24O880SeNa: 495.1; found: 494.9. [ ]296

Dα -75.5°

(c 1.0, CHCl3)


— 91 —

Conditions C: Per-acetylated rhamnosyl bromide (16) (103.2 mg, 0.29 mmol) was dissolved in

dry CH2Cl2 (1 mL) and this was placed on ice. Tetra-n-butylammonium hydrogen bromide (24.0

mg, 0.074 mmol) and potassium p-methylselenobenzoate (13) (83.4 mg, 0.35 mmol) was added

and it was left to stir on ice, allowed to heat to rt. After 16 h, dry DMF (0.5 mL) was added. After

3.5 days, analysis by TLC showed full consumption of starting material. The mixture was diluted

with Et2O and washed alternately with water and brine. The organic phase was dried (MgSO4),

filtered and concentrated. The crude residue contained some product, but mainly the by-product

from hydrolysis.

Conditions D: Per-acetylated rhamnosyl bromide (16) (107.8 mg, 0.30 mmol) was dissolved in

dry DMF (2 mL). Tetra-n-butylammonium hydrogen bromide (52.5 mg, 0.16 mmol) was added and

the mixture was placed on ice. Potassium p-methylselenobenzoate (13) (87.5 mg, 0.37 mmol) was

added and it was left to stir on ice under an atmosphere of nitrogen, allowed to heat to rt. After 18

h, analysis by TLC showed full consumption of starting material. The mixture was diluted with Et2O

and washed alternately with water and brine. The organic phase was dried and concentrated. The

crude residue contained a small fraction of product, but mainly the by-product from hydrolysis.


— 92 —

OAcOAcO OAc

SEt

19

Ethyl 2,3,4-tri-O-acetyl-1-thio-α/β-L-rhamnopyranoside (19α/β) Per-acetylated rhamnose (15) was made with acetic anhydride and iodine as described for 16

from L-rhamnose monohydrate (4.963 g, 27.2 mmol).

The crude product (15) was dissolved in dry CH2Cl2 (35 mL) and thioethanol (2.7 mL, 36.5 mmol)

was added. The mixture was placed on ice, BF3 ▪ Et2O (9 mL, 71.7 mmol) was added and the

reaction was left to stir on ice for 45 min under an atmosphere of nitrogen and then left to stir at rt.

After 4 h, the mixture was diluted with CH2Cl2 and washed three times with water. It was

neutralized by washing with sat. aq. NaHCO3, washed with brine, dried (MgSO4), filtered and

concentrated. Column chromatography (EtOAc/pentane 1:5 → 1:4) gave a high degree of

separation of the two diastereoisomers (19α/β) (7.256 g, 5.8:1 α/β, 80 % over two steps).

19α (clear oil): Rf (EtOAc/pentane 1:2) 0.54. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.32 (dd, 1H, J1,2 1.4 Hz, J2,3 3.6

Hz, H-2), 5.21 (dd, 1H, J2,3 3.6 Hz, J3,4 10.0 Hz, H-3), 5.18 (d, 1H, J1,2 1.4 Hz, H-1), 5.07 (t, 1H, J3,4

= J4,5 10.0 Hz, H-4), 4.21 (m, 1H, H-5), 2.62 (m, 2H, SCH2CH3), 2.14, 2.03, 1.96 (s, 9H, COCH3),

1.28 (t, 3H, J 7.6 Hz, SCH2CH3), 1.21 (d, 3H, J5,6 6.4 Hz, H-6). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.3, 170.2,

170.0 (COCH3), 82.2 (C-1), 71.8 (C-2), 71.5 (C-4), 69.7 (C-3), 67.2 (C-5), 25.7 (SCH2CH3), 21.1,

21.0, 20.9 (COCH3), 17.5 (C-6), 15.0 (SCH2CH3)163.

19β (white crystals): Rf (EtOAc/pentane 1:2) 0.35. Mp 165-167 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.49 (dd,

1H, J1,2 1.2 Hz, J2,3 3.4 Hz, H-2), 5.09 (t, 1H, J3,4 = J4,5 10.0 Hz, H-4), 5.02 (dd, 1H, J2,3 3.4 Hz, J3,4

10.0 Hz, H-3), 4.74 (d, 1H, J1,2 1.2 Hz, H-1), 3.55 (m, 1H, H-5), 2.73 (m, 2H, SCH2CH3), 2.18,

2.05, 1.97 (s, 9H, COCH3), 1.29 (t, 3H, J 7.6 Hz, SCH2CH3), 1.29 (d, 3H, J5,6 6.0 Hz, H-6). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.5, 170.4, 170.0 (COCH3), 82.2 (C-1), 75.2 (C-5), 72.2 (C-3), 71.0 (C-2),

70.7 (C-4), 25.9 (SCH2CH3), 21.0, 20.9, 20.9 (COCH3), 17.9, 15.2 (C-6, SCH2CH3)163. LRMS (ES+): Calcd. for C14H22O7SNa: 357.1; found: 357.0.

163 Spectral data was in accordance with previously published (Ref. 67)


— 93 —

Ethyl 2,3-O-isopropylidene-4-O-acetyl-1-thio-α-L-rhamnopyranoside (22) Per-acetylated α-thiorhamnoside (19α) (6.040 g, 18.0 mmol) was dissolved in dry MeOH (60 mL)

and a solution of sodium methoxide (1M in dry MeOH) (3 mL, 3 mmol) was added. The reaction

was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 3 h, TLC-analysis showed only one

spot corresponding to product, so the mixture was neutralized with Amberlite IR-120H, filtered and

concentrated to give the deprotected thiorhamnoside (20) as a clear oil. The crude product (3.977

g) was pure enough to be used without further purification.

Rf (EtOAc) 0.28. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.26 (s, 1H, H-1), 4.05-4.00 (m, 2H, H-2, H-5), 3.74 (dd, 1H,

J2,3 3.2 Hz, J3,4 9.2 Hz, H-3), 3.49 (t, 1H, J3,4 = J4,5 9.2 Hz, H-4), 2.62 (m, 2H, SCH2CH3), 1.32 (d,

3H, J5,6 6.4 Hz, H-6), 1.29 (t, 3H, J 7.2 Hz, SCH2CH3).

The crude mixture (20) was dissolved in dry acetone (25 mL) and it was placed on ice.

2,2-dimethoxypropane (3.3 mL, 26.9 mmol) and p-toluenesulfonic acid (0.155 g, 0.9 mmol) was

added. After 5 min, the ice-bath was removed and it was left to stir at rt under an atmosphere of

nitrogen. After 7 h, TLC-analysis still showed remaining starting material, so additional

2,2-dimethoxypropane (10 mL, 81.6 mmol) was added and the reaction was left overnight. After

20 h total, the mixture was neutralized by adding triethylamine (5 mL) and then concentrated to

give the partial protected thiorhamnoside (21). The crude product (5.129 g) was obtained as a

brown syrup and was used without further purification.

Rf (EtOAc/pentane 1:2) 0.50. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.51 (s, 1H, H-1), 4.17 (d, 1H, J2,3 5.8 Hz, H-2),

4.03 (dd, 1H, J2,3 5.8 Hz, J3,4 8.2 Hz, H-3), 3.97 (m, 1H, H-5), 3.45 (t, 1H, J3,4 = J4,5 8.2 Hz, H-4),

2.61 (m, 2H, SCH2CH3), 1.53, 1.35 (s, 6H, C(CH3)2), 1.33 – 1.28 (m, 6H, H-6, SCH2CH3).

The crude product (21) was dissolved in dry CH2Cl2 (30 mL) and acetic acid (2.55 mL, 27.0 mmol)

and triethylamine (3.75 mL, 27.1 mmol) was added. The reaction was left to stir at rt under an

atmosphere of nitrogen. After 1 h, a catalytic amount of DMAP was added. After 2 h total, the


— 94 —

mixture was diluted with CH2Cl2, washed with aq. HCl (0.5 M), washed with brine, dried (MgSO4),

filtered and concentrated. Recrystallization in Et2O/CH2Cl2/hexane gave the fully protected

thiorhamnoside (22) as white crystals (3.410 g, 65 % over three steps).

Rf (EtOAc/pentane 1:7) 0.64. Mp 108-111 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.54 (s, 1H, H-1), 4.91 (dd, 1H,

J3,4 8.0 Hz, J4,5 10.0 Hz, H-4), 4.19 (d, 1H, J2,3 5.6 Hz, H-2), 4.14 (dd, 1H, J2,3 5.6 Hz, J3,4 8.0 Hz,

H-3), 4.10-4.03 (m, 1H, H-5), 2.72-2.50 (m, 2H, SCH2CH3), 2.10 (s, 3H, COCH3), 1.57, 1.34 (s,

6H, C(CH3)2), 1.31 (t, 3H, J 7.2 Hz, SCH2CH3), 1.16 (d, 3H, J5,6 6 Hz). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.3

(COCH3), 110.0 (C(CH3)2), 79.7 (C-1), 77.0 (C-2), 75.8 (C-3), 75.0 (C-4), 64.8 (C-5), 27.9, 26.7

(C(CH3)2), 24.7 (SCH2CH3), 21.2 (COCH3), 17.2 (C-6), 14.9 (SCH2CH3). LRMS (ES+): Calcd. for

C13H22O5SNa: 313.1; found: 313.1164.

164 Spectral data was in accordance with previously published: Lowary, T. L.; Eichler, E.; Bundle, D. R., J. Org. Chem., 1995, 60, 7316-7327


— 95 —

Benzyl 2,3,4-tri-O-acetyl-1-seleno-α/β-L-rhamnopyranoside (24α/β) Rhamnosyl bromide (16) (247.4 mg, 0.70 mmol) was dissolved in dry acetone (4 mL). Potassium

selenocyanate (302.5 mg, 2.10 mmol) and 18-crown-6 (18.2 mg, 0.07 mmol) was added and the

mixture was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 3 h, TLC-analysis showed

remaining starting material, so additional potassium selenocyanate (100.2 mg, 0.70 mmol) was

added. After 24 h, the reaction was filtered and the filtrate was concentrated. It was dissolved in

CH2Cl2 and washed with water. The aqueous phase was extracted with CH2Cl2 and the combined

org. phases were washed with brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated to give the crude

rhamnosyl selenocyanate (23α/β) (281.7 mg) which was used without further purification.

The crude product (23α/β) was then dissolved in EtOH (99.9 %, 2 mL) and sodium borohydride

(40.2 mg, 1.06 mmol) was added on ice. After 10 min, the ice-bath was removed and the reaction

was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 1 h, benzyl bromide (0.17 mL, 1.43

mmol) was added and the mixture was left stirring at rt. After 15 min, TLC-analysis indicated full

conversion. The reaction was diluted with CH2Cl2 and washed with water. The aqueous phase

was extracted with CH2Cl2 and the combined org. phases were washed with brine, dried (MgSO4),

filtered and concentrated. Column chromatography (EtOAc/heptane 1:4 → 1:3), gave the benzyl

selenorhamnoside (24α/β) as a mixture of diastereoisomers (57.6 mg, 1:1 α/β, 19 % over two

steps). (Separation of the diastereoisomers was possible by column chromatography

(EtOAc/pentane 1:14))

24α (clear oil): Rf (EtOAc/pentane 1:2) 0.50. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.23-7.19 (m, 5H, Ar), 5.34 (d,

1H, J1,2 1.2 Hz, H-1), 5.30 (dd, 1H, J1,2 1.2 Hz, J2,3 3.2 Hz, H-2), 5.16 (dd, 1H, J2,3 3.2 Hz, J3,4 10.0

Hz, H-3), 5.03 (t, 1H, J3,4 = J4,5 10.0 Hz, H-4), 4.07 (m, 1H, H-5), 3.80 (AB-system, 2H, δA 3.82, δB

3.77, JA,B 12 Hz, SeCH2Ph), 2.05, 1.98, 1.90 (s, 9H, COCH3), 1.14 (d, 3H, J5,6 6.0 Hz, H-6). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.2, 170.1, 170.1 (COCH3), 138.5, 129.2, 128.8, 127.3 (Ar), 77.8 (C-1,

JC-1,H-1 172 Hz), 71.9 (C-2), 71.4 (C-4), 70.3 (C-3), 69.1 (C-5), 28.2 (SeCH2Ph), 21.1, 21.0, 20.9

(COCH3), 17.5 (C-6). [ ]296Dα : -141.6º (c 1.0, CHCl3).


— 96 —

24β (clear oil): Rf (EtOAc/pentane 1:2) 0.44. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.32-7.24 (m, 5H, Ar), 5.42 (d,

1H, J2,3 3.6 Hz, H-2), 5.07 (t, 1H, J3,4 = J4,5 10.0 Hz, H-4), 4.91 (dd, 1H, J2,3 3.6 Hz, J3,4 10.0 Hz,

H-3), 4.66 (s, 1H, H-1), 3.96 (AB-system, 2H, δA 4.00, δB 3.92, JA,B 12 Hz, SeCH2Ph), 3.35 (m, 1H,

H-5), 2.17, 2.03, 1.95 (s, 9H, COCH3), 1.27 (d, 3H, J5,6 6.0 Hz, H-6). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.4,

170.3, 170.0 (COCH3), 138.2, 129.2 128.9, 127.4 (Ar), 76.3 (C-5), 75.4 (C-1, JC-1,H-1 150 Hz), 72.0

(C-3), 71.6 (C-2), 70.7 (C-4), 27.5 (SeCH2Ph), 21.0, 20.9, 20.8 (COCH3), 17.9 (C-6). [ ]296Dα :

+90.0º (c 1.0, CHCl3).

HRMS (ES+): Calcd. for C19H24O780SeNa: 467.0585; found: 467.0585.


— 97 —

7.4.2 Ouabagenin

OHO

OHO

O

O

HO

OH

25

Ouabagenin 1,19-monoacetonide (25) Ouabain octahydrate (2) (1.016 g, 1.39 mmol) was dissolved in acetone (20 mL) containing HCl

(conc.) (0.1 mL). The mixture was left stirring at rt. After 3 days, precipitation had occurred. After 7

days, additional 0.1 mL HCl (conc.) was added and after 9 days, additional HCl (conc.) (0.1 mL)

was added. After a total of 13 days, the mixture was poured in a long test tube where the product

was allowed to precipitate. The liquid phase was removed with a pipette and the remaining solid

was washed with acetone and left to precipitate. This procedure was repeated three times with

acetone and once with CH2Cl2. The solid was then co-evaporated with toluene to give the acetal-

protected steroid (25) as a white powder (0.574 g, 86 %).

Rf (CH2Cl2/MeOH 9:1) 0.29. Mp 237-240 °C. 1H-NMR (DMSO-d6/acetone-d6 1:1): δ 5.91 (s, 1H,

H-22), 5.10 (br s, 1H, H-1), 4.88 (s, 2H, H-21a, H-21b), 4.72 (d, 1H, J 3.2 Hz, OH), 4.43 (d, 1H, J

2.8 Hz, OH), 4.29 (d, 1H, J19a,19b 12.0 Hz, H-19a), 4.13 (s, 1H, OH), 4.05 (br s, 1H, H-3), 3.98 (br s,

1 H, H-11), 3.65 (d, 1H, J19a,19b 12.0 Hz, H-19b), 3.02 (t, 1H, J17,16 8.1 Hz, H-17), 1.25, 1.24 (s, 6H,

H-25, H-26), 0.76 (s, 3H, H-18), 2.07-0.82 (m, 16H). 13C-NMR (DMSO-d6/acetone- d6 1:1): δ

175.5, 174.3 (C-20, C-23), 116.7 (C-22), 100.0 (C-24), 83.1 (C-13), 73.8 (C-21), 67.4, 66.4, 66.2

(C-1, C-3, C-11), 61.0 (C-19), 49.8, 49.0, 47.6, 47.0, 46.5, 37.6, 37.3, 33.6, 32.5, 26.7, 24.9, 24.5,

23.2, 18.1 (C-18)165. [ ]296Dα : +28.6˚ (c 1.0, DMSO). HRMS (ES+): Calcd. for C26H38O8Na:

501.2464; found: 501.2477.

165 Characterization of NMR-data was performed with help from published data on ouabain and ouabagenin: McIntyre, D. D.; Germann, M. W.; Vogel, H. J., Can. J. Chemistry, 1990, 68, 1263-1270


— 98 —

3-O-p-Toluenesulfonylouabagenin 1,19-monoacetonide (26) Oaubagenin monoacetonide (25) (85.0 mg, 0.18 mmol) was dissolved in dry pyridine (0.8 mL) and

it was placed on ice. Tosylic anhydride (113.0 mg, 0.35 mmol) and DMAP (cat.) was added. The

ice-bath was removed and it was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 7 days,

TLC-analysis still showed remaining starting material. Water was added and it was allowed to stir

for a few minutes. The mixture was diluted with CHCl3 and washed twice with sat. aq. NaHCO3

and with brine. The organic extract was dried (MgSO4), filtered and co-evaporated twice with

toluene. Purified by column chromatography (MeOH/CH2Cl2 1:39) to give the C-3-tosylated

product (26) as a white powder (18.1 mg, 16 %).

Rf (MeOH:CH2Cl2 1:9) 0.62. Mp 186-189 °C. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.74 (d, 2H, Jortho 8.2 Hz, Ar),

7.45 (d, 2H, Jortho 8.2 Hz, Ar), 5.90 (s, 1H, H-22), 5.12 (s, 1H, H-1), 4.90 (br s, 1H, H-3), 4.86 (s,

2H, H-21a, H-21b), 4.54 (d, 1H, J 4.8 Hz, OH), 4.19 (m, 2H, 2 OH), 4.18 (d, 1H, J19a,19b 12.0 Hz,

H-19a), 3.81 (br s, 1H, H-11), 3.64 (d, 1H, J19a,19b 12.0 Hz, H-19b), 2.85 (t, 1H, J16,17 7.6 Hz), 2.40

(s, 3H, SO2C6H4CH3), 1.23, 1.18 (s, 6H, H-25, H-26), 0.73 (s, 3H, H-18), 2.24-0.78 (m, 16H)165.

HRMS (ES+): Calcd. for C33H44O10SNa: 655.2553; found: 655.2563166.

166 It was not possible to measure optical rotation for this compound.


— 99 —

A by-product was also isolated (41.3 mg, 37 %). This was identified as a mono-tosylated

compound containing a double bond.

Rf (MeOH:CH2Cl2 1:9) 0.71. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.80 (d, 2H, Jortho 8.4 Hz, Ar), 7.31 (d, 2H, Jortho 8.4

Hz, Ar), 5.91 (s, 1H, H-22), 5.63 (d, 1H, JHC=CH 10.2 Hz, db-H), 5.52 (dd, 1H, JHC=CH 10.2 Hz, Jgem

1.2 Hz, db-H), 5.04 (br s, 1H), 4.92 (d, 1H, J21a,21b 17.8 Hz, H-21a), 4.76 (d, 1H, J21a,21b 17.8 Hz,

H-21b), 4.34 (br s, 1H), 4.28 (d, 1H, J19a,19b 12.0 Hz, H-19a), 4.02 (br s, 1H), 3.57 (d, 1H, J19a,19b

12.0 Hz, H-19b), 2.77 (t, 1H, J16,17 7.2 Hz, H-17), 2.43 (s, 3H, SO2C6H4CH3), 2.26 (d, 1H, J 16.0

Hz), 2.09 (dd, 1H, J 3.6 Hz, J 16.0 Hz), 1.96-1.37 (m, 11H), 1.31, 1.30 (s, 6H, H-25, H-26), 1.01

(dq, 1H, J 4.5 Hz, J 9.1 Hz), 0.90 (s, 3H, H-18)165. HRMS (ES+): Calcd. for C33H42O9SNa:

637.2447; found: 637.2457


— 100 —

3-Ouabagenone 1,19-monoacetonide (27) Ouabagenin monoacetonide (25) (73.0 mg, 0.15 mmol) was suspended in CH2Cl2 (1-2 mL) and

freshly prepared Dess-Martin periodinane (79.0 mg, 0.19 mmol) was added. It was left to stir at 0

°C and allowed to heat to rt. After 1 h 15 min, more Dess-Martin periodinane was added (12.9 mg,

0.030 mmol). After a total of 1.5 h, the reaction was quenched by addition of sat. aq. Na2S2O3 and

sat. aq. NaHCO3 and it was stirred vigorously. The mixture was diluted with EtOAc and washed

with water. Extraction with EtOAc. The combined org. phases were washed with water and brine,

then dried (MgSO4), filtered and concentrated. Column chromatography (MeOH/CH2Cl2 1:39 →

1:32 → 1:24) gave the ketone (27) as a white powder (9.8 mg, 14 %).

Rf (MeOH/CH2Cl2 1:9) 0.41. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.85 (s, 1H, H-22), 4.95 (s, 1H, OH), 4.90 (s, 1H,

H-1), 4.83 (d, 1H, J21a,21b 18.2 Hz, H-21a), 4.72 (d, 1H, J21a,21b 18.2 Hz, H-21b), 4.55 (d, 1H, J19a,19b

12.4 Hz, H-19a), 4.22 (d, 1H, J19a,19b 12.4 Hz, H-19b), 4.21 (d, 1H, J 10.8 Hz, OH), 3.99 (br s, 1H,

H-11), 2.64 (t, 1H, J16,17 8.4 Hz, H-17), 2.32 (d, 1H, J 12.8 Hz), 2.20 (dd, 1H, J 13.2 Hz, J 15.6 Hz),

2.14-1.19 (m, 15H), 1.33 (s, 6H, H-25, H-26), 0.80 (s, 3H, H-18)165. HRMS (ES+): Calcd. for

C26H36O8Na: 499.2308; found: 499.2305


— 101 —

11-Dehydro-3-ouabagenone 1,19-monoacetonide (28) This compound was formed as a by-product and was isolated (5.5 mg, 8 %), but was only

analyzed by LRMS.

Rf (MeOH/CH2Cl2 1:9) 0.54. LRMS (ES+): Calcd. for C26H34O8Na: 497.2; found: 497.2


— 102 —

7.5 Digitoxin

3-Digitoxigenone (30) Digitoxin (3) (298.9 mg, 0.39 mmol) was dissolved in acetone (10 mL) and it was placed on ice.

Chromium(VI)oxide (633.1 mg, 6.33 mmol) was dissolved in water (3 mL) and H2SO4 (conc.) (0.55

mL, 10.32 mmol) was added. This mixture was slowly added to the solution of digitoxin and the

reaction was left to stir at rt. After 5 h, MeOH (1-2 mL) was added and the solution was stirred for

~15 min. Water was added and the mixture was extracted repeatedly with CH2Cl2. The combined

org. phases were washed with sat. aq. NaHCO3, brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated to

give the oxidized steroid (30) as a white foam (94.5 mg, 65 %).

Rf (pentane/EtOAc 1:3) 0.39. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.88 (s, 1H, H-22), 4.99 (dd, 1H, J17,21a 1.2 Hz,

Jgem 17.8 Hz, H-21a), 4.81 (dd, 1H, J17,21b 1.6 Hz, Jgem 17.8 Hz, H-21b), 2.79 (m, 1H, H-17), 2.62 (t,

1H, J 14.0 Hz), 2.33 (dt, 1H, J 5.2 Hz, 14.0 Hz), 2.20-1.25 (m, 19H), 1.02 (s, 3H, CH3), 0.90 (s,

3H, CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 212.7 (C-3), 174.7, 174.6 (C-20, C-23), 118.0 (C-22), 85.5 (C-14),

73.7 (C-21), 51.0, 49.8 (C-13, C-17), 43.8, 42.3, 41.8, 40.0, 37.3, 36.9, 36.8, 35.4, 33.4, 27.1,

26.7, 22.8, 21.4, 21.2, 16.0167. HRMS (ES+): Calcd. for C23H32O4Na: 395.2198; found: 395.2191.

167 Characterization of NMR-data was performed with help from published data on digitoxin and digitoxigenin: Drakenberg, T.; Brodelius, P.; McIntyre, D. D.; Vogel, H. J., Can. J. Chemistry, 1990, 68, 272-277


— 103 —

O

O

OH

31OH

3-Epi-digitoxigenin (31) Digitoxigenone (30) (94.5 mg, 0.25 mmol) was dissolved in dioxane (7 mL) and water (1 mL) and

the solution was placed on ice. Sodium borohydride (24.2 mg, 0.64 mmol) was added and the

mixture was left to stir at rt. After 30 min, the reaction mixture was diluted with CH2Cl2 and washed

with water. The aqueous phase was extracted again with CH2Cl2 and the combined org. phases

were washed with brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated. Purified by column

chromatography (pentane/EtOAc 1:1 → EtOAc) to give the required equatorial alcohol (31) (63.8

mg, 68 %).

Rf (pentane/EtOAc 1:4) 0.22. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.81 (s, 1H, H-22), 4.92 (d, 1H, Jgem 18.4 Hz,

H-21a), 4.74 (dd, 1H, J17,21b 2.0 Hz, Jgem 18.4 Hz, H-21b), 3.59 (m, 1H, H-3), 2.72 (m, 1H, H-17),

2.10-0.92 (m, 21H), 0.85 (s, 3H, CH3), 0.80 (s, 3H, CH3)167. HRMS (ES+): Calcd. for C23H34O4Na:

397.2355; found: 397.2353.


— 104 —

Digitoxigenin (29)

This was obtained as a by-product and isolated (5.5 mg, 6 %).


Jgem 18.0 Hz, H-21a), 4.74 (dd, 1H, J17,21b 1.6 Hz, Jgem 18.0 Hz, H-21b), 3.86 (s, 1H, H-3), 2.60 (m,

1H, H-17), 1.95-1.04 (m, 21H), 0.74 (s, 3H, CH3), 0.66 (s, 3H, CH3)167. HRMS (ES+): Calcd. for

C23H34O4Na: 397.2355; found: 397.2356


— 105 —

O

O

OH

32OTs

3-Epi-O-p-toluenesulfonyldigitoxigenin (32) 3-Epi-digitoxigenin (31) (63.8 mg, 0.17 mmol) was dissolved in dry pyridine (2 mL). The solution

was placed on ice and tosylic anhydride (113.0 mg, 0.35 mmol) and DMAP (cat.) was added. The

mixture was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 22 h, analysis by TLC showed

remaining starting material, so additional tosylic anhydride (30.1 mg, 0.09 mmol) and DMAP was

added. TLC-analysis after 45 h still showed an incomplete reaction, so again more tosylic

anhydride (37.4 mg, 0.11 mmol) was added. After 49 h, TLC-analysis showed no further change.

Water (1-2 mL) was added and it was left to stir for 10-15 min. The solution was diluted with

CH2Cl2 and washed twice with sat. aq. NaHCO3. The combined aq. phases were extracted with

CH2Cl2 and the combined org. phases were dried (MgSO4), filtered and concentrated. The

resulting residue was co-evaporated three times with toluene, to give the tosylated product (32) as

a white foam (101.3 mg crude).

Rf (pentane/EtOAc 1:2) 0.59. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.78 (d, 2H, Jortho 8.4 Hz, Ar), 7.33 (d, 2H, Jortho

8.4 Hz, Ar), 5.85 (s, 1H, H-22), 4.98 (dd, 1H, J17,21a 1.6 Hz, Jgem 18.4 Hz, H-21a), 4.74 (dd, 1H,

J17,21b 2.0 Hz, Jgem 18.4 Hz, H-21b), 4.44 (sp, 1H, J 6.4 Hz, H-3), 2.76 (m, 1H, H-17), 2.44 (s, 3H,

SO2C6H4CH3), 2.18-0.92 (m, 21H), 0.87 (s, 3H, CH3), 0.84 (s, 3H, CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ

175.0, 174.8 (C-20, C-23), 144.8, 134.7, 130.0, 127.8 (Ar), 117.8 (C-22), 85.5 (C-14), 83.0 (C-3),

73.7 (C-21), 51.0, 49.8 (C-13, C-17), 41.9, 41.8, 40.0, 36.3, 34.9, 34.8, 33.3, 33.2, 27.9, 27.1,

26.9, 23.2, 21.9, 21.5, 21.1, 16.0167. HRMS (ES+): Calcd. for C30H40O6SNa: 551.2443; found:

551.2456


— 106 —

1

3

11

582

4 6 7

910 OH

MeSe

O

O

121314 15

1617

18

19

2021

22

23

3-Methylselenyldigitoxigenin (33) Sodium borohydride (16.9 mg, 0.45 mmol) was suspended in dry THF (2 mL) and dimethyl

diselenide (21 µL, 0.22 mmol) was added. EtOH (99.9 %, 0.5 mL) was added slowly and the

solution was stirred at rt. After 5 min, the yellow color of the solution had disappeared and it was

added to the tosylated 3-epi-digitoxigenin (32) (101.3 mg crude). The reaction mixture was left to

stir at reflux under an atmosphere of nitrogen. After 2h, TLC-analysis showed only ~50 %

conversion of starting material, so a new solution of sodium borohydride (8.7 mg, 0.23) and

dimethyl diselenide (10.5 µL, 0.11 mmol) in dry THF (1 mL) and EtOH (99.9 %, 0.25 mL) was

added. After 3.5 h, TLC-analysis showed a high degree of formation of by-product, so the mixture

was diluted with CH2Cl2, washed with water and brine. The organic phase was dried (MgSO4),

filtered and concentrated. Column chromatography (EtOAc/pentane 1:2) gave the desired product

(33) as a white powder (38.6 mg, 50 % over two steps).


Jgem 18.4 Hz, H-21a), 4.80 (dd, 1H, J17,21b 1.6 Hz, Jgem 18.4 Hz, H-21b), 3.39 (s, 1H, H-3), 2.77 (m,

1H, H-17), 1.96 (s, 3H, SeCH3), 2.19-1.18 (m, 21H), 0.95 (s, 3H, CH3), 0.86 (s, 3H, CH3). 13C-NMR

(CDCl3): δ 174.8, 174.8 (C-20, C-23), 117.9 (C-22), 85.8 (C-14), 73.7 (C-21), 51.1, 49.8 (C-13,

C-17), 42.2, 41.9, 40.2, 38.4, 36.4, 36.0, 33.4, 33.3, 32.2, 27.1, 27.0, 26.7, 23.9, 21.9, 21.2, 16.0,

4.4 (SeCH3)167. HRMS (ES+): Calcd. for C24H36O380SeK: 491.1467; found: 491.1464


— 107 —

17-Epi-3-methylselenyldigitoxigenin (34) This compound was formed as a by-product (11.5 mg, 15 %). It was isolated and identified.


Jgem 17.6 Hz, H-21a), 4.71 (d, 1H, Jgem 17.6 Hz, H-21b), 3.40 (s, 1H, H-3), 3.19 (m, 1H, H-17), 1.97

(s, 3H, SeCH3), 2.19-1.15 (m, 21H), 1.03 (s, 3H, CH3), 0.96 (s, 3H, CH3)167. HRMS (ES+): Calcd.

for C24H36O380SeNa: 475.1727; found: 475.1755


— 108 —

7.6 Glycosyl donors

36

O

AcHNAcO

AcO

OAc

Cl

2-Acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranosyl chloride (36)168 N-acetyl-D-glucosamine (35) (5.027 g, 22.7 mmol) was added to acetyl chloride (14.0 mL, 196.9

mmol), and the mixture was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 2.5 h, the solid

was completely dissolved and the mixture was spontaneously refluxing. After 3 days, the reaction

was diluted with CHCl3, poured into ice-water and stirred vigorously for 2 min. The phases were

separated and the organic layer was drawn off into ice/sat. aq. NaHCO3. This was repeated until

neutrality was obtained. The organic layer was dried (MgSO4), filtered and concentrated.

Recrystallization in CH2Cl2/dry Et2O. Crystals filtered, washed with dry Et2O and concentrated to

give the glycosyl chloride (36) as white crystals (5.655 g, 68 %). Filtrate concentrated and purified

by column chromatography (EtOAc/pentane 1:1). (517 mg, 6 % total yield 74 %).

Rf (EtOAc) 0.59. Mp 124-126 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 6.16 (d, 1H, J1,2 3.8 Hz, H-1), 5.92 (d, 1H,

JNH,2 8.6 Hz, NH), 5.30 (t, 1H, J2,3 = J3,4 10.4 Hz, H-3), 5.18 (t, 1H, J3,4 = J4,5 10.4 Hz, H-4), 4.51

(ddd, 1H, J1,2 3.8 Hz, JNH,2 8.6 Hz, J2,3 10.4 Hz, H-2), 4.28-4.24 (m, 2H, H-5, H-6a), 4.11 (d, 1H,

J6a,6b 10.4 Hz, H-6b), 2.07, 2.02, 2.02, 1.96 (s, 12H, COCH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 171.6, 170.8,

170.4, 169.3 (COCH3), 93.9 (C-1), 71.1 (C-5), 70.3 (C-3), 67.2 (C-4), 61.4 (C-6), 53.7 (C-2), 23.2,

20.9, 20.9, 20.7 (COCH3). LRMS (ES+): Calcd. for C14H20O8NClNa: 388.1; found: 388.0169.

168 This experiment was performed according to previously published procedure (Ref. 137) 169 Spectral data was in accordance with previously published: Bouvet, V. R.; Ben, R. N., J. Org. Chem., 2006, 71, 3619-3622


— 109 —

Phenyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-1-thio-β-D-glucopyranoside (37) Glycosyl chloride (36) (5.483 g, 15.0 mmol) was dissolved in dry MeCN (60 mL). Thiophenol (1.8

mL, 17.6 mmol) and triethylamine (4.2 mL, 30.1 mmol) was added. The reaction was left to stir at

rt under an atmosphere of nitrogen. After 2 h, TLC-analysis showed full conversion of starting

material. The mixture was diluted with CH2Cl2, washed with aq. HCl (0.5 m), water, brine, dried

(MgSO4), filtered and concentrated. Column chromatography (CH2Cl2/EtOAc 1:1 → 1:2 → 1:4 →

EtOAc) gave the phenyl thioglycoside (37) as a white solid (5.197 g, 80 %).

Rf (EtOAc/CH2Cl2 1:3) 0.46. Mp 205-206 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.51-7.48 (m, 2H, Ar), 7.30-7.29

(m, 3H, Ar), 5.58 (d, 1H, JNH,2 9.6 Hz, NH), 5.22 (t, 1H, J2,3 = J3,4 9.6 Hz, H-3), 5.05 (t, 1H, J3,4 = J4,5

9.6 Hz, H-4), 4.85 (d, 1H, J1,2 9.6 Hz, H-1), 4.21 (dd, 1H, J5,6a 5.4 Hz, J6a,6b 12.2 Hz, H-6a), 4.16

(dd, 1H, J5,6b 2.6 Hz, J6a,6b 12.2 Hz, H-6b), 4.02 (q, 1H, J1,2 = JNH,2 = J2,3 9.6 Hz, H-2), 3.72 (ddd, 1H,

J5,6b 2.6 Hz, J5,6a 5.4 Hz, J4,5 9.6 Hz, H-5) 2.07, 2.02, 2.01, 1.98 (s, 12H, COCH3). 13C-NMR

(CDCl3): δ 171.2, 170.8, 170.2, 169.5 (COCH3), 132.7, 129.1, 128.3, (Ar), 86.9 (C-1), 76.0 (C-5),

73.9 (C-3), 68.6 (C-4), 62.6 (C-6), 53.6 (C-2), 23.6, 21.0, 20.9, 20.8 (COCH3). LRMS (ES+):

Calcd. for C20H25O8NSNa: 462.1; found: 462.1170.

170 Spectral data was in accordance with previously published (Ref. 138)


— 110 —

Phenyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-1-thio-β-D-glucopyranoside (39) The acetyl-protected thiophenyl glycoside (37) (3.629 g, 8.26 mmol) was suspended in dry MeOH

(50 mL) and sodium methoxide (0.5 M in MeOH) (2 mL, 1.00 mmol) was added and it was allowed

to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. After 10 min, violent precipitation occurred. NMR of a

small sample of the reaction mixture showed completed reaction. Mixture concentrated and

co-evaporated several times with toluene to give the deprotected thioglycoside (38) as a white

solid (2.816 g crude). This was pure enough for further reaction.

Rf (MeOH/EtOAc 1:2) 0.57. 1H-NMR (D2O): δ 7.50-7.48 (m, 2H, Ar), 7.31-7.23 (m, 3H, Ar), 4.78 (d,

1H, J1,2 10.4 Hz, H-1), 3.87 (dd, 1H, J5,6a 2.4 Hz, J6a,6b 12.4 Hz, H-6a), 3.76 (dd, 1H, J2,3 9.6 Hz, J1,2

10.4 Hz, H-2), 3.68 (dd, J5,6b 5.6 Hz, J6a,6b 12.4 Hz, H-6b), 3.49-3.32 (m, 3H, H-3, H-4, H-5), 1.99

(COCH3).

The deprotected thioglycoside (38) (2.816 g crude) was dissolved in dry DMF (35 mL) and it was

placed on ice. Sodium hydride (60 % in mineral oil) (999.6 g, 25.0 mmol) was added and benzyl

bromide (3.9 mL, 32.8 mmol) was added slowly. Left to stir under an atmosphere of nitrogen and

allowed to heat to rt. TLC-analysis after 22 h, indicated incomplete reaction. Additional sodium

hydride (60 % in mineral oil) (328.9 mg, 8.22 mmol) was added. After 5 days total, the reaction

was worked up. It was diluted with EtOAc and water was added. Violent precipitation. The

aqueous phase was removed and the organic phase was filtered. The precipitated product was

washed repeatedly with water and then co-evaporated several times with toluene. The organic

filtrate was washed alternately with water and brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated. The

combined crude mixture was purified by column chromatography (EtOAc/CH2Cl2 5:95 → 6:94 →

7:93 → 8:92) to give the benzylated thioglycoside (39) as a white solid (3.854 g, 80 % over two

steps).

Rf (EtOAc/pentane 1:1.5) 0.31. Mp 177-181 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.52-7.49 (m, 2H, Ar), 7.34-

7.21 (m, 18H, Ar), 5.35 (d, 1H, JNH,2 8.4 Hz, NH), 5.05 (d, 1H, J1,2 10.0 Hz, H-1), 4.83 (d, 1H, Jgem

12.0 Hz, OCH2Ph), 4.80 (d, 1H, Jgem 12.0 Hz, OCH2Ph), 4.64 (d, 1H, Jgem 12.0 Hz, OCH2Ph), 4.61


— 111 —

(d, 1H, Jgem 12.0 Hz, OCH2Ph), 4.60 (d, 1H, Jgem 12.0 Hz, OCH2Ph), 4.53 (d, 1H, Jgem 12.0 Hz,

OCH2Ph), 3.99 (t, 1H, J2,3 = J3,4 9.2 Hz, H-3), 3.79 (dd, 1H, J5,6a 2.0 Hz, J6a,6b 11.2 Hz, H-6a), 3.74

(dd, 1H, J5,6b 4.4 Hz, J6a,6b 11.2 Hz, H-6b), 3.66-3.58 (m, 3H, H-2, H-4, H-5), 1.87 (s, 3H, COCH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.5 (COCH3), 138.5, 138.3, 133.6, 132.2, 129.1-127.7 (Ar), 85.9 (C-1), 82.5

(C-3), 79.4, 78.8 (C-3, C-4), 75.1, 75.0, 73.7 (OCH2Ph), 69.3 (C-6), 55.6 (C-2), 23.8 (COCH3).

[ ]296Dα : +14.5° (c 1.0, CHCl3). HRMS (ES+): Calcd. for C35H37O5NSNa: 606.2290; found:

606.2301.


— 112 —

7.7 Glycosylations

General procedure for coupling of glycosyl donor with various acceptors

Donor (37 or 39) (100 or 200 mg, 1 eq), N-iodosuccinimide (2 or 2.5 eq) and M(OTf)x (0.15 eq)

was dissolved in dry CH2Cl2. Acceptor (1-octanol or (-)-menthol) added. Left to stir at reflux (in the

case of 37) or at rt (in the case of 39) under an atmosphere of nitrogen. When reaction had gone

to completion the mixture was dissolved with CH2Cl2, washed with aq. NasS2O3/NaHCO3, brine,

dried (MgSO4), filtered and concentrated. Products purified by column chromatography in an

EtOAc/pentane-mixture.

n-Octyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (42) White solid. Rf (pentane/EtOAc 1:2) 0.27. Mp 124-126 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.97 (d, 1H, JNH,2

8.8 Hz, NH), 5.27 (dd, 1H, J2,3 9.2 Hz, J3,4 10.2 Hz, H-3), 5.01 (t, 1H, J3,4 = J4,5 10.2 Hz, H-4), 4.66

(d, 1H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.22 (dd, 1H, J5,6a 4.8 Hz, J6a,6b 12.2 Hz, H-6a), 4.08 (dd, 1H, J5,6b 2.4 Hz,

J6a,6b 12.2 Hz, H-6b), 3.82-3.76 (m, 2H, H-2, OCH2), 3.68 (ddd, 1H, J5,6b 2.6 Hz, J5,6a 5.4 Hz, J4,5

10.2 Hz, H-5), 3.43 (dt, 1H, Jgem 9.6 Hz, Jvic 6.8 Hz, OCH2), 2.03, 1.98, 1.97, 1.89 (s, 12H,

COCH3), 1.51 (br s, 2H, OCH2CH2), 1.20 (br s, 10 H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 0.82 (t, 3H, JCH2,CH3 7.0

Hz, O(CH2)7CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 171.0, 170.9, 170.5, 169.6 (COCH3), 100.9 (C-1), 72.7

(C-3), 71.9 (C-5), 70.1 (OCH2), 69.1 (C-4), 62.5 (C-6), 54.9 (C-2), 32.0, 29.6, 29.5, 29.4, 26.0 (5

CH2), 23.4 (COCH3) 22.8 (1 CH2), 20.9, 20.9, 20.8 (COCH3), 14.3 (O(CH2)7CH3). LRMS (ES+):

Calcd. for C22H37O9NNa: 482.2; found: 482.2171.

171 Spectral data in accordance with previously published: Iglesias-Guerra, F.; Romero, I.; Alcudia, F.; Vega-Pérez, J. M., Carbohyd. Res., 1998, 308, 57-62


— 113 —

(-)-Menthyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (43) White solid. Rf (pentane/EtOAc 1:2) 0.30. Mp 201-204 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 5.53 (d, 1H, JNH,2

8.8 Hz, NH), 5.40 (dd, 1H, J3,4 9.6 Hz, J2,3 10.8 Hz, H-3), 5.01 (t, 1H, J3,4 = J4,5 9.6 Hz, H-4), 4.79

(d, 1H, J1,2 8.4 Hz, H-1), 4.17 (dd, 1H, J5,6a 5.6 Hz, J6a,6b 11.8 Hz, H-6a), 4.10 (dd, 1H, J5,6b 2.8 Hz,

J6a,6b 11.8 Hz, H-6b), 3.71-3.62 (m, 2H, H-2, H-5), 3.39 (dt, 1H, J1’,6’e 4.4 Hz, J1’,2’ = J1’,6’a 10.8 Hz,

H-1’), 2.22 (dsp, 1H, J2’,7’ 2.4 Hz, J7’,CH3 6.8 Hz, H-7’), 2.04, 2.01, 2.01, 1.93 (s, 12H, COCH3), 1.89

(m, 1H, H-6’e), 1.64-1.60 (m, 2H, H-3’e, H-4’e), 1.33 (m, 1H, H-5’), 1.18 (m, 1H, H-2’), 0.96-0.75

(m, 3H, H-3’a, H-4’a, H-6’a) 0.89 (d, 3H, JCH,CH3 6.8 Hz, CH3), 0.85 (d, 3H, JCH,CH3 7.2 Hz, CH3),

0.72 (d, 3H, JCH,CH3 7.2 Hz, CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.9, 170.8, 170.3, 169.7 (COCH3), 98.3

(C-1), 78.7 (C-1’), 72.5 (C-3), 71.5 (C-5), 69.4 (C-4), 62.8 (C-6), 55.6 (C-2), 47.7 (C-2’) 40.9 (C-6’),

34.4 (C-3’ or C-4’), 31.6 (C-5’), 25.1 (C-7’), 23.5 (COCH3), 23.1 (C-3’ or C-4’), 22.4 (CH3), 21.1

(CH3), 20.9, 20.8, 20.8 (COCH3), 15.5 (CH3) 172. LRMS (ES+): Calcd. for C24H39O9NNa: 508.2523;

found: 508.2517173.

172 Characterization of NMR-data was performed with help from published data on menthol: a) Hurd, R. E.; John, B. K., J. Magn. Reson., 1991, 92, 658-668 b) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c4/Menthol_Proton_Spectrum.jpg 173 Spectral data in accordance with previously published: Zemlyakov, A. E.; Kur’yanov, V. O.; Sidorova, E. A.; Chirva, V. Y., Russ. J. Bioorg. Chem.+, 1998, 24, 551-558


— 114 —

n-Octyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (44) White solid. Rf (pentane/EtOAc 1:1) 0.55. Mp 115-118 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.35-7.19 (m, 15H,

Ar), 5.56 (d, 1H, JNH,2 8.0 Hz, NH), 4.82 (d, 1H, Jgem 11.4 Hz, OCH2Ph), 4.82 (d, 1H, J1,2 8.0 Hz,

H-1), 4.78 (d, 1H, Jgem 11.4 Hz, OCH2Ph), 4.67 (d, 1H, Jgem 11.4 Hz, OCH2Ph), 4.62 (d, 1H, Jgem

12.2 Hz, OCH2Ph), 4.58 (d, 1H, Jgem 11.4 Hz, OCH2Ph), 4.55 (d, 1H, Jgem 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.13

(dd, 1H, J2,3 8.0 Hz, J3,4 9.6 Hz, H-3), 3.85 (dt, 1H, Jvic 6.8 Hz, Jgem 9.6 Hz, OCH2(CH2)6CH3), 3.77

(dd, 1H, J5,6a 2.4 Hz, J6a,6b 11.0 Hz, H-6a), 3.72 (dd, 1H, J5,6b 4.4 Hz, J6a,6b 11.0 Hz, H-6b),

3.65-3.58 (m, 2H, H-4, H-5), 3.45 (dt, 1H, Jvic 6.8 Hz, Jgem 9.6 Hz, OCH2(CH2)6CH3), 3.38 (q, 1H,

J1,2 = J2,3 = JNH,2 8.0 Hz, H-2), 1.85 (s, 3H, COCH3), 1.56 (br s, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 1.26 (br

s, 10 H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 0.88 (t, 3H, JCH2,CH3 6.4 Hz, O(CH2)7CH3). 13C-NMR (CDCl3): δ

170.5, (COCH3), 138.8, 138.5, 138.3, 128.7-127.8, 100.0 (C-1), 80.6 (C-3), 79.0, 75.0 (C-4, C-5),

74.8, 74.8, 73.7 (OCH2Ph), 69.9 (OCH2(CH2)6CH3), 69.3 (C-6), 57.4 (C-2), 32.1, 29.8, 29.6, 29.5,

26.2 (5 CH2), 23.8 (COCH3) 22.9 (1 CH2), 14.3 (O(CH2)7CH3). [ ]296Dα : +14.2° (c 1.0, CHCl3).

HRMS (ES+): Calcd. for C37H49O6NNa: 626.3458; found: 626.3453.

This compound was also formed in the following experiment:

The tri-O-benzylated pentenyl glycoside (41) (96.0 mg, 0.17 mmol), N-iodosuccimide (78.4 mg,

0.35 mmol) and Sc(OTf)3 (12.9 mg, 0.026 mmol) was dissolved in dry CH2Cl2 (2 mL). Diphenyl

disulfide (18.9 mg, 0.086 mmol) and 1-octanol (14 μL, 0.088 mmol) was added and the mixture

was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen. Work-up and purification as described in

“General procedure for coupling of glycosyl donor with various acceptors”. Yield: 29 %.


— 115 —

(-)-Menthyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (45) Yellow oil. Rf (pentane/EtOAc 1:2) 0.29. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.19-7.11 (m, 15H, Ar), 5.53 (d, 1H,

JNH,2 7.2 Hz, NH), 4.95 (d, 1H, J1,2 8.4 Hz, H-1), 4.85 (d, 1H, J 12.0 Hz, OCH2Ph), 4.81 (d, 1H, J

11.2 Hz, OCH2Ph), 4.67 (d, 1H, J 12.0 Hz, OCH2Ph), 4.64 (d, 1H, J 11.2 Hz, OCH2Ph), 4.62 (d,

1H, J 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.54 (d, 1H, J 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.33 (dd, 1H, J2,3 8.8 Hz, J3,4 9.6 Hz,

H-3), 3.75 (dd, 1H, J5,6a 4.2 Hz, J6a,6b 11.0 Hz, H-6a), 3.69 (dd, 1H, J5,6b 1.8 Hz, J6a,6b 11.0 Hz,

H-6b), 3.62 (t, 1H, J3,4 = J4,5 9.6 Hz, H-4), 3.51 (ddd, 1H, J5,6b 1.8 Hz, J5,6a 4.2 Hz, J4,5 9.6 Hz, H-5),

3.42 (dt, 1H, J1’,6’e 4.4 Hz, J1’,2’ = J1’,6’a 10.8 Hz, H-1’), 3.13 (m, 1H, H-2), 2.31 (dsp, 1H, J2’,7’ 2.8 Hz,

J7’,CH3 7.2 Hz, H-7’), 1.93 (m, 1H, H-6’e), 1.84 (s, 3H, COCH3), 1.64-1.61 (m, 2H, H-3’e, H-4’e),

1.32 (m, 1H, H-5’), 1.18 (m, 1H, H-2’), 0.97-0.74 (m, 3H, H-3’a, H-4’a, H-6’a) 0.89 (d, 3H, JCH,CH3

6.0 Hz, CH3), 0.88 (d, 3H, JCH,CH3 7.2 Hz, CH3), 0.79 (d, 3H, JCH,CH3 6.8 Hz, CH3). 13C-NMR (CDCl3):

δ 170.6 (COCH3), 139.0, 138.6, 138.5, 128.6-127.7 (Ar), 97.5 (C-1), 80.7 (C-3), 79.4 (C-4), 78.3

(C-1’), 75.0 (C-5, 2 OCH2Ph), 73.9 (OCH2Ph), 69.5 (C-6), 58.8 (C-2), 48.1 (C-2’) 41.1 (C-6’), 34.6

(C-3’ or C-4’), 31.6 (C-5’), 25.3 (C-7’), 23.8 (COCH3), 23.3 (C-3’ or C-4’), 22.5 (CH3), 21.3 (CH3),

16.0 (CH3)172. [ ]296Dα : -5.6º (c 1.0, CHCl3). HRMS (ES+): Calcd. for C39H51O6NNa: 652.3614;

found: 652.3611.


— 116 —

7.8 Pentenyl glycoside

4-Pentenyl 2-acetamido-6-O-trityl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (46) Per-acetylated pentenyl glycoside (40) (1.203 g, 2.9 mmol) was dissolved in dry MeOH (15 mL).

Sodium methoxide (1 M in MeOH) (0.2 mL, 0.2 mmol) was added and it was left to stir at rt under

an atmosphere of nitrogen. After 1 h, TLC-analysis showed complete conversion and the reaction

mixture was concentrated by evaporation to give the fully deprotected glycoside (951.7 mg crude),

which was pure enough for further use.

Rf (MeOH/EtOAc 1:3) 0.58. 1H-NMR (D2O): δ 5.91 (m, 1H, CH=CH2), 5.11-5.03 (m, 2H, CH=CH2),

4.53 (d, J1,2 8.4 Hz, H-1), 3.96-3.45 (m, 8H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6a, H-6b, OCH2), 2.11 (m, 2H,

CH2CH=CH2), 2.06 (s, 3H, COCH3), 1.67 (m, 2H, OCH2CH2).

The crude product was dissolved in dry pyridine (10 mL) and triphenylmethyl chloride (1.205 mg,

4.3 mmol) was added. The reaction mixture was left to stir at rt under an atmosphere of nitrogen.

After 23 h, TLC-analysis showed remaining starting material, so DMAP (25.4 mg, 0.21 mmol) was

added. TLC-analysis still showed starting material after 50 h, so additional triphenylmethyl chloride

(407.9 mg, 1.5 mmol) was added. After 54 h, the reaction mixture was poured into ice-water and it

was extracted three times with CH2Cl2. The combined org. layers were washed with sat. aq.

NaHCO3, brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated. The resulting residue was

co-evaporated three times with toluene. Purified by column chromatography (EtOAc →

MeOH/EtOAc 1:14 → 1:9 → 1:4) to give the 6-tritylated product (46) as a white foam (1.280 g, 83

% over two steps).

Rf (MeOH/EtOAc 1:9) 0.46. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.49-7.17 (m, 15H, Ar), 6.44 (d, 1H, JNH,2 6.8 Hz,

NH), 5.81 (m, 1H, CH=CH2), 5.19 (d, 1H, J 4.0 Hz, OH), 5.03 (dd, 1H, Jgem 1.2 Hz, Jvic,trans 17.2 Hz,

CH=CH2 (trans)), 4.96 (dd, 1H, Jgem 1.2 Hz, Jvic,cis 10.4 Hz, CH=CH2 (cis)), 4.49 (d, J1,2 8.4 Hz,

H-1), 3.93 (dt, 1H, Jvic 6.8 Hz, Jgem 9.4 Hz, OCH2), 3.71 (s, 1H, OH), 3.55 (dt, 1H, Jvic 7.2 Hz, Jgem

9.4 Hz, OCH2), 3.65-3.29 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6a, H-6b), 2.11 (m, 2H, CH2CH=CH2),


— 117 —

1.95 (s, 3H, COCH3), 1.74 (m, 2H, OCH2CH2). 13C-NMR (CDCl3): δ 172.6 (COCH3), 144.1 (Ar),

138.2 (CH=CH2), 129.0, 128.1, 127.3 (Ar), 115.3 (CH=CH2), 100.7 (C-1), 86.9 (CPh3), 75.1, 75.0,

72.2 (C-3, C-4, C-5), 69.0 (OCH2), 64.1 (C-6), 57.6 (C-2), 30.4 (CH2CH=CH2), 29.0 (OCH2CH2),

23.8 (COCH3). [ ]296Dα : -48.6º (c 1.0, CHCl3). HRMS (ES+): Calcd. for C32H37O6NNa: 554.2519;

found: 554.2503.


— 118 —

4-Pentenyl 2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-6-O-trityl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (47) The monotritylated glycoside (46) (1.127 g, 2.12 mmol) was dissolved in dry DMF (13 mL) and it

was placed on ice. Sodium hydride (60 % in mineral oil) (252.2 mg, 6.30 mmol) was added and

benzyl bromide (1.00 mL, 8.42 mmol), was added slowly and the reaction mixture was left to stir

under an atmosphere of nitrogen. After 44 h, TLC-analysis showed full conversion. The mixture

was diluted with EtOAc and it was washed alternately with water and brine. The organic phase

was dried (MgSO4), filtered and concentrated. Purification by column chromatography

(EtOAc/CH2Cl2 1:19 → 1:14 → 1:9) gave the di-benzylated product (47) as a white solid (684.7

mg, 45 %).

Rf (EtOAc/CH2Cl2 1:9) 0.50. Mp 161-163 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.54-6.91 (m, 25H, Ar), 5.84

(m, 1H, CH=CH2), 5.50 (d, 1H, JNH,2 8.0 Hz, NH), 5.04 (dd, 1H, Jgem 1.0 Hz, Jvic,trans 16.8 Hz,

CH=CH2 (trans)), 4.98 (dd, 1H, Jgem 1.0 Hz, Jvic,cis 10.0 Hz, CH=CH2 (cis)), 4.86 (d, 1H, Jgem 11.4

Hz, CH2Ph), 4.78 (d, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.68 (d, 1H, Jgem 10.0 Hz, CH2Ph), 4.65 (d, 1H, Jgem 11.4

Hz, CH2Ph), 4.41 (d, 1H, Jgem 10.0 Hz, CH2Ph), 4.03-3.95 (m, 2H, OCH2, H-3 or H-4), 3.86 (t, 1H,

J 8.0 Hz, H-3 or H-4), 3.62-3.50 (m, 4H, OCH2, H-2, H-5, H-6a), 3.26 (dd, 1H, J5,6b 4.0 Hz, J6a,6b

10.0 Hz, H-6b), 2.18-2.13 (m, 2H, CH2CH=CH2), 1.88 (s, 3H, COCH3), 1.76 (m, 2H, OCH2CH2). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.5 (COCH3), 144.2 (Ar), 138.7, 138.3, 138.1 (CH=CH2, 2 Ar), 129.1,

128.7, 128.5, 128.4, 128.3, 128.0, 127.2 (Ar), 115.2 (CH=CH2), 100.3 (C-1), 86.6 (CPh3), 80.9,

79.1 (C-3, C-4), 75.0, 74.9, 74.9 (C-5, 2 CH2Ph) 68.7 (OCH2), 62.7 (C-6), 57.3 (C-2), 30.5

(CH2CH=CH2), 29.1 (OCH2CH2), 23.9 (COCH3). [ ]296Dα : +14.8° (c 1.0, CHCl3). HRMS (ES+):

Calcd. for C46H49O6NNa: 734.3458; found: 734.3468.


— 119 —

4-Pentenyl 2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (48) The fully protected pentenyl glycoside (47) (664.7 mg, 0.93 mmol) was dissolved in CH2Cl2/MeOH

(1:2, 20 mL) and p-toluenesulfonic acid monohydrate (44.1 mg, 0.23 mmol) was added. The

reaction mixture was left to stir at rt. After 20 h, TLC-analysis showed complete conversion. The

mixture was neutralized with triethylamine, diluted with CH2Cl2, washed with aq. HCl (0.5 M), sat.

aq. NaHCO3, brine, dried (MgSO4), filtered and concentrated. Column chromatography

(EtOAc/CH2Cl2 1:2 → 1:1 → 2:1) yielded the de-tritylated product (48) as a white powder (360.0

mg, 82 %).

Rf (EtOAc/CH2Cl2 1:1) 0.38. Mp 183-185 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 7.35-7.26 (m, 10H, Ar), 5.77 (m,

1H, CH=CH2), 5.63 (d, 1H, JNH,2 8.0 Hz, NH), 5.02-4.94 (m, 2H, CH=CH2), 4.85 (d, 1H, Jgem 11.6

Hz, CH2Ph), 4.84 (d, 1H, Jgem 11.0 Hz, CH2Ph), 4.82 (d, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.67 (d, 1H, Jgem 11.0

Hz, CH2Ph), 4.67 (d, 1H, Jgem 11.6 Hz, CH2Ph), 4.12 (dd, 1H, J3,4 8.8 Hz, J2,3 10.2 Hz, H-3),

3.88-3.81 (m, 2H, OCH2, H-6a), 3.73 (ddd, 1H, J5,6b 4.4 Hz, JOH,6b 8.0 Hz, J6a,6b 12.2 Hz, H-6b),

3.59 (t, 1H, J3,4 = J4,5 8.8 Hz, H-4), 3.50-3.43 (m, 2H, OCH2, H-5), 3.37 (dt, 1H, JNH,2 = J1,2 8.0 Hz,

J2,3 10.2 Hz, H-2), 2.12-2.05 (m, 3H, OH, CH2CH=CH2) 1.86 (s, 3H, COCH3), 1.66 (m, 2H,

OCH2CH2). 13C-NMR (CDCl3): δ 170.6 (COCH3), 138.7, 138.2, 138.2 (CH=CH2, 2 Ar), 128.7,

128.7, 128.2, 128.2, 128.1 (Ar), 115.2 (CH=CH2), 100.4 (C-1), 80.7 (C-3), 78.8 (C-4), 75.4, 75.0,

75.0 (C-5, 2 CH2Ph) 69.4 (OCH2), 62.2 (C-6), 57.6 (C-2), 30.2 (CH2CH=CH2), 28.9 (OCH2CH2),

23.8 (COCH3). [ ]296Dα : +13.1° (c 1.0, CHCl3). HRMS (ES+): Calcd. for C27H35O6NNa: 492.2362;

found: 492.2359.


— 120 —

Appendiks: NMR-spektre

1H-NMR

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

0

500


— 121 —

7

MsO

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.0

0

500

1000


— 122 —

8

SePh

1H-NMR

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.07.0

0

500


— 123 —

8

SePh

13C-NMR

ppm (f1)050100

0

500

1000

1500

2000

2500


— 124 —

OH

O O

OTs9

1H-NMR

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.07.08.0

0

50

100

150

200

250

300

350


— 125 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.08.0

0

500

1000

1500


— 126 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


— 127 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500

1000

1500

2000


— 128 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.08.0

0

500

1000


— 129 —

OAcOAcO OAc

17

Se

O

13C-NMR


— 130 —

NOESY

H-1 H-5


— 131 —

OAcOAcO OAc

SEt

19 1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


— 132 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500

1000


— 133 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300

400

500


— 134 —

24

OAcOAcO OAc

SeBn

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300


— 135 —

24

OAcOAcO OAc

SeBn

13C-NMR

ppm (f1)050100150

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


— 136 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200


— 137 —

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

1000

1500

2000


— 138 —

OHO

OHO

O

O

HO

OH

25 1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.0

0

500

1000


— 139 —

1H-NMR – Detalje

ppm (f1)3.504.004.505.005.50

0

50

100

150

200

H-3H-11


— 140 —

OHO

OHO

O

O

HO

OH

25 13C-NMR


— 141 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

-50

0

50

100

150

200

250

300

350


— 142 —

1H-NMR – Detalje

ppm (f1)4.004.505.005.506.00

0

50

H-11H-3


— 143 —

OHO

O O

O

TsO

OH OHO

O O

O

TsO

OHeller

Biprodukt 1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200

250


— 144 —

1H-NMR – Detalje

ppm (f1)3.504.004.505.005.506.00

0

50

100

150

200


— 145 —

27

OHO

OHO

O

O

OH

O

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300

400


— 146 —

27

OHO

OHO

O

O

OH

O

1H-NMR – Detalje

ppm (f1)3.504.004.505.005.506.00

0

50

100

150

H-11


— 147 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200


— 148 —

13C-NMR

ppm (f1)050100150200

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


— 149 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.08.0

0

100

200

300


— 150 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300

400

500


— 151 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200

250

300


— 152 —

O

O

OH

32OTs

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

1000

1500

2000

2500


— 153 —

O

O

OH

33

MeSe

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500

1000


— 154 —

O

O

OH

33

MeSe

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

1000

1500


— 155 —

1H-NMR

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200

250

300


— 156 —

36

O

AcHNAcO

AcO

OAc

Cl

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500

1000

1500

2000


— 157 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

500


— 158 —

1H-NMR

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300

400


— 159 —

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

1000

1500


— 160 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300

400


— 161 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

100

200

300

400

500

600


— 162 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200

250

300


— 163 —

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

1000

1500

2000


— 164 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200


— 165 —

13C-NMR

ppm (f1)50100150

0

500

1000

1500

2000


— 166 —

O

AcHNHO

HO

OTr

O

46 1H-NMR

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200


— 167 —

O

AcHNHO

HO

OTr

O

46 13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

1000

1500

2000

2500


— 168 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

0

50

100

150

200


— 169 —

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

1000

2000

3000

4000

5000


— 170 —

1H-NMR

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

-50

0

50

100

150

200

250

300

350


— 171 —

13C-NMR

ppm (f1)050100150

0

500

Documents

i. Forord · purpurfarvede blomster (Figur 4). Ekstrakter fra både planter og tudser indeholdende hjerteglycosider har længe været anvendt som gift i pile3. Figur 4. A: Bufo marinus