I microrganismi nella digestione anaerobica: casi di studio

Dr.ssa Aurora Rizzi

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM), Università di Milano

workshop ERSAF, 28 maggio, 2008

Olive Mill WastewaterOlive Mill Wastewater

Southern Europe Countries world major producers of olive oiland hence major producers of OMW

OMW characteristsicsVery high COD (up to 200 g l-1)High content of polyphenols (up to 6 g l-1)Relatively low pH (4-5)

OMW anaerobic digestionCH4 production

Spontaneous separation of CH4

Low sludge production[Bertin et al. 2004 FEMS Microbiol. Ecol. 48:413-423]

Polyphenols can strongly decrease the process efficiency being toxic for methanogenic Archaea, a key component of the reactor microflora

[Field & Lettinga 1987 Water Res. 21:367-371]

How methanogen community respond to increasing OMW organic loads?

OMW Effluent

Biogas

Gas Counter

GC

OMW Influent

Fixed bed filter

Contact reactor

Anaerobic Digester for OMW TreatmentAnaerobic Digester for OMW Treatment

Anaerobic digester (11 L)Up-flow fixed bed digester (7.5 L)Contact reactor (3.5 L)Packing with wood chipsHRT = 48 hTemperature = 37 °CVol. Org. Load = 1-15 g COD l-1d-1

OMW-InfluentDiluted OMWInfluent pH = 6.1-6.4N correction with NH4ClInfluent COD = 5.9-31 g l-1

Process PerformancesProcess Performances

COD removal

VO

L (g

CO

D l-1

d-1)

CH

4 (l/

10g

CO

D r

em)

VOLCH4

CO

D R

emov

al (

%)

Time (d)

Process PerformancesProcess Performances

- VFA: below 800 mg l-1

- Acetic acid (C2): 70-80% of VFA

Low VFA and C2 indicate efficient acetogenic and

methanogenic phases

VFA

C2VOL

Time (d)

VO

L (g

CO

D l-1

d-1)

VF

A a

nd C

2 (m

g l-1

)

- At VOL 10 g COD l-1d-1 the effluent COD is 1.6 g l-1

- Since 1g C2 gives 1g COD, more than 50% of effluent COD was due to VFA- Hence low residual polyphenols

A decrease of specific CH4 production at VOL of 10 g COD l-1d-1!!

acetone (50 ml) sample (25 ml) discarded centrifugation flocculated solids concentration under N2 stream acetone eliminated n-hexane (50ml) water solution discarded (extraction repeated lipid fraction 4 times) freeze drying H2O (1ml) CH3CN (10 ml) n-hexane (20 ml) (extraction repeated 6 times) sonication n-hexane discarded lipid fraction polyphenolic extract in CH3CN concentration under N2 flux, 30 C CH3CN eliminated MeOH (3ml) methanolic polyphenolic extract

Fig. 1. Scheme of the procedure used for the extraction of polyphenols from olive mill waste waters and from the plant effluents.

The average recovery of polyphenols on the basis of addition of known

concentrations of gallic acid was 59%.

The average percent removal of polyphenols in the ractor was 89.5%

[100% for 2-(p-hydroxy)phenilethanol].

Removal of 2-(p-hydroxy)phenilethanol was calculated on the basis of the

response factor of the corresponding standard while the content of the remain

polyphenols was calculated using the responce factor of caffeic acid.

Methanogenic Archaeal CommunityMethanogenic Archaeal Community

No apparent changes in the methanogen assemblage in the

effluent as shown by MPN counts and coenzyme F420

VO

L (g

CO

D l-1

d-1)

F42

0 C

oenz

yme

(nm

oles

g-1 V

SS

)

Time (d)

F420

VOL

VOL (g COD l-1d-1)

Met

hano

gen

coun

ts

(Log

MP

N g

-1 V

SS

)

2.7 5.7 6.6 10.1 15.2 2.7 5.7 6.6 10.1 15.2

H2 Acetate

Analysis of Methanogenic Archaeal CommunityAnalysis of Methanogenic Archaeal Community

Preparazione delle singole eliche

A- con la temperatura

B- con primer fosforilati e digestione con -esonucleasi

exon.

C- con primer biotinilati e cattura magnetica

biotin

Streptavidin+magnetic

beads

mag

net

Double str.

A B C

single strands

Analysis by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) can resolve the diversity of bacteria and Archaea by separation of single

strand fragments with different conformations

Methanogenic Archaeal Community: DiversityMethanogenic Archaeal Community: Diversity

- PCR with a P-labelled primer- -nuclease digestion of the P-labelled strand- PCR on a collection of 30 methanogen species- PCR on biofilm collected at 5.7 and 10 g COD l-1d-1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

No apparent qualitative differences in the Archaea community pattern. The methanogen community was apparently dominated by

M.bacterium M.sarcina/M.saeta H2 consuming Acetate consuming

5’ end phosphorilated primer

SSCP analysis of 16S rRNA gene

P

798 915Methanogen-specific primer Archaea-universal primer

Methanogenic Archaeal Community: AbundanceMethanogenic Archaeal Community: Abundance

Quantification of the different phylogenetic groups of methanogens based on extinction of PCR signals amplified from biofilm sludge DNA

[Wang et al., 1996 Appl. Environ. Microbiol. 62:1242-1247]

PCR sensitivity(the minimal n° of cells giving

amplification)

PCR titer(The maximum sludge DNA dilutions for positive PCR)

+++- -

PCR sensitivity

DNA extr.

Microscopic cell counts

Culture

Culture dilutions PCR

Sample

Sample dilutions

DNA extr.

+++- - PCR

PCR Titer

Methanogenic Archaeal Community: AbundanceMethanogenic Archaeal Community: Abundance

Specific PCR for the different phylogenetic groups of methanogens were set up basing on 16S rRNA gene signatures [Raskin et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:1232-1240]

5’ end bitinilated probe Magnetic Capture hybridization

B

798 915Methanogen-specific primer Archaea-universal primer

Fwd 300 800 1100 1200

M.bact.

M.sarc.

M.coc.

M.micr

Specific PCR

Methanogenic Archaeal Community: AbundanceMethanogenic Archaeal Community: Abundance

Following VOL increase methanogen community responded by changing the

relative abundance of different phylogenetic/physiological groups

VOL = 5.7(5.7 g COD l-1d-1)

VOL = 10.1(g COD l-1d-1)

PCR TITER IN THE BIOFILM

H2 consuming

Acetate consuming

M.bacteriaceae 1011 108

M.microbiaceae 104 106

M.coccaceae n.d. n.d.

M.sarcina/M.saeta 108 109

H 2 H 2

12

10

8

6

4

2

0Met

hano

gen

coun

ts

(Log

MP

N g

-1 V

SS

)

Ace

tate

Ace

tate

ConclusionsConclusions

In the adopted reactor OMW were efficiently treated (COD removal around 90%) up to VOL of 15 g COD l-1 d-1

A decrease of CH4 specific production occurred at VOL of 10 g COD l-1 d-1

The overall diversity of methanogen was not affected as shown by SSCP and sequencing

Methanogen community reacted by re-balancing the H2trophic/acetotrophic methanogen ratio

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

Gli scarti delle cantine vinicole sono costituiti dalle acque di lavaggio degli impianti di vinificazione e contengono parti dei raspi e le bucce degli acini

I reflui di cantina contengono concentrazioni residue di zuccheri e acido tartarico (dall’uva), etanolo, acido acetico e acido lattico (residui delle fermentazioni)

I reflui che derivano dalla vinificazione del vino rosso contengono anche considerevoli quantità di composti fenolici (antociani e tannini) che possono avere effetto tossico sui microrganismi coinvolti nella degradazione anaerobica, in particolare i metanogeni.

Trattamento dei reflui di cantina:• trattamento aerobico elevato consumo di energia richiesto dall’aerazione, e

necessità di aggiungere nutrienti• digestione anaerobica abbattimento del carico organico, con recupero di energia

(produzione di metano)

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

Un processo di digestione anaerobica degli effluenti di cantina vinicola è stato messo a punto in un impianto in scala di laboratorio

IMPIANTO:digestore cilindrico, h= 130 cm, riempito con materiale inerte di riempimento (truciolato di legno) come matrice di supporto. Caricamento in fase ascendente.

Il digestore conteneva una microflora selezionata nei trattamenti dei precedenti anni (depurazione degli effluenti di pirolisi, dell’acqua di vegetazione delle olive, degli impasti di cartiera)

TRATTAMENTO:le acque di cantina erano diluite fino ad avere un carico organico di COD=7-7,5 g/l, ed addizionate di NaHCO3 e NH4Cl.

Dopo un periodo di adattamento, il reattore ha raggiunto una fase di equilibrio “steady state” con una rimozione del COD del 90%. Il carico organico è stato quindi aumentato a 10,5-12,5 gCOD/ld, diminuendo il tempo di ritenzione a 16-17h

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

La digestione anaerobica delle acque provenienti dalla vinificazione in rosso è risultata meno efficiente rispetto a quella in bianco:

• minore rimozione di COD • inferiore produzione di metano• maggior contenuto di AGV nell’effluente (segnale di un’inibizione dei processi di acetogenesi e

metanogenesi)• le cariche dei metanogeni presenti nella fase circolante sono inferiori, mentre i batteri eterotrofi e

glucosio-fermentanti sono superiori

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

Il reattore è in grado di recuperare rapidamente (circa 10 giorni) shocks da carico organico pari ad un aumento improvviso di tre volte del carico organico specifico volumetrico

METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA

Start-up and operation of an anaerobic high-rate staged expanded granular sludge bed (EGSB) system for the treatment of cold (3 to 8°C), dilute wastewater (0.5 to

0.9 g of COD liter-1), containing 12 mg of O2 liter-1

METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA

POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO

- Trattamento termofilo reflui acidificati- Reattori UASB multipli- Carico organico fino a 100 kg COD m-3 day-1

POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO- Rimozione del COD > 90%- Tempo di ritenzione idraulico = 2-2.5 h- Produzione di biogas 40-50 m3 m-3

reattore day-1

Grazie per l’attenzione !